KR20170049200A

KR20170049200A - 락토바실러스 플란타룸 특이적 프라이머 쌍 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸의 검출방법

Info

Publication number: KR20170049200A
Application number: KR1020150150288A
Authority: KR
Inventors: 박동석
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2017-05-10
Also published as: KR101791570B1

Abstract

본 발명은 유산균인 락토바실러스 플란타룸 검출용 프라이머 쌍 및 이을 포함하는 락토바실러스 플란타룸의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명인 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유산균 락토바실러스 플란타룸 검출용 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 PCR을 이용한 검출 방법은 락토바실러스 플란타룸의 존재 여부를 시기별로 정확하고 신속하게 확인함으로써 균주 확인에 따른 시간과 비용을 절감 시킬 수 있다.

Description

락토바실러스 플란타룸 특이적 프라이머 쌍 및 이를 이용한 락토바실러스 플란타룸의 검출방법 {Lactobacillus plantarum specific primer and method for detecting Lactobacillus plantarum using thereof}

본 발명은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 검출용 프라이머 쌍 및 이을 포함하는 락토바실러스 플란타룸의 검출 방법에 관한 것이다.

젖산균은 글루코오스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 불리며, 젖산발효에 의해 생성되는 젖산에 의해서 병원균과 유해세균의 생육이 저지되는 성질을 유제품·김치류·양조식품 등의 식품제조에 이용하고 있다. 또한, 젖산균은 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제(整腸劑)로도 이용되고 있다. 상기 유산균은 그람양성균으로, 통성혐기성 또는 혐기성을 성질을 지니며, 락토바실루스 속과 스트렙토코쿠스 속에 여러 종류가 알려져 있다.

김치는 유산균(젖산균)에 의하여 발효되는 한국 전통 식품으로, 김치에서 분류된 젖산균(유산균)으로는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 페디오코코스 펜토사쿠스(Pediococcus pentosacues) 등이 있다.

일반적으로 김치가 발효되면서 발효 초기에 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)를 포함한 류코노스톡들이 우세하게 증식하여 초기의 산 생성을 주도하여 김치 발효에 관여하며, 점차 pH가 감소함에 따라 처음에 왕성했던 류코노스톡 균주의 수도 감소하게 된다. 반면, 발효 후기에는 산에 내성적인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 등의 락토바실러스 균들이 활발하게 활동하여 락토바실러스 균의 수가 점차 증가하면서 김치가 시어지게 된다.

다만, 종래 유산균을 분석하기 위해 김치와 같은 발효물 내에 존재하는 유산균을 유산균에 특이적인 배양조건상에서 도말 배양함으로써 형성된 콜로니(colony)의 형태나 수를 확인해왔다. 그러나, 도말 배양은 인위적인 배양조건에서 생존할 수 있는 미생물의 개체 수만 측정할 수 있어, 실제 김치에 존재하여 발효에 중요한 역할을 하는 미생물이 시료의 준비과정이나 배양과정에서 사멸될 수 있으며, 미생물이 배양이 된다 하더라도 균주가 콜로니를 형성하기까지 다소 시간이 소요되며, 특이성(specificity)과 민감성(sensitivity)이 낮은 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸종 만을 정확하게 검출하기 위해서 상기 단점을 극복할 수 있는 락토바실러스 플란타룸 특이적 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 검출방법을 개발하였다.

1. Quere, F., Deschamps, A., and Urdaci, M. C. (1997). DNA probe and PCR-specific reaction for Lactobacillus plantarum. Journal of Applied Microbiology. 82: 783-790. 2. Torriani, S., Felis, G. E. and Dellaglio, F. (2001). Differentitation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus and L. paraplantarum by recA Gene Sequence Analysis and Multiplex PCR assay with recA Gene-Derived Primers. Appl. Environ. Microbiol. 67(8): 3450-3454.

본 발명의 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자(Cell surface protein precursor gene) 검출용 프라이머 쌍을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성된 프라이머 쌍을 포함하는 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 키트를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성되는 프라이머를 포함하는 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 프라이머 쌍을 제공한다.

본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산서열로 구성되는 프라이머 쌍을 포함하는 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 조성물을 제공한다.

상기 프라이머들은 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자(등록번호 : GenBank Accession No. 254044759); 서열번호 3)에 특이적인 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머를 포함한다.

본 발명의 상기 프라이머 쌍은 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 4079번 내지 4394번으로 이루어진 316bp 핵산 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍일 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계;

를 포함하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 시료는 락토바실러스 플란타룸을 포함한 유산균 또는 유산균을 포함한 발효식품, 유제품 등 식품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 김치 또는 김치 국물이 더욱 바람직 하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 1) 단계에서 DNA의 추출은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 SDS 추출법 (Tai et al. Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al. Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있으며, 예를 들면, Fast DNA spin kit for soil (Mp Biomedicals)나 게놈(genomic) DNA 추출 키트(DNeasy^®Blood & Tissue Kit(Qiagen (Hilden, Germany))를 이용할 수 있다.

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용하여 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 표적 서열을 증폭할 수 있다.

상기 단계 2)의 PCR은 실시간(real-time) PCR, qRT-PCR 또는 RT-PCR일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 용어 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 본 발명의 기술 분야에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C.등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17,18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사 중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CPPCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loopmediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제 09/854,317호에 기술되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉,dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다(Levak KJ, et al., PCR Methods Appl., 4(6): 357-62(1995)). PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클(cycle)에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 CT 값(threshold cycle)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다. 종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태(plateau)에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플 리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 적은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 한계치(threshold)를 설정하면 한계치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 CT 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 인터킬레이팅(interchelating) 방법(SYBR 그린I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. 인터킬레이팅 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 반응계를 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다.

상기 실시간 PCR에 의한 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것이 바람직하고, 최소 5 fg만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.

상기 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론 (cloned) DNA를 포함한다.

상기 실시간 PCR에 의한 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출의 최소 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)양은 4.2 × 10² 내지 4.2 × 10⁸ (CFU/ml)인 것이 바람직하고, 최소 4.2 × 10²(CFU/ml)만 있어도 검출이 가능하므로 검출감도가 매우 높은 것이다.

아울러, 본 발명은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물을 포함하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 키트를 제공한다.

서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있기 위해 DNA 중합효소, dNTP 및 상기에서 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

상기 키트는 실시간 PCR용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 바이셀라 코리엔시스의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출의 최소 DNA 양은 5 fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것이나, 이에 한정하지 않는다.

상기 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 DNA는 게놈 DNA와 클론 DNA를 포함한다.

상기 실시간 PCR에 의한 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출의 최소 세균 세포 현탁액양은 4.2 × 10² 내지 4.2 × 10⁸(CFU/ml)인 것이나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자에 특이적인 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머는 같은 속 다른 종의 균주들은 검출하지 못한 반면, 락토바실러스 플란타룸 종만을 검출하였으며(도 2 및 도 3 참조), 게놈 DNA와 클론 DNA는 5 fg, 세균 세포 현탁액에서는 4.2 × 10² (CFU/ml)에서도 락토바실러스 플란타룸을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

본 발명의 서열번호 1의 프라이머 및 서열번호 2의 프라이머를 포함하는 조성물은 락토바실러스 플란타룸에 특이적이고 민감성이 높다. 따라서 본 발명의 프라이머 쌍 은 실시간 PCR 방법을 통해 락토바실러스 플란타룸의 정량과 김치 내에서 락토바실러스 플란타룸의 밀도 변화를 신속, 정확하게 판단 할 수 있다.

본 발명인 유산균 락토바실러스 플란타룸 검출용 프라이머 쌍 및 이를 포함하는 검출방법은 종래 김치 및 발효식품 등에서 발견되는 유산균의 검출 방법이 갖고 있는 단점을 극복하여 신속하고 정확하게 락토바실러스 플란타룸 균주만을 특이적으로 검출할 수 있다. 그리고 본 발명의 프라이머 쌍은 적은 DNA양으로도 락토바실러스 플란타룸을 시기별로 정량분석 할 수 있고 김치 내 락토바실러스 플란타룸의 밀도 변화를 모니터링할 수 있다.

도 1은 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를(등록번호 : GenBank Accession No. 254044759; 서열번호 3) blastn 서치 결과이다.
도 2는 제작한 프라이머 쌍으로 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자, recA 유전자(비특허문헌 2), 16S/23S rRNA 유전자(비특허문헌 1)을 각각 PCR 증폭한 결과이다. (A)는 16S/23S rRNA 유전자(비특허문헌 1), (B)는 recA 유전자(비특허문헌 2), (C)는 세포 표면 단백질 전구체 유전자이다. 1-9 레인은 락토바실러스 플란타룸 균주이고, 10-36레인은 표 1의 리스트에 있는 락토바실러스 플란타룸을 제외한 균주이고, 37레인은 증류수(음성 대조군)이다.
도 3은 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 실시간 PCR 결과이다.
도 4는 프라이머 쌍의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자에 대한 실시간 PCR 민감도 결과이다. (A) 클론 DNA, (B) 세균 세포 현탁액, (C) 게놈 DNA이다
도 5는 4°C에서 발효 중인 두 종류 김치의 전체 DNA에서 락토바실러스 플란타룸의 정량분석을 위한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화이다.
도 6은 15°C 와 25°C에서 발효 중인 두 종류 김치의 전체 DNA에서 락토바실러스 플란타룸의 정량분석을 위한 실시간 PCR의 Ct 값의 변화이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 본 발명에 사용된 락토바실러스 플란타룸을 포함한 균주들의 준비

본 발명에서 사용된 락토바실러스 플란타룸을 포함한 기타 미생물은 벨기에의 BCCMTM(Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms)와 KACC(Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양 받았으며, 이들의 출처는 하기 표 1에 정리하였다. 표 1의 균주들은 MRS배지(OXOID CM0361)로 30℃에서 각각 이틀 배양하였다.

Scientific name^a	Collection No.	Biological origin	Result^b
Lactobacillus plantarum ^T	LMG 6907	Pickled cabbage	+
Lactobacillus plantarum	LMG 9206	Dental caries	+
Lactobacillus plantarum	LMG 9208	Sauerkraut	+
Lactobacillus plantarum	LMG 12167	Homemade soft cheese	+
Lactobacillus plantarum	LMG 18024	Buffalo, Milk	+
Lactobacillus plantarum	LMG 18035	Fermented food from cassava	+
Lactobacillus plantarum	LMG 23521	Meat	+
Lactobacillus plantarum	LMG 25882	Dairy product	+
Lactobacillus plantarum ssp. argentoratensis ^T	LMG 9205	Fermented corn product(Ogi)	+
Lactobacillus pentosus ^T	LMG 10755	NK^c
Lactobacillus paraplantarum ^T	KACC 12373	Beer
Lactobacillus acidophilus ^T	LMG 9433	Human
Lactobacillus amylolyticus ^T	LMG 18796	Acidified beer wort
Lactobacillus brevis ^T	LMG 6906	Human
Lactobacillus buchneri ^T	LMG 6892	Tomato pulp
Lactobacillus casei ^T	LMG 6904	Cheese
Lactobacillus crispatus ^T	LMG 9479	Eye
Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ^T	LMG 6901	Bulgarian yoghurt
Lactobacillus fermentum ^T	LMG 6902	Fermented beets
Lactobacillus gasseri ^T	LMG 9203	Human
Lactobacillus hayakitensis ^T	LMG 24490	Sealthy thoroughbred, faeces
Lactobacillus helveticus ^T	KACC 12418	Swiss Emmental cheese
Lactobacillus sakei ^T	KACC 12414	Starter of sake(Moto)
Lactobacillus salivarius ^T	LMG 9477	Saliva
Lactococcus lactis ^T	KACC 13877	NK
Lactococcus lactis ssp. cremoris ^T	KACC 13438	Cheese starter culture
Leuconostoc citreum ^T	KACC 11860	Honeydew of rye ear
Leuconostoc fallax ^T	KACC 12303	Sauerkraut
Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides ^T	KACC 12312	Fermenting olives
Leuconostoc pseudomesenteroides ^T	KACC 12304	Cane juice
Pediococcus pentosaceus ^T	KACC 12311	Dried American beer yeast
Streptococcus gordonii ^T	KACC 13829	Patient suffering from subacute bacterial endocarditis
Weissella koreensis ^T	KACC 11853	Kimchi
Weissella minor ^T	KACC 13437	Milking machine slime
Weissella halotolerans ^T	KACC 11843	Sausage
Weissella thailandensis ^T	KACC 11849	Fermented fish

KACC, Korean Agricultural Culture Collection, Republic of Korea;

LMG, The Belgian Co-ordinated Collections of Microorganisms (BCCM^TM),Belgium

^T Type strain.

+ and indicate species was detected or not detected.

실시예 2. 배양된 균주들의 총(total) DNA 추출

배양된 균주의 총 DNA는 Qiagen (Hilden, Germany)사의 게놈 DNA 추출 키트 (DNeasy®Blood & Tissue Kit)를 이용하여 추출하였다.

실시예 3. 락토바실러스 플란타룸 특이적 프라이머 쌍 제작

락토바실러스 플란타룸을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머 쌍의 제작을 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자(등록번호 : GenBank Accession No. 254044759; 서열번호 3)를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인하고 프라이머 쌍을 제작하였다.

락토바실러스 플란타룸에서에서 316bp 크기의 단편을 증폭하는 plan316F 프라이머와 plan316R 프라이머 세트를 제작하였다. 프라이머의 서열은 다음과 같다.

plan316F 프라이머 : 5'-ATG CGG CTG GTA ACG AAG TAA GTA-3'(서열번호 1)

plan316R 프라이머 : 5'-ACG AGT GCC GCC TGT GA-3' (서열번호 2)

상기 프라이머는 GenBank 등록된 락토바실러스 플란타룸 JDM1 균주의 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다(도 1).

실시예 4. 프라이머 쌍의 락토바실러스 플란타룸의 특이적 검출 확인

PCR 증폭 반응은 PTC-200^TM thermocycler (MJ research, Watertown, mass)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 Tris-HCl 10mM, KCl 50mM, MgCl2 1.5mM, 젤라틴 0.01%, dNTP 각각 0.2mM, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 20pM, Taq 중합효소(Taq polymerase) 2unit (Promega, Madison, Wis.)을 함유하는 PCR 혼합액으로 총 25μ의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 몇몇 미생물의 게놈 DNA 양은 약 25ng이었다. 반응은 95℃에서 5분간 변성하고 95℃ 60초, 61℃ 30초, 72℃ 60초로 35회 반복시킨 후 72℃에서 10분간 반응하였다. 증폭반응 후 5μ의 PCR 산물을 LoadingStar(DYNEBIO, Republic of Korea)로 착색시켜 1.5% 농도의 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터(UV transilluminator)에서 확인하였다.

316bp 크기의 단편을 증폭하는 plan316F (5’-ATG CGG CTG GTA ACG AAG TAA GTA-3') (서열번호 1) 와 plan316R (5’-ACG AGT GCC GCC TGT GA-3') (서열번호 2) 프라이머는 NCBI의 Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 (등록번호: No. 254044759; 서열번호 3) 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 서열정보를 blastn 및 blastx 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작되었다. 이전 연구에서 보고된 16S/23S rRNA 유전자에서 제작된 Lbp11 (5’-AAT TGA GGC AGC TGG CCA-3’)(서열번호 4)와 Lbp12 (5’-GAT TAC GGG AGT CCA AGC-3’)(서열번호 5) 프라이머(비특허문헌 1) 그리고 recA 유전자에서 제작된 PlanF (5‘-CCG TTT ATG CGG AAC ACC TA-3’)(서열번호 6)와 pREV (5‘-TCG GGA TTA CCA AAC ATC AC-3’)(서열번호 7) 프라이머(비특허문헌 2)는 본 연구에서 제작된 plan316F/R 프라이머와 비교하기 위해 사용되었다(도 2).

그 결과, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍은 1-9번 레인에 해당하는 락토바실러스 플란타룸에서만 316bp 크기의 핵산 단편을 특이적으로 증폭함을 확인 할 수 있었다. 그리고 비특허문헌 1의 16s/23s rRNA 유전자에 특이적인 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머 쌍의 PCR 결과는 1-9레인에 해당하는 락토바실러스 플란타룸에서는 253bp의 단편이 증폭되었고 그 외에 10-36 레인에 해당하는 표 1에 제시된 바이셀라 코리엔시스 외 다른 균주들에서 다양한 단편이 증폭되었는 바, 락토바실러스 플란타룸 검출용 프라이머로 적합하지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 이전 연구(비특허문헌 2)에서 보고된 RecA 유전자에 특이적인 서열번호 6 및 서열번호 7의 프라이머 쌍은 1-9번 레인에 해당하는 락토바실러스 플란타룸의 318bp 크기의 단편을 특이적으로 증폭함을 확인 할 수 있으나, 11번 및 16번 레인에서 318bp 크기의 단편이 확인되는바, 본 발명의 프라이머에 비하여 특이성이 낮음이 확인되었다(도 2).

실시예 5. 프라이머 쌍의 실시간 PCR 특이성 분석

실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템 (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 5pM을 함유하는 실시간 PCR 혼합액으로 총20㎕의 양으로 수행하였다. 락토바실러스 플란타룸 LMG 6907 게놈 DNA 와 클론 DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석 하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 실시간 PCR 혼합액에 첨가하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 64℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브(melting curve)와 멜팅 피크(melting peak)를 위해 65 ~ 95℃ 까지 5초마다 0.5℃ 씩 증가시켰다.(도 3).

그 결과, 락토바실러스 플란타룸에서만 특정 온도(85℃)에서 멜팅 피크를 확인할 수 있었다. 멜팅 피크는 상보적으로 결합한 두 가닥의 DNA가 온도가 증가함에 따라 DNA 가닥이 서로 분리되는 순간의 온도를 나타내는 것으로 85℃에서 하나의 피크만이 나타났으므로 해당 세포 표면 단백질 전구체 유전자에 특이적으로 결합하였음을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 6. 프라이머 쌍의 실시간 PCR 민감도 분석

실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR 시스템 (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR premix Ex Taq (2x) (TAKARA Bio, Inc., Japan)과 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 각각 5pM을 함유하는 실시간 PCR 혼합액으로 총 20μ의 양으로 수행하였다. 락토바실러스 플란타룸 LMG 6907 게놈 DNA와 클론 DNA 양은 약 5ng에서부터 10배씩 희석하였고, 미생물 현탁액은 O.D 600에서 0.1이 되게 맞춘 후 10배씩 희석하여 Real-time PCR 혼합액에 첨가하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 64℃ 30초로 40회 반복시킨 후 95℃에서 15초간 반응시킨 뒤, 멜팅 커브와 멜팅 피크를 위해 65 ~ 95℃ 까지 5초마다 0.5℃ 씩 증가시켰다.

Cloned DNA		Genomic DNA		Cell suspension
Plasmid copies/㎕	C_t values (SD)^a	weight/㎕	C _t values (SD)	CFU/recation	C _t values (SD)
1.36 × 10⁸	14.36 ±0.16	5 ng	16.87 ±0.14	4.2 × 10⁸	16.78 ±0.24
1.36 × 10⁷	17.72 ±0.09	500 pg	19.90 ±0.19	4.2 × 10⁷	19.43 ±0.31
1.36 × 10⁶	21.00 ±0.04	50 pg	23.36 ±0.11	4.2 × 10⁶	23.89 ±0.02
1.36 × 10⁵	24.39 ±0.14	5 pg	26.86 ±0.25	4.2 × 10⁵	26.13 ±0.08
1.36 × 10⁴	27.72 ±0.23	500 fg	30.27 ±0.28	4.2 × 10⁴	29.47 ±0.28
1.36 × 10³	30.93 ±0.24	50 fg	32.63 ±0.50	4.2 × 10³	32.07 ±0.42
1.36 × 10²	34.04 ±0.43	5 fg	36.54 ±0.98	4.2 × 10²	35.43 ±0.73

^aN.D., Not determined.

그 결과, 스탠다드 커브(standard curve)의 R2값과 E값이 적정범위에 있고 슬로프(slope) 값이 -3.32에 근접한 값을 가지므로 증폭효율이 높고 신뢰할 수 있는 데이터로 판명할 수 있었으며(도 4), 게놈 DNA와 클론 DNA는 5 fg, 세균 세포 현탁액에서는 4.2 × 10² (CFU/ml) 에서도 락토바실러스 플란타룸을 안정적으로 정량 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다(표 2).

실시예 7. 김치 시료를 이용한 실시간 PCR 증폭

김치 시료부터의 실시간 PCR을 위하여 시중에 판매되고 있는 제조일로부터 하루 정도 지난 포기김치와 백김치를 구입하여 밀폐된 용기에 담아 각각 4℃, 15℃ 와 25℃에서 발효, 보관하였고 실험을 위해 김치 국물 30 ml 씩 4℃의 경우 일주일간격으로, 15℃와 25℃ 의 경우 하루간격으로 채취 하였으며 전처리로 고춧가루와 같은 큰 입자를 제거하기 위해 멸균된 거즈 (Daehan, Korea)를 네 겹으로 접어 짜낸 뒤 나온 김치 국물을 사용하였다. 거즈로 거른 김치 국물 1 ml을 1.5 ml 튜브에 담고 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 다음 아래에 수집된 펠렛(pellet)을 이용하여 MPbio (OH, USA)사의 Fast DNA®spin kit for soil을 이용하여 총 DNA를 추출한 후 실시간 PCR을 실시하였다. 실시간 PCR 증폭 반응은 CFX96 실시간 PCR system (Bio-Rad laboratories, Inc., USA)를 사용하여 실시하였으며, 각 반응은 SYBR®Premix Ex Taq (2x), 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머는 각각 5pM을 함유하는 SYBR green PCR 혼합액으로 총 20㎕의 양으로 수행하였다. PCR 혼합액에 첨가한 김치 시료의 총 DNA 양은 약 5ng이었다. 반응은 95℃에서 30초간 변성하고 95℃ 5초, 64℃ 30초로 45회 반복시킨 후 65℃에서부터 0.5℃씩 간격으로 10초간 반응 후 증가시키면서 95℃까지 반응시키면서 멜팅 커브와 멜팅 피크를 실시하였다. 그 결과 특이 커브와 피크를 각각 확인하였고 밀도 변화를 정리하였다(도 5, 도 6).

그 결과, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머을 사용하여, 락토바실러스 플란타룸에 대하여 실시간 PCR 기법으로 4℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰하였다. 포기김치의 경우, Ct 값은 34.49에서 처음 검출되었다. 하지만 보관 마지막 날인 14주차까지 Ct 값 34~35 사이를 나타내면서 밀도의 증가 변화는 관찰되지 않았다(도 5).

또한, 15℃와 25℃에서 보관된 포기김치와 백김치에 적용하여 밀도 변화를 관찰한 결과로, 15℃에서 보관된 포기김치는 Ct값 32.20 정도에서 처음 검출되었고, 점차 증가하여 마지막 날인 14일차에 Ct값 26.46을 보여주면서 초기에 비해 밀도가 약 100배 정도 증가하는 것으로 관찰되었다. 25℃에서 보관된 포기김치 역시 초기 검출 값은 15℃ 포기김치와 비슷했지만, 마지막 날인 14일차에 Ct값 19.86을 보여주면서 초기에 비해 밀도가 약 10,000배 정도 증가변화가 관찰되었다. 15℃에서 보관된 백김치의 경우 보관 6일차부터 Ct값 34.42로 처음 검출되었고 보관 마지막 날 Ct 값은 25.85로 약 100배 정도 증가 변화가 관찰되었다. 25℃에서 보관된 포기김치의 경우 보관당일 Ct값 36.36으로 검출되어 보관 마지막 날인 14일차의 Ct값은 19.97을 보여주며 약 100,000배 정도의 확연한 증가 변화가 관찰되었다(도 6).

따라서 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 특이적인 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여, 김치 내 시기별 락토바실러스 플란타룸의 정량분석과 락토바실러스 플란타룸 밀도 변화의 모니터링이 가능하다는 것이 확인되었다.

<110> Republic of Korea <120> Lactobacillus plantarum specific primer and method for detecting Lactobacillus plantarum using thereof <130> P15R12D1209 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plan316F primer <400> 1 atgcggctgg taacgaagta agta 24 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plan316R primer <400> 2 acgagtgccg cctgtga 17 <210> 3 <211> 6252 <212> DNA <213> Lactobacillus plantarum Cell surface protein precursor gene <400> 3 ttgactgaca ctggtttgcc agacattcca actggaactg gctataccgg taaatgggtc 60 aatcaagctg atgccaccca gacgtatacg tcgagtgagt taatggcttt gtataatggc 120 gtcgatagtc cagccgatac aatcacttgg gtctgggaaa ctagcccatc ctatgctgat 180 ttcacgtcca agaatgtaac cggactaatt gccgggccga agacgacgtg gcgagttgcc 240 gatagtgttg caacattaaa agatgtgaat gggactgata tttatgcgac cgctgacaca 300 gtcgtcaaag tgattagcgt gaacggcgat actgctgtaa cgacggtcga cactcaaact 360 gccggtacct atcaagttga cttgcagtat acggatgcgt atggcaaagt atggcagcaa 420 actagtacgg ttgcggtagc ggtaaatcaa ggcaaactag ttggtaaacc gttgacgatc 480 aaaatgggtg ctaagccaac gtatacgatt aatgatttaa tcgacacgga caactcccgc 540 aatgcggccg gcgataagct aagtgccgac gaactcgcga cggctacggt tacaggcttg 600 gatacgagta aagctggcgc acaaacggtt acgctggcgt atacggatga tgctactggc 660 atggtccaca cgacaaccac cacggtgacg atggtcgcaa ctaaggccga cttaacaatg 720 cgtaatagta ccatcattaa aggacccgaa aactcaagtt gggactatcg ccagtatgtc 780 acgagtgtca ctgattttga tgggaacccg gttagtttag acggacttaa cattgtggtt 840 gatcagcaac ctgatttaac gcaaattggg tcgcaaactg tcacactcac gtatacggat 900 gcgttgggca atgtcatcag cgtcccaact caagtaacag tcgttgcttc tcaggcacaa 960 gttacaacca aggcgccgtt aacgatttgg cccagtgagg ttgctcaatt aaaagtcgcc 1020 gatttggtga caatcacggc tgccaacggg aaccccgtcg atactagtac cgacctaaca 1080 gatgtcacaa tgagttcaat tgacacgagc aagggtggcg cgcagaccgt tactattact 1140 tatacggatg aagctggcaa tctagtgaca gcttatgcca aagtaacggt tgaccaatca 1200 gatttgaaga ccaagctaac gaatccaatt gcggggccta aagctaaatg ggactatcta 1260 gctggtttgg aatgggtcaa ggatgcaaat ggaaagttgc ttgataatct cgcaaccgct 1320 gatattaaag tcgttactga acctgattta agtgttgcga tggtcggcca tgaccaaacg 1380 gtgacactca gttatacgga tgagttgggc aaagaacact tagtcactgc ggttgtcaac 1440 acggtggctt cgaaggcgaa gattacggct gtcagcgacc agatcatcat acctgatgaa 1500 gccaaaaagc tgacggcaac cgacctggtc agtgagttaa ttgatgcggc gggaaataaa 1560 gccacgaatt ttgacgatgt gacgatgagt ggttttgatg ctaaagctat cgggccacaa 1620 accgtgacac tgacgtattc ggatgcgtat ggtaaccaaa cgactgattc gacgacagtc 1680 accgtggatt tcgccacaat cactggtcaa gcgacacacc caattgccgg tccaaccgcg 1740 acttgggatt accgtgacag cgtcactcaa gttatcgatg ccaacggaaa gataattgat 1800 gtcggcgatg ctgacattac agccacgacg ccggatttaa ctccggcaaa ggtgggcaag 1860 cctcagacgg ttacgttgac ctatactgac agtctgggta aagttcacac gaccgacgtg 1920 attgtaacga cgacgctttc aaaggcgaaa atcacggctg ttgctgacca gattatcata 1980 cctgatgaag ccaaaaagct gacggcaact gacctggtca gcgagttaat tgatgcggcg 2040 ggaaacaaaa tcacgaattt tgatggtgtg acgatgagtg gttttgatgc taaagctatc 2100 gggccacaaa ccgtgacact gacgtattcg gatgcgtatg gtaaccaaac aactgattcg 2160 acgactgtaa ccgtggattc cgcaacgcta acgcttcaga atcacactca agtggcagga 2220 cctaaggcga cttggaatta tgctgataac atcaaagcca tcactgattc taagggccag 2280 tcgctaacat taagcgatgc caagattacg gtcgtgcaac gtccagattt aagtgtggct 2340 ggaacttata aaattgtact tgaatatact gatgatttag ggcaagcgca cacagagact 2400 gccaatgttg aagtgacggc ttcaaaagcg gccattactg ccgtttctaa gcaggtgatt 2460 ttggcagaaa aagcgaccat ggtaactgcg tcgtcactag tgtcaacact gtacgatgcg 2520 gatggcgttc aaatttataa ttctgatgat gtgacgatga gtggctttaa tgctaaagct 2580 atcggaccac aaacagtaac gttagcgtat acggacgcgt atggcaatca aacgactgtt 2640 tcgacgactg taaccgtgga tttcgcaacg ctaacgcttc aaaatcacac tcaagtggcg 2700 ggacctaagg cgacttggaa ctatgctgat aacatcaaag ccgtcactga ttctaaggga 2760 caatcgctaa cattaagcaa tgctaagatt acggtcgtgc agcgtccaga tttaagtgtg 2820 gctggtactt ctccaatcgt gatcgaatat actgatgatt tagggcaagt gcacacagag 2880 actgccaatg ttgaagccac ggcttcaaca ttggccatta ctgccgtttc caagcaagtg 2940 attttggcgg aaaacgcaaa catggtaact gcgccgtcac tagtggcaac actgtacgat 3000 gcggacggct ttcaaattca taattttgat gatgtgatga tgagcagttt tgatgctcaa 3060 gctatcgggc cacaaaccgt gacgttaacg tatacagacg cgtatggcaa tcagatgact 3120 gattcgacga ctgtgatcgt ggatttagcc acaatcactg gtcaagcgac gcatccaatt 3180 gccggtccag cggcgacttg ggattatcgt gacagtgtca ctcaagttat cgatgccaac 3240 ggaaagacaa ttgatgtcga tactgctgac attacagcca caacgcctaa tttaactctg 3300 gcaaaggctg gcaagccaca gacggtcatg ttgacctata ctgacagtct gggtaaggtc 3360 cacacgaccg acgtgattgt aacgacgacg ctttcaaagg cgaagattac ggctgttgct 3420 gaccagatta tttggcctga tcaagctaaa caactgacgg caacggactt agttgatcgt 3480 ttatacgatg ctgaaggcca tctgattaca aattacgaca atgtcgaaat gagtgcgctg 3540 gattccaagc ttgcggggca gcaacgtttg acgttgactt acacggatgt tgcgggtaat 3600 caatccgtcg cgtatgccaa tgtgacagtc gaccaggcaa agctagtgac aaaaccaagt 3660 acggtaattg ccggcccgac ggcaacgtgg agttacgaag ccggtattag tcagctgacg 3720 aatgcagctg ggcaacttat taccgtccaa ccggggacaa ttaaagtgtt gaacaggcca 3780 gatctgaatg ttgattcagt cgggcaacaa cagctgatca cactgattta tacggatgag 3840 ctcgggaaat cccagtcggt cacggcaatg gtgacagctg aggcctcaca agctacgtta 3900 acggccaaga aagcagttat cctgcaaccg gatgccgcgg caaagctaac ggctaatgac 3960 cttgtaacga gcttaacgga cgcctctgga caagcggtga ctgattatca aatcgttcag 4020 atgtctaagc tagacgcgac tcggccaggt gttcaacccg tctcattaac ttatacggat 4080 gcggctggta acgaagtaag taccgttgta aaagtaacgg ttgatcaggc caagatggag 4140 agtcagaacc ggactcaaat ctggggacca agtatgactt gggattatcg gcaacaattg 4200 gcaactgtta cggattcgca agggcatcag ttgaatcctg atcaagctaa aattacggtc 4260 ataaccggcc cgcaactgac ggctaaaatg atcgataagc cgcaaacggt taccttgatg 4320 tacacggatg atctgcaaca gacgcatact gtgtcagcca ctttgacctt aacggcatca 4380 caggcggcac tcgtgccacg tccggcacag attgtatggg ccaaagatgc ggggcaactg 4440 acgccagcca actttttgca aacgattacc ggcgcggatg gtactcaagt gtcgtctttg 4500 accaatgtca agatgagtgc ggtcgatgcc agccagcctg gtgcccaaac ggtgattcta 4560 acgtataccg atgattacgg caacgaggtg acaacaactg cccaagtgac ggttgatcaa 4620 gccgccttaa cgacccaaac cgctcgaccg attgccgggc cgactgccca ttgggattat 4680 cagacgaact ttaaaaccgt gacgaatgct gccggcgaag tgattaatgt cggtgatgct 4740 aatattaagg tgttgacggg cccagatttg agcacaggca tggtggggca gcctcaagtc 4800 gttacgttca gttacactga tgaattagga ttgacccaaa ccgccacggc gaaggtcaca 4860 acagtcgcct cacgggcgca catgacgact agtgctgatc aggtgacctg gcctgcaact 4920 gtcggaaaat taacggttgc ggatctagtc actggtttaa cggacgcctg gggccagact 4980 agtcagaatt atcaaaatgt tacgatgacg accatcaatg cccaacaggc cggaaaacaa 5040 caagtcaccc tgacatatac tgatgaggtg ggcaacgtaa aaactgcgac tacgacggtg 5100 acagtcgacc aagcagcatt aacgactcag ccacaaacgg tcatcgcggg tccgactgcc 5160 aagtgggatt atcatcaggg tattggaacg attactgatg gtatgggcca gccgattgcg 5220 gtcaataatg ccgctattac agtcgtggcg atgccagact taacggttgc ccatattggt 5280 cagccacaaa ctgtgcaact ggtttacacg gactcgctgg gacaacaaca aacggcgttg 5340 gtccaagtga caaccgttgc cacgcaggct aaaatcagta cgcggccagt taccgtgatt 5400 gccggcccta agacgacctg gtcactgaat gatagtgttg actggtcaac gagtttggca 5460 gcggatggca cgttgctgac agcagcgcag cgccagcggg tgactgtaga tggtaccctg 5520 aacttacggc gggccggcaa ttacccactg acactaagtt acatggaccg tgcgggtaat 5580 ctgattactg tcacgacgag tatcgatgta ttggctagtc aggcccagtt acaagtgcgt 5640 gatagtcagt tgaccgtcgg aaacacttgg gctgctcagg ataatttcga acgtgcaacc 5700 gatgcccagg gccaagcact gacattagct gatatcgcgg tcgatggtac ggtcaacacg 5760 caacgcgctg gccagtacac gttgacttac cgctatacgg atgttgccgg taatcagtta 5820 actaaaacgg ctgtggtgac cgtcgccttg ccggaagatg atcacattaa cacgaccgac 5880 cctgacaaca atgatcatgc aggtatcact aatcctagtg aaacaccgaa gccgagtgag 5940 caacctaacg attcggatgg tcataccgtc gactggggcg ttgatgatcg gattacgaca 6000 aagcaacaac cggccgcggc tactcgtgca cagactaagg tcaagatgac cgctgagcca 6060 gctctaccgg ccaacaatga gcgtactagc gcggccaaag ctgtgacacg agtaactgac 6120 acgactgctg acacactgcc acagacgggc gagcgcgacc gctcagcaca acaaggcgcg 6180 gtagtactcg gattaacggg attattaggg ttaatgggat taggacgtcg gcggcatacg 6240 catgaggatt aa 6252 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lbp11 primer <400> 4 aattgaggca gctggcca 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lbp12 primer <400> 5 gattacggga gtccaagc 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PlanF primer <400> 6 ccgtttatgc ggaacaccta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pREV primer <400> 7 tcgggattac caaacatcac 20

Claims

서열번호 1의 핵산 서열로 구성되는 프라이머 및 서열번호 2의 핵산 서열로 구성되는 프라이머로 이루어진, 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 세포 표면 단백질 전구체 유전자(Cell surface protein precursor gene) 검출용 프라이머 쌍.
제 1항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 상기 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 4079번 내지 4394번으로 이루어진 316bp 핵산 단편 검출용 프라이머 쌍.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 조성물.
1) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 추출된 DNA를 주형으로 하고, 제 1항의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 PCR로 증폭한 결과 생성된 증폭 산물을 검출하는 단계;
를 포함하는, 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 시료는 김치 또는 김치 국물인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를 검출하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 단계 2)의 PCR은 실시간(real-time) PCR인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를 검출하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 실시간 PCR에 의한 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양이 5fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를 검출하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 실시간 PCR에 의한 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출을 위한 최소 세균 세포 현탁액(bacterial cell suspension)양이 4.2 × 10² 내지 4.2 × 10⁸ (CFU/ml)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자를 검출하는 방법.
제 1항의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 프라이머 쌍을 포함하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 키트.
제 9항에 있어서, 상기 키트는 실시간 PCR 용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출을 위한 최소 DNA 양이 5fg(femtogram) 내지 5ng(nanogram)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 키트.
제 9항에 있어서, 상기 키트는 실시간 PCR 용 키트이고, 상기 실시간 PCR에 의한 세포 표면 단백질 전구체 유전자의 검출을 위한 최소 세균 세포 현탁액 양이 4.2 × 10² 내지 4.2 × 10⁸ (CFU/ml)인 것을 특징으로 하는 서열번호 3의 락토바실러스 플란타룸의 세포 표면 단백질 전구체 유전자 검출용 키트.