JPH06141899A - 乳酸菌の高感度検出法 - Google Patents
乳酸菌の高感度検出法Info
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- JPH06141899A JPH06141899A JP4317920A JP31792092A JPH06141899A JP H06141899 A JPH06141899 A JP H06141899A JP 4317920 A JP4317920 A JP 4317920A JP 31792092 A JP31792092 A JP 31792092A JP H06141899 A JPH06141899 A JP H06141899A
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- dna
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- lactobacilli
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 乳酸菌を含む検体より、乳酸菌のＤＮＡを抽
出し、この抽出物をｔＲＮＡを共沈物として用い、エタ
ノール沈澱処理することにより乳酸菌のＤＮＡを回収す
る。このＤＮＡに対して下記の配列群の少なくとも１つ
を有するか又は該配列に対応する相補的配列を有するオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（Polymera
se Chain Reaction）を行い、乳酸菌に特異的な配列を
増幅させたのち、乳酸菌の検出を行う。 ５′−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−
３′ ５′−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−
３′ 【効果】 ビールなどの食品中に含まれる乳酸菌を非常
に高感度、かつ短時間に検出することができる。
出し、この抽出物をｔＲＮＡを共沈物として用い、エタ
ノール沈澱処理することにより乳酸菌のＤＮＡを回収す
る。このＤＮＡに対して下記の配列群の少なくとも１つ
を有するか又は該配列に対応する相補的配列を有するオ
リゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ（Polymera
se Chain Reaction）を行い、乳酸菌に特異的な配列を
増幅させたのち、乳酸菌の検出を行う。 ５′−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−
３′ ５′−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−
３′ 【効果】 ビールなどの食品中に含まれる乳酸菌を非常
に高感度、かつ短時間に検出することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳酸菌の迅速かつ高感
度な検出法に関し、詳しくは食品、特にビールの品質に
悪影響を及ぼすLactobacillus brevisをはじめとする乳
酸菌の検出法に関するものである。
度な検出法に関し、詳しくは食品、特にビールの品質に
悪影響を及ぼすLactobacillus brevisをはじめとする乳
酸菌の検出法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】食品、特
にビール製造において、乳酸菌はその耐酸性と耐アルコ
ール性から最も重要な有害菌である。そのため、ビール
などの食品中から該乳酸菌を迅速かつ高感度に検出する
方法の開発が待望されている。かかる要望に応えるべく
我々は研究を重ね、既に特願平３−１９１１１４号にお
いて、２５０mlのビール中にわずか３０菌体のL. brevi
s を検出することが可能な方法を開示した。しかし、乳
酸菌はわずか１菌体でも製品ビール中に混入すれば、や
がて増殖して混濁を起こす可能性があることを考えれ
ば、さらに高感度な乳酸菌の検出法が望まれる。そこ
で、本発明の目的は、前述の方法を上回る感度の乳酸菌
の検出法を提供することにある。
にビール製造において、乳酸菌はその耐酸性と耐アルコ
ール性から最も重要な有害菌である。そのため、ビール
などの食品中から該乳酸菌を迅速かつ高感度に検出する
方法の開発が待望されている。かかる要望に応えるべく
我々は研究を重ね、既に特願平３−１９１１１４号にお
いて、２５０mlのビール中にわずか３０菌体のL. brevi
s を検出することが可能な方法を開示した。しかし、乳
酸菌はわずか１菌体でも製品ビール中に混入すれば、や
がて増殖して混濁を起こす可能性があることを考えれ
ば、さらに高感度な乳酸菌の検出法が望まれる。そこ
で、本発明の目的は、前述の方法を上回る感度の乳酸菌
の検出法を提供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明は、下記の工程よ
りなる乳酸菌の高感度検出法に関する。（１）乳酸菌を
含む検体をポリカーボネート製メンブランフィルターを
用いて濾過する工程、（２）該フィルターを、揮発性溶
液中で超音波処理を行って乳酸菌をフィルターより遊離
させた後、揮発性溶液を蒸発させる工程、（３）上記工
程で得た検体試料をlysozyme， mutanolysin，proteina
se KおよびＳＤＳで処理することによって乳酸菌のＤＮ
Ａを抽出する工程、（４）上記工程で得た抽出物をtRNA
を共沈物として用い、エタノール沈殿処理することによ
り乳酸菌のＤＮＡを回収する工程、（５）乳酸菌ＤＮＡ
に対して、以下の配列群の少なくとも１つを有するか、
または該配列に対応する相補的配列を有するオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてPolymerase Chain Reactio
n （ＰＣＲ）を行い、乳酸菌に特異的な配列を増幅させ
たのち、乳酸菌の検出を行う工程、 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’……（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’……（ｂ）
りなる乳酸菌の高感度検出法に関する。（１）乳酸菌を
含む検体をポリカーボネート製メンブランフィルターを
用いて濾過する工程、（２）該フィルターを、揮発性溶
液中で超音波処理を行って乳酸菌をフィルターより遊離
させた後、揮発性溶液を蒸発させる工程、（３）上記工
程で得た検体試料をlysozyme， mutanolysin，proteina
se KおよびＳＤＳで処理することによって乳酸菌のＤＮ
Ａを抽出する工程、（４）上記工程で得た抽出物をtRNA
を共沈物として用い、エタノール沈殿処理することによ
り乳酸菌のＤＮＡを回収する工程、（５）乳酸菌ＤＮＡ
に対して、以下の配列群の少なくとも１つを有するか、
または該配列に対応する相補的配列を有するオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてPolymerase Chain Reactio
n （ＰＣＲ）を行い、乳酸菌に特異的な配列を増幅させ
たのち、乳酸菌の検出を行う工程、 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’……（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’……（ｂ）
【０００４】検体中の極少数の微生物の検出をＰＣＲを
用いて行うことを考えた場合、まず初めに検体の容量
（通常は数百ml）をいかに効率よく減らしてＰＣＲにか
けられるような数十μｌという容量にするかということ
が問題となる。そこで、本発明においては、まずポリカ
ーボネート製メンブランフィルターを用いて検体を濾過
し乳酸菌を捕獲する。ここで、フィルターの材質である
ポリカーボネートとしては特に制限はないが、ビスフェ
ノール系のものが好ましい。フィルターは、膜厚が１０
０μ以下、孔径が１μ以下、特に0.６μ以下のものが好
適である。従来は、主に親水性ポリフッ化ビニリデン系
メンブランフィルターが使用されていたが、乳酸菌の回
収率が十分とは言えなかった。ポリカーボネート製メン
ブランフィルターを用いることにより、乳酸菌の回収率
を向上させることができる。
用いて行うことを考えた場合、まず初めに検体の容量
（通常は数百ml）をいかに効率よく減らしてＰＣＲにか
けられるような数十μｌという容量にするかということ
が問題となる。そこで、本発明においては、まずポリカ
ーボネート製メンブランフィルターを用いて検体を濾過
し乳酸菌を捕獲する。ここで、フィルターの材質である
ポリカーボネートとしては特に制限はないが、ビスフェ
ノール系のものが好ましい。フィルターは、膜厚が１０
０μ以下、孔径が１μ以下、特に0.６μ以下のものが好
適である。従来は、主に親水性ポリフッ化ビニリデン系
メンブランフィルターが使用されていたが、乳酸菌の回
収率が十分とは言えなかった。ポリカーボネート製メン
ブランフィルターを用いることにより、乳酸菌の回収率
を向上させることができる。
【０００５】次に、濾過に用いたフィルターを揮発性溶
液中で超音波処理を行って乳酸菌をフィルターより遊離
させる。ここで、揮発性溶液は乳酸菌のＤＮＡに損傷を
与えないようなものであればよく、アルコール系，フェ
ノール系などのヒドロキシル基含有化合物が好適であ
り、特にエタノールが好ましい。揮発性溶液中で超音波
処理を行い菌体をフィルターより遊離させた後、エタノ
ール等の揮発性溶液を蒸発させることにより検体の容量
を短時間で減少させる。
液中で超音波処理を行って乳酸菌をフィルターより遊離
させる。ここで、揮発性溶液は乳酸菌のＤＮＡに損傷を
与えないようなものであればよく、アルコール系，フェ
ノール系などのヒドロキシル基含有化合物が好適であ
り、特にエタノールが好ましい。揮発性溶液中で超音波
処理を行い菌体をフィルターより遊離させた後、エタノ
ール等の揮発性溶液を蒸発させることにより検体の容量
を短時間で減少させる。
【０００６】次に、lysozyme， mutanolysin，proteina
se KおよびＳＤＳを用いることによって検体中より乳酸
菌のＤＮＡを効率よく抽出する。エタノール沈澱処理に
よって乳酸菌のＤＮＡを回収する際に、tRNAを共沈物と
して用いることによって回収率を高めることができる。
se KおよびＳＤＳを用いることによって検体中より乳酸
菌のＤＮＡを効率よく抽出する。エタノール沈澱処理に
よって乳酸菌のＤＮＡを回収する際に、tRNAを共沈物と
して用いることによって回収率を高めることができる。
【０００７】さらに、ＰＣＲの効率を上げる手段とし
て、ゲノム当たり複数個存在することが知られているrR
NA遺伝子由来の配列をプライマーとして用いる。かかる
プライマーとしては、以下の配列群の少なくとも１つを
有するか、または該配列に対応する相補的配列を有する
オリゴヌクレオチドがある。 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’……（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’……（ｂ）
て、ゲノム当たり複数個存在することが知られているrR
NA遺伝子由来の配列をプライマーとして用いる。かかる
プライマーとしては、以下の配列群の少なくとも１つを
有するか、または該配列に対応する相補的配列を有する
オリゴヌクレオチドがある。 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’……（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’……（ｂ）
【０００８】なお、本発明ではＰＣＲを行う際に、Taq
Polymeraseよりも耐熱性と正確さに優れているPfu Poly
meraseを使用することによって、一層効率よくＰＣＲを
行うことができる。ＰＣＲを行って乳酸菌に特異的な配
列を増幅させたのち、乳酸菌の検出を行う。
Polymeraseよりも耐熱性と正確さに優れているPfu Poly
meraseを使用することによって、一層効率よくＰＣＲを
行うことができる。ＰＣＲを行って乳酸菌に特異的な配
列を増幅させたのち、乳酸菌の検出を行う。
【０００９】乳酸菌の検出は、種々の方法により実施す
ることができるが、本発明では例えば上記の酵素反応液
をポリアクリルアミド電気泳動またはアガロース電気泳
動にかけることにより行い、増幅されたヌクレオチド断
片の存在とその長さを確認することができる。その結果
から、検体中にプライマーが認識すべきヌクレオチドが
存在しているか否かを判定できる。判定は、臭化エチジ
ウムによる核酸染色により行う。この判定により、乳酸
菌の有無を判定するのである。増幅されたヌクレオチド
断片の検出には、他の電気泳動やクロマトグラフィーも
有効である。
ることができるが、本発明では例えば上記の酵素反応液
をポリアクリルアミド電気泳動またはアガロース電気泳
動にかけることにより行い、増幅されたヌクレオチド断
片の存在とその長さを確認することができる。その結果
から、検体中にプライマーが認識すべきヌクレオチドが
存在しているか否かを判定できる。判定は、臭化エチジ
ウムによる核酸染色により行う。この判定により、乳酸
菌の有無を判定するのである。増幅されたヌクレオチド
断片の検出には、他の電気泳動やクロマトグラフィーも
有効である。
【００１０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ ＰＣＲ用サンプルの調製 ２５０mlのビールに様々な数の L. brevis JCM1059T を
添加（菌数はコロニーカウント法により測定）した検体
を、ポリカーボネート製メンブレンフィルター（直径４
７mm、膜厚１０μ、孔径0.４μｍ、Millipore 社製、ア
イソポアメンブレン）で吸引濾過した後、該フィルター
を１０ml容のチューブに入れ、５mlのエタノールを添加
する。超音波処理５分、振とう３０分の後、フィルター
を取り除き、チューブ内のエタノールを濃縮遠心機にて
蒸発させた後、検体を１００μｌの滅菌水に溶かす。
る。 実施例１ ＰＣＲ用サンプルの調製 ２５０mlのビールに様々な数の L. brevis JCM1059T を
添加（菌数はコロニーカウント法により測定）した検体
を、ポリカーボネート製メンブレンフィルター（直径４
７mm、膜厚１０μ、孔径0.４μｍ、Millipore 社製、ア
イソポアメンブレン）で吸引濾過した後、該フィルター
を１０ml容のチューブに入れ、５mlのエタノールを添加
する。超音波処理５分、振とう３０分の後、フィルター
を取り除き、チューブ内のエタノールを濃縮遠心機にて
蒸発させた後、検体を１００μｌの滅菌水に溶かす。
【００１１】次に、上記検体溶液に１５０μｌの溶菌液
A〔（1.６７ M sucrose／0.８mg／ml lysozyme／１6.
８μｇ／ml mutanolysin) in １6.７ mM potassium ph
osphate buffer(pH 6.８）〕を添加し、３７℃で３０分
処理した後、１５０μｌの溶菌液 B〔（１3.３mM MgCl2
／2.７％ triton X-100／2.７％ diethyl pyrocarbona
te／0.２７mg／ml proteinase K/ 6.７％ ＳＤＳ）in
１０ mM potassiumphosphate buffer(pH 6.８）〕を
添加し、７０℃で１０分処理して溶菌を行った。その
後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱処
理を行って核酸成分を精製した。なお、エタノール沈澱
処理の際に共沈物として５００ngのtRNAを用いた。この
後、１０μｌの緩衝液（１０mM Tris-HCl (pH 8.０）／
１mM EDTA）に溶かし、これをＰＣＲ用サンプルとし
た。
A〔（1.６７ M sucrose／0.８mg／ml lysozyme／１6.
８μｇ／ml mutanolysin) in １6.７ mM potassium ph
osphate buffer(pH 6.８）〕を添加し、３７℃で３０分
処理した後、１５０μｌの溶菌液 B〔（１3.３mM MgCl2
／2.７％ triton X-100／2.７％ diethyl pyrocarbona
te／0.２７mg／ml proteinase K/ 6.７％ ＳＤＳ）in
１０ mM potassiumphosphate buffer(pH 6.８）〕を
添加し、７０℃で１０分処理して溶菌を行った。その
後、フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱処
理を行って核酸成分を精製した。なお、エタノール沈澱
処理の際に共沈物として５００ngのtRNAを用いた。この
後、１０μｌの緩衝液（１０mM Tris-HCl (pH 8.０）／
１mM EDTA）に溶かし、これをＰＣＲ用サンプルとし
た。
【００１２】プライマーの合成 L. brevisの 5S rRNA遺伝子の配列（Woese, C.R. et a
l.、J. Mol. Evol.8,１４３−１５３（１９７６））か
ら前記した配列(a),(b) を選び、それと同じ配列を持つ
オリゴヌクレオチドを化学合成した。なお、ＤＮＡ合成
および精製は宝酒造株式会社に委託した。
l.、J. Mol. Evol.8,１４３−１５３（１９７６））か
ら前記した配列(a),(b) を選び、それと同じ配列を持つ
オリゴヌクレオチドを化学合成した。なお、ＤＮＡ合成
および精製は宝酒造株式会社に委託した。
【００１３】ＰＣＲ ＰＣＲ用サンプルに、終濃度５００nMのプライマー
（ａ）および（ｂ）、２００μＭのdNTPs および10X Pf
u Polymerase用反応液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加えて全
量を９9.５μｌとした。これを９４℃で５分、４５℃で
５分処理した後、７５℃に温度を維持しつつ1.２５Ｕの
Pfu Polymerase（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添加した。この
後、直ちに以下の条件でＰＣＲを行った。なお、温度制
御はＴＡＩＴＥＣ社製、ＴＲ−１００を用いて行った。
（ａ）および（ｂ）、２００μＭのdNTPs および10X Pf
u Polymerase用反応液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加えて全
量を９9.５μｌとした。これを９４℃で５分、４５℃で
５分処理した後、７５℃に温度を維持しつつ1.２５Ｕの
Pfu Polymerase（ＴＯＹＯＢＯ社製）を添加した。この
後、直ちに以下の条件でＰＣＲを行った。なお、温度制
御はＴＡＩＴＥＣ社製、ＴＲ−１００を用いて行った。
【００１４】熱変性：９４℃、３０秒 アニーリング：４５℃、５秒 重合反応：７５℃、１０秒 以上を１サイクルとして４０サイクル実施
【００１５】検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出する方
法として、縦型の５％ポリアクリルアミド電気泳動（Bi
o-Rad 社製、Mini-PROTEAN II)を行った。ＰＣＲ処理後
の反応液から１０μｌを取り出し、泳動を行った。泳動
は、ＴＢＥ溶液（８９mM Tris／８９mM boric acid/２
mM EDTA (pH 8.０））を用い、３００Ｖで６分行った。
その後、ゲルを臭化エチジウム溶液（0.５μｇ／ml）に
て染色し、紫外線照射によって視覚化した。
法として、縦型の５％ポリアクリルアミド電気泳動（Bi
o-Rad 社製、Mini-PROTEAN II)を行った。ＰＣＲ処理後
の反応液から１０μｌを取り出し、泳動を行った。泳動
は、ＴＢＥ溶液（８９mM Tris／８９mM boric acid/２
mM EDTA (pH 8.０））を用い、３００Ｖで６分行った。
その後、ゲルを臭化エチジウム溶液（0.５μｇ／ml）に
て染色し、紫外線照射によって視覚化した。
【００１６】結果 図１に示したように、ビールに１菌体のL. brevis を添
加した場合、試験した９点中３点が陽性（正解率３３
％）となった。その他の菌数の場合、表１のような結果
となった。
加した場合、試験した９点中３点が陽性（正解率３３
％）となった。その他の菌数の場合、表１のような結果
となった。
【００１７】
【表１】
【００１８】
【発明の効果】本発明の方法によれば、ビールなどの食
品中に含まれる乳酸菌を非常に高感度に検出することが
できる。しかも、本発明の方法に要する時間は、全工程
で約１１時間であり、従来の方法に比べ乳酸菌の検出に
要する時間を大幅に短縮することができる。
品中に含まれる乳酸菌を非常に高感度に検出することが
できる。しかも、本発明の方法に要する時間は、全工程
で約１１時間であり、従来の方法に比べ乳酸菌の検出に
要する時間を大幅に短縮することができる。
【図１】 L. brevis 添加（菌数１個／ビール２５０m
l) 試験結果を示す電気泳動写真である。矢印は、ＰＣ
Ｒによって増幅されたバンドを示し、このバンドが観察
されるものを陽性（＋）、観察されないものを陰性
（−）とした。ＭはＤＮＡサイズマーカーである。
l) 試験結果を示す電気泳動写真である。矢印は、ＰＣ
Ｒによって増幅されたバンドを示し、このバンドが観察
されるものを陽性（＋）、観察されないものを陰性
（−）とした。ＭはＤＮＡサイズマーカーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:225）
Claims (5)
- 【請求項１】 下記の工程よりなる乳酸菌の高感度検出
法。 （１）乳酸菌を含む検体をポリカーボネート製メンブラ
ンフィルターを用いて濾過する工程、（２）該フィルタ
ーを、揮発性溶液中で超音波処理を行って乳酸菌をフィ
ルターより遊離させた後、揮発性溶液を蒸発させる工
程、（３）上記工程で得た検体試料をlysozyme， mutan
olysin，proteinase KおよびＳＤＳで処理することによ
って乳酸菌のＤＮＡを抽出する工程、（４）上記工程で
得た抽出物をtRNAを共沈物として用い、エタノール沈殿
処理することにより乳酸菌のＤＮＡを回収する工程、
（５）乳酸菌ＤＮＡに対して、以下の配列群の少なくと
も１つを有するか、または該配列に対応する相補的配列
を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPolyme
rase Chain Reaction （ＰＣＲ）を行い、乳酸菌に特異
的な配列を増幅させたのち、乳酸菌の検出を行う工程、 ５’−ＴＧＴＧＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＣＣＴＧＡＡ−３’……（ａ） ５’−ＧＣＧＴＧＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＣＴ−３’……（ｂ） - 【請求項２】 揮発性溶液が、エタノールである請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 プライマーが、請求項１記載の各オリゴ
ヌクレオチドの配列のうち、少なくとも連続した１０塩
基以上を含むオリゴヌクレオチドである請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】 ＰＣＲを行う際に、Pfu Polymeraseを使
用する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 乳酸菌の検出を、ポリアクリルアミド電
気泳動またはアガロース電気泳動および臭化エチジウム
による核酸染色により行う請求項１記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4317920A JPH06141899A (ja) | 1992-11-04 | 1992-11-04 | 乳酸菌の高感度検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4317920A JPH06141899A (ja) | 1992-11-04 | 1992-11-04 | 乳酸菌の高感度検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141899A true JPH06141899A (ja) | 1994-05-24 |
Family
ID=18093523
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4317920A Pending JPH06141899A (ja) | 1992-11-04 | 1992-11-04 | 乳酸菌の高感度検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06141899A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0890650A2 (en) * | 1997-07-07 | 1999-01-13 | Asahi Breweries, Ltd. | Oligonucleotides for detecting lactic acid bacteria |
| US6103468A (en) * | 1997-10-07 | 2000-08-15 | Labatt Brewing Company Limited | Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer |
| WO2002012560A1 (en) * | 2000-08-04 | 2002-02-14 | E. & J. Gallo Winery | Method of amplifying nucleic acids of microorganisms present in fruit juice |
| US7183085B1 (en) * | 1999-09-24 | 2007-02-27 | Biotecon Diagnostics Gmbh | Method and nucleic acids for determining the presence of micro-organisms specific to the brewing process |
| WO2013156895A2 (es) * | 2012-04-19 | 2013-10-24 | Universidad De Chile | Método rápido y confiable de identificación de bacterias lácticas en vino |
| JP2019075997A (ja) * | 2017-10-20 | 2019-05-23 | 花王株式会社 | 吸収性物品に移行した微生物から核酸又はタンパク質を抽出する方法 |
-
1992
- 1992-11-04 JP JP4317920A patent/JPH06141899A/ja active Pending
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