JPH07289295A - 乳酸菌の検出または同定方法 - Google Patents
乳酸菌の検出または同定方法Info
- Publication number
- JPH07289295A JPH07289295A JP6092448A JP9244894A JPH07289295A JP H07289295 A JPH07289295 A JP H07289295A JP 6092448 A JP6092448 A JP 6092448A JP 9244894 A JP9244894 A JP 9244894A JP H07289295 A JPH07289295 A JP H07289295A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lactobacillus
- beer
- seq
- sequence
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定
ができない乳酸菌を検出および同定できるＤＮＡ分子、
既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定ができない
乳酸菌を迅速に検出または同定する方法、および、ある
種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を提供する。 【構成】 配列番号１に示される塩基配列の一部または
全部を含む、乳酸菌検出用ＤＮＡ分子；該ＤＮＡ分子ま
たはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮ
Ａ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出または同定する
方法；および配列番号１に示される塩基配列を含む、乳
酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
ができない乳酸菌を検出および同定できるＤＮＡ分子、
既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定ができない
乳酸菌を迅速に検出または同定する方法、および、ある
種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を提供する。 【構成】 配列番号１に示される塩基配列の一部または
全部を含む、乳酸菌検出用ＤＮＡ分子；該ＤＮＡ分子ま
たはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮ
Ａ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出または同定する
方法；および配列番号１に示される塩基配列を含む、乳
酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、乳酸菌の検出に使用で
きるＤＮＡ分子および該ＤＮＡ分子を用いて乳酸菌を検
出する方法に関する。
きるＤＮＡ分子および該ＤＮＡ分子を用いて乳酸菌を検
出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビールの保存に際して、ビール中に混入
した微生物、特にある種の乳酸菌が増殖してビールを混
濁させるなどの有害な作用を呈し、その結果、ビールの
品質が低下することが従来より問題となっている。この
ようなビール有害菌としては、ラクトバチルス ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス カゼイ
（L.casei）などいくつかの乳酸菌が指摘されており、
これらを迅速に検出または同定するための多くの方法が
従来より検討されている。
した微生物、特にある種の乳酸菌が増殖してビールを混
濁させるなどの有害な作用を呈し、その結果、ビールの
品質が低下することが従来より問題となっている。この
ようなビール有害菌としては、ラクトバチルス ブレビ
ス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス カゼイ
（L.casei）などいくつかの乳酸菌が指摘されており、
これらを迅速に検出または同定するための多くの方法が
従来より検討されている。
【０００３】例えば、抗原抗体反応を用いた方法（特開
平4-197167号公報）や、特定のプライマーを用いたＰＣ
Ｒ法を利用する方法（ASBC Journal.51,63(1993)）など
が開発されている。しかしながら、これらの方法は特定
の乳酸菌を検出するための技術であり、他の有害菌の検
出漏れが生じる可能性があった。
平4-197167号公報）や、特定のプライマーを用いたＰＣ
Ｒ法を利用する方法（ASBC Journal.51,63(1993)）など
が開発されている。しかしながら、これらの方法は特定
の乳酸菌を検出するための技術であり、他の有害菌の検
出漏れが生じる可能性があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定ができ
ない乳酸菌を検出または同定するためのＤＮＡ分子を提
供することである。本発明の別の目的は、既知の乳酸菌
検出用プライマーで検出できない乳酸菌を迅速に検出ま
たは同定する方法を提供することである。本発明のさら
なる目的は、ある種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を
提供することである。
は、既知の乳酸菌検出用プライマーで検出や同定ができ
ない乳酸菌を検出または同定するためのＤＮＡ分子を提
供することである。本発明の別の目的は、既知の乳酸菌
検出用プライマーで検出できない乳酸菌を迅速に検出ま
たは同定する方法を提供することである。本発明のさら
なる目的は、ある種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を
提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、既知のプラ
イマーで検出できないある種の乳酸菌の１６Ｓリボゾー
ムＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列を明らか
にし、その一部をプライマーとして試料、特にビール中
に存在しうる有害な微生物の核酸に作用させたところ、
特定の乳酸菌を検出できることを見出し、本発明を完成
させるに至った。すなわち、本発明は、配列番号１に示
される塩基配列の一部または全部を含む、乳酸菌検出用
ＤＮＡ分子を提供する。また、本発明は、前記のＤＮＡ
分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出または同
定する方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号１
に示される塩基配列を含む、乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子を提供する。
イマーで検出できないある種の乳酸菌の１６Ｓリボゾー
ムＲＮＡ（１６ＳｒＲＮＡ）遺伝子の塩基配列を明らか
にし、その一部をプライマーとして試料、特にビール中
に存在しうる有害な微生物の核酸に作用させたところ、
特定の乳酸菌を検出できることを見出し、本発明を完成
させるに至った。すなわち、本発明は、配列番号１に示
される塩基配列の一部または全部を含む、乳酸菌検出用
ＤＮＡ分子を提供する。また、本発明は、前記のＤＮＡ
分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含
むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出または同
定する方法を提供する。さらに、本発明は、配列番号１
に示される塩基配列を含む、乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子を提供する。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
乳酸菌検出用ＤＮＡ分子は、配列番号１に示される塩基
配列の一部または全部を含むものである。ここで、「Ｄ
ＮＡ分子」とは、２個以上のヌクレオチドを含む分子を
いうものとする。配列番号１は、乳酸桿菌Lactobacillu
s sp.DA1 の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示して
いる。上記Lactobacillus sp.DA1 は、ビール工場から
分離された乳酸桿菌であり、工業技術院生命工学工業技
術研究所に平成６年４月22日付けで寄託され、その微生
物受託番号は、FERM BP-4652である。上記塩基配列の中
から任意の箇所を選択することができるが、配列の塩基
数は少なくとも10ｂｐ程度が必要であり、高い検出感度
を得るためには、約15〜約25ｂｐであることが好まし
い。また、菌に対する選択性を上げるためには、配列番
号１に示される塩基配列のうち、可変領域に相当する１
番目から100番目までの塩基配列、特に30番目から100番
目までの塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡ分子が
望ましい。具体例としては、配列番号１に示される塩基
配列のうち40番目から57番目までの塩基配列（配列番号
２に示す。）を含むＤＮＡ分子が挙げられる。
乳酸菌検出用ＤＮＡ分子は、配列番号１に示される塩基
配列の一部または全部を含むものである。ここで、「Ｄ
ＮＡ分子」とは、２個以上のヌクレオチドを含む分子を
いうものとする。配列番号１は、乳酸桿菌Lactobacillu
s sp.DA1 の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示して
いる。上記Lactobacillus sp.DA1 は、ビール工場から
分離された乳酸桿菌であり、工業技術院生命工学工業技
術研究所に平成６年４月22日付けで寄託され、その微生
物受託番号は、FERM BP-4652である。上記塩基配列の中
から任意の箇所を選択することができるが、配列の塩基
数は少なくとも10ｂｐ程度が必要であり、高い検出感度
を得るためには、約15〜約25ｂｐであることが好まし
い。また、菌に対する選択性を上げるためには、配列番
号１に示される塩基配列のうち、可変領域に相当する１
番目から100番目までの塩基配列、特に30番目から100番
目までの塩基配列の一部または全部を含むＤＮＡ分子が
望ましい。具体例としては、配列番号１に示される塩基
配列のうち40番目から57番目までの塩基配列（配列番号
２に示す。）を含むＤＮＡ分子が挙げられる。
【０００７】上記のような塩基配列を含むＤＮＡ分子ま
たは該ＤＮＡ分子の塩基配列に対して相補的な塩基配列
を含むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出する
ことができる。上記ＤＮＡ分子あるいは上記ＤＮＡ分子
の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子
は、ABI Model 392 and 394 DNA/RNA Synthesizer 操作
説明書等に記載の公知の方法に従い化学合成によって作
成することができる。
たは該ＤＮＡ分子の塩基配列に対して相補的な塩基配列
を含むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出する
ことができる。上記ＤＮＡ分子あるいは上記ＤＮＡ分子
の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子
は、ABI Model 392 and 394 DNA/RNA Synthesizer 操作
説明書等に記載の公知の方法に従い化学合成によって作
成することができる。
【０００８】試料中の乳酸菌の検出または同定のために
は、上記ＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的
な塩基配列を含むＤＮＡ分子を放射性元素、蛍光色素等
で標識した後、これをプローブとして試料中に存在する
微生物の核酸とハイブリダイズさせるハイブリダイゼー
ション法、これらのＤＮＡ分子をプライマーとして用い
て、試料中に存在する微生物の核酸を増幅する方法を利
用することができるが、検出感度の面からは後者の方法
を利用することが好ましい。
は、上記ＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的
な塩基配列を含むＤＮＡ分子を放射性元素、蛍光色素等
で標識した後、これをプローブとして試料中に存在する
微生物の核酸とハイブリダイズさせるハイブリダイゼー
ション法、これらのＤＮＡ分子をプライマーとして用い
て、試料中に存在する微生物の核酸を増幅する方法を利
用することができるが、検出感度の面からは後者の方法
を利用することが好ましい。
【０００９】以下に、本発明の検出または同定方法の一
例について説明するが、この方法は、上記ＤＮＡ分子ま
たはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮ
Ａ分子をプライマーとして用いて、試料中に存在する微
生物の核酸を増幅する工程を含むものである。まず、試
料から、メンブレン濾過等の方法で微生物を分離する。
試料としては、製品ビール、熟成前の若ビール、回収酵
母等の全ての醸造工程サンプル等を挙げることができ
る。分離した微生物からそのまま、あるいは、分離した
後さらに培養増殖させてから、核酸を抽出する。核酸
は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッ
ド、およびこれらの混合物のいずれであってもよいが、
ＤＮＡであることが好ましい。また、この核酸は、二本
鎖および一本鎖のいずれであってもよいが、二本鎖であ
ることが好ましい。ＰＣＲ法を用いれば微量のサンプル
でも検出できるので、例えば菌体数が少なくとも20個で
あれば十分検出可能である。
例について説明するが、この方法は、上記ＤＮＡ分子ま
たはその塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮ
Ａ分子をプライマーとして用いて、試料中に存在する微
生物の核酸を増幅する工程を含むものである。まず、試
料から、メンブレン濾過等の方法で微生物を分離する。
試料としては、製品ビール、熟成前の若ビール、回収酵
母等の全ての醸造工程サンプル等を挙げることができ
る。分離した微生物からそのまま、あるいは、分離した
後さらに培養増殖させてから、核酸を抽出する。核酸
は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッ
ド、およびこれらの混合物のいずれであってもよいが、
ＤＮＡであることが好ましい。また、この核酸は、二本
鎖および一本鎖のいずれであってもよいが、二本鎖であ
ることが好ましい。ＰＣＲ法を用いれば微量のサンプル
でも検出できるので、例えば菌体数が少なくとも20個で
あれば十分検出可能である。
【００１０】微生物からの核酸の抽出方法としては、従
来知られているいかなる方法を用いても良く、例えば、
微生物をガラスビーズで粉砕した後、フェノール／クロ
ロホルムで抽出する方法、溶菌酵素処理による抽出方
法、オートクレーブにて溶菌後抽出する方法、界面活性
剤処理による抽出方法などを用いることができる。本発
明の上記のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補
的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成るプライマー、お
よび、少なくとも１種のユニバーサルプライマーを用い
て、抽出された核酸をＰＣＲ法により増幅する。プライ
マーは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよいが、
ＰＣＲ法による核酸の増幅効率を上げるためには、一本
鎖であることが好ましい。また、プライマーが二本鎖で
ある場合には、ＰＣＲ法に使用する前にその鎖を分離す
る処理を行うことが好ましい。ユニバーサルプライマー
は全ての細菌に共通な配列を有するプライマーであり、
その一例として、Nucleic Acid Techniques in Bacteri
al Systematics JohnWiley & Sons Ltd.(1991)P.133 の
ＴＡＢＬＥ６．３に記載の１６ＳｒＲＮＡシークエンシ
ングプライマーを挙げることができるが、それに限定さ
れることはない。下記の表１に、上記文献のＴＡＢＬＥ
６．３に記載の１６ＳｒＲＮＡシークエンシングプライ
マーの一部を示す。本発明のＤＮＡ分子またはその塩基
配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成
るプライマー、および、ユニバーサルプライマーの組み
合わせは、一方がセンスプライマーで他方がアンチセン
スプライマーであるような組み合わせであればよく、例
えば、配列番号１に示す１〜100番目の塩基配列の中か
らセンスプライマーを設定し、表１に示したユニバーサ
ルプライマーのアンチセンスプライマーと組み合わせる
ことができる。このうち、配列番号２に示す塩基配列を
含むＤＮＡ分子と９０７ｒとの組み合わせが好ましい。
来知られているいかなる方法を用いても良く、例えば、
微生物をガラスビーズで粉砕した後、フェノール／クロ
ロホルムで抽出する方法、溶菌酵素処理による抽出方
法、オートクレーブにて溶菌後抽出する方法、界面活性
剤処理による抽出方法などを用いることができる。本発
明の上記のＤＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補
的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成るプライマー、お
よび、少なくとも１種のユニバーサルプライマーを用い
て、抽出された核酸をＰＣＲ法により増幅する。プライ
マーは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよいが、
ＰＣＲ法による核酸の増幅効率を上げるためには、一本
鎖であることが好ましい。また、プライマーが二本鎖で
ある場合には、ＰＣＲ法に使用する前にその鎖を分離す
る処理を行うことが好ましい。ユニバーサルプライマー
は全ての細菌に共通な配列を有するプライマーであり、
その一例として、Nucleic Acid Techniques in Bacteri
al Systematics JohnWiley & Sons Ltd.(1991)P.133 の
ＴＡＢＬＥ６．３に記載の１６ＳｒＲＮＡシークエンシ
ングプライマーを挙げることができるが、それに限定さ
れることはない。下記の表１に、上記文献のＴＡＢＬＥ
６．３に記載の１６ＳｒＲＮＡシークエンシングプライ
マーの一部を示す。本発明のＤＮＡ分子またはその塩基
配列に対して相補的な塩基配列を含むＤＮＡ分子から成
るプライマー、および、ユニバーサルプライマーの組み
合わせは、一方がセンスプライマーで他方がアンチセン
スプライマーであるような組み合わせであればよく、例
えば、配列番号１に示す１〜100番目の塩基配列の中か
らセンスプライマーを設定し、表１に示したユニバーサ
ルプライマーのアンチセンスプライマーと組み合わせる
ことができる。このうち、配列番号２に示す塩基配列を
含むＤＮＡ分子と９０７ｒとの組み合わせが好ましい。
【００１１】
【表１】
【００１２】ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼは95
℃の耐熱性を有するものであればその起源は問わない。
ＰＣＲ法の反応条件として、変性温度は90〜95℃、アニ
ーリング温度は40〜60℃、伸長温度は70〜75℃、サイク
ル数10回以上が好ましいが、これに限定されず、通常Ｐ
ＣＲ法に使用できる条件であればよい。得られた反応生
成物は、アガロースゲルを用いた電気泳動法等の検出ま
たは同定手段により分離され、増幅産物の有無が確認さ
れる。このような方法により、乳酸桿菌 Lactobacillus
sp. DA1、Lactobacillus sp. BG2 、Lactobacillus s
p. SE3 と同等な性質、つまり、ビール中で増殖するに
もかかわらず、ブレビス等の既知のビール有害乳酸菌プ
ライマーでは検出されない性質の乳酸桿菌を検出または
同定することができる。これらの乳酸桿菌は、ビール混
濁能を有するものであることがわかっている。従って、
本発明の方法により、ビール中に存在する有害な菌を検
出または同定することが可能となる。
℃の耐熱性を有するものであればその起源は問わない。
ＰＣＲ法の反応条件として、変性温度は90〜95℃、アニ
ーリング温度は40〜60℃、伸長温度は70〜75℃、サイク
ル数10回以上が好ましいが、これに限定されず、通常Ｐ
ＣＲ法に使用できる条件であればよい。得られた反応生
成物は、アガロースゲルを用いた電気泳動法等の検出ま
たは同定手段により分離され、増幅産物の有無が確認さ
れる。このような方法により、乳酸桿菌 Lactobacillus
sp. DA1、Lactobacillus sp. BG2 、Lactobacillus s
p. SE3 と同等な性質、つまり、ビール中で増殖するに
もかかわらず、ブレビス等の既知のビール有害乳酸菌プ
ライマーでは検出されない性質の乳酸桿菌を検出または
同定することができる。これらの乳酸桿菌は、ビール混
濁能を有するものであることがわかっている。従って、
本発明の方法により、ビール中に存在する有害な菌を検
出または同定することが可能となる。
【００１３】さらに、本発明の検出または同定方法を従
来の検出または同定方法と組み合わせることにより、乳
酸菌、特に、ビール混濁能を有する乳酸菌をより完全に
検出または同定することができる。次に本発明を実施例
を用いて具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限
定されるものではない。
来の検出または同定方法と組み合わせることにより、乳
酸菌、特に、ビール混濁能を有する乳酸菌をより完全に
検出または同定することができる。次に本発明を実施例
を用いて具体的に説明するが、本発明の範囲はこれに限
定されるものではない。
【００１４】
〔実施例１〕乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1、sp. BG
2 およびsp. SE3 の調製 市販のビールあるいはビール工場から分離されたヘテロ
型発酵乳酸菌のうち、ビール中で増殖可能で、かつ、抗
Lactobacillus brevis JCM1170 血清による抗原抗体反
応（特開平4-72570号公報）において反応しない菌株３
種を選び、Lactobacillus sp. DA1（以下、「ＤＡ１
菌」と記す）、sp. BG2（以下、「ＢＧ２菌」と記す）
およびsp. SE3（以下、「ＳＥ３菌」と記す）とした。
2 およびsp. SE3 の調製 市販のビールあるいはビール工場から分離されたヘテロ
型発酵乳酸菌のうち、ビール中で増殖可能で、かつ、抗
Lactobacillus brevis JCM1170 血清による抗原抗体反
応（特開平4-72570号公報）において反応しない菌株３
種を選び、Lactobacillus sp. DA1（以下、「ＤＡ１
菌」と記す）、sp. BG2（以下、「ＢＧ２菌」と記す）
およびsp. SE3（以下、「ＳＥ３菌」と記す）とした。
【００１５】〔実施例２〕ＤＡ１菌の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列の決定 例１で調製したＤＡ１菌を乳酸菌検出培地Ｍ−ＮＢＢ培
地（MBAA Technical Quarterly, 22, 61 (1985))で４日
間、25℃で培養した。菌体培養液１ｍｌを1.5ｍｌ容サ
ンプルチューブに入れ、遠心分離をおこなった。沈殿を
回収することにより菌体を集菌した後、滅菌蒸留水100
μｌで２回洗浄した。菌体を滅菌蒸留水100μｌに懸濁
させ、150μｌのフェノール：クロロホルム（１：１）
（以下、「Ｐ／Ｃ」と記す。）と0.4ｇのガラスビーズ
（粒径106μｍ以下）の入った1.5ｍｌ容サンプルチュー
ブに加えて、ミキサーで１分間攪拌した。遠心分離し
て、水層を別チューブに移し、100μｌのＰ／Ｃで再抽
出し、水層を得て、これをＤＮＡ抽出液とした。
伝子の塩基配列の決定 例１で調製したＤＡ１菌を乳酸菌検出培地Ｍ−ＮＢＢ培
地（MBAA Technical Quarterly, 22, 61 (1985))で４日
間、25℃で培養した。菌体培養液１ｍｌを1.5ｍｌ容サ
ンプルチューブに入れ、遠心分離をおこなった。沈殿を
回収することにより菌体を集菌した後、滅菌蒸留水100
μｌで２回洗浄した。菌体を滅菌蒸留水100μｌに懸濁
させ、150μｌのフェノール：クロロホルム（１：１）
（以下、「Ｐ／Ｃ」と記す。）と0.4ｇのガラスビーズ
（粒径106μｍ以下）の入った1.5ｍｌ容サンプルチュー
ブに加えて、ミキサーで１分間攪拌した。遠心分離し
て、水層を別チューブに移し、100μｌのＰ／Ｃで再抽
出し、水層を得て、これをＤＮＡ抽出液とした。
【００１６】図１に示した３つのフラグメントＡ、Ｂお
よびＣを増幅するために、細菌に共通なユニバーサルプ
ライマー（表１参照）を３対（Ａ．２７ｆ（配列番号
３）−９０７ｒ（配列番号４）、Ｂ．５３０ｆ（配列番
号５）−１３９２ｒ（配列番号６）、およびＣ．１１１
４ｆ（配列番号７）−１５２５ｒ（配列番号８））用意
した。ＰＣＲ法はGene Amp PCR reagent kit（パーキン
エルマー シータス社製）を用いて表２の反応液組成
でおこなった。反応は、サーマルサイクラーモデル480
（パーキン エルマー シータス社製）中で、変性を94
℃、１分間、アニーリングを50℃、１分間、伸長を72
℃、１分間順次おこなう工程を25サイクル繰り返すこと
により行った。
よびＣを増幅するために、細菌に共通なユニバーサルプ
ライマー（表１参照）を３対（Ａ．２７ｆ（配列番号
３）−９０７ｒ（配列番号４）、Ｂ．５３０ｆ（配列番
号５）−１３９２ｒ（配列番号６）、およびＣ．１１１
４ｆ（配列番号７）−１５２５ｒ（配列番号８））用意
した。ＰＣＲ法はGene Amp PCR reagent kit（パーキン
エルマー シータス社製）を用いて表２の反応液組成
でおこなった。反応は、サーマルサイクラーモデル480
（パーキン エルマー シータス社製）中で、変性を94
℃、１分間、アニーリングを50℃、１分間、伸長を72
℃、１分間順次おこなう工程を25サイクル繰り返すこと
により行った。
【００１７】
【表２】
【００１８】増幅された断片を0.7％アガロースゲルで
電気泳動した後切り出し、ＤＮＡＣＥＬＬ（第１科学薬
品社製）を用いてゲルから溶出させた。ゲルから溶出さ
せた断片をＰ／Ｃで抽出し、エタノール沈殿により得ら
れたＤＮＡを精製ＤＮＡテンプレートとした。次に、Ａ
ＬＦ ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア社製）を用
い、ＦＩＴＣで蛍光標識したユニバーサルプライマー
（表１参照）を適宜使用して、常法に従い、Ｄｙｅプラ
イマー法によるジデオキシ法により、得られたＤＮＡの
配列決定をおこなった。ジデオキシ法はAuto Cycle Seq
uencing Kit(ファルマシア社製）を用いておこなった。
反応液組成、反応条件は表３に 示す。なお、反応はサ
ーマルサイクラー480中でおこなった。
電気泳動した後切り出し、ＤＮＡＣＥＬＬ（第１科学薬
品社製）を用いてゲルから溶出させた。ゲルから溶出さ
せた断片をＰ／Ｃで抽出し、エタノール沈殿により得ら
れたＤＮＡを精製ＤＮＡテンプレートとした。次に、Ａ
ＬＦ ＤＮＡシーケンサー（ファルマシア社製）を用
い、ＦＩＴＣで蛍光標識したユニバーサルプライマー
（表１参照）を適宜使用して、常法に従い、Ｄｙｅプラ
イマー法によるジデオキシ法により、得られたＤＮＡの
配列決定をおこなった。ジデオキシ法はAuto Cycle Seq
uencing Kit(ファルマシア社製）を用いておこなった。
反応液組成、反応条件は表３に 示す。なお、反応はサ
ーマルサイクラー480中でおこなった。
【００１９】
【表３】
【００２０】得られた塩基配列を、配列番号１、並び
に、図２〜４に示す。比較のために、キリンビール
（株）ビール研究所で決定されたラクトバチルス ブレ
ビス Ｌ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列
番号９、並びに、図２〜４に示す。図２〜４は、ＤＡ１
菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（上段に示す）お
よびラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ
遺伝子の塩基配列（下段に示す）を比較したものであ
る。図２〜４中、線で結んだ部分は、ＤＡ１菌とラクト
バチルス ブレビスＬ６３との間で相同性のある配列部
分である。
に、図２〜４に示す。比較のために、キリンビール
（株）ビール研究所で決定されたラクトバチルス ブレ
ビス Ｌ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列
番号９、並びに、図２〜４に示す。図２〜４は、ＤＡ１
菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（上段に示す）お
よびラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ
遺伝子の塩基配列（下段に示す）を比較したものであ
る。図２〜４中、線で結んだ部分は、ＤＡ１菌とラクト
バチルス ブレビスＬ６３との間で相同性のある配列部
分である。
【００２１】図２〜４からわかるように、ＤＡ１菌の１
６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、全体にわたってラク
トバチルス ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配
列と異なっている。特に上流100ｂｐまではかなり異な
っている。ラクトバチルス属においては５’末端近辺が
可変領域であることが知られている（System Appl. Mic
robiol.15,123(1992) ）。そこで、ＤＡ１菌の１〜100
ｂｐまでの領域について、ジーンバンクに納めれている
塩基配列とのホモロジーサーチをおこなったところ、90
％以上のマッチングを示すＤＮＡは存在しなかった。従
来の、例えばラクトバチルス ブレビスをターゲットに
したプライマーはこの領域の配列を利用したものであり
（例えば、前記ASBC Journalに記載のプライマー（配列
番号10））、そのプライマーを用いても本菌を検出でき
ないことが予想される。そのほかの既知の乳酸菌検出用
プライマーについても同様である。
６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、全体にわたってラク
トバチルス ブレビスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配
列と異なっている。特に上流100ｂｐまではかなり異な
っている。ラクトバチルス属においては５’末端近辺が
可変領域であることが知られている（System Appl. Mic
robiol.15,123(1992) ）。そこで、ＤＡ１菌の１〜100
ｂｐまでの領域について、ジーンバンクに納めれている
塩基配列とのホモロジーサーチをおこなったところ、90
％以上のマッチングを示すＤＮＡは存在しなかった。従
来の、例えばラクトバチルス ブレビスをターゲットに
したプライマーはこの領域の配列を利用したものであり
（例えば、前記ASBC Journalに記載のプライマー（配列
番号10））、そのプライマーを用いても本菌を検出でき
ないことが予想される。そのほかの既知の乳酸菌検出用
プライマーについても同様である。
【００２２】〔実施例３〕 配列番号２の塩基配列を有
するプライマーの製造 配列番号１に示される塩基配列のうち40番目から57番目
までの塩基配列を有するプライマーをABI DNA シンセサ
イザーモデル392 を用いて合成した。得られたプライマ
ーの塩基配列を配列番号２に示す。
するプライマーの製造 配列番号１に示される塩基配列のうち40番目から57番目
までの塩基配列を有するプライマーをABI DNA シンセサ
イザーモデル392 を用いて合成した。得られたプライマ
ーの塩基配列を配列番号２に示す。
【００２３】〔実施例４〕 配列番号２の塩基配列を有
するプライマーを用いた乳酸菌の検出および同定 ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳＥ３菌、ラクトバチルス
ブレビス(JCM1170) 、カゼイ(ATCC25303) 、ファーメン
タム(JCM1560) およびプランタラム(JCM1149)（これら
の菌と同じ種に分類される菌の中に、ビール混濁能を有
するものが存在することが報告されている）の各菌をＭ
−ＮＢＢ培地で、２〜14日間、25℃で培養した。培養液
を例２と同様の方法で処理して、ＤＮＡ抽出液を得た。
これについて、例３で製造したプライマー（配列番号
２）およびユニバーサルプライマー９０７ｒ（配列番号
４）を用いてＰＣＲ法をおこなった。反応条件は例２と
同様であった。得られた反応生成物をアガロースゲルに
よる電気泳動（150Ｖ，１時間）に供した。
するプライマーを用いた乳酸菌の検出および同定 ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳＥ３菌、ラクトバチルス
ブレビス(JCM1170) 、カゼイ(ATCC25303) 、ファーメン
タム(JCM1560) およびプランタラム(JCM1149)（これら
の菌と同じ種に分類される菌の中に、ビール混濁能を有
するものが存在することが報告されている）の各菌をＭ
−ＮＢＢ培地で、２〜14日間、25℃で培養した。培養液
を例２と同様の方法で処理して、ＤＮＡ抽出液を得た。
これについて、例３で製造したプライマー（配列番号
２）およびユニバーサルプライマー９０７ｒ（配列番号
４）を用いてＰＣＲ法をおこなった。反応条件は例２と
同様であった。得られた反応生成物をアガロースゲルに
よる電気泳動（150Ｖ，１時間）に供した。
【００２４】その結果、ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳＥ
３菌のみに約900ｐｂｓのバンドが検出された。
３菌のみに約900ｐｂｓのバンドが検出された。
【００２５】〔比較例１〕ＤＡ１菌、ＢＧ２菌およびＳ
Ｅ３菌のＤＮＡ抽出液について、配列表２の塩基配列を
有するプライマーの代わりに、ブレビス特異プライマー
（配列番号10）、カゼイ特異プライマー（配列番号1
1）、ファーメンタム特異プライマー（配列番号12）、
プランタラム特異プライマー（配列番号13）を用いてＰ
ＣＲ法を行ったほかは、例４の手順を繰り返した。ここ
で、いずれのプライマーもＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイ
ザーで合成した。
Ｅ３菌のＤＮＡ抽出液について、配列表２の塩基配列を
有するプライマーの代わりに、ブレビス特異プライマー
（配列番号10）、カゼイ特異プライマー（配列番号1
1）、ファーメンタム特異プライマー（配列番号12）、
プランタラム特異プライマー（配列番号13）を用いてＰ
ＣＲ法を行ったほかは、例４の手順を繰り返した。ここ
で、いずれのプライマーもＡＢＩ社製ＤＮＡシンセサイ
ザーで合成した。
【００２６】その結果、どのプライマーを用いた場合に
も、バンドは確認できなかった。従って、配列番号２の
塩基配列を有するプライマーを用いることにより、既知
のプライマーを用いても検出や同定ができないある種の
乳酸菌を検出および同定することができることが明らか
となった。
も、バンドは確認できなかった。従って、配列番号２の
塩基配列を有するプライマーを用いることにより、既知
のプライマーを用いても検出や同定ができないある種の
乳酸菌を検出および同定することができることが明らか
となった。
【００２７】
【発明の効果】本発明により、既知の乳酸菌検出用プラ
イマーで検出や同定ができない乳酸菌を検出および同定
できるＤＮＡ分子が提供された。また、本発明により、
従来の方法では検出できない乳酸菌を迅速に検出または
同定することができるようになった。さらに、本発明に
より、ある種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が提供さ
れた。
イマーで検出や同定ができない乳酸菌を検出および同定
できるＤＮＡ分子が提供された。また、本発明により、
従来の方法では検出できない乳酸菌を迅速に検出または
同定することができるようになった。さらに、本発明に
より、ある種の乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子が提供さ
れた。
【００２８】
配列番号：１ 配列の長さ：１４７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：乳酸菌 株名：Lactobacillus sp. DA1 配列 CGTTGGCGGC GTGCCTAAAT AACATGCAAG TCGAACGAGG TCTCCTAACT GATAGCTGGT 60 GCTTGCATCA GCTTGACGAT AGATCTGACC GAGTGGCGAA CTGGTGAGTA ACACGTGGGT 120 AACCTGCCCA GAAGAAGGGG ATAACACCTG GAAACAGATG CTAATACCGT ATAACAACGA 180 GAACCACATG GTTCTCGTTT GAAAGATGGC TTTTATGCTA TCGCTTCTGG ATGGACCCGC 240 GGCGTATTAG CTAGTTGGTG AGATAATAGC TCACCAAGGC AATGATACGT AGCAGACCTG 300 AGAGGGTAAT CTGCCACAAT GGGACTGAGA CACGGCCCAT ACTCCTACGG GAGGCAGCAG 360 TAGGGAATCT TCCACAATGG ACGAAAGTCT GATGGAGCAA CGCCGCGTGA GTGAAGAAGG 420 GTTTCGGCTC GTAAAACTCT GTTGTTAGAG AAGAACGACC GTGAGAGCAA CTGCTCACGG 480 TGTGACGGTA TCTAACCAGA AAGTCACGGC TAACTACGTG CCAGCAGCCG CGGTAATACG 540 TAGGTGGCAA ACGTTGTCCG GATTTATTGG GCGTAAAGCG AGCGCAGGCG GTTTTCTAAG 600 TCTGATGTTG AAACTTCGGC TTAACCGGAG AAGTGCATCG GAAACTGGAT AACTTGAGTG 660 CAGAAAAGGA CAGTGGAACT TCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGATATA TGAAGGAACA 720 CCAGTGGCGA AGGCGGCTGT CTGGTCTGCA TCTGACGCTG AGGCTCGAAA GCATGGGTAG 780 CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAT GCCGTAAACG ATGAATGCTA GGTGTTGGGA 840 GGTTTCCGCC TCTCAGTGCC GCAGCTAACG CATTAAGCAT TCCGCCTGGG GAGTACGACC 900 GCAAGGTTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG GACCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT 960 AATTCGATGC TACGCGAAGA ACCTTACCAG GACTTGACAT CTTCTGTTAA CCTAAGAGAT 1020 TAGGTGTCCC CTTCGGGGGC AGAATGACAG GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG 1080 TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTG TCTTTAGTTG CCAGCATTAA 1140 GTTGGGCACT CTAGAGAGAC TGCCGGTGAT AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA 1200 TCATCATGCC CCTTATGTCC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACGGTA CAACGAGTTG 1260 CGAAACCGCA AGGTCAAGCT AATCTCTTAA AGCCGTTCTC AGTTCGGATT GCAGGCTGCA 1320 ACTCGCCTGC ATGAAGTTGG AATCGCTAGT AATCGTGGAT CAGCATGCCA CGGTGAATAC 1380 GTTCCCGGGT CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGAGA GTTTGTAACA CCCAAAGTCG 1440 GTTGGATAAC CTTTACGGAG TCCGCCGCCT AAGGT 1475
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＴＣＴＣＣＴＡＡＣ ＴＧＡＴＡＧＣＴ １８
【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＡＧＡＧＴＴＴＴＧＡ ＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ Ｇ ２１
【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣ ＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴ １０
【００３２】配列番号：５ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧ ＡＡＧＡＧＧ １６
【００３３】配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧ ＴＧＴＡＣ １５
【００３４】配列番号：７ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧ ＣＡＡＣＣＣ １６
【００３５】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡ ＴＣＣＡＧＣＣ １７
【００３６】配列番号：９ 配列の長さ：１５０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ラクトバチルス ブレビス 株名：Ｌ６３ 配列 GGCATGCCTA ATACATGCAA GTCGAACGAG CTTCCGTTGA ATGACGTGCT TGCACTGATT 60 TCACCAATGA AGCGAGTGGC GAACTGGTGA GTAACACGTG GGAAATCTGC CCAGAAGCAG 120 GGGATAACAC TTGGAAACAG GTGCTAATAC CGTATAACAA CAAAATCCGC ATGGATTTTG 180 TTTGAAAGGT GGCTTCGGCT ATCACTTCTG GATGATCCCG CGGCGTATTA GTTAGTTGGT 240 GAGGTAAAGG CCCACCAAGA CGATGATACG TAGCCGACCT GAGAGGGTAA TCGGCCACAT 300 TGGGACTGAG ACACGGCCCA AACTCCTACG GGAGGCAGCA GTAGGGAATC TTCCACAATG 360 GACGAAAGTC TGATGGAGCA ATGCCGCGTG AGTGAAGAAG GGTTTCGGCT CGTAAAACTC 420 TGTTGTTAAA GAAGAACACC TTTGAGAGTA ACTGTTCAAG GGTTGACGGT ATTTAACCAG 480 AAAGCCACGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGTGGCA AGCGTTGTCC 540 GGATTTATTG GGCGTAAAGC GAGCGCAGGC GGTTTTTTAA GTCTGATGTG AAAGCCTTCG 600 GCTTAACCGG AGAAGTGCAT CGGAAACTGG GAGACTTGAG TGCAGAAGAG GACAGTGGAA 660 CTCCATGTGT AGCGGTGGAA TGCGTAGATA TATGGAAGAA CACCAGTGGC GAAGGCGGCT 720 GTCTAGTCTG TAACTGACGC TGAGGCTCGA AAGCATGGGT AGCGAACAGG ATTAGATACC 780 CTGGTAGTCC ATGCCGTAAA CGATGAGTGC TAAGTGTTGG AGGGTTTCCG CCCTTCAGTG 840 CTGCAGCTAA CGCATTAAGC ACTCCGCCTG GGGAGTACGA CCGCAAGGTT GAAACTCAAA 900 GGAATTGACG GGGGCCCGCA CAAGCGGTGG AGCATGTGGT TTAATTCGAA GCTACGCGAA 960 GAACCTTACC AGGTCTTGAC ATCTTCTGCC AATCTTAGAG ATAAGACGTT CCCTTCGGGG 1020 ACAGAATGAC AGGTGGTGCA TGGTTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT TGGGTTAAGT 1080 CCCGCAACGA GCGCAACCCT TATTATCAGT TGCCAGCATT CAGTTGGGCA CTCTGGTGAG 1140 ACTGCCGGTG ACAAACCGGA GGAAGGTGGG GATGACGTCA AATCATCATG CCCCTTATGA 1200 CCTGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGACGG TACAACGAGT CGCGAAGTCG TGAGGCTAAG 1260 CTAATCTCTT AAAGCCGTTC TCAGTTCGGA TTGTAGGCTG CAACTCGCCT ACATGAAGTT 1320 GGAATCGCTA GTAATCGCGG ATCAGCATGC CGCGGTGAAT ACGTTCCCGG GCCTTGTACA 1380 CACCGCCCGT CACACCATGA GAGTTTGTAA CACCCAAAGC CGGTGAGATA ACCTTCGGGA 1440 GTCAGCCGTC TAAGGTGGGA CAGATGATTA GGGTGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTAGGA 1500 GAA 1503
【００３７】配列番号：１０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧ ＡＧＣＴＴＣＣ １７
【００３８】配列番号：１１ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧ ＧＴＣＧＧＣ １６
【００３９】配列番号：１２ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＡＡＴＣＡＡＴＴＧ ＧＧＣＣＡＡＣＧＣＧ Ｔ １１
【００４０】配列番号：１３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＴＡＣＣＣＧＣＡＴＡ ＡＣＡＡＣＴＴＧＧ １９
【図１】図１は、１６ＳｒＤＮＡ；ユニバーサルプライ
マー２７ｆおよび９０７ｒを用いて増幅される断片Ａ；
ユニバーサルプライマー５３０ｆおよび１３９２ｒを用
いて増幅される断片Ｂ；およびユニバーサルプライマー
１１４ｆおよび１５２５ｒを用いて増幅される断片Ｃの
模式図である。
マー２７ｆおよび９０７ｒを用いて増幅される断片Ａ；
ユニバーサルプライマー５３０ｆおよび１３９２ｒを用
いて増幅される断片Ｂ；およびユニバーサルプライマー
１１４ｆおよび１５２５ｒを用いて増幅される断片Ｃの
模式図である。
【図２】図２は、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1およ
びラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を比較したものである。
びラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を比較したものである。
【図３】図３は、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1およ
びラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を比較したもの（図２の続き）である。
びラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を比較したもの（図２の続き）である。
【図４】図４は、乳酸桿菌 Lactobacillus sp. DA1およ
びラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を比較したもの（図３の続き）である。
びラクトバチルス ブレビスＬ６３の１６ＳｒＲＮＡ遺
伝子の塩基配列を比較したもの（図３の続き）である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:24） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:245） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:25） Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:24） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:245） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:25）
Claims (7)
- 【請求項１】 配列番号１に示される塩基配列の一部ま
たは全部を含む、乳酸菌検出用ＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 配列番号１に示される塩基配列のうち１
番目から100番目までの塩基配列の一部または全部を含
む、請求項１記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 配列番号１に示される塩基配列のうち少
なくとも40番目から57番目までの塩基配列を含む、請求
項２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＤ
ＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列
を含むＤＮＡ分子を用いて、試料中の乳酸菌を検出また
は同定する方法。 - 【請求項５】 請求項１ないし３のいずれかに記載のＤ
ＮＡ分子またはその塩基配列に対して相補的な塩基配列
を含むＤＮＡ分子から成るプライマー、および、少なく
とも１種のユニバーサルプライマーを用いて、試料中に
存在する微生物の核酸を増幅する工程を含む、請求項４
記載の方法。 - 【請求項６】 検出すべき乳酸菌がビール混濁能を有す
るものである、請求項４ないし５のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項７】 配列番号１に示される塩基配列を含む、
乳酸菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09244894A JP3677056B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 乳酸菌の検出または同定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09244894A JP3677056B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 乳酸菌の検出または同定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289295A true JPH07289295A (ja) | 1995-11-07 |
| JP3677056B2 JP3677056B2 (ja) | 2005-07-27 |
Family
ID=14054695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09244894A Expired - Fee Related JP3677056B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 乳酸菌の検出または同定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3677056B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6103468A (en) * | 1997-10-07 | 2000-08-15 | Labatt Brewing Company Limited | Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer |
| JP2005230001A (ja) * | 2004-01-20 | 2005-09-02 | Mariusu:Kk | リボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたたんぱく質翻訳調節因子及びリボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたイニシエーションファクター並びにリボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたたんぱく質翻訳調節方法 |
| US7795005B2 (en) | 2004-02-25 | 2010-09-14 | Suntory Holdings Limited | Bacteria detecting instrument, bacteria detecting method, and bacteria detecting kit |
| EP2270227A1 (en) | 2005-08-16 | 2011-01-05 | Suntory Holdings Limited | Oligonucleotides, arrays thereof for detecting microorganisms, and an apparatus, a method and a kit for detecting microorganisms |
-
1994
- 1994-04-28 JP JP09244894A patent/JP3677056B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6103468A (en) * | 1997-10-07 | 2000-08-15 | Labatt Brewing Company Limited | Rapid two-stage polymerase chain reaction method for detection of lactic acid bacteria in beer |
| JP2005230001A (ja) * | 2004-01-20 | 2005-09-02 | Mariusu:Kk | リボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたたんぱく質翻訳調節因子及びリボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたイニシエーションファクター並びにリボソームｒｎａ塩基配列に相補的な１本鎖ｄｎａオリゴマーを用いたたんぱく質翻訳調節方法 |
| US7795005B2 (en) | 2004-02-25 | 2010-09-14 | Suntory Holdings Limited | Bacteria detecting instrument, bacteria detecting method, and bacteria detecting kit |
| EP2455495A2 (en) | 2004-02-25 | 2012-05-23 | Suntory Holdings Limited | Instrument for detecting bacteria, method of detecting bacteria and kit for detecting bacteria |
| EP2270227A1 (en) | 2005-08-16 | 2011-01-05 | Suntory Holdings Limited | Oligonucleotides, arrays thereof for detecting microorganisms, and an apparatus, a method and a kit for detecting microorganisms |
| US7893008B2 (en) | 2005-08-16 | 2011-02-22 | Suntory Holdings Limited | Oligonucleotides, arrays thereof for detecting microorganisms, and an apparatus, a method and a kit for detecting microorganisms |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3677056B2 (ja) | 2005-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI102298B (fi) | Menetelmä maitohappobakteerilajien määrittämiseksi ja menetelmään sove ltuvia oligonukleotideja | |
| WO2005078086A1 (ja) | 乳酸菌の検出・識別方法 | |
| AU781702B2 (en) | Method and nucleic acids for determining the presence of micro-organisms specific to the brewing process | |
| JP3677056B2 (ja) | 乳酸菌の検出または同定方法 | |
| JPWO2007132589A1 (ja) | デッケラ属酵母およびブレタノミセス属酵母の検出用プライマーセット | |
| JP3338924B2 (ja) | 乳酸菌検出用オリゴヌクレオチド及びそれを用いた判定法 | |
| US5869642A (en) | Detection of the genus pectinatus | |
| US7160701B2 (en) | Genes for detecting bacteria and a method for detecting bacteria by using the genes | |
| KR101501361B1 (ko) | 웨이셀라 비리데스켄스 동정용 마커 조성물 | |
| Delaherche et al. | Intraspecific diversity of Oenococcus oeni strains determined by sequence analysis of target genes | |
| US7439022B2 (en) | Nucleic acids for detection of Listeria | |
| JP7252606B2 (ja) | 乳酸菌検出プライマーセットおよび該プライマーセットを用いた検出方法 | |
| JP3163436B2 (ja) | 乳酸菌のホップ耐性ｄｎａおよびホップ耐性乳酸菌の検出方法 | |
| WO2023214588A1 (ja) | 芽胞形成細菌の検出方法 | |
| JP4037926B2 (ja) | Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓの検出に用いるプライマー | |
| RU2432402C2 (ru) | НАБОР ПРАЙМЕРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ РОДА Saccharomyces | |
| JP2008005779A (ja) | ラクトバチルス・ブレビス検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| Ramanuj et al. | Lactic Acid Bacteria: Dna Isolation And Molecular Characterization | |
| JP2935791B2 (ja) | ラクトバチルス属細菌の検出プライマー | |
| JP2008263971A (ja) | ラクトバチラス属乳酸菌の検出用プライマーおよびプローブ | |
| JP2005160333A (ja) | オリゴヌクレオチド及びこれをプライマーとして用いたラクトバチルス属細菌の検出方法 | |
| CASTELLUCCI | RESOLUTION OIV-OENO 409-2012 | |
| AU2003220730B2 (en) | Genes for detecting bacteria and detection method by using the same | |
| WO2005078092A1 (ja) | 偏性嫌気性グラム陰性菌の検出・識別方法 | |
| JP2008161187A (ja) | サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットおよびその組合せ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040427 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040628 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040628 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050426 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050506 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080513 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080513 Year of fee payment: 3 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110513 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120513 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |