CN114058509A - 用于pcr扩增的微量丝状真菌高纯度dna简易制备方法 - Google Patents
用于pcr扩增的微量丝状真菌高纯度dna简易制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下几个步骤：步骤一，在微型离心管中，加入0.3～0.5 mm无菌石英砂至管总体积的1/20，挑取1～3 mm2真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入几丁质酶溶液，捣碎，37℃孵育30分钟；步骤二，加入细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；步骤三，加入磁珠，对核酸‑磁珠复合物进行纯化和洗脱，获得高纯度的DNA。本发明克服了提取试剂盒对样本量的要求，解决了丝状真菌破壁困难，DNA提取中PCR抑制因子存在导致的PCR假阴性等技术问题，实现了微量丝状真菌DNA的快速高质量低成本制备。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取工艺的领域，尤其涉及一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法的技术领域。
背景技术
在真菌分子生物学鉴定中，DNA模板在PCR扩增反应中起着至关重要的作用，高纯度的DNA可以减弱或消除导致PCR假阴性的PCR抑制因子。真菌的DNA提取过程中，一定程度有效地破坏真菌细胞壁是获取核酸的关键，而丝状真菌相比酵母菌，其细胞壁成分更为复杂，主要由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖和糖蛋白等组成，更难被破坏。现有的真菌高纯度的核酸提取常采用试剂盒提取法，市场上常见的包括QIAGEN 12888 土壤DNA提取试剂盒、Biospin 真菌基因组DNA提取试剂盒、天根植物提取试剂盒等。针对菌落小或微量的丝状真菌样本，采用试剂盒提取法很难获得PCR扩增反应所需的核酸量，而且操作中还需使用球磨仪、高速离心机等仪器，提取成本也相对较高。
发明内容
为了克服现有技术的不足, 本发明的目的是提供一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，不采用试剂盒提取法，实现微量丝状真菌DNA的快速高质量低成本制备。
一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下步骤：
步骤一，在200 μL离心管中，加入尺寸为0.3～0.5 mm的石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取1 mm2真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；
步骤二，加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；
步骤三，加入Beckman的XP纳米磁珠，形成核酸-磁珠复合物，在磁力架上移除上清液，加入洗涤液对核酸-磁珠复合物进行洗涤；移除磁力架，加入洗脱液对核酸-磁珠复合物进行洗脱，获得高纯度的DNA。
所述石英砂尺寸为0.3～0.5 mm，经121℃高温及灭菌处理30分钟。
所述几丁质酶来源于链球菌属真菌，其溶液浓度为1 mg/mL；
所述细胞裂解液，含Triton X-100 5.0%～10.0%，Tween 20 1.0%～5.0%，40 mM～100 mM Tris-HCl，pH 6.0。
所述洗涤液为75%～85%乙醇。
所述洗脱液为TE缓冲液，含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA， pH=8.0。
本发明的有益效果：本发明采用细胞壁酶解、蛋白等变性、磁珠纯化等步骤，专一性地解决丝状真菌破壁困难，去除丝状真菌样本中的杂质及PCR抑制因子等技术问题。该制备方法具有操作简单，试剂简单易得，样本量要求低，制备成本低的优点。
附图说明
图1是微量丝状真菌提取过程中不同阶段核酸作为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
其中，1、100 bp Marker；2、 EG1-1裂解后的上清液；3、 EG1-2裂解后的上清液；4、EG2-1裂解后的上清液；5、 EG2-2裂解后的上清液；6、 CGN1-1裂解后的上清液；7、 CGN1-2裂解后的上清液；8、 CGN2-1裂解后的上清液；9、 CGN2-2裂解后的上清液。
图2是本发明添加几丁质酶溶液与QIAGEN 12888 土壤DNA提取试剂盒获得的核酸作为模板的PCR产物琼脂糖凝胶电泳对比图；
图中，1、100 bp Marker；2、 EG1-1；3、 EG1-2；4、 EG2-1；5、 EG2-2；6、 CGN1-1；7、CGN1-2；8、 CGN2-1；9、 CGN2-2；10、 CG1-1；11、 CG1-2；12、 CG2-1；13、 CG2-2。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1
一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，包括以下几个步骤：
步骤一，在200 μL离心管中，加入石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取黑曲霉、橘青霉各1 mm2菌体菌丝于离心管中作为实验组，并标记为EG1、EG2，各加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；鉴于30分钟的孵育时间已达到丝状真菌破壁的目的，如因实验安排，采用37℃孵育更长时间或过夜处理，均可实施，但时间过长，核酸的不可控性会增大，可能会对后期实验造成不利影响，建议酶解时间30分钟。
步骤二，在上述溶液中加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，10000 g 离心5分钟，将上清液转移至新的200 μL离心管中；分别吸取2.0 μL含核酸的上清液进行PCR扩增反应，PCR反应体系为25 μL：2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) (5 μM) 0.5 μL，ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (5 μM) 0.5 μL，DNA模板 2.0 μL，Nuclease-free H2O 9.5 μL；PCR反应参数：95℃，预变性2min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min；8℃，保存。反应结束后取3μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图1所示。
步骤三，在上述剩余的上清液中加入50 μL纳米磁珠，轻弹混匀，500 rpm瞬时离心后，室温孵育5分钟，将离心管置于磁力架上，磁吸5分钟，形成核酸-磁珠复合物，移除清液；加入200 μL洗涤液对核酸-磁珠复合物进行洗涤，弃清液；室温条件下离心管开盖干燥5分钟，待磁珠干燥至磨砂状，加入30 μL洗脱液，移除磁力架，混匀后室温孵育5分钟，将离心管置于磁力架上磁吸5分钟，转移清液至新的200 μL微型离心管中即为获得的DNA。DNA在-20℃保存。
其中，石英砂尺寸为0.3～0.5 mm，且该石英砂经121℃高温及灭菌处理30分钟；几丁质酶来源于链球菌属真菌，其溶液浓度为1 mg/mL；细胞裂解液包括Triton X-100 5.0%～10.0%，Tween 20 1.0%～5.0%，40 mM～100 mM Tris-HCl，pH 6.0；纳米磁珠为Beckman的XP磁珠；洗涤液为75%～85%乙醇；洗脱液为TE缓冲液，包括10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH=8.0。
实施例2
本实施例的提取过程同实施例1，标记为CGN1、CGN2作为对照组1，区别在于步骤1中几丁质酶溶液用25 μL Nuclease-free H2O代替。
实施例3
用无菌牙签挑取黑曲霉、橘青霉各1 mm2菌体菌丝于2 mL离心管中作为对照组2，并标记为CG1、CG2，采用QIAGEN 12888 土壤DNA提取试剂盒，洗脱体积30 μL，完成CG1、CG2的DNA提取。
采用Nanodrop 2000对实验组和对照组1和2提取的DNA进行测定，检测结果如下表1:
根据测定浓度，取上述实验组和对照组中的DNA 11.5 μL进行PCR扩增反应。PCR反应体系为25 μL：2×Phanta Max Master Mix 12.5 μL，ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) (5 μM) 0.5 μL，ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (5 μM) 0.5 μL，DNA模板11.5 μL；PCR反应参数：95℃，预变性2 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min；8℃，保存。反应结束后取3 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图2所示。
图1 表明，采用本发明方法提取核酸时，不论样本是否使用几丁质酶溶液处理，以未经磁珠纯化的含核酸上清液为模板，PCR产物均无条带。图2中2~9结果表明，采用本发明方法提取的核酸，其PCR产物均有条带，但提取过程中未加入几丁质酶溶液的样本均无条带，结合表1测定的结果，表明未添加几丁质酶溶液的样本，可能细胞壁难以得到破坏而无法得到所需核酸。对比图1和图2中2~9可知，尽管添加了几丁质酶专一性裂解丝状真菌样本，若后期未经磁珠纯化步骤处理，即使裂解后获得了一定量核酸，但因PCR抑制因子的存在导致后期PCR无条带，因此，几丁质酶溶液破壁处理和磁珠纯化步骤是制备微量丝状真菌获取PCR所需DNA必不可少的关键步骤，缺一不可。
由表1可知，采用试剂盒提取微量的丝状真菌DNA，其A260/A280与本发明提取的相当,介于1.6～1.7，但浓度很低或无。由图2中2～5和10～13可知，本发明提取的DNA PCR扩增有条带，而试剂盒提取的无条带。表1和图2表明，本发明核酸制备获得的DNA浓度佳，纯度优，可以满足后期的PCR扩增。本发明核酸制备方法具有操作简单、便捷，试剂简单易得，制备成本低的优点，为微量的丝状真菌分子生物学鉴定提供了可行性方案。
Claims (6)
1.一种用于PCR扩增的微量丝状真菌高纯度DNA简易制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一，在200 μL离心管中，加入尺寸为0.3～0.5 mm的石英砂至管总体积的1/20，用无菌牙签挑取1 mm2真菌菌体菌丝样本于离心管中，加入25 μL几丁质酶溶液，盖上管盖，振荡混匀，500 rpm 瞬时离心后，37℃孵育30分钟；
步骤二，加入25 μL细胞裂解液，95℃振荡10分钟，离心收集含有核酸的上清液；
步骤三，加入Beckman的XP纳米磁珠，形成核酸-磁珠复合物，在磁力架上移除上清液，加入洗涤液对核酸-磁珠复合物进行洗涤；移除磁力架，加入洗脱液对核酸-磁珠复合物进行洗脱，获得高纯度的DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述石英砂尺寸为0.3～0.5 mm，经121℃高温及灭菌处理30分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述几丁质酶来源于链球菌属真菌，其溶液浓度为1 mg/mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细胞裂解液，含Triton X-100 5.0%～10.0%，Tween 20 1.0%～5.0%，40 mM～100 mM Tris-HCl，pH 6.0。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗涤液为75%～85%乙醇。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述洗脱液为TE缓冲液，含10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0。
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