CN117551644A - 一种森林土壤基因组dna提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒，该试剂盒含有两种细胞壁裂解组分试剂1和试剂2，能破坏细胞膜上的脂肪酸和脂质，减少蛋白对DNA的缠绕损失，显著提高了DNA释放效率；含有试剂5，可以沉淀腐殖酸，提高DNA纯度，本发明的试剂盒不仅使得提取步骤简洁，而且还节省时间，还提高了提取的DNA产量，进行下游PCR扩增适应性强，可以应用到森林土壤微生物分子生物学研究的科研实验。
Description
技术领域
本发明涉及提取基因组DNA技术领域，具体为一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒。
背景技术
目前土壤基因组DNA常用的提取技术包括化学法、磁珠法和筛选法等。化学法是最常见的方法，通过化学试剂和物理处理将DNA从土壤样品中提取出来。磁珠法利用磁性珠子表面的特定配体与DNA结合，然后通过磁力将DNA捕获和分离。筛选法则通过筛网或离心等手段将DNA从土壤中分离出来。现有技术存在的问题：目前市面上已经有多家公司推出了针对土壤基因组DNA提取的试剂盒产品，如Qiagen、Omega Bio-Tek等。这些试剂盒通常具有高效、快速、稳定的特点。但森林土壤基因组DNA提取试剂盒相对较少，主要原因有以下2点：
(1)森林土壤中存在着大量的抑制物，如多酚类化合物、腐殖质和黏土颗粒等。这些抑制物会干扰DNA的提取和纯化过程，降低提取效率和DNA的质量。
(2)森林土壤中有机质含量较高，这些有机质会与DNA结合，形成复杂的复合物，这些复合物的存在会增加DNA的难以分离和纯化，影响DNA的提取效果和后续PCR扩增效率。
针对这些问题，提供了一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒，本试剂盒通过改进特定的提取缓冲液配方、优化提取条件、添加抑制物去除剂等方法可以有效克服这些困难，提高森林土壤DNA的提取效果。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒，以解决上述背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒，
一种森林土壤提取基因组DNA的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的森林土壤基因组DNA提取试剂盒，该试剂盒含有以下七种提取试剂：
试剂1：是由Na2HPO4、NaH2PO4、Tris-HCL、NaCL、SDS溶液组成，试剂中Na2HPO4的浓度为100mM，NaH2PO4为7mM，Tris-HCL为50mM，NaCL为10mM，SDS的质量浓度为5％，最后用盐酸调节pH为8.0；
试剂2：是由0.12mM的蛋白K溶液组成；
试剂3：是酚-氯仿-异戊醇按照25:24:1体积比制成的混合液；
试剂4：是氯仿-异戊醇按照24:1体积比制成的混合液；
试剂5：是由50％聚乙二醇8000、蛋白-AL(OH)3复合物和1.5M的NaCL溶液组成；
试剂6：是70％的乙醇；
试剂7：是由10mM Tris-HCL(pH8.5)和水溶液组成。
一种森林土壤提取基因组DNA的方法，采用森林土壤基因组DNA提取试剂盒，具体步骤如下：
步骤1：取500mg森林土壤至2mL离心管，加入0.5g研磨珠；
步骤2：加入1000μL试剂1和100μL试剂2，上下颠倒混匀，使用组织研磨仪3500-4000rpm研磨30-45s；
步骤3：65℃水浴10min其间振荡混匀一次；
步骤4：12000rpm离心10min，吸取850μL上清液至新的离心管；
步骤5：加入850μL试剂3，涡旋混匀，12000rpm离心10min，转移800μL上清液至新的离心管；
步骤6：加入800μL试剂4，涡旋混匀，12000rpm离心10min，转移700μL上清液至新的离心管；
步骤7：加入700μL试剂5，涡旋混匀，13000rpm离心60min，吸除上清液；
步骤8：加入500μL试剂6，12000rpm离心10min，吸除上清液，室温放置5min；
步骤9：加入100μL试剂7，涡旋混匀，10000rpm离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。
本发明的有益效果是：该试剂盒含有两种细胞壁裂解组分试剂1和试剂2，能破坏细胞膜上的脂肪酸和脂质，减少蛋白对DNA的缠绕损失，显著提高了DNA释放效率；含有试剂5，可以沉淀腐殖酸，提高DNA纯度，本发明的试剂盒不仅使得提取步骤简洁，而且还节省时间，还提高了提取的DNA产量，进行下游PCR扩增适应性强，可以应用到森林土壤微生物分子生物学研究的科研实验。
试剂盒内匀质细胞的TZP微珠具有韧性高，耐冲击，研磨效率高效等性能，本试剂盒采用不同直径TZP微珠的合理配比使更多土壤细胞释放到裂解液中，可实现森林土壤细菌、古菌、真菌等微生物DNA的高效提取目的。
本试剂盒针对森林土壤高腐殖酸特性配置的试剂2可加速蛋白裂解，进而释放更多与蛋白缠绕的核酸；试剂5可与腐殖酸进行沉淀，进一步提高DNA提取效率同时，减少腐殖酸对后续实验的影响。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明试剂盒提取管(a)和细胞裂解液(b)的对比图；
图3为本发明试剂盒提取森林土壤DNA电泳图；
图4为本发明试剂盒提取森林土壤DNA浓度参数比较表格图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例：请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒，
如图1所示：一种森林土壤提取基因组DNA的方法，采用本发明的试剂盒，该试剂盒含有以下七种提取试剂：
试剂1：是由Na2HPO4、NaH2PO4、Tris-HCL、NaCL、SDS溶液组成，试剂中Na2HPO4的浓度为100mM，NaH2PO4为7mM，Tris-HCL为50mM，NaCL为10mM，SDS的质量浓度为5％，最后用盐酸调节pH为8.0；
试剂2：是由0.12mM的蛋白K溶液组成；
试剂3：是酚-氯仿-异戊醇按照25:24:1体积比制成的混合液；
试剂4：是氯仿-异戊醇按照24:1体积比制成的混合液；
试剂5：是由50％聚乙二醇8000、蛋白-AL(OH)3复合物和1.5M的NaCL溶液组成；
试剂6：是70％的乙醇；
试剂7：是由10mM Tris-HCL(pH8.5)和水溶液组成。
一种森林土壤提取基因组DNA的方法，采用森林土壤基因组DNA提取试剂盒，具体步骤如下：
步骤1：取500mg森林土壤至2mL离心管，加入0.5g研磨珠；
步骤2：加入1000μL试剂1和100μL试剂2，上下颠倒混匀，使用组织研磨仪3500-4000rpm研磨30-45s；
步骤3：65℃水浴10min其间振荡混匀一次；
步骤4：12000rpm离心10min，吸取850μL上清液至新的离心管；
步骤5：加入850μL试剂3，涡旋混匀，12000rpm离心10min，转移800μL上清液至新的离心管；
步骤6：加入800μL试剂4，涡旋混匀，12000rpm离心10min，转移700μL上清液至新的离心管；
步骤7：加入700μL试剂5，涡旋混匀，13000rpm离心60min，吸除上清液；
步骤8：加入500μL试剂6，12000rpm离心10min，吸除上清液，室温放置5min；
步骤9：加入100μL试剂7，涡旋混匀，10000rpm离心2min，收集DNA溶液，-20℃保存。
如图2所示本试剂盒提取管(a)和细胞裂解液(b)。其中1-4：添加了试剂5；5-6：未添加试剂5。从图2中可以看出，本试剂盒添加了试剂5的颜色更加透明，而未添加试剂5的颜色呈森林土壤含有典型腐殖酸的棕褐色，表明本试剂盒试剂5可有效去除腐殖酸。
如图3所示本试剂盒提取森林土壤DNA电泳图。其中1-5：添加了试剂5；6-8：未添加试剂5；Marker：DNA Ladder5000。从图3中可以看出，添加了试剂5的电泳条带更加明亮，而未添加试剂5条带亮度微弱，表明本试剂盒试剂5可有效去除腐殖酸的同时和可以提高DNA提取浓度。
从图4可以看出，本试剂盒提取DNA浓度约为500ng/μL，且相对纯净基本无蛋白和盐类物质污染。
以上实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种森林土壤基因组DNA提取试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有以下七种提取试剂；
试剂1：是由Na2HPO4、NaH2PO4、Tris-HCL、NaCL、SDS溶液组成，试剂中Na2HPO4的浓度为100mM，NaH2PO4为7mM，Tris-HCL为50mM，NaCL为10mM，SDS的质量浓度为5％，最后用盐酸调节pH为8.0；
试剂2：是由0.12mM的蛋白K溶液组成；
试剂3：是酚-氯仿-异戊醇按照25:24:1体积比制成的混合液；
试剂4：是氯仿-异戊醇按照24:1体积比制成的混合液；
试剂5：是由50％聚乙二醇8000、蛋白-AL(OH)3复合物和1.5M的NaCL溶液组成；
试剂6：是70％的乙醇；
试剂7：是由10mM Tris-HCL(pH8.5)和水溶液组成。
2.一种森林土壤提取基因组DNA的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的森林土壤基因组DNA提取试剂盒，具体步骤如下：
步骤1：取500mg森林土壤至2mL离心管，加入0.5g研磨珠；
步骤2：加入1000μL试剂1和100μL试剂2，上下颠倒混匀，使用组织研磨仪3500-4000rpm研磨30-45s；
步骤3：65℃水浴10min其间振荡混匀一次；
步骤4：12000rpm离心10min，吸取850μL上清液至新的离心管；
步骤5：加入850μL试剂3，涡旋混匀，12000rpm离心10min，转移800μL上清液至新的离心管；
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