CN105136874B

CN105136874B - 一种酶生物传感器中的检测配方

Info

Publication number: CN105136874B
Application number: CN201510303651.2A
Authority: CN
Inventors: 熊晶; 邱笑违; 余占江
Original assignee: Lepu Medical Technology Beijing Co Ltd
Current assignee: Beijing Lepu Diagnostic Technology Co., Ltd
Priority date: 2015-06-05
Filing date: 2015-06-05
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2035-06-05
Also published as: CN105136874A

Abstract

本发明实施例公开了一种酶生物传感器中的检测配方，所述配方由枸橼酸或枸橼酸盐、苹果酸或苹果酸盐、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐、铁氰化钾、酶和非反应活性组分组成；在该配方中，枸橼酸或枸橼酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；苹果酸或苹果酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；铁氰化钾的浓度为0.01％～10％W/V；酶的浓度为0.1％～70％W/V；非反应活性组分的浓度为0.1％～70％W/V。本检测配方可以抑制铁氰化钾被还原，提高铁氰化钾媒介体的稳定性，减小背景电流对检测结果的影响。

Description

一种酶生物传感器中的检测配方

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种酶生物传感器中的检测配方。

背景技术

在生物体系中，存在着各种各样的物质，它们对生物学过程的各个方面都有十分重要的影响，对这些物质进行快速准确的分析一直是分析科学所追求的目标。发酵工业、临床诊断等应用领域也很迫切需要建立各种快速的、简便的分析方法。

经过长期的发展，生物体系中的分析方法已从传统的化学法发展为生物传感器分析法。电化学酶生物传感器是最早问世的生物传感器，其工作原理为：酶生物传感器是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物的定量测定。

发展至今，酶生物传感器已经从第一代酶生物传感器发展到第三代酶生物传感器，目前普遍采用的是第二代酶生物传感器。第二代生物传感器采用了含有电子媒介体的化学修饰层，此化学修饰层不仅能促进电子传递过程，使得响应的线性范围拓宽，电极的工作电位降低，同时，噪声、背景电流及干扰信号均小，且排除了过氧化氢，使得酶生物传感器的工作寿命延长。

根据产生的电信号类别不同，电化学酶生物传感器分为电流型和电位型两类。电流型电化学酶生物传感器主要基于探测生物识别或化学反应中的电活性物质，通过固定工作电极的电位给电活性的电子转移反应提供驱动力，探测电流随时间的变化，该电流直接测量了电子转移反应的速度，反映了生物分子识别的速度，即电流正比于待测物质的浓度。电子媒介体的作用是将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使电极产生相应电流变化的分子导电体。

铁氰化钾具有良好的生物兼容性、无毒、较低的氧化还原电位、可逆的电极动力学、能吸附或滞留在电极表面、可与酶的氧化还原辅基快速反应以及可提高相应电流密度等诸多优点，被广泛的应用于如血糖、血酮、尿酸和胆固醇等各类电化学酶生物传感器中。

发明内容

发明人经过大量研究发现，铁氰化钾作为媒介体时性能并不稳定，在储存过程中会逐渐还原变成亚铁氰化钾，当生物传感器施加一定的电压时，亚铁氰化钾又会被氧化成铁氰化钾并释放出电子产生背景电流，导致被测物质测试值比真实值偏高。

有鉴于此，本发明提供一种酶生物传感器中的检测配方，抑制铁氰化钾在储存过程中转化成亚铁氰化钾，减小背景电流的影响，提高检测的准确性。

本发明实施例提供一种酶生物传感器中的检测配方，所述配方由枸橼酸或枸橼酸盐、苹果酸或苹果酸盐、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐、铁氰化钾、酶和非反应活性组分组成；

在该配方中，枸橼酸或枸橼酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

苹果酸或苹果酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

铁氰化钾的浓度为0.01％～10％W/V；

酶的浓度为0.1％～70％W/V；

非反应活性组分的浓度为0.1％～70％W/V。

优选的，枸橼酸或枸橼酸盐在配方中的浓度为0.1％～5％W/V。

优选的，苹果酸或苹果酸盐在配方中的浓度为0.1％～5％W/V。

优选的，聚丙烯酸或聚丙烯酸盐在配方中的浓度为0.1％～5％W/V。

优选的，聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的分子量范围为2000～10000。

优选的，聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的分子量范围为2000～5000。

优选的，铁氰化钾在配方中的浓度为1％～5％W/V。

优选的，所述检测配方的pH范围为5～8，该PH通过添加缓冲液调节。

优选的，所述缓冲液为柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液。

优选的，在该配方中，所述缓冲液的浓度为1％～3％W/V。

与现有技术相比，本发明提供的酶生物传感器中的检测配方具有以下优点和显著的进步：

在酶生物传感器配方中加入枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)以及聚丙烯酸(或盐)三种物质，可以抑制配方中羧基、羟基的活性，以保护配方中的酶，抑制铁氰化钾被还原为亚铁氰化钾，由于被转化出的亚铁氰化钾较少，当生物传感器施加一定的电压时，亚铁氰化钾被氧化成铁氰化钾释放出电子产生的背景电流相对减小，对检测结果的影响将会减小。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

本发明提供一种酶生物传感器中的检测配方实施例，所述配方由枸橼酸或枸橼酸盐、苹果酸或苹果酸盐、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐、铁氰化钾、酶和非反应活性组分组成；

在该配方中，枸橼酸或枸橼酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

苹果酸或苹果酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

铁氰化钾的浓度为0.01％～10％W/V；

酶的浓度为0.1％～70％W/V；

非反应活性组分的浓度为0.1％～70％W/V。

首先需要说明的是，上述配方中包含的枸橼酸或枸橼酸盐、苹果酸或苹果酸盐、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐，可以是所述三种酸与三种盐的任意搭配，比如只有枸橼酸、苹果酸、聚丙烯酸，也可以只有枸橼酸盐、苹果酸盐和聚丙烯酸盐，也可以是枸橼酸、苹果酸和聚丙烯酸盐，不论是哪三种物质，其在配方中所占的浓度均符合上述实施例中的描述。

上述所述的任一组成成分的浓度不是该成分本身溶液的浓度，而是与其他成分混合构成配方后，在配方中的浓度。或者可以理解为该配方包括溶剂，各组成成分溶于溶剂后的浓度。

优选的，在实际操作中，当使用枸橼酸时，枸橼酸可以是含结晶水的也可不含结晶水；当使用枸橼酸盐时，可以是枸橼酸钠也可以是枸橼酸钾等其他盐类。在一些实施例中，所述枸橼酸或枸橼酸盐的浓度范围为0.1％～5％W/V，更优选的，在一些实施例中，所述枸橼酸或枸橼酸盐的浓度范围为0.1％～3％W/V。

在一些实施例中，苹果酸盐可以是苹果酸钠或苹果酸钾等其他盐类,在实际测试时，在一些实施例中，更为优选的，苹果酸或苹果酸盐浓度范围为0.1％～5％W/V。在一些实施例中，更优选的，苹果酸或苹果酸盐浓度范围为0.1％～3％W/V。

在一些实施例中，聚丙烯酸盐可以是聚丙烯酸钠或聚丙烯酸钾。聚丙烯酸或聚丙烯酸盐浓度范围为0.1％～5％W/V。在一些实施例中，更优选的，聚丙烯酸或聚丙烯酸盐浓度范围为0.1％～3％W/V。聚丙烯酸(或聚丙烯酸盐)的分子量范围为2000～10000，优选范围为2000～5000。

配方中铁氰化钾的浓度为0.01％～10％W/V(质量浓度比)，在一些实施例中，所述铁氰化钾的浓度可以为1％～5％W/V。

酶生物传感器所用的酶为任何可用于制作生物传感器的酶，如葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、尿酸氧化酶、胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶等。在一些实施例中，酶的浓度为1％～20％W/V。

其中，非反应活性组分可以包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、BSA等物质，在配方中的浓度范围为0.1％～70％W/V，在一些实施例中，非反应活性组分的浓度范围为20％～60％W/V。

该配方的pH优选范围为5～8，以保持枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)以及聚丙烯酸(或盐)三种物质的最佳效果，对铁氰化钾被还原达到最好的抑制效果。可以采用通过添加缓冲液的方式实现，pH缓冲液可以是任何可将测试溶液pH调节至5～8范围的物质，优选为柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液。在该配方中，所述缓冲液的浓度可以为1％～3％W/V，在一些实施例中，其浓度为1％～2.5％W/V，更优选的，所述缓冲液的浓度为2％W/V。

实验说明：

一、溶液状态实验条件

a.以未加入枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)以及聚丙烯酸(或盐)三种物质的配方作为对照溶液；

以加入枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)以及聚丙烯酸(或盐)三种物质的酶配方作为改进溶液进行对比。

这里对三种物质加入的顺序不作限定。

b.两种配方溶液分别在室温下避光搅拌10分钟混匀后，将生物传感器空白电极插入对应的测试仪器，将对照溶液和改进溶液分别加至空白电极上，通过对应的测试仪器测试两溶液在测试开始后5秒、10秒和30秒时间点上的电信号(电流值)强度。在测试开始前所用的测试物品均需在测试环境中平衡至少30分钟以上。

c.两种溶液在室温下避光继续搅拌24小时后，在其他测试条件不变的情况下，将生物传感器空白电极插入对应的测试仪器，将对照溶液和改进溶液分别加至空白电极上，通过对应的测试仪器测试两者在测试开始后5秒、10秒和30秒时间点上的电信号(电流值)强度。

d.分别计算在5秒、10秒和30秒三个时间点上对照溶液和改进溶液b步骤测试电流值与对应时间点上在c步骤测试电流值的相对偏差。

二、干式状态实验条件

a1.以未加入枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)以及聚丙烯酸(或盐)三种物质的酶配方作为对照溶液；

以加入枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)以及聚丙烯酸(或盐)三种物质的酶配方作为改进溶液。

b1.两种配方溶液分别在室温下避光搅拌10分钟混匀后，将其加样至生物传感器空白电极上并烘干，制成干式配方电极。

c1.将两种配方溶液制成的干式配方电极分别分成两等份，一份存放于4℃冰箱，另一份放于37℃烘箱进行加速老化30天。

d1.30天后将干式配方电极分别从冰箱和烘箱中取出和其他的测试物品一起在测试环境中至少平衡30分钟。

e1.将对照配方和改进配方在两种存放状态下的干式配方电极插入生物传感器测试仪进行测试，记录测试开始后5秒、10秒和30秒时间点上的电信号(电流值)强度。

f1.分别计算在5秒、10秒和30秒三个时间点上对照配方和改进配方4℃冰箱存放的干式配方电极与37℃烘箱加速老化的干式配方电极测试电流值的相对偏差。

采用上述实验说明，在真实环境中进行实验，得出以下实验数据及实验结果。

实验1：溶液状态下铁氰化钾稳定性的评估

(1)对照溶液各成分浓度为：1.0％W/V的羧甲基纤维素钠，0.3％W/V的羟乙基纤维素，0.5％W/V的BSA(牛血清白蛋白)，浓度为2％W/V、PH为6.0的PBS(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline)，0.8％W/V的铁氰化钾，1.0KU/mL(每毫升1万单位)葡萄糖氧化酶。

(2)改进溶液各成分浓度为：1.0％W/V的羧甲基纤维素钠，0.3％W/V的羟乙基纤维素，0.5％W/V的BSA，浓度为2％W/V、PH为6.0的PBS(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffersaline)，0.8％W/V的铁氰化钾，1.0KU/mL葡萄糖氧化酶，0.2％W/V的柠檬酸钠，0.3％W/V的苹果酸钠，0.2％W/V的聚丙烯酸(平均分子量Mw＝3500)。

其中，上述浓度是指各成分在配方中的浓度，而不是给组成成分本身溶液的浓度。羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、BSA和缓冲液为非反应活性组分。

(3)按照(1)和(2)的配方组成配制对照配方(溶液)和改进配方(溶液)，并在室温(18～28摄氏度)条件下避光搅拌10分钟使其混匀。

(4)将生物传感器空白电极插入对应的测试仪器。

(5)取出约0.5mL对照配方溶液和改进配方溶液，用一次性滴管吸取一定量取出溶液加样至空白电极上。

(6)通过对应的测试仪器测试加样溶液，在测试开始后记录5秒、10秒和30秒时间点上的电信号(电流值)强度，每个时间点测试十个数据并记录测试环境的温度和湿度。

(7)将配制好的对照溶液和改进配方溶液继续在室温条件下搅拌24小时。

(8)将测试的环境条件控制与搅拌10分钟后测试的环境相近，温度偏差＜±2℃，湿度偏差＜±5％。

(9)按照(4)和(5)步骤进行测试，并记录测试开始后5秒、10秒和30秒时间点上的电信号(电流值)强度，每个时间点测试10个数据。

需要注意的是，在测试开始前，测试所需的所有物品均应在测试环境条件下至少平衡30分钟以上。

溶液状态下铁氰化钾稳定性的评估结果如下：

表1对照配方溶液状态下铁氰化钾稳定性评估结果

表2改进配方溶液状态下铁氰化钾稳定性评估结果

实验2：干式状态下铁氰化钾稳定性的评估

(1)将实验一中的对照配方溶液和改进配方溶液点样至空白电极上，45℃烘干10分钟，制成干式状态配方电极。

(2)将两种配方溶液制成的干式配方电极分别分成两等份，一份存放于4℃冰箱，另一份放于37℃烘箱进行加速老化30天。

(3)30天后将干式配方电极分别从冰箱和烘箱中取出和其他的测试物品一起在测试环境中至少平衡30分钟。

(4)将对照配方和改进配方在两种存放状态下的干式配方电极插入生物传感器测试仪。

(5)用一次性滴管吸取一定量的纯化水滴加至插入生物传感器测试仪的干式配方电极上进行测试，记录测试开始后5秒、10秒和30秒时间点上的电信号(电流值)强度。

(6)分别计算在5秒、10秒和30秒三个时间点上对照配方和改进配方4℃冰箱存放的干式配方电极与37℃烘箱加速老化的干式配方电极测试电流值的相对偏差。

配方干式状态下铁氰化钾稳定性的评估结果如下：

表3对照配方干式状态下铁氰化钾稳定性评估结果

表4改进配方干式状态下铁氰化钾稳定性评估结果

表1-表4中所示的测试数据为不同时间测量的背景电流值，其单位为μA。

通过表1和表2的数据对比可以看出，相同条件下，对照配方(未添加枸橼酸或枸橼酸盐、苹果酸或苹果酸盐、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐)随着时间的增加，产生的背景电流增大，相对偏差较大。而改进配方下(添加了上述物质)测得的背景电流值比较平稳，没有随时间的增加而产生较大的波动，且整体的背景电流要比对照配方下的电流小。说明改进配方下酶生物传感器中铁氰化钾媒介体相对比较稳定。同理，从表3～表4可看出，加入枸橼酸(或盐)、苹果酸(或盐)和聚丙烯酸(或盐)三种物质的改进配方较未加这三种物质的对照配方相比，铁氰化钾稳定性有明显改善。

本发明实施例提供的配方，可以明显的抑制铁氰化钾被还原的速率，铁氰化钾在改进配方溶液状态储存24小时或在干式试纸状态37℃加速老化1个月其背景电流的升高相对值均未超过5％。

Claims

1.一种酶生物传感器中的检测配方，其特征在于，所述配方由枸橼酸或枸橼酸盐、苹果酸或苹果酸盐、聚丙烯酸或聚丙烯酸盐、铁氰化钾、酶和非反应活性组分组成；

在该配方中，枸橼酸或枸橼酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

苹果酸或苹果酸盐的浓度为0.01％～10％W/V；

聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的浓度为0.01％～10％W/V，所述聚丙烯酸或聚丙烯酸盐的分子量范围为2000～5000；

铁氰化钾的浓度为0.01％～10％W/V；

酶的浓度为0.1％～70％W/V；

非反应活性组分的浓度为0.1％～70％W/V。

2.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，枸橼酸或枸橼酸盐在配方中的浓度为0.1％～5％W/V。

3.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，苹果酸或苹果酸盐在配方中的浓度为0.1％～5％W/V。

4.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，聚丙烯酸或聚丙烯酸盐在配方中的浓度为0.1％～5％W/V。

5.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，铁氰化钾在配方中的浓度为1％～5％W/V。

6.根据权利要求1所述的配方，其特征在于，所述检测配方的pH范围为5～8，该pH通过添加缓冲液调节。

7.根据权利要求6所述的配方，其特征在于，所述缓冲液为柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液。

8.根据权利要求6或7所述的配方，其特征在于，在该配方中，所述缓冲液的浓度为1％～3％W/V。