JP2004101531A - 電気化学的分析物検出アッセイにおける媒介物質の安定化剤組成物およびこれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明の試薬組成物は一定の酵素、一定のレドックス媒介物質および一定の媒介物質安定化用の緩衝剤を含有している。随意的に、この試薬組成物はさらに一定の湿潤化剤、洗浄剤、酵素補助因子およびこれらの組み合わせ物を含むことができる。さらに、本発明の試薬組成物を含む各種の電気化学的試験片、当該試薬組成物を含有しているシステムおよびキット、ならびに、当該試薬組成物を分析物決定アッセイにおいて使用するための方法も提供されている。本発明はグルコース濃度決定の用途を含む種々の異なる用途において有用であることが分かっている。
【選択図】 図1
Description
米国特許特許文書:第5,723,284号、同第5,834,224号、同第5,942,102号、同第5,972,199号、同第5,997,817号、同第6,059,946号、同第6,083,710号、同第6,121,009号、同第6,134,461号、同第6,179,979号、同第6,193,973号、および同第6,284,125号、ならびに、その他の特許文書:PCT国際公開第WO99/49307号、同第WO97/18465号、同第WO01/57510号、同第WO01/57238号、同第WO02/48707号、同第WO02/50609号、欧州特許(EP)第0969097A2号、日本国特開平09−140378号、および英国特許第2304628号。
上記においてまとめられているように、本発明は媒介物質安定化型の電気化学的試薬組成物を提供している。本発明の電気化学的な試薬組成物は、例えば、試験片等の電気化学的な分析物検出装置において有用であることが分かっている各種の組成物であり、典型的なレドックス(酸化還元)試薬組成物である。媒介物質安定化型の試薬組成物とは、この組成物における媒介物質成分が一般的な保管条件下において一定の延長された期間にわたり一定の還元された形態に変換しない一定の組成物を意味する。さらに、一般的な保管条件とは、約−20乃至約55℃、通常的に約5乃至約40℃の範囲の一定温度および約5乃至約90%、通常的に約10乃至約60%における条件を意味する。また、本発明の媒介物質安定化型の試薬組成物は約18ヶ月よりも長い範囲の保管期間にわたり安定である。
本発明の試薬組成物における酵素成分は、多くの実施形態において、一定の酵素または関連の分析物を協働して酸化するように作用する複数の酵素である。換言すれば、この酵素要素は、検出される一定の電気化学的な信号を発生可能にする、単一の分析物酸化酵素または関連の分析物を協働して酸化するように作用する2種類以上の酵素の集合体により構成されている。このような関連の酵素は各種のオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、リパーゼ、キナーゼ、ジアホラーゼ、キノンタンパク質等を含む。
上記試薬組成物の別の成分は一定のレドックス媒介物質であり、この物質は1種類以上の物質または薬剤を含むことができる。この媒介物質は上記酵素(分析物の酸化中にその分析物から1個以上の電子を取り出す)から一定の電極への電子の移動を容易にする一定の媒介として作用する。フェリシアニド、フェナジン・エトサルフェート、フェナジン・メトサルフェート、フェニレンジアミン、N,N,N’,N’−テトラメチル・フェニレンジアミン、1−メトキシ−フェナジン・メトサルフェート、2,5−ジメチル−1,4−ベンゾキノン、2,6−ジメチル−1,4−ベンゾキノン、2,5−ジクロロ−1,4−ベンゾキノン、フェロセン誘導体、オスミウム・ビピリジル錯体、ルテニウム錯体等を含む当該技術分野において知られている種々の異なる媒介物質が使用可能である。なお、多くの実施形態において、上記レドックス媒介物質はフェリシアニドである。
上記試薬組成物の別の成分は一定の媒介物質安定化用の緩衝成分である。この本発明の媒介物質安定化用の緩衝成分は、1種類以上の、例えば、2種類、3種類、4種類またはそれ以上の別々の緩衝剤により構成することができ、この場合に、この緩衝用の成分は、上記媒介物質が使用前の、例えば、保管中において、仮にあるとしても、還元されることがほとんどないように、上記組成物を乾燥した形態で保管している間にその媒介物質を安定化する。一定の緩衝剤は、当該緩衝剤の存在下であれば、一定の媒介物質を安定化すると考えられ、仮にあるとしても、その媒介物質は、上述したような、一定の保管期間にわたりその還元された形態にほとんど変換しない。適当な緩衝剤は、以下における実験の部分において説明されている各種のアッセイにより決定されているように、一定の電気化学的試験におけるバックグラウンド信号を経時的に増加させない各種の緩衝剤である。なお、このバックグラウンド信号は分析物を含まないサンプルを一定の電気化学的試験用のシステムに導入した場合に得られる信号である。
上述したように、上記試薬組成物はさらに以下の付加的な成分、すなわち、一定の湿潤剤、洗浄剤、補酵素、酵素補助因子、安定化剤、粘度変性剤またはこれらの組み合わせ物の1種類以上を含むことができる。
一定の洗浄剤との組み合わせにおける一部の実施形態において、一定の湿潤剤を上記試薬組成物に添加することにより、一定の電気化学的試験片におけるその試薬組成物の均一な塗布を容易にすることができる。このような物質の複数の1種類以上の組み合わせも使用可能である。これらの使用される試薬はアッセイの各試薬の溶解性を改善すると共に、一定の毛細管充填型試験片の吸引特性を高めることができる。これらの物質は、例えば、各種のポリマー、消泡剤、および界面活性剤等のような、当業界において知られている物質を含む。関連の界面活性剤/洗浄剤の代表的な種類はトリトン(Tritons)、マコール(Macols)、テトロニック(Tetronics)、シルベット(Silwets)、ゾニル(Zonyls)、およびプルロニック(Pluronics)を含むがこれらに限らない。さらに、適当な物質はプルロニック材料であり、これらはポリエチレン・オキシドおよびポリプロピレン・オキシドのブロック・コ−ポリマーである。プルロニック材料の例は良好な湿潤性を有しているプルロニックP103および良好な洗浄性を有しているプルロニックF87プリルを含む。これらのプルロニックP103およびF87プリルは共に80℃よりも高い一定の曇り点温度を有しており、このことはこの特性が上記の乾燥処理中における組成物の相変化を回避するために好ましい。
本発明の配合物における酵素成分を活性化する補酵素もまた望まれる場合に上記試薬組成物に添加することができる。関連の補酵素の例はピロロキノリン・キノン(PQQ)である。関連の別の補助因子は、一定の試験試薬に供給される酵素の種類に応じて、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド(NAD)、フラビン・アデニン・ジヌクレオチド(FAD)、シトクローム等を含むがこれらに限らない。
特定の実施形態において、本発明の組成物はさらに1種類以上の酵素補助因子を含む。関連の酵素補助因子は二価の金属カチオン、例えば、Ca2+、Mg2+等を含む。
各種の安定化剤も上記試薬組成物に添加して、酵素を安定化することおよびタンパク質の変性を防止することを補助できる。さらに、この安定化剤は上記媒介物質のレドックス状態、特に、酸化されたレドック媒介物質の状態を安定化することも補助できる。このような安定化剤の例は各種の炭化水素(例えば、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびラクトース)、アミノ酸、タンパク質(BSAおよびアルブミン等)およびEDTA等のような有機化合物を含むがこれらに限らない。
粘度変性剤も液体の試薬の流動性を変化するために上記試薬に添加できる。このような物質の例はポリ(アクリル酸)、ポリ(ビニル・アルコール)、デキストラン、BSA等を含む。
上記試薬組成物は一定の乾燥状態または液体の形態で存在できる。上述したような種々の成分の量は変更可能であり、以下の特定的に示されている各量は例示のみを目的として示されている。
関連の一定の代表的な特定の配合物において、この配合物は上記酵素としてグルコース・デヒドロゲナーゼ、および補酵素としてPQQを含有している。また、一定の酵素補助因子Ca2+も存在している。このような配合物において、PQQはGDHおよびCa2+と結合して活性化状態の酵素またはホロ酵素を形成する。なお、GDHの二量体分子1個当たりに2個のPQQがこの酵素を完全に活性化するために必要とされることが知られている。一部の実施形態において、上記試薬組成物中のGDHに対するPQQのモル比率は約2乃至約4である。さらに別の実施形態においては、このGDHに対するPQQのモル比率は約2.2乃至約2.5である。これらの代表的な配合物におけるGDH−PQQのホロ酵素の活性は一般的に約10乃至1000kU/ml、通常的に少なくとも約50乃至約300kU/mlの範囲である。この酵素の活性は30℃において行なわれる一定の分光光度計によるアッセイにより決定されている。一般的に、3部の酵素溶液が100部の基質溶液に混合される。次に、吸光度を5秒間にわたり600nmでモニターする。この基質溶液は112mMのグルコース、2mMのフェナジン・エトサルフェート、60nMの2,6−ジクロロインドフェノール、および50mMのピペラジン,N,N’−ビス−(2−エタンスルホン酸)(PIPES)をpH6.8において含有している。一方、上記の酵素溶液は約0.25乃至0.50mg/mLのGDH、1.25μMのPQQ、1.25mMのCaCl2 、0.1%(重量/容量)のウシ血清アルブミン、および50mMのPIPESをpH6.8において含有している。例えば、CaCl2 により供給される場合のCa2+の量は一般的に約0乃至10mMの範囲である。さらに、関連の特定の配合物中における媒介物質はフェリシアニドであり、この物質は一般的に約0.1乃至10mM、通常的に約0.3乃至約1.0mMの範囲の量で存在している。存在している場合に、上記の湿潤剤/洗浄剤の成分は約0.01乃至1.0%(重量/重量)の範囲の一定量で存在している。また、スクロースは、存在している場合に、約10乃至約1000mMの範囲の一定量で存在している。さらに、特定の関連の緩衝剤はシトラコン酸および/またはメリト酸であり、これらは上述した範囲内において存在している。
上記においてまとめられているように、上記本発明の試薬組成物を含む電気化学的セルも本発明により提供されている。それぞれの開示内容が本明細書に参考文献として含まれる米国特許文書の第5,723,284号、同第5,834,224号、同第5,942,102号、同第5,972,199号、同第5,997,817号、同第6,083,710号、同第6,121,009号、同第6,134,461号、および同第6,193,873号、ならびに、その他の特許文書のPCT国際公開第WO99/49307号、同第WO97/18465号、同第WO01/57510号、同第WO01/57238号、同第WO02/48707号、同第WO02/50609号、欧州特許第0969097A2号および英国特許第2304628号において記載されている構成を含む、種々の異なる様式の電気化学的セルの構成が知られている。さらに、上記各特許の優先権書類もまた、これらが米国特許出願である場合に、本明細書に参考文献として含まれる。当該技術分野における熟練者において知られている任意の電気化学的セルまたはその他の電気化学的セルが本発明の組成物を組み込むために変更可能である。
上記の試薬組成物を含む本発明の電気化学的試験片は一定の作用電極および一定の基準電極を備えている。一般に、これらの作用電極および基準電極は細長い長方形の部材片の形態で構成されている。一般的に、これらの電極の長さは約1.9cm乃至約4.5cm、通常的に約2乃至約2.8cmの範囲である。また、これらの電極の幅は約0.38乃至約0.76cm、通常的に約0.51乃至約0.67cmの範囲である。基準電極は一般的に約10乃至100nm、通常的に約18乃至約22nmの範囲の一定の厚さを有している。特定の実施形態において、上記電極の一方の長さが他方の電極の長さよりも短く、この場合に、特定の実施形態において、その長さは約0.32cmだけ短い。
上記本発明の電気化学的試験片の特徴は上記のような作用電極および基準電極が互いに対向していて、一定のわずかな距離だけ離れており、当該電気化学的試験片の反応領域または区域の中における作用電極と基準電極との間の距離が極めて小さくなっていることである。このような本発明の試験片における作用電極と基準電極との最小の間隔はこれら作用電極と基準電極との間に位置決めまたは挟まれている一定の薄いスペーサー層の存在の結果である。このスペーサー層の厚さは一般に約1乃至約500μm、通常的に約100乃至約200μmの範囲である。このスペーサー層は反応領域の中に到る少なくとも1個の入口ポートおよび当該反応領域から出る一般に1個の出口ポートを伴う一定の反応領域または区域を形成するように切断されている。代表的な一定のスペーサー層の構成が図1および図2において見られる。このスペーサー層はこれらの図において側面における入口および出口の各穴またはポートを伴って切断されている一定の円形の反応領域を有するものとして示されているが、例えば、正方形、卵形、三角形、長方形、および不規則な形状の反応領域等のような、別の構成も可能である。このスペーサー層は任意の好都合な材料により作成可能であり、この場合に、代表的な適当な材料はPET、PETG、ポリイミド、ポリカーボネート等を含み、この場合に、そのスペーサー層の各表面部分はそれぞれ電極に対して接着性を有するように処理することができ、これにより、その電気化学的な試験片の構造が維持できる。特に重要なことは、上記スペーサー層としての一定のダイ切断型両面接着剤片の使用である。
本発明の電気化学的試験片は上記の作用電極、基準電極およびスペーサー層により定められる一定の反応領域または区域を備えており、この場合に、これらの構成要素は既に説明されている。特に、作用電極および基準電極は反応領域の上部および下部をそれぞれ定めており、スペーサー層はこの反応領域の各壁部を定めている。この反応領域の容積は少なくとも約0.1μl、通常的に少なくとも約1μl、さらに通常的に少なくとも約1.5μlであり、この場合に、この容積は10μl程度またはそれ以上にすることも可能である。上述したように、この反応領域は一般に少なくとも1個の入口ポートを有しており、さらに、多くの場合において、一定の出口ポートも有している。これら入口ポートおよび出口ポートの断面積は、その反応領域における一定の有効な流体の流入および流出を行なうために十分な大きさを有している限りにおいて、変更可能であるが、一般に約9×10-5乃至約5×10-3cm2 、通常的に約5×10-4乃至約2.5×10-3cm2 の範囲である。
さらに、一定の生理学的サンプル中における一定の分析物の濃度を決定するために上記本発明の試薬組成物を使用する方法も本発明により提供されている。便宜上、この方法は上記の代表的な試験片に関連して説明されている。しかしながら、本発明はこの特定の方法に限定されることはなく、一定の電気化学的セルにおいて本発明の試薬配合物を用いて一定の分析物を検出するあらゆる方法が本発明に含まれる。
各種の分析物の検出において使用するためのシステムも本発明により提供されており、この場合に、これらのシステムは、例えば、上述したような一定の試験片の中に存在している、本発明による一定の試薬組成物、および当該試薬組成物を用いて一定のサンプルを電気化学的にアッセイすることにおいて使用するための一定の装置を含む。
さらに、上記本発明の方法の実施において使用するためのキットもまた本発明により提供されている。この本発明のキットは上述したような試薬組成物を含み、この場合に、これらの組成物は上述したような一定の試験片の中に存在している場合が多い。この本発明のキットはさらに一定の生理学的サンプルを入手するための一定の入手要素を含むことができる。例えば、この生理学的サンプルが血液である場合に、本発明のキットはさらに、指を突刺すための一定のランス、および一定のランス作動手段等のような、一定の血液サンプルを入手するための要素を含むことができる。加えて、本発明のキットは、例えば、一定の標準化された濃度のグルコースを含む一定の対照溶液等のような、一定の分析物の標準物を含むこともできる。特定の実施形態において、このキットはさらに、上記の試薬組成物およびこれらを含む試験片と共に使用するための、上述したような、一定の自動化装置も含む。
実施例1.クエン酸塩、リンゴ酸および酒石酸によるグルコースの線形性の結果
クエン酸、リンゴ酸、および酒石酸の各緩衝剤配合物を100mMの濃度およびpH5.5において別々に配合した。これら3種類の配合物は全て同等量の0.1%の消泡剤(RNAエクイリブレーター(RNA Equilibrator))、1mMのCaCl2 、PQQ(GDHに対して2倍のモル比率)、200mMのカリウム・フェリシアニド、および45mg/mLのGDHを含有していた。各配合物を一定のパラジウム(Pd)の支持体にインク−ジェット処理した。次に、各センサーが10秒間にわたり−0.3Vの電位を印加し、さらに、5秒間にわたり+0.3Vの電位を印加することによる時間電流測定によりグルコースを含有している血液を試験した。この血液についての試験は全ての場合においてグルコースの良好な線形性を示した(図3)。クエン酸塩およびリンゴ酸の各緩衝剤のバックグラウンドは同等であったが、酒石酸の緩衝剤のバックグラウンドはそれよりも高かった。加えて、酒石酸の緩衝剤はCa2+により一定の不溶性の塩を形成して望ましくない結果を示した。
クエン酸塩緩衝剤を400mMおよびpH5.5において配合した。さらに、メリト酸塩緩衝剤を160mMおよびpH6.4において配合した。これら両方の配合物は同等量の0.1%の消泡剤(RNAエクイリブレーター)、1mMのCaCl2 、PQQ(GDHに対して2倍のモル比率)、200mMのカリウム・フェリシアニド、および32mg/mLのGDHを含有していた。次に、3種類のヘマトクリット値(20,42および70%)および4種類のグルコース量を用いて血液試験を行なった(図4および図5)。この場合のグルコースの応答は線形ではなかったが、グルコース濃度の増加に伴って増加した。また、クエン酸塩緩衝剤におけるヘマトクリット特性の方がメリト酸塩の場合よりもわずかに良好であった。これらの結果が図4および図5において示されている。
クエン酸塩およびシトラコン酸塩の各緩衝剤を300mMの濃度およびpH6.5において別々に配合した。これら両方の配合物は同等量の0.1%の消泡剤(RNAエクイリブレーター)、4mMのCaCl2 、PQQ(GDHに対して2倍のモル比率)、800mMのカリウム・フェリシアニド、および46mg/mLのGDHを含有していた。各配合物をインクジェット処理によりPd上に堆積させた。これら両方のクエン酸塩およびシトラコン酸塩の緩衝剤におけるヘマトクリット特性は同等であった(図6および図7)。14日間にわたる56℃における加速したエージング処理において、シトラコン酸塩はクエン酸塩に比して優れたバックグラウンドおよび性能の安定性を示した(表1)。表1において示されているバイアス値は40mg/dLのグルコース濃度における一定の絶対的な応答差および100mg/dLよりも高いグルコース濃度における一定のバイアス率として示されている。
シトラコン酸塩およびマレイン酸の各緩衝剤を300mMの濃度およびpH6.5において別々に配合した。これら両方の配合物は同等量の0.066%のプルロニック25R2、0.033%のプルロニックL62、4mMのCaCl2 、PQQ(GDHに対して2倍のモル比率)、800mMのカリウム・フェリシアニド、および26mg/mLのGDHを含有していた。これらの配向物をインクジェット処理によりPd上に堆積させた。公称のヘマトクリット値における初期的な性能試験は良好な線形性を示した(図8)。また、安定性のデータは両方の場合において安定なバックグラウンドを示したが、マレイン酸の緩衝剤配合物における性能は高いグルコース量において低下し、酵素の不安定性を示した(表2)。
試薬を一定の手動式のピペットにより堆積させて一定の熱空気流により一定のホット・プレート下において乾燥したことを除いて、実施例4と同様の様式で各試験片を作成した。図9および図10はシトラコン酸塩およびメリト酸塩の各緩衝剤により作成したグルコース・センサーにおける安定性のデータをそれぞれ示している。メリト酸およびシトラコン酸に対してそれぞれ105mMおよび40mMの緩衝剤濃度の濃度において6.5の一定のpH値を選択した。これらのセンサーを2週間にわたり5℃または56℃において保管した後に、18%、37%および63%のヘマトクリット値の血液により試験した。
(1)前記緩衝剤が一定のポリカルボン酸を含む請求項1に記載の試薬組成物。
(2)前記ポリカルボン酸がメリト酸およびその塩類である実施態様(1)に記載の試薬組成物。
(3)前記ポリカルボン酸がシトラコン酸およびその塩類である実施態様(1)に記載の試薬組成物。
(4)実施態様(1)乃至(3)に記載の一定の試薬組成物を含む一定の電気化学的セル。
(5) 一定の電気化学的試験片を作成するための方法において、
実施態様(1)乃至(3)に記載の一定の試薬組成物を使用している方法。
12 作用電極
14 基準電極
16 スペーサー層
18 切除部分
Claims (7)
- 一定の試薬組成物において、
(a)一定の酵素、
(b)一定のレドックス媒介物質
(c)前記レドックス媒介物質を保管して安定化するために十分な一定の量で存在している一定の媒介物質安定化用の緩衝剤を含有している試薬組成物。 - 請求項1に記載の一定の試薬組成物を含む電気化学的セル。
- 請求項2に記載の一定の電気化学的セルを含む電気化学的試験片。
- 一定の電気化学的試験片を作成するための方法において、
請求項1に記載の一定の試薬組成物を使用している方法。 - 一定のサンプル中における一定の分析物の濃度を決定するための方法において、
(a)請求項2に記載の一定の電気化学的セルに前記分析物を供給する工程、
(b)前記セルにより一定の電気的な信号を検出する工程、および
(c)前記検出した信号を前記サンプル中における分析物の濃度に関連付ける工程を含む方法。 - 一定の生理学的サンプル中における一定の分析物の濃度を決定することにおいて使用するためのキットにおいて、
(a)請求項3に記載の一定の電気化学的試験片、および
(b)(i)一定のサンプル入手要素、および
(ii)一定の分析物標準物、の内の少なくとも一つを含むキット。 - 一定のシステムにおいて、
(a)請求項3に記載の一定の電気化学的試験片、および
(b)前記試験片を読み取るための一定の計器を含むシステム。
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