ES2317947T3 - Biosensor. - Google Patents
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Abstract
Biosensor, que comprende: una placa de base aislante (1), un sistema de electrodos que está previsto sobre dicha placa de base y que por lo menos presenta un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, un elemento de cubierta (8) que se combina con dicha placa de base para delimitar una vía de suministro de soluciones de muestra (10) para conducir una solución de muestra desde una unidad de suministro de muestras hasta dicho sistema de electrodos, comprendiendo un sistema de reactivos de reacción (22, 23 y 24) por lo menos una enzima de oxidación-reducción y un mediador de electrones, y un filtro (11) dispuesto entre dicho sistema de electrodos y dicha unidad de suministro de muestras en dicha vía de suministro de soluciones de muestra, presentando dicho biosensor un espacio (14, 15 y 16) que rodea una superficie de dicho filtro en una zona comprendida entre un extremo de dicho filtro que está en la proximidad de dicha unidad de suministro de muestras y el otro extremo de dicho filtro que está en la proximidad de dicho sistema de electrodos, en el que dicho sistema de reactivos de reacción, está dispuesto en la vía de suministro de soluciones de muestra, de tal forma que únicamente una solución de muestra transmitida a través del filtro alcanza el sistema de reactivos de reacción, y en el que dicho espacio que rodea la superficie de dicho filtro impide que cualquier parte de la solución de muestra que no es absorbida por el filtro sino que fluye directamente desde un espacio situado en la zona de contacto del filtro con la vía de suministro de soluciones de muestra que está en la proximidad de la unidad de suministro de muestras fluya hacia el sistema de electrodos.
Description
Biosensor.
La presente invención se refiere a un biosensor
que realiza una determinación simple de alta velocidad y alta
precisión de un objeto de destino en una muestra.
Se ha propuesto un biosensor operativo para
determinar un componente específico de una muestra mediante un
procedimiento simple en el que no se disuelve ni agita la solución
de muestra (publicación de patente japonesa abierta al público nº
2-062952).
En este biosensor, se forma (por ejemplo,
mediante serigrafía) un sistema de electrodos que comprende un
electrodo de medición o un electrodo de trabajo, un contraelectrodo
y un electrodo de referencia, sobre una placa de base aislante. A
continuación, se forma una capa de reacción enzimática que comprende
un polímero hidrofílico, una enzima de
oxidación-reducción y un mediador electrónico, sobre
el sistema de electrodos. Según las necesidades, se puede añadir un
amortiguador a esta capa de reacción enzimática.
Cuando se añade gota a gota una solución de
muestra que contiene un sustrato en la capa de reacción enzimática
del biosensor construido de esta forma, la capa de reacción
enzimática se disuelve provocando la reacción de la enzima con el
sustrato, hecho que da por resultado la reducción del mediador
electrónico. Una vez finalizada la reacción enzimática, el mediador
electrónico reducido se oxida electroquímicamente, y la
concentración del sustrato comprendido en la solución de muestra se
calcula a partir del valor observado de la corriente de
oxidación.
En principio, el biosensor es aplicable a la
medición de diversas sustancias seleccionando una enzima adecuada
que reacciona con la sustancia de destino de la medición que
constituye el sustrato. Por ejemplo, cuando se utiliza la glucosa
oxidasa como enzima de oxidación-reducción, el
biosensor construido es capaz de medir la concentración de glucosa
en sangre. Dicho biosensor se utiliza ampliamente como sensor de
glucosa. Cuando se utiliza la colesterol oxidasa, se construye un
biosensor que es capaz de medir el colesterol en suero.
El valor del colesterol en suero utilizado de
manera general como índice diagnóstico es la suma de las
concentraciones de colesterol y éster de colesterol. No obstante,
el éster de colesterol no es el sustrato de la reacción de
oxidación con colesterol oxidasa. Para medir el valor del colesterol
en suero como índice diagnóstico, se requiere pues un proceso
adicional para cambiar el éster de colesterol por colesterol. Se
utiliza la colesterol esterasa como enzima catalizadora de este
proceso.
El biosensor que comprende colesterol esterasa y
colesterol oxidasa en su capa de reacción enzimática se utiliza
para medir la concentración total de colesterol en suero.
La medición del colesterol se ve afectada por el
colesterol que está presente en la membrana celular. Es preferible
la coexistencia de un agente tensoactivo con la colesterol esterasa
en la capa de reactivos de reacción para aumentar la reactividad.
El agente tensoactivo destruye la membrana celular en muchos casos,
y cabe la posibilidad de que las sustancias del interior de la
célula afecten directamente o indirectamente a la reacción
enzimática o la reacción en los electrodos. Desde este punto de
vista, es preferible que la reacción enzimática y la subsiguiente
reacción en los electrodos tengan lugar en plasma o en suero en el
sensor de colesterol. En los biosensores distintos al sensor de
colesterol, la presencia de hematocitos en la sangre puede afectar
también a la respuesta. En consecuencia, en una situación ideal la
reacción enzimática y la reacción en los electrodos tiene lugar en
una solución libre de hematocitos.
El centrifugado es un procedimiento conocido
para separar el plasma o el suero de la sangre total. El
procedimiento de centrifugado, sin embargo, es bastante prolongado
y requiere operaciones complicadas.
En la patente US nº 3.607.092, se da a conocer
una membrana utilizada para realizar análisis de sangre. Esta
membrana presenta una capa de película fina que es permeable a los
líquidos pero impermeable a los sólidos tales como los hepatocitos
y las células gigantes tales como las proteínas. Es decir, esta
película fina es operativa para separar los hematocitos. No
obstante, puesto que con el paso de la sangre el componente sólido
se va acumulando en la película fina, se necesita una gran zona de
la película fina para obtener cierta cantidad de filtrado
suficiente para la reacción del biosensor. Por lo tanto, la película
fina dada a conocer resulta insuficiente.
Se dan a conocer unos biosensores en los
documentos EP 0 856 685 A y US nº 5.658.444. Asimismo, se dan a
conocer otros biosensores en los documentos EP 1 118 675 A, EP 1 235
068 A y EP 1 182 456 A, que pertenecen a la técnica anterior según
el Artículo 54(3) EPC y por lo tanto solo se consideran
desde el punto de vista de la novedad.
En la patente US nº 4.477.575, se da a conocer
un aparato y un procedimiento para separar el suero de la sangre
total que pasa a través de un filtro de fibra de vidrio. El
procedimiento de separación del suero de la sangre total con un
filtro de fibra o un filtro poroso es aplicable al biosensor. No
obstante, el procedimiento no da por resultado la retención de los
hematocitos dentro del filtro, sino simplemente la reducción de la
velocidad de flujo de los hematocitos para la separación del
plasma. En caso de que se aplique este procedimiento al biosensor,
es necesario obtener cierta cantidad de plasma o suero filtrado
suficiente para la reacción en el biosensor, antes de que extraigan
los hematocitos del filtro. Con esta finalidad, debe aplicarse un
valor específico que cumpla esta condición a lo largo del filtro en
la dirección del flujo de la sangre.
El filtro que cumple esta condición se dispone
entre una parte del biosensor que comprende el sistema de electrodos
y el sistema de reactivos de reacción y otra parte del biosensor
que es operativa para suministrar sangre como muestra, para
construir de ese modo un biosensor con capacidad de filtración de
los hematocitos. La figura 9 representa un biosensor construido de
esta manera. La figura 9 es una vista en perspectiva descompuesta
del biosensor sin la capa de reactivos de reacción.
En el ejemplo de la figura 9, se imprime,
mediante serigrafía, pasta de plata sobre una placa de base aislante
101 que se compone de politereftalato de etileno, para formar unos
conductores 102 y 103 y la base de un sistema de electrodos.
Asimismo, se imprime una pasta conductora de carbono que comprende
un aglutinante de resina sobre la placa de base 101 para formar el
sistema de electrodos que comprende un electrodo de trabajo 104 y
un contraelectrodo 105, mientras se imprime pasta aislante para
formar una capa aislante 106. El electrodo de trabajo 104 se
conecta al conductor 102, y el contraelectrodo 105 al conductor 103.
La capa aislante 106 hace que la zona expuesta del electrodo de
trabajo 104 y el contraelectrodo 105 sea constante, y recubre
parcialmente los conductores.
Mediante el procedimiento, la placa de base
aislante 101 con el sistema de electrodos, una cubierta 108 con un
orificio de ventilación 109, un separador 107 y un filtro 111 con
capacidad para filtrar hematocitos se disponen en la relación
posicional representada por la línea mixta de puntos simples y rayas
y se juntan entre sí para montar un biosensor. El filtro 111 se
corta para acomodar una vía de suministro de soluciones de muestras,
delimitada por una hendidura 110 del separador 107 situado entre la
cubierta 108 y la placa de base aislante 101. El número 113a
representa una parte donde el filtro 111 entra en contacto con la
placa de base aislante. El filtro 111 se dispone entre el sistema
de electrodos y una unidad de suministro de muestras 112 sobre la
placa de base, sin recubrir el sistema de electrodos que comprende
el electrodo de trabajo 104 y el contraelectrodo 105, en la vía de
suministro de soluciones de muestra.
En el biosensor que presenta la construcción
anterior, la sangre añadida gota a gota en la unidad de suministro
de muestras 112 se absorbe por un extremo del filtro 111 que está en
la proximidad de la unidad de suministro de muestras. En el filtro,
el índice de permeación de los hematocitos es inferior al índice de
permeación del plasma que constituye el componente líquido, y en
consecuencia el plasma sale al exterior por el extremo del filtro
que está en la proximidad del sistema de electrodos. El plasma
filtrado disuelve los reactivos de reacción, que comprenden enzimas
y están contenidos en una posición específica que recubre el sistema
de electrodos o en la cara posterior de la cubierta justo encima de
la posición específica, y llena toda la vía de suministro de
soluciones de muestras desde los alrededores del sistema de
electrodos hasta el orificio de ventilación 109. Cuando toda la vía
de suministro de soluciones de muestra está llena de líquido, el
flujo del líquido en el filtro 111 se detiene, de tal forma que los
hematocitos no llegan al extremo del filtro que está en la
proximidad del sistema de electrodos, sino que quedan retenidos en
la posición actual.
A través de la filtración de hematocitos, la
capa de reactivos de reacción disuelta en plasma reacciona
químicamente con un componente de destino comprendido en el plasma
(que es el colesterol en el caso del sensor de colesterol). Una vez
transcurrido un tiempo preestablecido, el valor de la corriente
eléctrica se mide por medio de la reacción que tiene lugar en los
electrodos. Esto determina el componente en plasma.
En este biosensor de técnica anterior, parte de
la sangre añadida gota a gota en la unidad de suministro de
muestras 112 no se absorbe a través del extremo del filtro 111 que
está en la proximidad de la unidad de suministro de muestras, sino
que la sangre que comprende los hematocitos se transfiere a través
del espacio entre la vía de suministro de soluciones de muestra y
el filtro 111 hasta alcanzar la capa de reactivos de reacción. Esto
determina que los hematocitos o cierto componente de los hematocitos
reaccionen con el reactivo de reacción y generen un error
significativo en la medición.
Si se fija el filtro 111 a la vía de suministro
de soluciones de muestra por medio de un adhesivo, puede prevenirse
la transferencia de sangre a través del espacio entre el filtro 111
y la vía de suministro de soluciones de muestra.
No obstante, el adhesivo puede afectar a los
componentes de la sangre. Este procedimiento también requiere que
el adhesivo se aplique o bien a la superficie del filtro 111 o bien
a la vía de suministro de soluciones de muestra, lo cual complica
el procedimiento de fabricación.
El objetivo de la presente invención es, por lo
tanto, resolver los inconvenientes descritos anteriormente,
perfeccionando el biosensor con un filtro que sea capaz de filtrar
componentes sólidos tales como los hematocitos.
Más particularmente, el objetivo de la presente
invención consiste en ofrecer un biosensor que tenga una respuesta
estable, permitiendo que la muestra añadida en el sensor penetre en
un filtro y que solo una solución de muestra transmitida a través
del filtro alcance una capa de reactivos de reacción y un sistema de
electrodos.
Un biosensor según la presente invención
comprende: una placa de base aislante, un sistema de electrodos que
está dispuesto sobre la placa de base y que presenta por lo menos un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo, un elemento de cubierta
que se combina con la placa de base para delimitar una vía de
suministro de soluciones de muestra para conducir una solución de
muestra desde una unidad de suministro de muestras hasta el sistema
de electrodos, un sistema de reactivos de reacción que comprende por
lo menos una enzima de oxidación-reducción y un
mediador de electrones, y un filtro dispuesto entre el sistema de
electrodos y la unidad de suministro de de muestras en la vía de
suministro de soluciones de muestras, presentando el biosensor un
espacio que rodea la superficie del filtro en la zona comprendida
entre un extremo del filtro que está en la proximidad de la unidad
de suministro de muestras y el otro extremo del filtro que está en
la proximidad del sistema de electrodos, en el que dicho sistema de
reactivos de reacción está dispuesto en la vía de suministro de
soluciones de muestra, de tal forma que solo una solución de muestra
transmitida a través del filtro alcanza el sistema de reactivos de
reacción, y en el que dicho espacio que rodea la superficie de dicho
filtro impide que ninguna parte de la solución de muestra que no es
absorbida por el filtro sino que fluye directamente hacia el
interior de la vía de suministro de soluciones de muestra desde un
espacio situado en una zona de contacto del filtro con la vía de
suministro de soluciones de muestra que está en la proximidad de la
unidad de suministro de muestras, fluya hacia el sistema de
electrodos.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, la unidad de suministro de muestras está
dispuesta sobre la placa de base, y la vía de suministro de
soluciones de muestras está situada a lo largo de la placa de base
y el elemento de cubierta.
En esta forma de realización, es deseable que el
espacio que rodea la superficie del filtro tenga una anchura no
inferior a 0,5 mm. Si la anchura del espacio es inferior a 0,5 mm,
la sangre transmitida a través del espacio entre la placa de base y
el elemento de cubierta que forma la vía de suministro de soluciones
de muestra y el filtro puede alcanzar la zona del espacio por
capilaridad. La anchura preferida del espacio está comprendida
entre 0,5 mm y 5.00 mm. Si la anchura es superior a 5.0 mm, el
filtro puede experimentar una deformación no deseable por las
vibraciones aplicadas al sensor. Más particularmente, la anchura
preferida está comprendida entre 1,0 mm y 3,0 mm.
En otra forma de realización preferida de la
presente invención, la unidad de suministro de muestras está
dispuesta en el elemento de cubierta, y la vía de suministro de
soluciones de muestras está dispuesta en la dirección de la
gravedad desde la unidad de suministro de muestras. En esta
modalidad, es preferible que la anchura del espacio que rodea la
superficie del filtro no sea inferior a 100 \mum y que sea más
pequeña que el grosor del filtro.
El filtro utilizado en este caso está
constituido por un cuerpo poroso que presenta espacios conectados
entre sí de una manera tridimensional y en el que la sangre se
desplaza desde la unidad de suministro de muestras hacia la vía de
suministro de soluciones de muestra por capilaridad, mientras que es
operativo para filtrar hematocitos basándose en la diferencia entre
las resistencias al flujo del plasma y los hematocitos. Para formar
el filtro, puede utilizarse una tela no tejida, que preferentemente
se compone de una fibra hidrofílica, tal como la fibra de vidrio,
la celulosa, la pulpa de papel, el papel de filtro u otro cuerpo
poroso.
La disposición de la presente invención se
aplica preferentemente a un sensor de colesterol en el que la enzima
de oxidación-reducción es la colesterol
oxidasa.
En el sensor de colesterol, es preferible que el
sistema de reactivos de reacción comprenda una enzima con capacidad
de hidrolizar el éster de colesterol. También es preferible que la
enzima con capacidad de hidrolizar el éster de colesterol sea la
colesterol esterasa y que el sistema de reactivos de reacción
comprenda un agente tensoactivo.
Es deseable que una parte o todo el elemento de
cubierta y la placa de base aislante sean transparentes.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es una vista en perspectiva
descompuesta que ilustra un biosensor sin capa de reactivos de
reacción en una forma de realización de la presente invención.
La figura 2 es una vista en sección vertical que
ilustra el biosensor de la figura 1.
La figura 3 es una vista en planta que ilustra
la parte principal de un biosensor en otra forma de realización de
la presente invención.
La figura 4 es una vista en sección vertical que
ilustra un biosensor en otra o de la presente invención.
La figura 5 es una vista en sección vertical que
ilustra un biosensor en otra forma de realización de la presente
invención.
La figura 6 es una vista en perspectiva
descompuesta que ilustra el biosensor de la figura 5.
La figura 7 es una vista en sección vertical que
ilustra un biosensor en otra forma de realización de la presente
invención.
La figura 8 es una vista en perspectiva
descompuesta que ilustra el biosensor de la figura 7.
La figura 9 es una vista en prespectiva
descompuesta que ilustra un biosensor de técnica anterior sin capa
de reactivos de reacción.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se ha descrito anteriormente, un biosensor
de la presente invención presenta una vía de suministro de
soluciones de muestra que está delimitada por una combinación de una
placa de base y un elemento de cubierta, y un filtro que está
dispuesto en la vía de suministro de soluciones de muestra entre una
unidad de suministro de muestras, dispuesta ya sea en la placa de
base o bien en el elemento de cubierta, y un sistema de electrodos
situado sobre la placa de base, presentando el biosensor un espacio
que rodea la superficie del filtro en la zona comprendida entre un
extremo del filtro que está en la proximidad de la unidad de
suministro de muestras y el otro extremo del filtro que está en la
proximidad del sistema de electrodos. En particular, existe una
zona específica, en la cual toda la circunferencia de la superficie
del filtro no está en contacto ni con la placa de base ni con el
elemento de cubierta que forman la vía de suministro de soluciones
de muestra.
Un aspecto de la presente invención es un
biosensor que comprende: una placa de base aislante, un sistema de
electrodos que está dispuesto sobre la placa de base y que presenta
por lo menos un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, un
elemento de cubierta que se combina con la placa de base para
delimitar una vía de suministro de soluciones de muestra para
conducir una solución de muestra desde una unidad de suministro de
muestras dispuesta sobre la placa de base hasta el sistema de
electrodos dispuesto sobre la placa de base, un sistema de
reactivos de reacción que comprende por lo menos una enzima de
oxidación-reducción y un mediador electrónico y que
está dispuesto en los alrededores del sistema de electrodos, y un
filtro dispuesto entre el sistema de electrodos y la unidad de
suministro de muestras en la vía de suministro de soluciones de
muestra, presentando el biosensor un espacio que rodea la
superficie del filtro en la zona comprendida entre un extremo del
filtro que está en la proximidad de la unidad de suministro de
muestras y el otro extremo del filtro que está en la proximidad del
sistema de
electrodos.
electrodos.
Otro aspecto de la presente invención es un
biosensor que comprende: una placa de base aislante, un sistema de
electrodos que está dispuesto sobre la placa de base y que presenta
por lo menos un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, un
elemento de cubierta que se combina con la placa de base, una vía de
suministro de soluciones de muestra formada entre el elemento de
cubierta y la placa de base para conducir una solución de muestra
desde una unidad de suministro de muestras dispuesta en el elemento
de cubierta hasta el sistema de electrodos dispuesto sobre la placa
de base, un sistema de reactivos de reacción que comprende por lo
menos una enzima de oxidación-reducción y un
mediador electrónico y que está dispuesto en los alrededores del
sistema de electrodos, y un filtro dispuesto entre el sistema de
electrodos y la unidad de suministro de muestras en la vía de
suministro de soluciones de muestra, presentando el biosensor un
espacio que rodea la superficie del filtro en la zona comprendida
entre un extremo del filtro que está en la proximidad de la unidad
de suministro de muestras y el otro extremo del filtro que está en
la proximidad del sistema de electrodos.
En la estructura anterior, la solución de
muestra, por ejemplo la sangre, añadida gota a gota a la unidad de
suministro de muestras es absorbida por el filtro y fluye a través
de la vía de suministro de soluciones de muestra hacia el sistema
de electrodos y la capa de reactivos de reacción, mientras que la
sustancia sólida, por ejemplo los hematocitos, es separada por el
filtro. En consecuencia, solo la solución de muestra que carece del
componente sólido, por ejemplo los hematocitos, alcanza el sistema
de electrodos. En la vía de suministro de soluciones de muestra que
está en la proximidad de la unidad de suministro de muestras, sin
embargo, es posible que una parte de la solución de muestra no sea
absorbida por el filtro sino que fluya directamente desde un
pequeño espacio situado en la zona de contacto del filtro con la vía
de suministro de soluciones de muestra y se introduzca en la vía de
suministro de soluciones de muestra. Aun en dichos casos, el espacio
que rodea la superficie del filtro impide de una forma eficaz que
la solución de muestra fluya hacia el sistema de electrodos. De
esta manera, pues, se impide que la solución de muestra que
comprende la sustancia sólida, por ejemplo los hematocitos, fluya a
través de este espacio hacia el sistema de electrodos. Es preferible
que el sistema de reactivos de reacción esté dispuesto en los
alrededores del sistema de electrodos en la vía de suministro de
soluciones de muestra.
La enzima de oxidación-reducción
comprendida en el sistema de reactivos de reacción que se va a
utilizar puede consistir en una enzima de una diversidad que
comprende por ejemplo la glucosa oxidasa, la lactato oxidasa y la
colesterol oxidasa.
En el caso de la medición del colesterol del
suero, se utiliza la colesterol oxidasa y una enzima con capacidad
para hidrolizar el éster de colesterol. La colesterol esterasa y la
lipoproteína lipasa son ejemplos de enzima con capacidad de
hidrolizar el éster de colesterol. En particular, es preferible
utilizar la colesterol esterasa, puesto que convierte rápidamente
el éster de colesterol en colesterol en presencia de un agente
tensoactivo adecuado.
Cuando el sistema de reactivos de reacción
comprende la enzima con capacidad de hidrolizar el éster de
colesterol, es preferible que el sistema de reactivos de reacción
comprenda además un agente tensoactivo para aumentar la capacidad
de la enzima. Esto reduce convenientemente el tiempo necesario para
la reacción enzimática.
Para aumentar la actividad de la colesterol
esterasa, puede utilizarse cualquiera de los siguientes agentes
tensoactivos:
n-octil-\beta-D-glucósido,
polietilenglicol monodecil éter, colato de sodio,
dodecil-\beta-maltósido,
monolaurato de sacarosa, deoxicolato de sodio, taurodeoxicolato de
sodio,
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)colamida
y
N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)deoxicolamida,
polioxietilén-p-t-octilfenil
éter (TritonX-100).
Cuando se utiliza un metal electroquímicamente
estable como el platino para el sistema de electrodos del biosensor,
el valor observado de la corriente de oxidación no comprende ningún
error. No obstante, dichos metales son costosos. En sensores de
tipo desechable, el sistema de electrodos comprende un electrodo de
plata que se compone de, por ejemplo, pasta de plata y un electrodo
de carbono obtenido recubriendo el electrodo de plata con pasta de
carbono. Cuando la solución de muestra comprende un agente
tensoactivo, la solución de muestra penetra en las partículas de
carbono mediante la acción del agente tensoactivo. Esto puede
reducir la actividad del electrodo de carbono y, asimismo,
determina que la solución de muestra entre en contacto con el
electrodo de plata. Cuando se aplica un voltaje al electrodo de
trabajo en dichas condiciones, puede producirse una reacción de
oxidación en el electrodo de plata que genera corriente eléctrica y
un error positivo en el valor observado de corriente eléctrica.
En un procedimiento propuesto para suprimir
dichos fenómenos, la superficie del sistema de electrodos se recubre
de un polímero hidrofílico. El polímero hidrofílico convierte la
solución de muestra introducida en una capa viscosa, hecho que
impide que la solución de muestra entre en contacto con los
electrodos.
Los ejemplos de polímero hidrofílico comprenden:
carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, polivinil alcohol,
etilcelulosa, hidrocipropilcelulosa, gelatina, ácido poliacrílico y
sus sales, almidón y sus derivados, polímeros de anhídrido maleico
o sus sales, poliacrilamida, resina de metacrilato y
poli-2-hidroxietilmetacrilato.
En lugar de utilizar el procedimiento basado en
el polímero hidrofílico, puede aplicarse el procedimiento siguiente
para suprimir los efectos del agente tensoactivo descritos
anteriormente. Una parte específica del sistema de electrodos que
entra en contacto con la solución de muestra está constituida solo
por pasta de carbono. La pasta de plata, que asegura la
conductividad eléctrica, se utiliza solo en la parte recubierta de
una capa aislante. La capa de polímero hidrofílico no se necesita en
dichos electrodos impresos. No obstante, el polímero hidrofílico
también es operativo para impedir que la proteína de la solución de
muestra o la mezcla de la solución de muestra y el reactivo de
reacción se absorba en la superficie del electrodo y disminuya la
actividad de la reacción que tiene lugar en el electrodo. En
consecuencia, es preferible utilizar un polímero hidrofílico
incluso en dichos electrodos impresos.
Cuando se utiliza plata y carbono para el
sistema de electrodos del biosensor, debe añadirse un mediador
electrónico a la capa de reactivos de reacción.
El mediador electrónico que se va a utilizar
puede ser cualquier compuesto soluble en agua que actúe de mediador
en la transferencia de electrones entre la enzima y el electrodo,
por ejemplo, ferricianuro potásico, p-benzoquinona,
metosulfato de feniazina y derivados del ferroceno (de
oxidación).
Para medir la corriente de oxidación, se puede
aplicar un sistema de dos electrodos, en el que se utiliza solo el
electrodo de trabajo y el contraelectrodo, y un sistema de tres
electrodos, en el que se utiliza el electrodo de referencia además
de los dos electrodos anteriores. Es preferible utilizar el sistema
de tres electrodos para asegurar una medición de alta
precisión.
En la presente memoria, la descripción detallada
de la presente invención se refiere a unas formas de realización
particulares. Asimismo, debe tenerse en cuenta que los dibujos solo
son ilustrativos y que las dimensiones relativas de los respectivos
elementos no reflejan los tamaños exactos.
La figura 1 es una vista en perspectiva
descompuesta que ilustra un biosensor de una forma de realización
de la presente invención, y la figura 2 es una vista en sección
vertical del biosensor.
Mediante serigrafía, se imprime pasta de plata
sobre una placa de base aislante 1 de politereftalato de etileno
para formar los conductores 2 y 3 y la base de un sistema de
electrodos. Además, se imprime pasta de carbono conductora de
electricidad que contiene un aglutinante de resina sobre la placa de
base 1 para formar un sistema de electrodos que comprende un
electrodo de trabajo 4 y un contraelectrodo 5, mientras se imprime
pasta aislante para formar una capa aislante 6. El electrodo de
trabajo 4 está conectado al conductor 2, y el contraelectrodo 5 al
conductor 3. La capa aislante 6 hace que las zonas expuestas del
electrodo de trabajo 4 y el contraelectrodo 5 sean constantes y
recubre parcialmente los conductores.
La placa de base aislante 1 con el sistema de
electrodos, una cubierta 8 con un orificio de ventilación 9, un
separador 7 y un filtro 11 con capacidad para filtrar hematocitos se
unen de conformidad con la relación posicional representada
mediante una línea mixta de puntos simples y rayas, para preparar un
biosensor. Una hendidura 10 del separador 7 situado entre la placa
de base 1 y la cubierta 8 delimita una vía de suministro de
soluciones de muestra que se extiende a lo largo de la placa de base
1 y la cubierta 8. El filtro 11 se recorta con un tamaño que se
adapta a la vía de suministro de soluciones de muestra y se dispone
entre el sistema de electrodos y una unidad de suministro de
muestras, sin recubrir el sistema de electrodos. Los números 13a y
13b representan las partes donde el filtro 11 entra en contacto con
la placa de base aislante 1 y la cubierta 8, respectivamente.
Existe una zona específica comprendida entre un
extremo del filtro 11 que está en la proximidad de la unidad de
suministro de muestras 12 y el otro extremo que está en la
proximidad del sistema de electrodos, en la cual la superficie del
filtro 11 no está en contacto ni con la placa de base 1 ni con el
separador 7 ni con la cubierta 8 que delimitan la vía de suministro
de soluciones de muestra. Para formar esta zona, la placa de base 1
y la cubierta 8 presentan, respectivamente, los orificios de paso 14
y 15 en posiciones correspondientes, y el espaciador 7 presenta dos
muescas 16 que se conectan con la hendidura 10. Unas tapas 17 y 18
están fijadas a las caras externas de la placa de base 1 y la
cubierta 8 para recubrir respectivamente los orificios de paso 14 y
15 formados en la placa de base 1 y la cubierta 8. Los orificios de
paso 14 y 15 y las muescas 16 y 16 forman el espacio que rodea la
superficie del filtro 11.
Aunque en esta forma de realización los
orificios de paso 14 y 15 se cierran con las tapas 17 y 18, dichos
orificios de paso 14 y 15 pueden ejercer sus funciones en el estado
abierto también. El filtro 11 queda expuesto al exterior en el
estado abierto. En consecuencia, cabe la posibilidad de que la
evaporación de la solución de muestra a través de la parte expuesta
ocasione el retroceso del líquido que pasa a través del filtro y
llega al sistema de electrodos. Por consiguiente, las tapas 17 y 18
se proporcionan para cubrir los orificios de paso de la placa de
base y la cubierta. En caso de que tanto la placa de base como la
cubierta sean suficientemente gruesas, pueden formarse rebajes que
no precisan de las tapas 17 y 18, en lugar de los orificios de
paso.
Cuando la solución de muestra se añade gota a
gota a la unidad de suministro de muestras 12 situada sobre la
placa de base para que entre en contacto con un extremo del filtro
11 que está en la proximidad de la unidad de suministro de
muestras, la solución de muestra penetra en el filtro 11. El filtro
11 separa el componente sólido (por ejemplo, los hematocitos), y el
plasma fluye a través de la vía de suministro de soluciones de
muestra y se introduce en el sensor. El plasma llena toda la vía de
suministro de soluciones de muestra desde la zona próxima al
sistema de electrodos hasta la parte del orificio de ventilación 9,
mientras disuelve los reactivos de reacción situados en una
posición específica encima del sistema de electrodos o en la cara
posterior de la cubierta justo encima de la posición específica.
Cuando toda la vía de suministro de soluciones de muestra está
llena de líquido, el flujo del líquido hacia el filtro 11 se
interrumpe. En ese momento, los hematocitos no habrán llegado hasta
el extremo del filtro 11 que está próximo al sistema de electrodos
sino que quedan retenidos en su posición actual. Por lo tanto, el
filtro 11 está diseñado para generar una diferencia entre las
resistencias al flujo del plasma y los hematocitos, de tal forma
que, cuando el plasma haya pasado a través del filtro y haya
llenado toda la vía de suministro de soluciones de muestra, los
hematocitos todavía no habrán alcanzado el extremo del filtro.
En esta forma de realización, la longitud de la
vía de suministro de soluciones de muestra delimitada por la
hendidura 10 comprendida entre el extremo situado en la unidad de
suministro de muestras y la circunferencia externa del orificio de
ventilación 9 es de 12,5 mm. La hendidura 10 tiene una anchura de
2,0 mm y una profundidad de 0,1 mm.
Las dimensiones de los orificios de paso 14 y 15
expresadas como (la dimensión en la dirección perpendicular a la
dirección longitudinal de la placa de base) x (la dimensión en la
dirección longitudinal de la placa de base) son de 4,0 x 3,0 mm, y
las dimensiones de las muescas 16 son también de 4,0 x 3,0 mm. Tanto
la placa de base como la cubierta tienen un grosor de 0,35 mm, y el
grosor del separador es de 0,1 mm. En consecuencia, el filtro 11
está rodeado por un espacio que tiene un grosor de 0,35 mm por
encima y por debajo del filtro 11 y un grosor de 2,0 mm por el lado
derecho y por el lado izquierdo del filtro 11 y un grosor de 3,0 mm
en la dirección del flujo de la solución de muestra (en lo sucesivo
denominada "anchura del espacio"). El espacio ocupa una
posición que se halla a una distancia de 1 mm del extremo de la
unidad de suministro de muestras y a una distancia de 3,00 mm del
extremo del sistema de electrodos. Las dimensiones anteriores solo
representan un ejemplo de la forma de realización preferida y no son
restrictivos en ningún sentido.
La figura 2 es una vista en sección vertical que
ilustra el biosensor montado. Sobre el sistema de electrodos de la
placa de base 1, se ha formado una capa de polímero hidrofílico 21 y
una capa de mediador electrónico 22 que recubren la capa de
polímero hidrofílico 21. El filtro 11 está dispuesto en la vía de
suministro de soluciones de muestra delimitada por la hendidura 10
del separador 7. El extremo del filtro 11 puede estar o no en
contacto con el sistema de electrodos, pero no debe estar en
contacto con el electrodo de trabajo 4 del sistema de electrodos ni
separado del mismo. En la vía de suministro de soluciones de
muestra, se ha formado una capa 23 que comprende enzimas y un
agente tensoactivo en una posición específica interpuesta entre un
extremo del filtro 11 que está en la proximidad del sistema de
electrodos y el orificio de ventilación 9 situado en la cara
posterior de la cubierta 8. El contacto de esta capa 23 con el
extremo del filtro 11 facilita el flujo de la solución de muestra
hacia el interior de la capa 23, aunque el contacto no es
esencial.
La figura 3 es una vista en planta que ilustra
la relación posicional entre el separador y el filtro de un
biosensor de otra forma de realización de la presente invención. La
hendidura 10 que delimita la vía de suministro de soluciones de
muestra presenta una parte 10a donde está instalado el filtro, y una
parte 10b que presenta el sistema de electrodos y recibe la muestra
de entrada que pasa a través del filtro. La anchura de la parte 10a
es diferente de la anchura de la parte 10b. Más particularmente, en
la forma de realización de la figura 3, la anchura de la parte 10a
con el filtro instalado es más estrecha que la anchura de la parte
10b con el sistema de electrodos.
La figura 4 es una vista en sección vertical que
ilustra un biosensor de otra forma de realización de la presente
invención. El biosensor presenta una estructura similar a la de la
figura 2 con una disposición diferente de la capa de reactivos de
reacción. En la estructura de esta forma de realización, solo se ha
formado la capa de polímero hidrofílico 21 sobre el sistema de
electrodos. La cubierta 8 está provista de un soporte poroso 24
impregnado de enzimas, un agente tensoactivo y un mediador
electrónico para entrar en contacto con un extremo del filtro
11.
La figura 5 es una vista en sección vertical que
ilustra un biosensor de otra forma de realización de la presente
invención, y la figura 6 es una vista en perspectiva descompuesta
del biosensor sin la capa de reactivos de reacción.
Como en la estructura de la figura 1, sobre una
placa de base aislante 31 se han formado los conductores 32 y 33,
un electrodo de trabajo 34 y un contraelectrodo 35 que se conectan
con los respectivos conductores, y una capa aislante 36. Sobre la
placa de base 31, se ha dispuesto una combinación de varios
separadores 41, 43, 45, 47 y 49 con una cubierta 52. Entre el
separador 53 y la cubierta 52, se ha interpuesto un filtro 51. Un
orificio de paso 53 situado en la cubierta 52 forma una unidad de
suministro de muestras. Los orificios de paso 42, 44, 46, 48 y 50
formados en los separadores 41, 43, 45, 47 y 49 delimitan una vía de
suministro de soluciones de muestra que se extiende en la dirección
de la gravedad. Puesto que los orificios de paso 46 y 50 de los
separadores 45 y 49 tienen unos diámetros superiores al diámetro del
filtro 51, se forman unos espacios que rodean el filtro 51,
representados mediante los números de referencia 55 y 56. El
separador 47 está parcialmente en contacto con la circunferencia
externa del filtro 51 para situar el filtro 51. El separador 41
presenta un orificio de ventilación 54 que conecta el extremo de la
vía de suministro de soluciones de muestra con el aire. La solución
de muestra se introduce por capilaridad en la dirección de la
gravedad dentro de la vía de suministro de soluciones de muestra,
que conecta el orificio de paso 53 que está dispuesto encima del
sistema de electrodos y es operativo como unidad de suministro de
muestras con el sistema de electrodos. El movimiento de la solución
de muestra se detiene cuando el plasma que pasa a través del filtro
51 alcanza el sistema de electrodos.
El grosor de los separadores 49 y 45 que
determina la altura de los espacios 55 y 56 que rodean el filtro 51
es preferentemente no inferior a 100 \mum. La reacción de la
solución de muestra con los reactivos tiene lugar en el orificio de
paso 42 formado en el separador 41. El grosor preferido del
separador 41 está comprendido entre 100 y 200 \mum. La
orientación de la vía de suministro de soluciones de muestra en la
dirección de la gravedad permite que la muestra pase a través del
filtro gracias a la gravedad y que alcance rápidamente la capa de
reactivos de reacción.
En esta forma de realización, se ha formado una
capa de CMC 61 y una capa de mediador electrónico 62 sobre el
sistema de electrodos. Se ha formado una capa 63 que comprende
enzimas y un agente tensoactivo en la cara posterior del separador
43.
La figura 7 es una vista en sección vertical que
ilustra un biosensor de otra forma de realización de la presente
invención. La figura 8 es una vista en perspectiva descompuesta que
ilustra el biosensor de la figura 7 sin capa de reactivos de
reacción. Este sensor es prácticamente igual al sensor representado
en las figuras 5 y 6, excepto en que el separador 43 se ha
sustituido por una capa de inducción de soluciones de muestra 57
que se compone principalmente de una tela no tejida. En el biosensor
de esta forma de realización, el sistema de electrodos está
provisto de una capa de CMC 61 y una capa 64 que comprende enzimas,
un agente tensoactivo y un mediador electrónico.
A continuación, se describen ejemplos de la
presente invención.
Se fabrica un sensor de colesterol como ejemplo
de biosensor. En el proceso, primero se añade mediante goteo una
solución acuosa al 0,5% en peso de carboximetilcelulosa sódica
(denominada "CMC" en lo sucesivo), que constituye el polímero
hidrofílico, al sistema de electrodos situado sobre la placa de base
aislante 1 representado en la figura 1, y la solución se seca en un
secador de aire caliente a 50º durante 10 minutos para formar una
capa de CMC 21. Subsiguientemente, se añaden mediante goteo 4 \mul
de una solución acuosa de ferricianuro potásico (correspondiente a
70 mM de ferricianuro potásico), que constituye el mediador
electrónico, a la capa de CMC, y la solución se seca en el secador
de aire caliente a 50º durante 10 minutos para formar una capa de
ferrocianuro potásico 22.
A continuación, se añaden mediante goteo 2
\mul de una solución etanólica al 2% en peso de Triton
X-100, que constituye el agente tensoactivo, en una
cavidad delimitada por la cubierta 8 y la hendidura 10 del separador
7, y la solución se deja secar a temperatura ambiente durante 3
minutos para formar una capa de agente tensoactivo. Se añade Triton
X-100 a una solución acuosa en la que se ha disuelto
colesterol oxidasa procedente de Nocardia (EC1.1.3.6, denominada en
lo sucesivo "ChOD") y colesterol esterasa procedente de
Pseudomonas (EC. 3.1.1.13, denominada en lo sucesivo "ChE").
Se añaden a continuación 1,5 \mul de la mezcla de la solución a
la capa de agente tensoactivo, y la capa se congela con nitrógeno
líquido y se seca en un matraz de Kjeldahl durante toda la noche
dentro de un liofilizador, para obtener una capa de enzimas/agente
tensoactivo 23 que comprende 1 unidad (U)/sensor de colesterol
oxidasa, 2,5 unidades (U)/sensor de colesterol esterasa y un 2% en
peso de agente tensoactivo. A continuación, se dispone un filtro de
vidrio rectangular de 2 mm x 8 mm (GC50, fabricado por ADVANTEC
LTD, grosor: 0,19 mm) en la posición representada en la figura 1,
de tal forma que este no entra en contacto con el electrodo de
trabajo.
Los orificios de paso 14 y 15 y las muescas 16 y
16 se forman en la posición específica, con el filtro de la vía de
suministro de soluciones de muestra tal como se representa en la
figura 1. Esta disposición delimita la zona en la que la superficie
del filtro no entra en contacto ni con la placa de base aislante ni
con el separador ni con la cubierta que delimitan la vía de
suministro de soluciones de muestra. Las dimensiones de estos
elementos se han indicado previamente haciendo referencia a la
figura 1.
Se añade mediante goteo una solución de muestra
constituida por 20 \mul de una muestra de sangre total en la
unidad de suministro de muestras 12 de la placa de base 1. Se
realizan observaciones visuales a través de la cubierta 8 que se
compone de un material transparente para confirmar que el líquido
que pasa a través del filtro alcanza la parte de la circunferencia
externa del orificio de ventilación 9 de la vía de suministro de
soluciones de muestra. 3 minutos después de la confirmación, se
aplica un impulso de voltaje de +0,5 V al electrodo de trabajo en
la dirección del ánodo con el contraelectrodo como referencia. Se
mide el valor de la corriente eléctrica al cabo de 5 segundos. El
resultado proporciona una respuesta que depende de la concentración
de colesterol en suero.
Aunque en este ejemplo la capa de enzimas/agente
tensoactivo 23 se forma mediante el procedimiento de liofilización,
dicha capa puede formarse mediante el procedimiento de secado por
aire. No obstante, en este último caso, la solubilidad de la capa
de reactivos de reacción se reduce considerablemente. En
consecuencia, la reacción que tiene lugar una vez que el líquido
filtrado alcanza la circunferencia externa del orificio de
ventilación 9 de la vía de suministro de soluciones de muestra se
prolonga mucho.
En el ejemplo 1, el sistema de reactivos de
reacción se compone de la capa de enzimas/agente tensoactivo 23
formada mediante el procedimiento de liofilización sobre la cara
posterior de la cubierta de la vía de suministro de soluciones de
muestra, y de la capa de CMC 21 y la capa de ferricianuro potásico
22 formadas mediante el procedimiento de secado por aire en la
posición especificada que recubre el sistema de electrodos situado
sobre la placa de base. En este ejemplo, como se representa en la
figura 4, el sistema de reactivos de reacción se compone de un
soporte poroso 24, que está en contacto con un extremo del filtro 11
y contiene enzimas, un agente tensoactivo y un mediador electrónico
que se absorben y retienen en el mismo, y de la capa de CMC 21
formada mediante el procedimiento de secado por aire en la posición
especificada que recubre el sistema de electrodos situado sobre la
placa de base.
Con la incorporación de una parte de los
reactivos comprendidos en el sistema de reactivos de reacción en el
soporte poroso, es posible aumentar la solubilidad de los reactivos
de reacción en la solución de muestra, como sucede en el caso del
procedimiento de liofilización.
Como en el ejemplo 1, en el proceso, primero, se
añade mediante goteo una solución acuosa al 0,5% en peso de CMC,
que constituye el polímero hidrofílico, al sistema de electrodos, y
la solución se seca en un secador de aire caliente a 50º C durante
10 minutos para formar la capa de CMC 21.
A continuación, se adhiere y se fija el soporte
poroso 24 realizado en fieltro y recortado con el tamaño de 2 x 4,5
mm, que se compone principalmente de filtros de vidrio, en una
posición especificada de la cubierta de la vía de suministro de
soluciones de muestra representada en la figura 4, con un adhesivo
celulósico (Cemedine C, fabricado por Cemedine Co, Ltd), para que
entre en contacto con un extremo del filtro 11.
A continuación, se añaden mediante goteo 5
\mul de la solución acuosa en la que se ha disuelto, como en el
caso del ejemplo 1, colesterol oxidasa, colesterol esterasa,
ferricianuro potásico y Triton X-100, al soporte
poroso 24, se deja que la solución penetre homogéneamente dentro del
soporte poroso 24, y la solución se seca en un secador de aire
caliente a 50ºC durante 15 minutos.
Como en el ejemplo 1, finalmente se coloca el
filtro y se une el elemento de cubierta a la placa de base 1 para
obtener un biosensor completo. El soporte poroso 24 tiene un grosor
aproximado comprendido entre 0,1 y 0,2 mm. En consecuencia, la
distancia entre la placa de base 1 y la cubierta 8 en la parte de la
vía de suministro de soluciones de muestra que está en la
proximidad del sistema de electrodos se establece en 0,3 mm, que es
significativamente superior a la distancia de 0,1 mm de la
estructura del ejemplo 1, En el ejemplo 2, el filtro 11 utilizado
es un filtro GB100R.
Este biosensor proporciona una respuesta que
corresponde a la concentración de colesterol una vez transcurridos
tres minutos tras la adición mediante goteo de la muestra de sangre
total a la unidad de suministro de muestras.
En los ejemplos anteriores, la placa de base 1 y
la cubierta 8 están fabricadas en un material transparente, con lo
cual es posible observar el estado de flujo de la muestra a simple
vista.
En los ejemplos anteriores, la parte específica
de la hendidura 10 para formar la vía de suministro de soluciones
de muestra, en la que se instala el filtro tiene una anchura igual a
la anchura de la parte que comprende el sistema de electrodos y
recibe un flujo de la muestra que pasa a través del filtro. Una de
estas partes puede ser más estrecha que la otra. En la figura 5, se
representa la relación posicional entre el separador y el filtro y
las formas de dicho ejemplo.
La disposición de los reactivos que constituyen
la capa de reactivos de reacción y el procedimiento de retención de
los mismos no están restringidos a las especificaciones de los
ejemplos anteriores, con tal de que los reactivos del sistema de
reactivos de reacción se disuelvan rápido en la solución de muestra
para asegurar que la reacción enzimática se desarrolle sin
dificultades.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
invención impide de manera eficaz que un componente sólido
comprendido en una solución de muestra, tal como los hematocitos,
entre en contacto con el sistema de electrodos y el sistema de
reactivos de reacción, proporcionando de ese modo un biosensor que
asegura una medición de gran precisión y cuya respuesta presenta
pocas variaciones.
Claims (14)
1. Biosensor, que comprende: una placa de base
aislante (1), un sistema de electrodos que está previsto sobre
dicha placa de base y que por lo menos presenta un electrodo de
trabajo y un contraelectrodo, un elemento de cubierta (8) que se
combina con dicha placa de base para delimitar una vía de suministro
de soluciones de muestra (10) para conducir una solución de muestra
desde una unidad de suministro de muestras hasta dicho sistema de
electrodos, comprendiendo un sistema de reactivos de reacción (22,
23 y 24) por lo menos una enzima de
oxidación-reducción y un mediador de electrones, y
un filtro (11) dispuesto entre dicho sistema de electrodos y dicha
unidad de suministro de muestras en dicha vía de suministro de
soluciones de muestra, presentando dicho biosensor un espacio (14,
15 y 16) que rodea una superficie de dicho filtro en una zona
comprendida entre un extremo de dicho filtro que está en la
proximidad de dicha unidad de suministro de muestras y el otro
extremo de dicho filtro que está en la proximidad de dicho sistema
de electrodos, en el que dicho sistema de reactivos de reacción,
está dispuesto en la vía de suministro de soluciones de muestra, de
tal forma que únicamente una solución de muestra transmitida a
través del filtro alcanza el sistema de reactivos de reacción, y en
el que dicho espacio que rodea la superficie de dicho filtro impide
que cualquier parte de la solución de muestra que no es absorbida
por el filtro sino que fluye directamente desde un espacio situado
en la zona de contacto del filtro con la vía de suministro de
soluciones de muestra que está en la proximidad de la unidad de
suministro de muestras fluya hacia el sistema de electrodos.
2. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicho elemento de cubierta está dispuesto por encima de dicha
placa de base, y dicha vía de suministro de soluciones de muestra
empieza en dicha unidad de suministro de muestras dispuesta sobre
dicha placa de base y se extiende a lo largo de dicho elemento de
cubierta y dicha placa de base.
3. Biosensor según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que dicha unidad de suministro de muestras
está situada a un lado de dicho sistema de electrodos.
4. Biosensor según la reivindicación 2 ó 3, en
el que dicho espacio tiene una anchura comprendida entre 0,5 mm y
5,0 mm.
5. Biosensor según la reivindicación 4, en el
que dicho espacio tiene una anchura comprendida entre 1,0 mm
y
3,0 mm.
3,0 mm.
6. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicha vía de suministro de soluciones de muestra está dispuesta
en la dirección de la gravedad desde dicha unidad de suministro de
muestras situada sobre dicho elemento de cubierta.
7. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicha unidad de suministro de muestras está situada por encima
de dicho sistema de electrodos.
8. Biosensor según la reivindicación 6 ó 7, en
el que la anchura de dicho espacio no es inferior a 100 \mum ni
inferior al grosor de dicho filtro.
9. Biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho filtro es un cuerpo
poroso que presenta unos espacios que se conectan entre sí de una
manera tridimensional, y dicho cuerpo poroso es capaz de desplazar
sangre desde dicha unidad de suministro de muestras hacia dicha vía
de suministro de soluciones de muestra por capilaridad y de filtrar
los hematocitos basándose en la diferencia entre las resistencias
al flujo del plasma y los hematocitos.
10. Biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enzima de
oxidación-reducción es la colesterol oxidasa.
11. Biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicho sistema de reactivos de
reacción comprende una enzima con capacidad para hidrolizar éster
de colesterol.
12. Biosensor según la reivindicación 11, en el
que la enzima con capacidad de hidrolizar éster de colesterol es la
colesterol esterasa.
13. Biosensor según la reivindicación 10, 11 ó
12, en el que dicho sistema de reactivos de reacción comprende un
agente tensoactivo.
14. Biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que una parte o la totalidad de
dicho elemento de cubierta y dicha placa de base aislante son
transparentes.
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