ES2264149T3 - Sensores electroquimicos con selectividad mejorada y sensibilidad aumentada. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE SENSORES ELECTROQUIMICOS, CON PREFERENCIA BIOSENSORES ELECTROQUIMICOS, DONDE LOS ELECTRODOS DE REFERENCIA Y LOS ELECTRODOS DE MEDICION ESTAN SEPARADOS UNO DE OTRO A TRAVES DE UNA FORMACION PLANA ELECTRICAMENTE POROSA NO CONDUCTORA.

Description

Sensores electroquímicos con selectividad mejorada y sensibilidad aumentada.

La presente invención describe sensores amperométricos, preferiblemente biosensores electroquímicos. Se describe también un procedimiento para la fabricación de biosensores amperométricos para el campo del diagnóstico de fluidos corporales.

El uso de biosensores amperométricos, especialmente en el campo del diagnóstico de azúcar en sangre, es estado de la técnica desde hace algunos años.

Se describen dichos productos, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 4545382, en los documentos EP 127958, EP 351891 y solicitud EP 0471986. Los correspondientes sistemas de ensayo están disponibles comercialmente con los nombres de producto Medisense®, ExacTex® y Glucocard®. Permiten un sencillo diagnóstico del azúcar en sangre en condiciones de usuario doméstico.

Han conseguido una importancia especial los biosensores amperométricos con glucosaoxidasa como componente receptor. Como se describe detalladamente en Anal. Chem. 1990, 62, 1111 a 1117, mediante la reacción de glucosa con glucosaoxidasa se produce una cantidad de peróxido de hidrógeno proporcional a la concentración de azúcar.

Sin embargo, ya que la oxidación anódica H_{2}O_{2} \rightarrow O_{2}+ 2H^{+}+ 2e^{-} requiere una tensión celular relativamente alta (aprox. 600 mV), pueden aparecer problemas de interferencia indeseados en el análisis de sangre completa. A la tensión anteriormente citada, determinados componentes sanguíneos, como ácido ascórbico, reaccionan igualmente, apareciendo entonces resultados falsos positivos.

Con vistas a la mejora de la selectividad en sensores amperométricos, se ha desarrollado por tanto el concepto de los mediadores. Los mediadores utilizados frecuentemente en los biosensores de la denominada segunda generación son, por ejemplo, ferrocenos o hexacianoferrato de potasio K_{3}F(CN)_{6}. La determinación amperométrica de azúcar en sangre se desarrolla en este caso según el siguiente esquema de reacción:

(1)

Glucosa + GO (FAD) \rightarrow gluconolactona + GO (FADH_{2})

(2)

GO (FADH_{2}) + Fe(III)(CN)_{6}^{3-} \rightarrow Fe(II)(CN)_{6}^{4-} + GO (FAD) + H^{+}

(3)

Fe(II)(CN)_{6}^{4-} \rightarrow Fe(III)(CN)_{6}^{3-}+ e^{-}.

La determinación amperométrica de azúcar en sangre se limita metrológicamente por tanto a la oxidación anódica descrita en (3), que transcurre a un potencial de +360 mV. Dichos biosensores modificados con mediador presentan por tanto una selectividad aumentada.

Con vistas a resultados reproducibles, debe reducirse lo más completamente posible la reacción secundaria controlada por O_{2} GO (FADH_{2}) + O_{2} \rightarrow GO (FAD) + H_{2}O_{2}.

La constitución de un agente de ensayo adecuado contiene, además de los reactivos de análisis necesarios, por ejemplo, glucosaoxidasa y hexacianoferrato de potasio, al menos dos electrodos (electrodo de trabajo y electrodo de referencia) que deben ponerse en contacto mediante un puente electrolítico.

Como materiales de electrodo se tienen en cuenta los metales nobles correspondientes del estado de la técnica, como paladio, platino, oro, plata y cobre o grafito, en los que el ánodo (electrodo de trabajo) y el cátodo (electrodo de referencia) pueden fabricarse a partir de distintos materiales o a partir del mismo material, y pueden poseer superficies de igual tamaño o distinto tamaño.

El desarrollo del ensayo en los sistemas disponibles comercialmente para los pacientes se limita al suministro del fluido de muestra (sangre completa), indicándose digitalmente el valor de análisis al cabo de al menos un minuto.

Sin embargo, el desarrollo real de la reacción en la que se oxida el analito (glucosa) y se reduce el mediador está controlado metrológicamente de modo que observen las siguientes etapas:

a)

toma de sangre y desarrollo de la reacción correspondiente a (1) a (2),

b)

después de observar un tiempo de reacción conocido de aprox. 5 a 30 s, se aplica una tensión constante de aprox. 400 mV, teniendo lugar la oxidación anódica descrita en (3),

c)

después de un tiempo de espera corto, se mide la corriente.

La valoración analítica se realiza en el campo de las corrientes límites de difusión, en el que según la denominada ecuación de Cottrell

ecuación (A)i(t)= \frac{n \cdot F \cdot A \cdot \sqrt{D} \cdot C}{\sqrt{\pi} \cdot \sqrt{t}}

i= corriente

n= número de electrones en la reacción de electrodo

F= constante de Faraday

D= coeficiente de difusión

C= concentración del analito

A= superficie del electrodo de trabajo

D= grosor de la capa límite de difusión sobre el electrodo de trabajo

t= tiempo.

Para satisfacer estas condiciones, es necesario que la forma oxidada del mediador rédox (K_{3}Fe(CN)_{6}) en el contraelectrodo supere claramente la concentración de la forma reducida del mediador (K_{4}Fe(CN)_{6}) en el electrodo de trabajo.

Los agentes de ensayo que posibilitan una aplicación separada del sistema mediador, por ejemplo hexacianoferrato de potasio (K_{3}Fe(CN)_{6}), sobre el contralelectrodo, así como del receptor enzimático (GO) sobre el electrodo de trabajo, dado el caso fijado mediante inmovilización, deberían en consecuencia ser ventajosos.

Los sistemas de ensayo con zonas reactivas separadas pueden ser también ventajosos con vistas a la estabilidad a largo plazo del sistema reactivo.

En una serie de distintas publicaciones, se citan otras características de propiedades deseables para biosensores electroquímicos que pueden contribuir a una optimización del sistema general.

Se citan a continuación algunas importantes:

- Aumento adicional de la selectividad

La memoria de patente europea 0276782 describe electrodos enzimáticos con capas de albúmina reticuladas mediante glutaraldehído que, debido a su permeabilidad, protegen al electrodo de trabajo de componentes interferentes electroactivos, particularmente de proteínas de alto peso molecular.

Se describe el uso de membranas sintéticas para la exclusión de glóbulos rojos de celdas electroquímicas en la solicitud de patente europea 0289265.

En el documento WO 94/27140 se describen sensores electroquímicos con membranas de exclusión de eritrocitos que contienen agentes de aglutinación de eritrocitos móviles.

En la solicitud de patente europea 0546536 se describe un sistema con un electrodo de trabajo de dos piezas compuesto por un campo exento de enzima y un campo que contiene enzima, en el que en primer lugar se registran los componentes interferentes oxidables no reaccionables enzimáticamente, como ácido ascórbico. Después, se determina calculando el valor de azúcar en sangre real corregido a partir de las medidas de potencial individual.

Nankai y col. describen en el documento WO 86/07642 un sistema de tres electrodos que, además de electrodo de trabajo y electrodo de referencia, contiene también un electrodo base que equilibra la dependencia de la tensión celular de la corriente celular.

- Aumento de la sensibilidad del sensor

Se describe en el documento EP 0385964 el aumento de la sensibilidad mediante la ampliación de la superficie del electrodo correspondientemente a la ecuación (A).

- Manejabilidad mejorada

Nankai y col. describen en la solicitud europea 0471986 la fabricación de un sistema de ensayo amperométrico de azúcar en sangre con sensores individuales, caracterizándose este sistema por una manejabilidad especialmente buena. El sensor individual insertado en el aparato de valoración amperométrica se pone en contacto mediante la punta del sensor con la gota de sangre a analizar. Mediante un microcapilar (sistema de flujo capilar), se transporta sangre completa al espacio de trabajo del sensor (electrodo de trabajo o de referencia más reactivos de análisis). En este momento, se disuelven los reactivos de análisis (GO/K_{3}Fe(CN)_{6}) en el fluido a analizar (sangre) y se desarrolla la reacción de análisis ya citada. En caso de humedecer ambos electrodos con sangre, condición para una capacidad de funcionamiento libre de interferencias, se realiza automáticamente el arranque del aparato de análisis debido al valor de resistencia reducido. El aparato puede manejarse por tanto sin ningún botón de mando. Con vistas a una obtención de sangre poco dolorosa, la cantidad de sangre necesaria se mantiene al mínimo posible, y por tanto se limita el volumen del sistema microcapilar a aproximadamente 5 \mul. Desde el espacio de reacción limitado por el microcapilar, las pistas conductoras se dirigen a través de la pieza de sensor extendida hacia la toma de corriente, por tanto, está excluida una contaminación de piezas de función importantes en el aparato de valoración.

Para la fabricación de los biosensores de glucosa en sangre citados se utiliza habitualmente el procedimiento de tecnología de serigrafía.

Para el proceso de impresión de la pieza de electrodo (transductor) se utilizan pastas de serigrafía comercialmente disponibles, por ejemplo, basadas en grafito o plata (compañía Acheson), que se impresionan sobre materiales soporte como cerámica o láminas de plástico. A este respecto, son necesarias varias etapas consecutivas de impresión y secado (pistas conductoras, electrodos de trabajo, electrodos de referencia, capas dieléctricas).

Las pastas de serigrafía, que contienen con vistas a la procesabilidad una serie de distintos aditivos como antiespumantes, agentes tixotrópicos y detergentes, presentan a menudo elevadas carencias respecto a la reproducibilidad.

Frecuentemente, las superficies de electrodo serigrafiadas deben activarse todavía mediante tratamiento con plasma. Debido a la alta proporción de aglutinante relativamente hidrófobo, sus superficies son, a saber, más hidrófobas, mal humedecidas y de conductividad altamente reducida frente al material conductor puro, por ejemplo, grafito o plata.

Deben tenerse en cuenta otras desventajas del tratamiento con plasma, como envejecimiento u obtención de grupos superficiales activos rédox no deseados. A continuación de la fabricación de la pieza de electrodo se realiza la aplicación de la formulación de reactivo de análisis, por ejemplo, glucosaoxidasa (GO) y hexacianoferrato de potasio en el caso de análisis de azúcar en sangre. En este momento, cada superficie de trabajo individual del sensor debe dotarse individualmente, aplicándose igualmente o bien el procedimiento de tecnología de serigrafía o el costoso procedimiento de micropipeteado.

En un tercer proceso del procedimiento, se aplica finalmente el sistema microcapilar mediante adhesión de las correspondientes láminas premoldeadas, que deben proveer dado el caso capas hidrófilas con vistas a una buena humectabilidad.

Observado en conjunto, se trata pues de un proceso de fabricación relativamente complicado.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente un procedimiento para la fabricación de sensores electroquímicos que simplifica claramente con vistas a la fabricación y es más seguro con vistas a la reproducibilidad.

El procedimiento según la invención permite especialmente reunir en un sistema las propiedades pretendidas descritas en el texto, que deben conducir a una mejora del producto. En el estado actual, estos perfiles de propiedades combinadas e integrales todavía no se han puesto en práctica.

Así, es posible un aumento de la sensibilidad (susceptibilidad) de manera sencilla mediante una ampliación de la superficie de la matriz reactiva, sin que los volúmenes de muestra necesarios (por ejemplo, gota de sangre) deban aumentar claramente, como en el sistema convencional.

Es posible un aumento de la selectividad mediante la integración de capas de separación porosas. Como se describe con detalle a continuación, pueden integrarse procesos de separación aumentadores de la selectividad en distintas capas de sensor, a saber, por ejemplo, electrodo de referencia poroso, membranas como matriz reactiva y, dado el caso, mediante recubrimiento de membrana del electrodo de trabajo.

Para la ilustración de los sistemas sensores según la invención servirá la Fig. 1:

Se aplica sobre una lámina de grafito (2), que está fijada sobre una lámina base (1), una matriz reactiva (membrana) (3) con una superficie en el intervalo de varios mm^{2}. Sobre ella, se sujeta mediante una cinta adhesiva doble perforada (4) una tira de un fieltro de grafito (5). Como cubierta superior, se pega finalmente una lámina perforada (6). El volumen de muestra necesario puede definirse mediante la integración de una zona de retención de fluido en el fieltro de grafito, por ejemplo, detrás de la matriz reactiva (membrana) (3).

La puesta en contacto del potenciostato se realiza en (7) para la capa de fieltro de grafito (electrodo de referencia, cátodo), así como en (8) para la lámina de grafito (electrodo de trabajo, ánodo). La toma de muestra puede realizarse por el lado delantero (9) del fieltro de grafito, con lo que aparece un transporte de fluido en la dirección de la matriz reactiva, como se describe en los ejemplos.

A continuación, se describen detalladamente los componentes usados o posibles para las capas funcionales individuales.

a) Electrodo de trabajo

Se utilizan preferiblemente láminas de grafito que están disponibles con los nombres comerciales Sigraflex® de la compañía SGL CarbonGroup.

Los parámetros importantes para esta finalidad de uso son:

Resistencia eléctrica específica:

8 a 10 \Omega\mum paralelamente a la capa

\quad

600 a 650 \Omega\mum perpendicularmente a la capa

Grosor de capa:

0,25 a 1,00 mm

Pureza:

>99,85%.

Con vistas al aumento de la selectividad de reacción, puede proveerse la superficie de grafito orientada a la matriz reactiva (3), como se describe después en los ejemplos, con una capa de membrana integral, pudiéndose tratar de una membrana microporosa o de una capa de membrana hinchable exenta de poros.

Como alternativa a las láminas de grafito, pueden utilizarse otros materiales de electrodo conocidos como oro, plata o platino.

No es necesario un tratamiento con plasma para la mejora de la humectabilidad o para el aumento de la conductibilidad.

b) Matriz soporte permeable

Los fabricados planos permeables que se tienen aquí en cuenta pueden seleccionarse del grupo de los fieltros poliméricos, por ejemplo, de poliéster o polivinilalcohol, tejidos poliméricos, por ejemplo, de poliamida o poliéster o preferiblemente del grupo de membranas poliméricas.

Las membranas poliméricas preferidas son aquellas que acompañan a los grupos de microfiltración, y que se encuentran en el intervalo de poro de aprox. 0,1 a 10 \mum, de forma especialmente preferida en el intervalo de 0,3 a 5 \mum, y que se caracterizan por una buena humectabilidad. Son ejemplos de ellas membranas de poliamida (Biodyne®) de la compañía PALL, membranas de poli(fluoruro de vinilo) hidrofilizadas (Durapore®) de la compañía Millipore, membranas de polisulfona hidrofilizadas (Supor®) de la compañía Gelmann o membranas de mezcla polimérica como se describen en el documento US 5124128.

Los tipos de membrana utilizados pueden ser autosoportados o soportados por soporte, pudiendo componerse el material soporte de fieltro polimérico o tejido polimérico, y pudiendo integrarse central o lateralmente en la capa de membrana. En lo que respecta a la constitución estructural, las membranas utilizadas pueden ser asimétricas o simétricas.

Una ventaja especial de los sensores según la invención se basa en el carácter dual de estas matrices reactivas especiales, que ejercen tanto funciones portadoras de reactivo como funciones de separación.

La selección de la matriz soporte permeable adecuada se adapta según el caso de aplicación especial. Así, son especialmente bien adecuadas, por ejemplo para el ensayo de azúcar en sangre, aquellas membranas que dejan permear bien el plasma, pero que retienen los glóbulos rojos sanguíneos.

También es posible utilizar aquellos sistemas de matriz soporte que posibilitan una inmovilización de los reactivos de análisis, por ejemplo, glucosaoxidasa. Serían entonces formas de realización concebibles, por ejemplo, biosensores de funcionamiento continuo o reutilizables.

Con vistas a reacciones de análisis de varias etapas, por ejemplo ensayo de colesterol, pueden combinarse también varios sistemas de matriz soporte uno encima de otro. Proporcionan entonces múltiples posibilidades con vistas a la introducción de los reactivos de análisis, así como para la separación de los componentes interferentes indeseados.

Como se describe algo más detalladamente a continuación en el ejemplo del ensayo de azúcar en sangre, existen ya en las variantes de matriz monocapa distintos tipos de posibilidades de introducción de reactivos, en comparación con la serigrafía o el micropipeteado, que son de interés, por ejemplo, con vistas a la actuación de la reacción o a la estabilidad a largo plazo:

La matriz soporte puede impregnarse en el caso más sencillo mediante procedimientos de impregnación convencionales, por ejemplo, con glucosaoxidasa y hexacianoferrato de potasio.

También es posible recubrir un preparado reactivo pastoso sobre uno o ambos lados de la matriz, pudiendo combinarse también procedimientos de impregnación y recubrimiento.

Así, por ejemplo, como se describe detalladamente en los ejemplos, en un procedimiento preferido para el ensayo amperométrico de azúcar en sangre, la matriz soporte se impregna con hexacianoferrato de potasio, mientras que se aplica una formulación de glucosaoxidasa pastosa sobre el lado orientado hacia el electrodo de trabajo.

Sin embargo, en todas las formas de introducción de reactivos es evidente que, en comparación con procedimientos como serigrafía o micropipeteado, no puede utilizarse dotado de sensor individual sino procedimientos establecidos en el diagnóstico de tiras reactivas convencionales, de lo que resultan ventajas industriales considerables.

Las superficies de matriz reactiva utilizadas para el sensor individual pueden variar igualmente en un intervalo relativamente amplio. Así, pueden obtenerse, por ejemplo, para analitos menos sensibles o presentes en un intervalo de concentración más bajo, con la ayuda de superficies de matriz reactiva mayores, correspondientemente a la ecuación (A), señales de respuesta a la dosis todavía bien interpretables, sin que sean necesarios volúmenes de muestra (por ejemplo sangre) desproporcionadamente grandes.

Debido a la posibilidad de poder aumentar la sensibilidad mediante la superficie de matriz reactiva, los sensores según la invención son de gran interés especialmente también para sistemas de análisis inmunoquímico.

Las superficies de matriz practicables se encuentran en el intervalo de varios mm^{2}. Como se describe en los ejemplos, se utilizaron para la evaluación del ensayo de azúcar en sangre discos de matriz de forma circular con un diámetro de 3 mm, que corresponde a una superficie de aproximadamente 7 mm^{2}.

Para el funcionamiento de los biosensores así fabricados, sorprendentemente eran suficientes volúmenes de ensayo en el intervalo de aprox. 2 \mul, pudiendo conseguirse en comparación con los biosensores de azúcar en sangre conocidos hasta ahora rendimientos de corriente claramente mayores (valores aumentados aprox. 8 veces).

Los biosensores convencionales que comprenden superficies de electrodo de trabajo de aprox. 1 a 2 mm^{2} necesitan cantidades de volumen de muestra (sangre) de al menos 5 \mul, y consiguen un rendimiento de corriente en el intervalo de aprox. 0,1 a 20 \muA.

Los sistemas sensores que pueden trabajar con volúmenes de muestra mínimos son de interés especialmente en el marco del denominado concepto "mínimamente invasivo" (documento PCT WO 95/10223), en el que fijan como objetivo valores de 2 \mul o menos.

c) Electrodo de referencia conductor poroso

Como material preferido se utilizaron, como ya se ha citado, fieltros de grafito, que se pueden obtener, por ejemplo, con el nombre comercial Sigrafil® SPC 7011 de la compañía SGL Carbon Group.

Se trata a este respecto de fieltro negro muy resistente al desgarro con un gramaje de 30 g/m^{2}, un grosor de 0,5 mm, un diámetro medio de fibra de 7 \mum y un sistema aglutinante de polivinilalcohol reticulado, cuya proporción se encuentra de aprox. el 20 al 24% en peso.

Como ya se ha indicado, este material se caracteriza por dos propiedades especiales que son de interés para la fabricación de biosensores electrónicos. Son éstas las capacidades de transporte de fluido muy rápida y suavemente, tanto en dirección vertical como horizontal, así como su conductividad eléctrica, encontrándose la resistencia eléctrica específica en el intervalo de aprox. 10 \Omega\mum.

Esta capa de fieltro de grafito ejerce por tanto simultáneamente la función de transporte capilar de fluido así como de electrodo de referencia.

Dichas capas de fieltro de grafito en combinación con agentes aglutinantes como lectinas pueden efectuar también de modo excelente una separación de sangre/plasma.

Dichos procesos de separación son de gran interés en el análisis de muestras de sangre con respecto a la reducción de la influencia del hematocrito.

Como alternativa a los fieltros de grafito citados, pueden utilizarse también otros tejidos porosos conductores eléctricos, como tejidos, fieltros o membranas metalizados, que pueden tratarse para mejorar la humectabilidad con sustancias tensioactivas.

Como ejemplo de un tejido conductor eléctrico adecuado se citan los tipos Metalen 120 a 34T de la compañía SEFAR.

Se trata a este respecto de un tejido de poliéster mutihilo niquelado.

Las membranas conductoras se pueden obtener, por ejemplo, en la compañía Millipore basadas en plata pura.

Con el fin de obtener electrodos de referencia porosos conductores, también es posible utilizar membranas convencionales que se metalizan según un procedimiento corriente.

d) Láminas de plástico

La lámina base (1) o la lámina superior de recubrimiento (6) puede seleccionarse, en principio, sin un gran procedimiento de selección a partir del amplio surtido de láminas de plástico.

Sin embargo, con vistas a la estabilidad mecánica de la tira de biosensor, se prefieren láminas con determinadas rigideces y grosores de capa.

Se utilizaron, por ejemplo, láminas de poliéster, policarbonato y PVC en el intervalo de grosor de aprox. 100 a 300 \mum, que eran parcialmente transparentes o pigmentadas.

Con respecto a un transporte de fluido mejorado, puede ser ventajoso cuando el lado interno de la lámina de recubrimiento porta una capa de sustrato hidrófilo. Dichas láminas modificadas se obtienen, por ejemplo, en el surtido de láminas estándar de las compañías ICI o DuPont.

El pegado o laminado de las capas individuales puede realizarse, como se ha citado, con ayuda de cintas adhesivas, adhesivos de fusión en caliente o uno de los procedimientos de exudación conocidos.

Ejemplo

Se constituyó un agente de ensayo amperométrico según la fig. 1:

(1)

Lámina base (lámina de policarbonato, 250 \mum de grosor)

(2)

Lámina de grafito (Sigraflex®, con cinta adhesiva doble sujeta a (1))

(3)

Membrana reactiva (Biodyne®, compañía PALL, impregnada con glucosaoxidasa y hexacianoferrato de potasio)

(4)

Cinta adhesiva doble

(5)

Fieltro de grafito (Sigratex® SPC 7011)

(6)

Lámina de recubrimiento (lámina de policarbonato, 250 \mum de grosor).

Se realizó la puesta en contacto del amperímetro con el fieltro de grafito en (7) (cátodo, electrodo de referencia) o en la lámina de grafito en (8) (ánodo, electrodo de trabajo).

El suministro de muestra (3 \mul) se realizó en la parte delantera (9) del fieltro de grafito con ayuda de una pipeta. Así, se produjo un transporte de fluido capilar en la dirección de la matriz reactiva.

Preparación de la matriz reactiva:

a) Impregnación con hexacianoferrato de potasio

Se impregnó una membrana de nailon de la compañía PALL (Biodyne, 0,45 \mum) con una disolución de hexacianoferrato de potasio al 20%, y se secó.

b) Introducción de la glucosaoxidasa

Con ayuda de un agitador de giro rápido (disolvedor), se fabricó una solución de vertido que contenía una glucosaoxidasa a partir de los siguientes componentes:

4,42 g de poli(óxido de etileno) 300.000 (Union Carbide)

84,08 g de tampón citrato (0,01 M, pH= 6,5)

0,58 g de 1-octanol

3,84 g de Aerosil® (sílice altamente dispersada, compañía Degussa)

0,12 g de tensioactivo FC-170C (compañía 3M)

7,00 g de glucosaoxidasa (150 \mug/mg).

Después de desgasificar, se recubrió esta solución de vertido con ayuda de una rasqueta (aplicación húmeda de 50 \mum) sobre la membrana de nailon impregnada con hexacianoferrato de potasio, y se secó con aire caliente.

Con ayuda de una punzonadora de revólver, se troquelaron en la membrana reactiva así fabricada recortes redondeados con un diámetro de 3 mm.

Después del montaje del formato representado en la Fig. 1, se llevaron a cabo series de ensayos amperométricos a 400 mV con las siguientes disoluciones de ensayo:

a) Disoluciones generales acuosas

0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 mg/dl de glucosa.

Se observaron tiempos de medida de 30 s, obteniéndose correspondientemente a la ecuación de Cottrell curvas cronoamperométricas decrecientes con 1/t. Correspondientemente a la concentración de glucosa creciente, se obtuvieron valores de densidad de corriente crecientemente elevados.

b) Sangre completa

Se aplicó sangre completa fresca con un valor de glucosa de 104 mg/dl análogamente a a). Resultó una curva de medida que era en gran medida congruente con la curva a 100 mg/dl de a).

2. Ejemplo

Fabricación de láminas de grafito recubiertas con membrana a) Capa de membrana porosa

Con ayuda de un agitador de giro rápido (disolvedor), se fabricó una disolución de vertido a partir de los siguientes componentes:

Dralon L	(Bayer AG)	50,0 g
Ultason E	(BASF)	50,0 g
Aerosil 200	(Degussa)	30,0 g
Pluriol P 600	(BASF)	90,0 g
N-metilpirrolidona	(NMP)	484,0 g.

Después de desgasificar, se recubrió esta solución de vertido con ayuda de una rasqueta (aplicación húmeda de 150 \mum) sobre la lámina de grafito (Sigraflex), y se sumergió en un baño de agua. Después de secar e impregnar con glucosaoxidasa y hexacianoferrato de potasio, se troqueló, como se describe en el ejemplo 1, un disco de membrana de 3 mm de diámetro y se configuró igualmente al formato descrito en el ejemplo 1.

En la valoración cronoamperométrica, se obtuvieron a concentraciones crecientes de glucosa densidades de corriente crecientes, análogamente al ejemplo 1a.

b) Capa de membrana hinchable no porosa sobre lámina de grafito

Con ayuda de un agitador de giro rápido, se fabricó una disolución de vertido a partir de los siguientes componentes:

8,77 g	dispersión acuosa de poliuretano DLS	(Bayer AG)
9,66 g	poli(óxido de etileno) 300.000	(Union Carbide)
0,06 g	Pluronic PE 6400	(BASF)
1,20 g	tampón citrato (0,1 M, pH= 6,5)
0,34 g	Aerosil 200	(Degussa)
1,00 g	glucosaoxidasa (154 U/mg).

Después de desgasificar, se recubrió esta disolución de vertido con ayuda de una rasqueta (aplicación húmeda de 100 \mum) sobre una lámina de grafito (Sigraflex®), se secó y se troqueló (discos circulares de 3 mm).

El electrodo de trabajo así recubierto se utilizó correspondientemente a (3) de la Fig. 1. En la valoración con disoluciones acuosas de glucosa a una tensión aplicada de 600 mV, se midieron a concentraciones crecientes de glucosa densidades de corrientes crecientes, análogamente al ejemplo 1a.

Resultados de los sensores de glucosa con láminas de grafito recubiertas con membrana:

Mientras que las disoluciones acuosas de glucosa pura dieron resultados en gran medida análogos al ejemplo 1, con los sistemas de sensor modificados con membrana se obtuvieron resultados mejorados con vistas a las disoluciones de ensayo que contenían conjuntamente componentes interferentes (ácido ascórbico, acetaminofeno).

Se eliminó de forma prácticamente total una alteración falsa positiva por compuestos interferentes.

Claims (11)

1. Sensor amperométrico que contiene un electrodo de trabajo y un electrodo de referencia, así como al menos un reactivo de análisis, caracterizado porque el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia están separados entre sí por un fabricado plano permeable no conductor eléctrico que presenta un reactivo de análisis, y porque el electrodo de referencia está compuesto por un fabricado plano poroso conductor eléctrico que sirve para el transporte capilar de fluido desde una zona de suministro de muestra al fabricado plano permeable no conductor eléctrico.

2. Sensor según la reivindicación 1, caracterizado porque el fabricado plano permeable no conductor eléctrico está compuesto por un material poroso, por ejemplo, fieltro, papel, tela, membrana o por una capa de membrana hinchable no porosa.

3. Sensor según las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el fabricado plano permeable no conductor eléctrico está constituido por varias capas.

4. Sensor según la reivindicación 3, caracterizado porque las capas individuales contienen distintos reactivos de análisis.

5. Sensor según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el fabricado plano permeable no conductor eléctrico tiene una superficie en el intervalo de algunos mm^{2}, preferiblemente en el intervalo de 7 mm^{2}.

6. Sensor según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el fabricado plano permeable no conductor eléctrico tiene un tamaño de poro en el intervalo de 0,1 a 10 \mum, preferiblemente en el intervalo de 0,3 a 0,5 \mum.

7. Sensor según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque los reactivos de análisis se ponen en contacto con el fabricado plano permeable no conductor eléctrico mediante impregnación o recubrimiento.

8. Sensor según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque los reactivos de análisis son glucosaoxidasa y hexacianoferrato de potasio.

9. Sensor según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el fabricado plano poroso no conductor eléctrico está compuesto por tela, fieltro o membrana metalizados.

10. Sensor según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el fabricado plano poroso conductor eléctrico está compuesto por un material de fibra de grafito hidrófilo, preferiblemente fieltro de grafito, o por un fieltro hidrófilo no conductor con una lámina conductora de metal o grafito superpuesta.

11. Sensor según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el fabricado plano poroso conductor eléctrico contiene otros reactivos.