ES2260305T3 - Biosensor. - Google Patents
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Abstract
Biosensor que comprende: una placa base aislante; un sistema de electrodos que presenta un electrodo de medición y un contraelectrodo dispuesto en dicha placa base; una capa de reacción que comprende por lo menos una oxirreductasa y un mediador electrónico; una vía de suministro de la solución de muestra que incluye dicho sistema de electrodos y dicha capa de reacción; una unidad de suministro de muestra; y un filtro (20) previsto entre dicha unidad de suministro de muestra y dicha vía de suministro de la solución de muestra para eliminar por filtración los hemocitos de la sangre, en el que el plasma de dicha sangre, con dichos hemocitos que han sido eliminados por filtración mediante dicho filtro, es aspirado al interior de dicha vía de suministro de la solución de muestra debido al fenómeno capilar, en el que dicho filtro presenta en el lado corriente arriba del mismo, un área de sección transversal (F1) mayor que el área de la sección transversal de la abertura (S1) de dicha vía de suministro de la solución de muestra y también mayor que el área de la sección transversal (F2) en el lado corriente abajo del mismo, estando situado dicho lado corriente abajo en dicha abertura de dicha vía de suministro de la solución de muestra.
Description
Biosensor.
La presente invención se refiere a un biosensor,
particularmente a un sensor de colesterol, el cual puede
cuantificar fácilmente un componente específico de una muestra con
mucha rapidez y con gran exactitud.
A continuación se describe un sensor de glucosa,
como ejemplo de biosensor convencional.
Un procedimiento generalmente conocido de
cuantificación de la glucosa es un sistema que utiliza una
combinación de glucosa oxidasa con un electrodo de oxígeno o un
electrodo de peróxido de hidrógeno. La glucosa oxidasa oxida
selectivamente la \beta-D-glucosa,
como sustrato, a
D-glucono-\delta-lactona,
utilizando oxígeno como mediador electrónico. Durante este proceso
de reacción, el oxígeno se reduce a peróxido de hidrógeno. En este
caso, la glucosa se cuantifica tanto a través de la medición de la
cantidad de oxígeno consumida con la utilización del electrodo de
oxígeno, como mediante la medición de la cantidad de peróxido de
hidrógeno generado utilizando, por ejemplo, un electrodo de
platino.
No obstante, los procedimientos tales como el
descrito anteriormente están muy influidos por la concentración de
oxígeno disuelto en el caso de algunos objetos de medición, o
resultan imposibles de llevar a cabo en condiciones de ausencia de
oxígeno. Por lo tanto, se ha desarrollado un sensor de glucosa de
esta clase que utiliza, como mediador electrónico, un complejo
metálico o un compuesto orgánico tal como ferricianuro de potasio,
un derivado de ferroceno y un derivado de quinona, sin utilizar
oxígeno como mediador electrónico (ver la publicación de patente
japonesa abierta al público Hei
2-062952).
Para construir este biosensor, se forma un
sistema de electrodos, que comprende un electrodo de medición, un
contraelectrodo y un electrodo de referencia, sobre una placa base
aislante mediante, por ejemplo, serigrafía, y a continuación se
forma sobre el sistema de electrodos una capa de reacción
enzimática que comprende un polímero hidrófilo, una oxirreductasa y
un mediador electrónico. En caso necesario, se añade adicionalmente
un tampón a esta capa de reacción enzimática.
Cuando una muestra de solución que contiene el
sustrato se vierte gota a gota sobre la capa de reacción enzimática
de este biosensor, la capa de reacción enzimática se disuelve y la
enzima reacciona con el sustrato, provocando dicha reacción la
reducción del mediador electrónico. La concentración del sustrato en
la solución de muestra puede determinarse mediante una corriente de
oxidación para oxidar electroquímicamente el mediador electrónico
así reducido, una vez finalizada la reacción enzimática.
Conforme a esta clase de sensor, la forma
reducida del mediador electrónico generada como consecuencia de la
reacción enzimática es oxidada por el electrodo, y puede
determinarse la concentración de glucosa mediante la corriente de
oxidación.
Este tipo de biosensor puede utilizarse, en
principio, para medir diversas sustancias utilizando una enzima
cuyo sustrato es cada una de las sustancias que deben medirse. Por
ejemplo, el nivel de colesterol en suero, que se utiliza como
índice de diagnóstico en diversas instituciones médicas, puede
medirse utilizando, como oxirreductasa, colesterol oxidasa o
colesterol deshidrogenasa y colesterol esterasa.
La reacción enzimática de la colesterol esterasa
avanza muy lentamente. Añadiendo a la misma un surfactante
adecuado, puede aumentar la actividad de la colesterol esterasa para
poder reducir el tiempo necesario para la reacción total.
No obstante, ya que de este modo el sistema de
reacción contiene un surfactante, que afecta negativamente a los
hemocitos, ha resultado imposible utilizando sangre completa.
Como se ha descrito anteriormente, en el caso de
la medición del nivel de colesterol en sangre, el sistema de
reacción contiene un surfactante que afecta negativamente a los
eritrocitos de la sangre. Por esta razón ha sido imposible que
sensores tales como los sensores de glucosa midan una sangre
completa per se. Se ha efectuado una propuesta para
suministrar un elemento de filtro cerca de la abertura de la vía de
acceso de suministro de la solución de muestra, para suministrarle
únicamente el plasma de la sangre, habiendo sido eliminados
previamente de la misma por filtración los eritrocitos. Se dan a
conocer ejemplos de un sistema de esta clase en las patentes US nº
5.609.749; US nº 5.658.444; JP 11344461 y EP 0 856 586. No obstante,
la velocidad del flujo de plasma filtrado en el interior del sensor
es baja e inconstante, de modo que los valores de respuesta varían,
y con frecuencia se generan burbujas cuando el plasma entra al
interior del sensor, haciendo imposible la medición.
Un objetivo de la presente invención es disponer
un biosensor perfeccionado que no adolezca de los inconvenientes
anteriormente descritos y que permita que el plasma sanguíneo, una
vez eliminados los eritrocitos por filtración, reaccione
rápidamente con el sistema de electrodos.
Otro objetivo de la presente invención es
disponer un sensor de colesterol muy exacto y con características
de respuesta superiores, y que permita efectuar la medición en
sangre completa.
El biosensor según la presente invención
comprende: una placa base aislante; un sistema de electrodos que
presenta un electrodo de medición y un contraelectrodo dispuesto en
la placa base; una capa de reacción que comprende por lo menos una
oxirreductasa y un mediador electrónico; una vía de suministro de la
solución de muestra que incluye el sistema de electrodos y la capa
de reacción; una unidad de suministro de muestra; y un filtro
dispuesto entre la unidad de suministro de muestra y la vía de
suministro de la solución de muestra para eliminar por filtración
los hemocitos de la sangre, en el que el plasma de la sangre, con
los hemocitos habiendo sido eliminados por filtración mediante el
filtro, es aspirado al interior de la vía de suministro de la
solución de muestra debido al fenómeno capilar, caracterizado porque
el filtro presenta en el lado corriente arriba del mismo, un área
de sección transversal mayor que el área de la sección transversal
de la abertura de la vía de suministro de la solución de
muestra.
El filtro aquí utilizado comprende un cuerpo
poroso que presenta poros interconectados de forma tridimensional.
Dicho cuerpo poroso, debido a la acción capilar, desplaza dicha
sangre desde el lado de la unidad de suministro de muestra al lado
de la vía de suministro de la solución de muestra, y ejerce la
función de eliminar por filtración hemocitos gracias a las
diferencias de las resistencias de flujo entre el plasma y los
hemocitos. Los materiales que deben utilizarse para este filtro son
telas no tejidas, papeles de filtro y otros cuerpos porosos,
incluyendo fibras, preferentemente fibras hidrófilas, tales como
fibra de vidrio, celulosa y pasta de madera.
El área de la sección transversal del filtro en
el lado corriente arriba del mismo debe ser preferentemente igual o
mayor que el área de la sección transversal en el lado corriente
abajo del mismo, estando situado en dicha abertura de la vía de
suministro de la solución de muestra.
La figura 1 es una vista en sección transversal
vertical de un biosensor según una forma de realización de la
presente invención.
La figura 2 es una vista en planta del mismo
sensor del cual se han eliminado la capa de reacción, el separador
y la cubierta.
La figura 3 es una vista explosionada oblicua
del mismo sensor.
La figura 4 es una vista ampliada en sección
transversal de la parte principal del mismo sensor.
La figura 5 es una vista esquemática en sección
transversal vertical que muestra ejemplos de estructuras de
unidades de suministro de muestra para el sensor.
La figura 6 es una vista esquemática de planta
que muestra ejemplos de modificaciones de filtros para el
sensor.
La figura 7 es una vista esquemática en sección
transversal vertical que muestra ejemplos de modificaciones de los
filtros para el sensor.
La figura 8 es una vista en sección transversal
vertical de un sensor según otra forma de realización de la
presente invención.
La figura 9 es una vista oblicua explosionada
del mismo sensor.
La figura 10 es una vista esquemática en sección
transversal vertical que muestra ejemplos de modificaciones de los
filtros para el sensor.
La figura 11 es una vista en sección transversal
vertical de un sensor según el Ejemplo Comparativo.
La figura 12 es una vista en planta del mismo
sensor.
La figura 13 es un gráfico que muestra
características de respuesta de los sensores de colesterol según un
Ejemplo de la presente invención y el Ejemplo Comparativo.
Como se ha descrito anteriormente, el objetivo
de la presente invención es eliminar de la sangre los hemocitos,
que son sustancias obstaculizadoras, mediante la utilización de un
filtro, y permitir que el plasma sanguíneo fluya rápidamente al
interior del sistema de electrodos del sensor. Más específicamente,
se dispone un filtro entre la unidad de suministro de muestra y la
vía de suministro de la solución de muestra, que incluye un sistema
de electrodos y una capa de reacción, en el que el filtro presenta
la función de separar los hemocitos por filtración y presenta un
área de sección transversal en el lado corriente arriba del mismo
mayor que el área de la sección transversal de la abertura de la
vía de suministro de la solución de muestra. De ese modo, el plasma
del flujo, con los hemocitos eliminados del mismo por filtración a
través del filtro, es aspirado al interior de la vía de suministro
de la solución de muestra gracias al fenómeno capilar.
Según una forma de realización preferida, la vía
de suministro de la solución de muestra se forma entre la placa
base y el elemento de cobertura combinado con la placa base.
Según otra forma de realización preferida, por
lo menos una parte del elemento de cobertura, la función de la cual
es cubrir el filtro y la vía de suministro de la solución de
muestra, es transparente.
Además, se prefiere que se cumplan las
condiciones siguientes para introducir en el sistema de electrodos
el plasma sanguíneo del cual han sido separados los hemocitos:
- 1)
- el área de la sección transversal de la vía de suministro de la solución de muestra es igual o menor que el área de la sección transversal de la abertura de la vía de suministro de la solución de muestra;
- 2)
- el área de la sección transversal de la parte final del filtro en el lado del electrodo es igual o menor que el área de la sección transversal en el lado de la introducción de la solución de muestra, es decir, el lado corriente arriba de la misma; y
- 3)
- el filtro está sostenido por un cuerpo de soporte de modo que no se obstaculiza la expansión del mismo.
Más específicamente, es más preferible que las
áreas de las secciones transversales de la parte hueca y del filtro
en el interior del sensor, donde fluye la solución de muestra,
disminuyan gradualmente desde el lado corriente arriba del filtro,
que está orientado hacia la unidad de suministro de muestra, hasta
el lado del orificio de ventilación, abierto en el extremo de la
vía de suministro de la solución de muestra.
Son ejemplos de filtros con áreas de sección
transversal menores en el extremo frontal de los mismos en el lado
del electrodo, por ejemplo, los filtros que presentan una forma
global, por ejemplo, convexa, cónica y trapezoidal.
El concepto de área de la sección transversal
menor en el extremo frontal del filtro significa que la parte que
soporta la parte del extremo frontal del filtro en el lado del
electrodo se va estrechando a medida que se aproxima a la vía de
suministro de la solución de muestra.
Para eliminar completamente los hemocitos, que
son sustancias obstaculizadoras, es preferible que haya por lo
menos una parte del filtro en la cual el filtro no esté en contacto
con la unidad de soporte de filtro dentro de una zona que comprende
desde la unidad de suministro de muestra a la vía de suministro de
la solución de muestra, a saber, la parte del filtro en la cual un
espacio rodea la superficie del filtro, de modo que la solución de
muestra pasa a través del filtro sin falta ni excepción. Dicho de
otro modo, existe la posibilidad de que algunos hemocitos puedan
deslizarse a lo largo de la unidad de soporte del filtro sin pasar a
través del filtro, y puedan fluir al interior del sistema de
electrodos.
Ahora compararemos el caso en el cual el filtro,
corriente abajo del mismo, presenta un área de la sección
transversal menor que el área de la sección transversal corriente
arriba del mismo, con el caso en el cual el filtro presenta la
misma área de la sección transversal corriente arriba y corriente
abajo del mismo. En el primer caso, la posición de separación de
los hemocitos está más cerca del lado corriente arriba en
comparación con el segundo caso, en el cual la posición de
separación de los hemocitos está más cerca del lado corriente
abajo. Por consiguiente, en el último caso, posiblemente algunos
hemocitos podrán ir a parar a la vía de suministro de la solución
de muestra.
Utilizando estas estructuras y configuraciones,
es posible eliminar las sustancias obstaculizadoras de la muestra
de solución y permitir que el plasma fluya rápidamente al interior
del sensor.
Respecto a la posición relativa entre el extremo
frontal del filtro en el lado de los electrodos y los electrodos,
es preferible que el filtro no esté en contacto con los
electrodos.
Respecto a la posición en la cual debe
conectarse el elemento de filtro al biosensor de tipo electrodo,
normalmente es correcto elegir dicha posición en el lado de la
abertura de la vía de suministro de la solución de muestra, pero
dicha posición también puede elegirse en el lado del orificio de
ventilación con el fin de ahorrar espacio. En tal caso, la abertura
de la vía de suministro de la solución de muestra funciona como
orificio de ventilación.
Tanto la unidad de soporte del filtro como la
cubierta y el separador deben ser preferentemente transparentes,
con el fin de poder efectuar una supervisión visual del proceso en
el cual la solución de muestra es filtrada utilizando el filtro, y
del proceso en el cual la solución de muestra filtrada es aspirada
al interior de la vía de suministro de la solución de muestra
gracias al fenómeno capilar, y de poder confirma que la filtración
se ha realizado con éxito.
Los mediadores electrónicos utilizables son el
ferricianuro potásico y los seleccionados a partir de compuestos
redox que presentan una función de transferencia de electrones a
oxirreductasa y desde la misma, tales como la colesterol
oxidasa.
La oxirreductasa que debe utilizarse es una
enzima cuyo sustrato es la sustancia objetivo de medición. En el
caso del sensor para la medición de glucosa como objetivo de
medición, debe utilizarse glucosa oxidasa.
La colesterol oxidasa o la colesterol
deshidrogenasa, que es una enzima para catalizar la reacción de
oxidación del colesterol, y la colesterol esterasa, que es una
enzima para catalizar el proceso de conversión del éster de
colesterol en colesterol, se emplean para la medición del nivel de
colesterol en el suero sanguíneo, utilizado como índice de
diagnóstico. La reacción enzimática de la colesterol esterasa avanza
muy lentamente. Añadiendo un surfactante adecuado a la misma, puede
aumentarse la actividad de la colesterol esterasa, para poder
reducir el tiempo necesario para la reacción total. El surfactante
se añade en el sistema de electrodos o cerca del mismo. En el caso
de un sensor que presenta un elemento de cubierta, que al combinarlo
con la placa base forma una vía de suministro de la solución de
muestra entre el elemento de cubierta y la placa base, también puede
proveerse en una parte expuesta a la vía de suministro de la
solución de muestra o en la abertura de la vía de suministro de la
solución de muestra. Sea cual sea la ubicación, es preferible que la
capa de reactivo de reacción pueda ser fácilmente disuelta por la
solución de muestra introducida para de ese modo alcanzar el
sistema de electrodos. Para proteger el electrodo y suprimir la
exfoliación de la capa de reacción formada, es preferible que se
forme una capa de polímero hidrófila en contacto con la superficie
del sistema de electrodos. Además, al margen del sistema de
electrodos, es preferible que la capa de polímero hidrófilo se forme
como base para la formación de la capa de reacción, o que la capa
de reacción, como capa más inferior, contenga un polímero
hidrófilo.
Se prefiere que la capa que contiene un mediador
electrónico esté separada del surfactante con el fin de incrementar
la solubilidad del mismo. Además, se prefiere que esté separada de
la colesterol esterasa, que es una enzima para la catalización de
la reacción de oxidación del colesterol, con el fin de asegurar la
estabilidad de almacenaje de la misma.
En el caso de los biosensores para la medición
de los niveles sanguíneos de azúcar, existe un ejemplo en el cual
se forma una capa que contiene un lípido para cubrir, por ejemplo,
la capa formada en el sistema de electrodos con el fin de facilitar
la introducción de la solución de muestra a la capa de reacción
(Ver, por ejemplo, la publicación de patente japonesa abierta al
público Hei 2-062952). El biosensor para medir el
colesterol según la presente invención contiene un surfactante, el
cual presenta una función similar a la del lípido, de modo que no
es necesaria la capa de lípido.
Como polímeros hidrófilos utilizables pueden
citarse, por ejemplo, derivados de la celulosa solubles en agua,
particularmente etilcelulosa, hidroxipropilcelulosa y
carboximetilcelulosa, así como polivinilpirrolidona,
polivinilalcohol, gelatina, ácidos poliacrílicos y sus sales,
almidón y sus derivados, polímero del anhídrido maleico y sus
sales, poliacrilamida, resina de metacrilato y
poli-2-hidroxietilmetacrilato.
Los surfactantes pueden seleccionarse entre
n-octil-\beta-D-tioglucósido,
éter monododecílico del polietilenglicol, colato sódico,
dodecil-\beta-maltósido,
monolaurato de sacarosa, deoxicolato sódico, taurodeoxicolato
sódico, N,N-bis
(3-D-glucon-amidapropil)
deoxicoleamida y polioxietileno (10) octilfeniléter.
Los lípidos que pueden utilizarse son los
fosfolípidos, preferentemente lípidos anfipáticos tales como
lecitina, fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina.
Como procedimientos para medir la corriente de
oxidación, pueden citarse un sistema de dos electrodos que utiliza
solamente un electrodo de medición y un contraelectrodo, y un
sistema de tres electrodos que utiliza adicionalmente un electrodo
de referencia. El sistema de tres electrodos permite efectuar
mediciones más exactas.
En adelante se describirá la presente invención
con mayor detalle considerando formas de realización
específicas.
La figura 1 es una vista en sección transversal
vertical de un biosensor según una forma de realización, y la
figura 2 es una vista en planta sin la capa de reacción, el
separador y la cubierta, mientras que la figura 3 es una vista de
despiece oblicua del biosensor sin la capa de reacción y el
filtro.
La referencia numérica 1designa una placa base
aislante fabricada de tereftalato de polietileno. Esta placa base 1
presenta un semielemento izquierdo 1a con un espesor más fino y un
semielemento derecho 1b con un espesor de aproximadamente el doble
del espesor del semielemento izquierdo. En el elemento más fino 1a,
se imprime una pasta de plata para formar los conductores 2, 3 y
una base para un sistema de electrodos. Sobre la placa 1 se imprime
además una pasta de carbono eléctricamente conductora que contiene
un aglomerante de resina para formar un sistema de electrodos que
comprende un electrodo de medición 4 y un contraelectrodo 5. Además,
se forma una capa aislante 6 imprimiendo una pasta aislante en una
zona determinada. La capa aislante 6 define unas partes expuestas
del electrodo de medición 4 y del contraelectrodo 5 para que se
mantengan constantes y cubre parcialmente los conductores 2 y 3. En
el elemento más grueso 1b de la placa base 1 se disponen unos
rebajes abiertos 7 y 8 orientados hacia arriba.
Un separador 11 que debe combinarse con la placa
base 1 comprende un elemento de placa plano 11a que presenta un
tamaño adecuado para cubrir sustancialmente la capa aislante 6 de la
placa base 1, y un elemento 11b en forma aproximadamente de U que
presenta una altura mayor para cubrir la parte periférica del
elemento 1b de la placa base y para formar una parte de espacio
para alojar un filtro, que se describirá posteriormente, en la
placa base 1. El elemento en forma de U 11b presenta, en su parte
final izquierda 16, un estrechamiento que reduce de forma continua
su altura hasta que presenta la misma altura que el elemento de
placa plano en la sección del mismo que debe conectarse al elemento
de placa plano 11a. Además, el elemento en forma de U 11b presenta
una parte de presión 19 para presionar el filtro, en una posición
encima de una parte que corresponde a la parte de partición 9 entre
los rebajes 7 y 8 de la placa base 1. El elemento de placa plano 11a
presenta una hendidura 12 que penetra desde la parte superior a la
parte inferior del mismo, y que está abierta hacia el lado del
elemento en forma de U.
La cubierta 21 presenta unos elementos 21a y 21b
los cuales cubren respectivamente el elemento de placa plano 11a y
el elemento 11b del separador 11, y presenta, en el elemento 21b de
la misma, una parte en pendiente 26 inclinada en correspondencia
con la parte de estrechamiento 16 del separador. La cubierta 21
presenta también un orificio de ventilación 22 que debe estar
conectado al extremo de la hendidura 12 de la placa base 1, y
presenta un orificio pasante 28 que debe estar conectado con el
rebaje 8 y una abertura 18 en el lado derecho de la parte de prensa
19 del separador 11.
El biosensor que muestra la figura 1 se
construye mediante las etapas siguientes: formación de una capa o
capas de reactivo de reacción sobre la placa base1 y/o en el lado de
la cubierta 11; posterior fijación del filtro 20 sobre la placa
base 1; y combinación del separador 11 y de la cubierta 21 con la
placa base 1. En la figura 1, la referencia numérica 10 designa un
sistema de electrodos. El filtro 20 se fija de modo que queda
intercalado entre la cara superior y la cara inferior del extremo
posterior del mismo por la parte de partición 9 de la placa base 1
y la parte de presión 19 de la cubierta 21; y también de modo que
queda intercalado en el extremo frontal del sistema, entre la parte
inclinada 26 y la cubierta 21 y una parte de la placa base 1
respectivamente, siendo la parte de la placa base contigua a la
abertura de la vía de suministro de la solución de muestra. Además,
el filtro 20 está orientado, por el extremo frontal del mismo, a la
vía de suministro de la solución de muestra formada en la parte de
hendidura 12 del separador 11.
El filtro 20 fijado de este modo no entra en
contacto ni con la placa base ni con el elemento de cobertura en
una superficie a su alrededor situada encima del rebaje 7 de la de
la placa base 1. De este modo, el hecho es que existe una parte del
filtro 20 que no se encuentra en contacto con la unidad de soporte
del filtro, es decir que existe una parte de separación que rodea
el filtro, mediante la cual puede evitarse que los hemocitos se
deslicen a lo largo de la unidad de soporte del filtro, sin pasar a
través del filtro, para fluir al interior del sistema de
electrodos.
Con referencia a las figuras 1 y 2, F1 indica el
área de la sección transversal del lado corriente arriba del filtro
20, mientras que F2 indica el área de la sección transversal del
lado corriente abajo del filtro 20, estando situado el lado
corriente abajo en la abertura de la vía de suministro de la
solución de muestra. Por otra parte, S1 designa el área de la
sección transversal de la abertura de la vía de suministro de la
solución de muestra, mientras que S2 designa el área de la sección
transversal de la vía de suministro de la solución de muestra.
La presente invención consiste en disponer de
una relación S1<F1. De ese modo, el plasma sanguíneo con los
hemocitos del mismo eliminados por filtración alcanza rápidamente el
sistema de electrodos. Una relación preferible es S2\leqqF1, más
preferentemente F2\leqqF1.
Para medir el nivel de colesterol en sangre
utilizando este sensor, se introduce sangre de muestra en el
interior del rebaje 8 de la placa base 1 a través del orificio
pasante 28 de la cubierta 21. La sangre suministrada penetra al
interior del filtro 20 desde su parte final. La velocidad de
penetración de los hemocitos de la sangre en el filtro 20 es menor
que la del plasma, que es un componente líquido. Por lo tanto, el
plasma se filtra desde el final del filtro, en el lado del sistema
de electrodos. El plasma filtrado de este modo llena completamente
la vía de suministro de la solución de muestra desde cerca del
sistema de electrodos al orificio de ventilación 22 disolviendo el
reactivo, que comprende, por ejemplo, enzimas, y es transportado a
una posición en la cual cubre el sistema de electrodos o a la
superficie posterior de la cubierta inmediatamente sobre la
posición. Cuando toda la vía de suministro de la solución de muestra
está llena con el líquido cesa el flujo de líquido en el filtro 20.
En este instante, los hemocitos no alcanzan la parte final, en el
lado del sistema de electrodos, del filtro 20 y quedan retenidos en
las posiciones. Por consiguiente, el filtro 20 se diseña para crear
una diferencia de resistencia de flujo entre el plasma y los
hemocitos en una extensión tal que los hemocitos siguen sin
alcanzar el lado corriente abajo del filtro, ni siquiera después de
que una cantidad de plasma que llena completamente la vía de
suministro de la solución de muestra pase a través del mismo. Un
filtro adecuado según la presente invención es un filtro de
profundidad que presenta un tamaño medio de poro de aproximadamente
1 a 7 \mum.
Después de este proceso de filtrado de los
hemocitos, el reactivo disuelto por el plasma reacciona químicamente
con el componente que debe medirse en el plasma, por ejemplo
colesterol en el caso de un sensor de colesterol. Una vez
transcurrido un tiempo determinado, puede cuantificarse el
componente presente en el plasma midiendo un valor de corriente
eléctrica basado en la reacción producida en los electrodos. La
figura 4 muestra un ejemplo de configuración de la capa de reactivo
cerca del sistema de electrodos en la vía de suministro de la
solución de muestra. En el sistema de electrodos de la placa base 1,
se forma una capa 30 de una sal de sodio de carboximetilcelulosa
(en adelante designada como CMC), la cual es un polímero hidrófilo,
y una capa 31a de un reactivo que contiene, por ejemplo, un
mediador electrónico. Además, se forma una capa de surfactante 32 y
una capa de reactivo 31b que contiene oxirreductasa en la superficie
posterior del elemento de cubierta que presenta la cubierta 21
combinada con el separador 11, estando la superficie posterior
expuesta a la vía de suministro de la solución de muestra.
Las figuras 5, 6 y 7 son dibujos esquemáticos
que muestran ejemplos de modificaciones del sensor.
La figura 5 muestra diferentes ejemplos de
unidad es de suministro de muestra. La figura 5(a) muestra
una estructura, en la cual una unidad de suministro de muestra 8
presenta un rebaje para alojar una solución de muestra como en el
caso de la figura 1. La figura 5(b) muestra un ejemplo que
presenta una unidad de suministro de muestra 8 estructurada de modo
que el filtro 20 presenta, en la cara superior de la parte final del
mismo, una parte expuesta en la cual debe aplicarse la solución de
muestra. La figura 5(c) muestra una estructura en la que
quedan expuestas la parte superior de la parte final y la superficie
final del lado corriente arriba del filtro 20. Por lo tanto, puede
aplicarse la muestra tanto en la unidad de suministro de muestra 8
como en la parte superior de la parte final del filtro 20.
La figura 6 es una vista en planta que muestra
diversas formas de filtros. La figura 6(a) muestra un ejemplo
en el cual el filtro presenta una anchura igual desde el lado
corriente arriba al lado corriente abajo del mismo. La figura
6(b) muestra un ejemplo en el cual el filtro presenta un
estrechamiento mediante el cual la anchura decrece de forma
continua desde el lado corriente arriba al lado corriente abajo del
mismo, presentando una forma aproximadamente trapezoidal. La figura
6(c) muestra un ejemplo en el cual la anchura cambia en el
punto medio, de forma que en el lado corriente arriba es mayor que
en el lado corriente abajo.
La figura 7 muestra ejemplos de filtros que
presentan formas de sección transversal distintas. Las figuras
7(a) a (c), presentan tales estrechamientos para que las
secciones transversales de los lados corriente arriba sean mayores
que las de los lados corriente abajo. En cada una de las figuras
7(d) y (e), los lados corriente arriba presenta la misma
sección transversal que el lado corriente abajo.
Como muestran la figura 1 y las figuras 5 a 7
anteriores, la hendidura 12, la cual constituye la vía de suministro
de la solución de muestra, está diseñada para presentar un área de
la sección transversal, perpendicular a la dirección en la cual
fluye el líquido, menor que el área de la sección transversal del
filtro 20 en cada caso. Además, el filtro 20 debe presentar una
densidad sustancialmente uniforme a través del mismo. Por lo tanto,
según la presente invención, el área de la sección transversal S2 de
la vía de suministro de la solución de muestra está diseñada para
ser menor que el área de la sección transversal F1 del lado
corriente arriba del filtro 20, con lo cual, el plasma sanguíneo
con sus hemocitos eliminados por filtración es aspirado rápidamente
al interior de la vía de suministro de la solución de muestra debido
al fenómeno capilar. Haciendo menor el área de la sección
transversal del filtro en el extremo frontal del mismo resulta
posible permitir que el plasma fluya rápidamente al interior del
sensor.
También resulta posible permitir que el plasma
fluya rápidamente al interior de la vía de suministro de la
solución de muestra en el caso de que cada unidad de suministros de
muestra, como puede apreciarse en la figura 5, se combine con cada
forma plana del filtro, como muestra la figura 6, y/o con cada forma
de sección transversal del filtro, como muestra la figura 7.
Según cada uno de los biosensores mostrados, la
anchura de lado corriente arriba del filtro se prefiere que no sea
mayor de 5 mm, y el espesor del mismo no debe ser superior a 2 mm.
La anchura de la abertura de la vía de suministro de la solución de
muestra se prefiere que no sea superior a 2 mm, y el espesor de la
misma igual o inferior a 200 \mum.
La figura 8 es una vista en sección transversal
vertical de un biosensor según otra forma de realización de la
presente invención, mientras que la figura 9 es una vista en
despiece oblicua de la cual se ha eliminado la capa de
reactivo.
En una placa base aislante 31 se forman unos
conductores 32 y 33, un electrodo de trabajo 34 y un contraelectrodo
35 conectados a los conductores respectivos, así como una capa
aislante 36 de forma similar a la del caso de la figura 1. En esta
placa base 31 se montan separadores plurales 41, 43, 45, 47 y 49 y
una cubierta 53. Se fija un filtro 51 en una sección de los
orificios pasantes 46, 48 y 50 entre el separador 43 y la cubierta
53. El orificio pasante 53 de la cubierta 52 constituye una vía de
suministro de la solución de muestra, y los orificios pasantes 42 y
44 dispuestos en los separadores 41 y 43 constituyen una vía de
suministro de la solución de muestra. Los orificios pasantes 46 y
50 de los separadores 45 y 49 presentan un diámetro superior al del
filtro 51, de modo que se forman espacios como los designados con
las referencias numéricas 55 y 56 alrededor del filtro 51 que
circundan el filtro 51. El separador 47 entra en contacto
parcialmente con la periferia exterior del filtro 51 con la función
de posicionar el filtro. El separador 41 presenta un par de
orificios de ventilación 54 para liberar un lado de la parte final
terminal de la vía de suministro de la solución de muestra a la
atmósfera exterior. Gracias al fenómeno capilar, se introduce una
solución de muestra en el filtro 51 y en la vía de suministro de la
solución de muestra de la zona que se extiende desde el orificio
pasante 53, que sirve como unidad de suministro de muestra, hasta el
sistema de electrodos. El movimiento de la solución de muestra cesa
cuando el plasma filtrado por el filtro 51 alcanza el sistema de
electrodos.
Aquí, cada espesor de los separadores 49 y 45,
el cual define las alturas de los espacios 55 y 56, se prefiere que
no sea inferior a 100 \mum. El separador 41 presenta el orificio
pasante 42, que sirve como lugar de reacción de la solución de
muestra con el reactivo. El espesor del espaciador 41 se prefiere
que no sea mayor de 200 \mum.
En este ejemplo, se forman una capa CMC 61 y una
capa de mediador electrónico 62 en el sistema de electrodos, y se
forma una capa 63 que contiene una enzima y un surfactantes sobre la
superficie posterior del espaciador 43.
La figura 10 muestra ejemplos de filtros de los
sensores de la clase descrita anteriormente, se suministra una
solución de muestra desde una unidad de suministro de muestra
dispuesta en el lado de la cubierta, a un sistema de electrodos en
la dirección de la gravedad. La figura 10(a) muestra un
ejemplo en el cual se utiliza un filtro 51 que presenta una sección
transversal igual en los dos lados corriente arriba y corriente
abajo del mismo, igual que en la figura 8, mientras que la figura
10(b) muestra un ejemplo que presenta en el lado corriente
abajo del mismo un área de la sección transversal inferior al área
de la sección transversal del lado corriente arriba del mismo.
A continuación se describirá un ejemplo de la
presente invención.
A continuación se describe un procedimiento para
construir un sensor de colesterol, que presenta una estructura como
la que muestran las figuras 1 a 4, en el cual: una capa de reacción
31a contiene un mediador electrónico; una capa de reacción 31b
colesterol oxidasa, colesterol esterasa y un surfactante; y una capa
32 comprende un surfactante.
En primer lugar, se vertieron gota a gota 5
\mul de una solución acuosa que contiene un 0,5% en peso de sal
de sodio de carboximetilcelulosa sobre un sistema de electrodos, y a
continuación se secaron con un secador de aire caliente a 50ºC
durante 10 minutos, formándose una capa de CMC 30. A continuación,
se vertieron gota a gota 4 \mul de una solución acuosa de
ferricianuro potásico (correspondientes a 70 mM de ferricianuro
potásico) sobre la capa de CMC 30, y seguidamente se secaron con un
secador de aire caliente a 50ºC durante 10 minutos, formándose una
capa de reacción 31a que contiene ferricianuro potásico.
Se vertieron gota a gota 2 \mul de una
solución de etanol que contiene un 2% en peso de
polioxietileno(10)octilfeniléter (Triton
X-100), que es un surfactante, en un rebaje formado
por una hendidura de la cubierta que presenta una cubierta
combinada con un separador, y se dejaron secar a temperatura
ambiente durante 3 minutos, formándose una capa de surfactante 32.
La hendidura anteriormente descrita tiene 2 mm de anchura y 4,5 mm
de longitud, mientras que el separador presenta un espesor de 100
\mum.
Se añadió
polioxietileno(10)octilfeniléter (Triton
X-100), que es un surfactante, a una solución acuosa
en la cual se había disuelto colesterol oxidasa procedente de
Nocardia (EC1.1.3.6, en adelante designada como ChOD) y colesterol
esterasa procedente de Pseudomonas (EC.3.1.1.13, en adelante
designada como ChE). Una cantidad de 1,5 \mul de esta solución
acuosa mezclada se vertió gota a gota sobre la capa de surfactante
32, se congeló con nitrógeno líquido a
-196ºC, a continuación se guardó en un frasco Kjeldahl y después se secó en un liofilizador durante la noche, formando una capa de reacción 31b, que contiene 480 unidades (U)/ml de colesterol oxidasa, 1.200 U/ml de colesterol esterasa y un 2% en peso de surfactante. En la placa base 1 para sensor construida de este modo, se dispuso un papel de filtro de fibra de vidrio que había sido cortado para adquirir forma de trapezoide con una cara superior de 2 mm, una cara inferior de 4 mm, una altura de 3 mm y un espesor de 600 \mum y un tamaño medio de poro de 2,3 \mum, de modo que no entrara en contacto con un electrodo de trabajo del modo que muestra la figura 2.
-196ºC, a continuación se guardó en un frasco Kjeldahl y después se secó en un liofilizador durante la noche, formando una capa de reacción 31b, que contiene 480 unidades (U)/ml de colesterol oxidasa, 1.200 U/ml de colesterol esterasa y un 2% en peso de surfactante. En la placa base 1 para sensor construida de este modo, se dispuso un papel de filtro de fibra de vidrio que había sido cortado para adquirir forma de trapezoide con una cara superior de 2 mm, una cara inferior de 4 mm, una altura de 3 mm y un espesor de 600 \mum y un tamaño medio de poro de 2,3 \mum, de modo que no entrara en contacto con un electrodo de trabajo del modo que muestra la figura 2.
A continuación, el elemento de cobertura
anteriormente descrito se unió a la placa base, formando el sensor
de colesterol que muestra la figura 1.
Ejemplo comparativo
1
Se montó un sensor de colesterol similar al del
ejemplo 1, salvo en que en este caso el sensor utilizó un filtro de
20' de dimensiones tales que la anchura era de 2 mm, la longitud era
de 27 mm y el espesor era de 100 \mum, como muestran la figura 11
y la figura 12.
Los sensores de colesterol A y B según el
ejemplo 1 y el ejemplo comparativo respectivamente, se proveyeron
cada uno de 20 \mul de sangre completa como solución de muestra,
la cual se introdujo en el rebaje 8 de la placa base 1 a través del
orificio pasante 28 de la cubierta 21, siendo el orificio pasante
una entrada para la solución de muestra. Al cabo de 3 minutos, se
aplico al electrodo de medición un impulso de tensión de +0,5 V en
la dirección del ánodo, con el contraelectrodo actuando de
referencia, midiéndose el valor del flujo de corriente eléctrica
entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo, 5 segundos
después de la aplicación del impulso de tensión. Los resultados de
tales mediciones se muestran en la figura 13. Tanto el filtro del
Ejemplo 1 como el del Ejemplo Comparativo 1 presentan un volumen
aparente de 5,4 mm^{3}.
Como puede apreciarse en el gráfico, según el
sensor de la presente invención puede obtenerse una buena linealidad
entre las concentraciones de colesterol y los valores de
respuesta.
Según la presente invención, los hemocitos de la
sangre, que son sustancias obstaculizadoras, pueden eliminarse
mediante un filtro, y la sangre puede suministrarse con rapidez al
sistema de electrodos, de modo que puede disponerse de un biosensor
electroquímico que presenta características de respuesta
superiores.
superiores.
Claims (9)
1. Biosensor que comprende:
una placa base aislante; un sistema de
electrodos que presenta un electrodo de medición y un
contraelectrodo dispuesto en dicha placa base; una capa de reacción
que comprende por lo menos una oxirreductasa y un mediador
electrónico; una vía de suministro de la solución de muestra que
incluye dicho sistema de electrodos y dicha capa de reacción; una
unidad de suministro de muestra; y un filtro (20) previsto entre
dicha unidad de suministro de muestra y dicha vía de suministro de
la solución de muestra para eliminar por filtración los hemocitos
de la sangre, en el que el plasma de dicha sangre, con dichos
hemocitos que han sido eliminados por filtración mediante dicho
filtro, es aspirado al interior de dicha vía de suministro de la
solución de muestra debido al fenómeno capilar, en el que dicho
filtro presenta en el lado corriente arriba del mismo, un área de
sección transversal (F1) mayor que el área de la sección
transversal de la abertura (S1) de dicha vía de suministro de la
solución de muestra y también mayor que el área de la sección
transversal (F2) en el lado corriente abajo del mismo, estando
situado dicho lado corriente abajo en dicha abertura de dicha vía de
suministro de la solución de muestra.
2. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicha vía de suministro de la solución de muestra presenta un
área de sección transversal (S2) igual o menor que dicha área de
sección transversal (S1) de dicha abertura de dicha vía de
suministro de la solución de muestra.
3. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicha área de sección transversal (F2) de dicho filtro en dicho
lado corriente abajo es igual o mayor que dicha área de sección
transversal (S1) de dicha abertura de dicha vía de suministro de la
solución de muestra.
4. Biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho filtro comprende un cuerpo
poroso que presenta unos poros interconectados de forma
tridimensional, y en el que dicho cuerpo poroso, debido a la acción
capilar, desplaza dicha sangre desde el lado de la unidad de
suministro de muestra al lado de la vía de suministro de la
solución de muestra, y ejerce la función de eliminar por filtración
dichos hemocitos gracias a las diferencias de las resistencias de
flujo entre dicho plasma y dichos hemocitos.
5. Biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende, en una parte de dicho filtro,
en una zona que se extiende desde dicha unidad de suministro de
muestra a dicha vía de suministro de la solución de muestra, un
espacio que circunda la superficie de dicho filtro.
6. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que el extremo frontal de dicho filtro en el lado corriente abajo
del mismo no está en contacto con dichos electrodos.
7. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicha vía de suministro de la solución de muestra está formada
entre dicha placa base y un elemento de cobertura combinado con
dicha placa base.
8. Biosensor según la reivindicación 7, en el
que por lo menos una parte de dicho elemento de cobertura, cuya
parte cubre dicho filtro y dicha vía de suministro de la solución de
muestra, es transparente.
9. Biosensor según la reivindicación 7, en el
que un surfactante es transportado o está fijado sobre dicho
elemento de cobertura.
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