DD244567A1 - Verfahren zur erhoehung der spezifitaet von hoeher integrierten biologisch aktiven systemen - Google Patents

Abstract

In der Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung spezifischer Stoffwechselleistungen bei höher integrierten biologisch aktiven Systemen durch Verwendung reversibel oder irreversibel wirkende Inhibitoren bei Stoffwandlefigsprozessen und analytischen Substratbestimmungen mit Biosensoren beschrieben. Auf diese Weise werden unerwünschte Stoffwechselwege oder enzymatische Nebenreaktionen spezifisch eingeschränkt oder vollständig gehemmt. Das Verfahren besitzt ein breites Anwendungsspektrum in der Mikrobiologie, Landwirtschaft, Lebensmittelindustrie und -analytik, Medizin, Biotechnologie, Pharmazie, Toxikologie sowie im Umweltschutz.

Description

Im allgemeinen werden bei mikrobiologischen Elektroden intakte Mikroorganismen vor allem elektrochemischen Meßfühler immobilisiert, diese Vorrichtung aus elektrochemischen Transducer und biokatalytisch aktiver Schicht in eine Meßlösung getaucht, und nach Zugabe eines Substrates wird durch die Stoffwandlungsreaktion in der biologisch aktiven Schicht vor dem Transducer eines oder mehrere Produkte gebildet. Mit dem elektrochemischen Transducer können dann die Produktbildung oder die Substratabnahme gemessen und aus diesen Werten die ursprünglichen Substratkonzentrationen berechnet werden. Diese Meßvorrichtung liefert aber nur bei Verwendung idealer Meßlösungen mit nur einem Substrat genaue Analysenergebnisse. Einzelne Komponenten in komplexen Meßlösungen wie Fermentationsproben oder Abwasserproben können mit dieser Methode nicht bestimmt werden. Mit einer mikrobiologischen Elektrode erfaßt man in komplexen Meßlösungen in der Regel nur summarische Parameter wie zum Beispiel den biologischen Sauerstoffbedarf (BSB). Es wurde nun gefunden, daß durch Inhibierung unerwünschter Stoffwechselwege und/oder Substrattransportsysteme und/ oder enzymatischer Nebenaktivitäten eine Erhöhung der Spezifität in Richtung gewünschter Stoffwechselreaktionen erreicht wird. Die Erhöhung der Spezifität wird dabei verwirklieht durch Zugabe von reversibel oder irreversibel wirkenden Inhibitoren zu den Reaktionsansätzen in Konzentrationen, die einen weiten Konzentrationsbereich überstreichen können und die dem jeweilig zu lösenden Problem angepaßt werden müssen. In Abhängigkeit von Inhibitorart und damit vom Inhibitortyp werden die Inhibitoren den Reaktionsansätzen kontinuierlich mit den Reaktionslösungen zugeführt bei einer reversiblen Inhibierung oder aber einmalig vor der Stoffwandlungsreaktion bei einer irreversiblen Inhibierung. Dieses Verfahren zur Erhöhung spezifischer metabolischer Stoffwechselleistungen kann sowohl auf lösliche, in Lösung suspendierte oder immobilisierte höher integrierte biologisch aktive Systeme angewendet werden. Die gewünschten biokatalytischen Aktivitäten bleiben dabei aber unbeeinflußt oder aber werden erhöht. Unter metabolischen Stoffwechselleistungen werden Stoffwandlungsreaktionen, d. h. Produktbildungen aus Substratangeboten mit Hilfe der höher integrierten biologisch aktiven Systeme verstanden. Biologisch aktive Systeme im Sinne der Erfindung sind Mikroorganismen beziehungsweise Gewebeschnitte pflanzlichen, tierischen oder humanen Materials oder aber aus diesen Systemen isolierte und noch zur Stoffwandlung befähigte Zellen und Organellen. Diese biologisch aktiven Systeme sind gekennzeichnet durch ein breites Stoffwandlungspotential. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird erreicht, daß die Fähigkeit von Mikroorganismen zur allgemeinen Substrataufnahme und -umwandlung infolge Oxidation (Veratmung) unerwünschter Substrate durch Inhibitoren eingeschränkt oder unterdrückt und gleichzeitig die Spezifität (Empfindlichkeit) für ein bestimmtes Substrat erhöht wird. Die beschriebene Methode kann angewandt werden zur Bestimmung von Substraten wie Aminosäuren, Kohlehydraten, organischen Säuren, Alkoholen und anderen unterschiedlichsten Stoffwechselmetaboliten in komplexen Lösungen. Aus dem dargelegten Prinzip wird aber auch ersichtlich, daß nicht nur Elektrodensysteme als Transducer verwendet werden können, sondern auch die Vielzahl mit biokatalytischen Aktivitäten koppelbaren Sensoren wie Thermistoren, Feldeffekttransistoren oder optischen Sensoren, Sensorelemente ganz allgemein also. Das durch die Erfindung dargelegte Prinzip der selektiven Inhibierung unerwünschter Stoffwechselwege und/oder Stofftransportsysteme und/oder enzymatischer Nebenaktivitäten ist aber auch in der biotechnologischen Stoffwandlung anwendbar. In diesem Fall sind zum Beispiel enzymatische Nebenaktivitäten der höher integrierten biologisch aktiven Systeme unerwünscht, die nicht in Stoffwechselwege zur gewünschten Produktbildung integriert sind. Zum einen verringern diese Enzymaktivitäten die gewünschte Produktausbeute, bezogen auf die eingesetzte Substratmenge, und zum anderen werden auch Nebenprodukte gebildet, die sowohl die Aufarbeitung der Reaktionslösungen als auch die Gewinnung der gewünschten Produkte in reiner Form erschweren können. Nach der Erfindung werden solche unerwünschten Nebenaktivitäten der höher integrierten biologisch aktiven Verbindungen durch Anwesenheit von reversibel oder irreversibel wirkende Inhibitoren in den Reaktionslösungen eingeschränkt oder gänzlich unterdrückt. Praktisch erfolgt der Einsatz der Inhibitoren in ähnlicher Weise, also in Abhängigkeit von Inhibitorart und Inhibitionstyp, wie bei ihrer Verwendung in Kombination mit Biosensoren oben beschrieben.

Der Vorteil dieses Vorgehens bei der Steuerung von Produktbildungen durch höher integrierte biologisch aktive Systeme besteht darin, daß nicht mehr unspezifisch irgendwelche biokatalytische Aktivitäten dieser Systeme verringert oder beseitigt werden und damit auch solche, die zu einer angestrebten Produktbildung beitragen, sondern spezifisch solche, die die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten bewirken

Nachfolgend wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, die ihren Umfang aber nicht einschränken sollen:

Ausführungsbeispiele

1. Beispiel

In einem halbsynthetischen Medium (5g Caseinhydrolysat, 5g Ammoniumchlorid, 20ml Salzstammlösung (0,4% FeCL₃ · 6H₂O, 0,13% CaCI₂,0,2% ZnSO₄ · 7H₂0,2,46% MgSO₄ · 7H₂0,3,7% HCI) ad 11 0,134M Phosphatpuffer pH 6,0) bei 3O⁰C 18-2Oh kultivierte Bacillus subtilis-Zellen werden zur Herstellung einer mikrobiologischen Elektrode nach der in DD-WP 210761 beschriebenen Art und Weise eingesetzt. Die so präparierte mikrobiologische Elektrode wird in eine gerührte und temperierte Meßzelle (30⁰C) gebracht, die 2,5ml 0,1 M Phosphatpuffer enthält. Der Meßzelle werden 100/xl des irreversibel wirkenden Inhibitors Chlormercuribenzoat (Endkonzentration in der Meßzelle 0,1 M) zugesetzt. Nach 20 min Einwirkungszeit wird die Meßzelle gespült und die Empfindlichkeit des Sensors gegenüber Glukose und Glutaminsäure getestet. Wie Tabelle 1 zeigt, wird das Glukosesignal um 48% reduziert und gleichzeitig die Empfindlichkeit gegenüber Glutaminsäure leicht erhöht.

Die Selektivität des Sensors gegenüber Glutaminsäure im Vergleich zur Glukose— hat sich durch

Signal Glukose /nA/min/ die Chlormercuribehandlung von 3,8 auf 9,3 erhöht.

Tabelle 1 Erhöhung der Glutamspezifität eines B. subtilis-Sensoren durch Chlormercuribenzoalbehandlung (CMB)

nA Substrat Änderung der Stromstärke ;—

vorCMB nach CMB

Glukose 1,2 mM 293 139(48%)

Glutaminsäure 1,2 mM 1117 1296(116%)

2. Beispiel Die im Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wird durch eine NaF-Behandlung ergänzt, indem dem jeweiligen Meßansatz 100/aI NaF (Endkonzentration 5OmM) zugesetzt werden. NaF hemmt den Glukosestoffwechsel reversibel.

Durch NaF kann die Glutaminsäureselektivität im Vergleich zu Glukose weiter erhöht werden (auf 14,5, siehe Tabelle 2).

Tabelle 2 Erhöhung der Glutamspezifität durch NaF

Substrat .	Änderung der Stromstärke	mit NaF	nA min
	ohne NaF	86(62%) 1245(96%)
Glukose 1,2 mM Glutaminsäure 1,2 mM	139 1296

Beispiel 3

5 Gramm zur Spaltung von Penicillin G befähigte immobilisierte Zellen von E. coli, hergestellt nach einer bekannten Methode durch Immobilisierung ganzer Zellen an einem mitGlutaraldehyd aktivierten makroporösen, aminogruppenhaltigen Kopolymeren auf der Basis von 2-Hydroxyäthylmethacrylat-co-Äthylendimethacrylat (MW_Um 1 000000 Dalton) werden in 50ml Reaktionslösung suspendiert. Die Reaktionslösung besteht aus einer 5%igen Lösung von Penicillin G (Kaliumsalz) in einem Phosphatpuffer (20mM/Liter) vom pH-Wert 7,8, dem als reversibler Inhibitor Borsäure in einer Konzentration von 10mM/Liter zugesetzt werden. Die Reaktion wird bei 35⁰C unter Rühren und Addition von Natronlauge (0,1 M/Liter) zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Wertes in der Reaktionslösung durchgeführt. Die quantitative Bestimmung der aus dem Penicillin G gebildeten 6-Aminopenicillansäure erfolgte spektralphotometrisch nach der Methode mit p-Dimethylaminobenzaldehyd. Durch enzymatische Nebenreaktion verursachte Bildung von Penicillen G-Säure und Penillen G-Säure konnten chromatographisch in der Reaktionslösung nicht nachgewiesen werden.

Claims (3)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Erhöhung der Spezifitätvon zur Stoffwandlung oder in Biosensoren eingesetzten höher integrierten biologisch aktiven Systemen, wie Mikroorganismen oder Zellen pflanzlichen bzw. tierischen Ursprungs, dadurch gekennzeichnet, daß reversibel oder irreversibel wirkende Inhibitoren zum Reaktionsansatz zugegeben werden.
2. 2. Verfahren zur Erhöhung der Spezifität nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer reversiblen Inhibierung die Inhibitoren kontinuierlich zugeführt werden.
3. 3. Verfahren zur Erhöhung der Spezifität nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei einer irreversiblen Inhibierung die Inhibitoren einmalig vor der Stoffwandlungsreaktion bzw. analytischen Reaktion zugeführt werden.

   Anwendungsgebiet der Erfindung

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Spezifität von höher integrierten biologisch aktiven Systemen wie Mikroorganismen oder Zellen pflanzlichen bzw. tierischen Ursprungs bei Stoffwandlungsprozessen und in Biosensoren. Das Verfahren ist geeignet für eine Anwendung in der Mikrobiologie, Landwirtschaft, Lebensmittelindustrie, Medizin, Biotechnologie und im Umweltschutz.

   Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

   In der biotechnologischen Stoffwandlung und in Biosensoren werden in zunehmendem Maße höher integrierte biologische Systeme verwendet. Bei praktischen Einsatz dieser biologisch aktiven Systeme treten im Vergleich zum Einsatz isolierter biokatalytisch wirksamer Verbindungen eine Reihe von Vorteilen ein, die in erster Linie wegen des Wegfalls der Isolierung von Enzymen aus den höher integrierten Systemen auf ökonomischem Gebiet liegen. Ganze Zellen werden bei der Stoffwandlung und in Biosensoren sowohl in Reaktionslösungen suspendiert oder in immobilisierter Form eingesetzt. Wie an vielen Stellen schon beschrieben (u.a. bei Klein, J. and Vorlop, K.-D., Comprehensive Biotechnology VoI III [1985] Chaper 12, in Press, Mattiasson, B., Immobilized Cells and Organelles, Vol. I P. 1-135 [1983] CRC, Press, Inc. Boca Raton, Florida), ist es besonders günstig, immobilisierte Zellen in den genannten Einsatzgebieten zu verwenden. Für die Bestimmung natürlicher Substrate wie Aminosäuren, Kohlenhydrate, organische Säuren und Alkohole lösen Biosensoren mehr und mehr die herkömmlichen Verfahren ab (Guilbaujt, G. g., Enzyme microbiol.Technol., 2,258-264 [1980], Suzuki, S. and Karube, I., Proc. G. Int. Ferm. Symp., London [Canada], Vol. Ill, p. 355-360 [1980], Fukui, S. and Tanaka, A., Ann. Rev. Microbiol., 36,145-172 [1982]). Während sich Enzymelektroden meist durch eine hohe Substratspezifität auszeichnen, sind mikrobiologische Elektroden, das heißt solche mit höher integrierten biologisch aktiven Systemen hergestellte, im allgemeinen relativ unspezifisch, weil neben den zu bestimmenden Substanzen häufig andere assimilierbare Substanzen stören. Bei der Stoffwandlung mit löslichen oder immobilisierten höher integrierten biologisch aktiven Systemen treten ähnliche Probleme auf. Die vergleichsweise geringe Spezifität dieser Systeme führt oft zu einer Vielzahl von Nebenprodukten. Aus ökonomischer Sicht besteht dabei der Nachteil, daß bei Anwendung dieser Systeme, ob in löslicher oder immobilisierter Form und ganz im Gegenteil zum Einsatz löslicher oder immobilisierter Enzyme, zur Aufrechterhaltung des Stoffwechsels der Zellen der höher integrierten biologisch aktiven Systeme ein großer Teil der Substrate zur Synthese unerwünschter und damit das Stoffwandlungsverfahren ökonomisch beeinträchtigende Produkte verwendet wird. Zwangsläufig steht damit die zur unerwünschten Syntheseleistung verwendete Substratmenge der gewünschten Produktbildung nicht zur Verfugung. Verbesserungen zugunsten erwünschter Produktleistungen bei Stoffwandlungsreaktionen mit immobilisierten Zellen zum Beispiel sind denkbar und beschrieben, unter anderem durch Vorbehandlung der Zellen mit geringen Konzentrationen bifunktioneller Reagenzien wie Glutaraldehyd, die jedoch so gering sein müssen, daß keine Quervernetzungen der Zellen eintreten, können solche unerwünschten Stoffwechselleistungen eingeschränkt oder blockiert werden. Der Nachteil bei diesem Vorgehen besteht aber darin, daß die bifunktionellen Reagenzien ganz unspezifisch wirken und oftmals auch die gewünschte Syntheseleistung der Zellen in unvertretbar hohem Grade unterdrücken. Das gleiche Ziel — aber auch mit den gleichen Einschränkungen —wird oft durch eine Immobilisierung erreicht.

   Ziel der Erfindung

   Die Erfindung hat das Ziel, oben genannte Nachteile beim Einsatz höher integrierter biologisch aktiver Verbindungen zur Stoffwandlung und in Biosensoren zu verringern, um eine Verbesserung spezifischer metabolischer Leistungen dieser Systeme zu erreichen.

   Darlegung des Wesens der Erfindung

   Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, bisher nicht oder nur ungenau wegen zu geringer Spezifität der verwendeten höher integrierten biologisch aktiven Systeme bestimmbare Substrate mittels zu den Biosensoren gehörenden mikrobiologischen Elektroden in natürlichen oder komplexen Lösungen durch Erhöhung der Spezifität der genannten Systeme gegenüber den genannten Substraten zu bestimmen.