DD244567A1

DD244567A1 - METHOD FOR INCREASING THE SPECIFICITY OF HOEHER INTEGRATED BIOLOGICALLY ACTIVE SYSTEMS

Info

Publication number: DD244567A1
Application number: DD28497785A
Authority: DD
Inventors: Klaus Riedel; Manfred Kuehn; Peter Liebs; Reinhard Renneberg
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-12-23
Filing date: 1985-12-23
Publication date: 1987-04-08

Abstract

In der Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung spezifischer Stoffwechselleistungen bei höher integrierten biologisch aktiven Systemen durch Verwendung reversibel oder irreversibel wirkende Inhibitoren bei Stoffwandlefigsprozessen und analytischen Substratbestimmungen mit Biosensoren beschrieben. Auf diese Weise werden unerwünschte Stoffwechselwege oder enzymatische Nebenreaktionen spezifisch eingeschränkt oder vollständig gehemmt. Das Verfahren besitzt ein breites Anwendungsspektrum in der Mikrobiologie, Landwirtschaft, Lebensmittelindustrie und -analytik, Medizin, Biotechnologie, Pharmazie, Toxikologie sowie im Umweltschutz.In the invention, a method for increasing specific metabolic performance in more highly integrated biologically active systems by using reversibly or irreversibly acting inhibitors in fabric wall processes and analytical substrate determinations with biosensors is described. In this way, undesired metabolic pathways or enzymatic side reactions are specifically restricted or completely inhibited. The process has a wide range of applications in microbiology, agriculture, food industry and analysis, medicine, biotechnology, pharmacy, toxicology and environmental protection.

Description

Im allgemeinen werden bei mikrobiologischen Elektroden intakte Mikroorganismen vor allem elektrochemischen Meßfühler immobilisiert, diese Vorrichtung aus elektrochemischen Transducer und biokatalytisch aktiver Schicht in eine Meßlösung getaucht, und nach Zugabe eines Substrates wird durch die Stoffwandlungsreaktion in der biologisch aktiven Schicht vor dem Transducer eines oder mehrere Produkte gebildet. Mit dem elektrochemischen Transducer können dann die Produktbildung oder die Substratabnahme gemessen und aus diesen Werten die ursprünglichen Substratkonzentrationen berechnet werden. Diese Meßvorrichtung liefert aber nur bei Verwendung idealer Meßlösungen mit nur einem Substrat genaue Analysenergebnisse. Einzelne Komponenten in komplexen Meßlösungen wie Fermentationsproben oder Abwasserproben können mit dieser Methode nicht bestimmt werden. Mit einer mikrobiologischen Elektrode erfaßt man in komplexen Meßlösungen in der Regel nur summarische Parameter wie zum Beispiel den biologischen Sauerstoffbedarf (BSB). Es wurde nun gefunden, daß durch Inhibierung unerwünschter Stoffwechselwege und/oder Substrattransportsysteme und/ oder enzymatischer Nebenaktivitäten eine Erhöhung der Spezifität in Richtung gewünschter Stoffwechselreaktionen erreicht wird. Die Erhöhung der Spezifität wird dabei verwirklieht durch Zugabe von reversibel oder irreversibel wirkenden Inhibitoren zu den Reaktionsansätzen in Konzentrationen, die einen weiten Konzentrationsbereich überstreichen können und die dem jeweilig zu lösenden Problem angepaßt werden müssen. In Abhängigkeit von Inhibitorart und damit vom Inhibitortyp werden die Inhibitoren den Reaktionsansätzen kontinuierlich mit den Reaktionslösungen zugeführt bei einer reversiblen Inhibierung oder aber einmalig vor der Stoffwandlungsreaktion bei einer irreversiblen Inhibierung. Dieses Verfahren zur Erhöhung spezifischer metabolischer Stoffwechselleistungen kann sowohl auf lösliche, in Lösung suspendierte oder immobilisierte höher integrierte biologisch aktive Systeme angewendet werden. Die gewünschten biokatalytischen Aktivitäten bleiben dabei aber unbeeinflußt oder aber werden erhöht. Unter metabolischen Stoffwechselleistungen werden Stoffwandlungsreaktionen, d. h. Produktbildungen aus Substratangeboten mit Hilfe der höher integrierten biologisch aktiven Systeme verstanden. Biologisch aktive Systeme im Sinne der Erfindung sind Mikroorganismen beziehungsweise Gewebeschnitte pflanzlichen, tierischen oder humanen Materials oder aber aus diesen Systemen isolierte und noch zur Stoffwandlung befähigte Zellen und Organellen. Diese biologisch aktiven Systeme sind gekennzeichnet durch ein breites Stoffwandlungspotential. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird erreicht, daß die Fähigkeit von Mikroorganismen zur allgemeinen Substrataufnahme und -umwandlung infolge Oxidation (Veratmung) unerwünschter Substrate durch Inhibitoren eingeschränkt oder unterdrückt und gleichzeitig die Spezifität (Empfindlichkeit) für ein bestimmtes Substrat erhöht wird. Die beschriebene Methode kann angewandt werden zur Bestimmung von Substraten wie Aminosäuren, Kohlehydraten, organischen Säuren, Alkoholen und anderen unterschiedlichsten Stoffwechselmetaboliten in komplexen Lösungen. Aus dem dargelegten Prinzip wird aber auch ersichtlich, daß nicht nur Elektrodensysteme als Transducer verwendet werden können, sondern auch die Vielzahl mit biokatalytischen Aktivitäten koppelbaren Sensoren wie Thermistoren, Feldeffekttransistoren oder optischen Sensoren, Sensorelemente ganz allgemein also. Das durch die Erfindung dargelegte Prinzip der selektiven Inhibierung unerwünschter Stoffwechselwege und/oder Stofftransportsysteme und/oder enzymatischer Nebenaktivitäten ist aber auch in der biotechnologischen Stoffwandlung anwendbar. In diesem Fall sind zum Beispiel enzymatische Nebenaktivitäten der höher integrierten biologisch aktiven Systeme unerwünscht, die nicht in Stoffwechselwege zur gewünschten Produktbildung integriert sind. Zum einen verringern diese Enzymaktivitäten die gewünschte Produktausbeute, bezogen auf die eingesetzte Substratmenge, und zum anderen werden auch Nebenprodukte gebildet, die sowohl die Aufarbeitung der Reaktionslösungen als auch die Gewinnung der gewünschten Produkte in reiner Form erschweren können. Nach der Erfindung werden solche unerwünschten Nebenaktivitäten der höher integrierten biologisch aktiven Verbindungen durch Anwesenheit von reversibel oder irreversibel wirkende Inhibitoren in den Reaktionslösungen eingeschränkt oder gänzlich unterdrückt. Praktisch erfolgt der Einsatz der Inhibitoren in ähnlicher Weise, also in Abhängigkeit von Inhibitorart und Inhibitionstyp, wie bei ihrer Verwendung in Kombination mit Biosensoren oben beschrieben.In general, in microbiological electrodes, intact microorganisms, especially electrochemical sensors, are immobilized, this electrochemical transducer and biocatalytically active layer device is immersed in a measuring solution, and after addition of a substrate, one or more products are formed by the mass conversion reaction in the biologically active layer in front of the transducer , The electrochemical transducer can then be used to measure product formation or substrate removal and to calculate the original substrate concentrations from these values. However, this measuring device provides accurate analysis results only when using ideal measuring solutions with only one substrate. Individual components in complex measuring solutions such as fermentation samples or waste water samples can not be determined with this method. With a microbiological electrode, in complex measurement solutions, only summary parameters such as the biological oxygen demand (BOD) are generally recorded. It has now been found that an increase in specificity towards desired metabolic reactions is achieved by inhibiting undesired metabolic pathways and / or substrate transport systems and / or enzymatic side activities. The increase in specificity is thereby realized by adding reversible or irreversible inhibitors to the reaction mixtures in concentrations which can cover a wide concentration range and which must be adapted to the respective problem to be solved. Depending on the type of inhibitor and thus on the type of inhibitor, the inhibitors are fed to the reaction mixtures continuously with the reaction solutions in the case of a reversible inhibition or else once before the substance conversion reaction in the case of irreversible inhibition. This method of increasing specific metabolic metabolic performance can be applied to either soluble, solution-suspended, or immobilized more highly integrated biologically active systems. However, the desired biocatalytic activities remain unaffected or increased. Among metabolic metabolic activities, metabolic reactions, i. H. Product formations from substrate offerings understood with the help of higher integrated biologically active systems. Biologically active systems within the meaning of the invention are microorganisms or tissue sections of plant, animal or human material or cells and organelles isolated from these systems and still capable of metabolizing them. These biologically active systems are characterized by a broad metabolic potential. With the method according to the invention it is achieved that the ability of microorganisms for general substrate uptake and conversion due to oxidation (respiration) of undesired substrates by inhibitors is restricted or suppressed and at the same time the specificity (sensitivity) is increased for a particular substrate. The method described can be used to determine substrates such as amino acids, carbohydrates, organic acids, alcohols and other metabolites in complex solutions. However, it can also be seen from the principle explained that not only electrode systems can be used as transducers, but also the multiplicity of sensors which can be coupled with biocatalytic activities, such as thermistors, field effect transistors or optical sensors, sensor elements in general. However, the principle of the selective inhibition of undesired metabolic pathways and / or mass transfer systems and / or enzymatic side activities set forth by the invention can also be used in biotechnological metabolic conversion. In this case, for example, secondary enzymatic activities of the more highly integrated biologically active systems, which are not integrated into metabolic pathways for desired product formation, are undesirable. On the one hand, these enzyme activities reduce the desired product yield, based on the amount of substrate used, and on the other hand, by-products are formed, which can complicate both the work-up of the reaction solutions and the recovery of the desired products in pure form. According to the invention, such unwanted side activities of the more highly integrated biologically active compounds are restricted or completely suppressed by the presence of reversibly or irreversibly acting inhibitors in the reaction solutions. Practically, the use of the inhibitors in a similar manner, that is, depending on inhibitor type and type of inhibition, as described in their use in combination with biosensors above.

Der Vorteil dieses Vorgehens bei der Steuerung von Produktbildungen durch höher integrierte biologisch aktive Systeme besteht darin, daß nicht mehr unspezifisch irgendwelche biokatalytische Aktivitäten dieser Systeme verringert oder beseitigt werden und damit auch solche, die zu einer angestrebten Produktbildung beitragen, sondern spezifisch solche, die die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten bewirkenThe advantage of this approach in the control of product formation by more highly integrated biologically active systems is that there is no longer any nonspecific reduction or elimination of any biocatalytic activities of these systems, and thus those that contribute to desired product formation, but specifically those that contribute to formation cause undesirable by-products

Nachfolgend wird die Erfindung durch Ausführungsbeispiele näher erläutert, die ihren Umfang aber nicht einschränken sollen: The invention will be explained in more detail by exemplary embodiments, which are not intended to limit its scope:

embodiments

1. Beispiel1st example

In einem halbsynthetischen Medium (5g Caseinhydrolysat, 5g Ammoniumchlorid, 20ml Salzstammlösung (0,4% FeCL₃ · 6H₂O, 0,13% CaCI₂,0,2% ZnSO₄ · 7H₂0,2,46% MgSO₄ · 7H₂0,3,7% HCI) ad 11 0,134M Phosphatpuffer pH 6,0) bei 3O⁰C 18-2Oh kultivierte Bacillus subtilis-Zellen werden zur Herstellung einer mikrobiologischen Elektrode nach der in DD-WP 210761 beschriebenen Art und Weise eingesetzt. Die so präparierte mikrobiologische Elektrode wird in eine gerührte und temperierte Meßzelle (30⁰C) gebracht, die 2,5ml 0,1 M Phosphatpuffer enthält. Der Meßzelle werden 100/xl des irreversibel wirkenden Inhibitors Chlormercuribenzoat (Endkonzentration in der Meßzelle 0,1 M) zugesetzt. Nach 20 min Einwirkungszeit wird die Meßzelle gespült und die Empfindlichkeit des Sensors gegenüber Glukose und Glutaminsäure getestet. Wie Tabelle 1 zeigt, wird das Glukosesignal um 48% reduziert und gleichzeitig die Empfindlichkeit gegenüber Glutaminsäure leicht erhöht.In a semisynthetic medium (5 g casein hydrolyzate, 5 g ammonium chloride, 20 ml saline stock solution (0.4% FeCl ₃ .6H ₂ O, 0.13% CaCl ₂ , 0.2% ZnSO ₄ .7H ₂ 0.2.46% MgSO ₄₎ . 7H ₂ 0,3,7% HCI) ad 11 0,134M phosphate buffer pH 6.0) at 3O ⁰ C 18-2Oh cultured Bacillus subtilis cells are used to produce a microbiological electrode by the method described in DD-WP 210761 manner , The thus prepared microbiological electrode is brought into a stirred, and temperature-measurement cell (30 ⁰ C) containing 2.5 ml of 0.1 M phosphate buffer. The measuring cell is added to 100 / xl of the irreversibly acting inhibitor chlormercuribenzoate (final concentration in the measuring cell 0.1 M). After a reaction time of 20 minutes, the measuring cell is rinsed and the sensitivity of the sensor to glucose and glutamic acid is tested. As shown in Table 1, the glucose signal is reduced by 48% while the susceptibility to glutamic acid is increased slightly.

Die Selektivität des Sensors gegenüber Glutaminsäure im Vergleich zur Glukose— hat sich durchThe selectivity of the sensor compared to glutamic acid in comparison to glucose has been proven

Signal Glukose /nA/min/ die Chlormercuribehandlung von 3,8 auf 9,3 erhöht.Signal glucose / nA / min / increases the chloromercurane treatment from 3.8 to 9.3.

Table 1 Increase of the glutam specificity of B. subtilis sensors by chlorormercuribenzoal treatment (CMB)

nA Substrat Änderung der Stromstärke ;—nA substrate change in current, -

vorCMB nach CMBbefore CMB according to CMB

Glukose 1,2 mM 293 139(48%)Glucose 1.2 mM 293 139 (48%)

Glutaminsäure 1,2 mM 1117 1296(116%)Glutamic acid 1.2 mM 1117 1296 (116%)

2. Beispiel Die im Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wird durch eine NaF-Behandlung ergänzt, indem dem jeweiligen Meßansatz 100/aI NaF (Endkonzentration 5OmM) zugesetzt werden. NaF hemmt den Glukosestoffwechsel reversibel.2nd Example The procedure described in Example 1 is supplemented by a NaF treatment by adding 100 / aI of NaF (final concentration 5OmM) to the respective measurement batch. NaF reversibly inhibits glucose metabolism.

Durch NaF kann die Glutaminsäureselektivität im Vergleich zu Glukose weiter erhöht werden (auf 14,5, siehe Tabelle 2). With NaF, the glutamic acid selectivity can be further increased compared to glucose (to 14.5, see Table 2).

Table 2 Increase of glutam specificity by NaF

Substrat .Substrate. Änderung der StromstärkeChange in current mit NaFwith NaF nA minmin ohne NaFwithout NaF 86(62%) 1245(96%)86 (62%) 1245 (96%) Glukose 1,2 mM Glutaminsäure 1,2 mMGlucose 1.2 mM glutamic acid 1.2 mM 139 1296139 1296

Example 3

5 Gramm zur Spaltung von Penicillin G befähigte immobilisierte Zellen von E. coli, hergestellt nach einer bekannten Methode durch Immobilisierung ganzer Zellen an einem mitGlutaraldehyd aktivierten makroporösen, aminogruppenhaltigen Kopolymeren auf der Basis von 2-Hydroxyäthylmethacrylat-co-Äthylendimethacrylat (MW_Um 1 000000 Dalton) werden in 50ml Reaktionslösung suspendiert. Die Reaktionslösung besteht aus einer 5%igen Lösung von Penicillin G (Kaliumsalz) in einem Phosphatpuffer (20mM/Liter) vom pH-Wert 7,8, dem als reversibler Inhibitor Borsäure in einer Konzentration von 10mM/Liter zugesetzt werden. Die Reaktion wird bei 35⁰C unter Rühren und Addition von Natronlauge (0,1 M/Liter) zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Wertes in der Reaktionslösung durchgeführt. Die quantitative Bestimmung der aus dem Penicillin G gebildeten 6-Aminopenicillansäure erfolgte spektralphotometrisch nach der Methode mit p-Dimethylaminobenzaldehyd. Durch enzymatische Nebenreaktion verursachte Bildung von Penicillen G-Säure und Penillen G-Säure konnten chromatographisch in der Reaktionslösung nicht nachgewiesen werden.5 gram immobilized E. coli cells capable of cleaving penicillin G prepared by a known method by immobilizing whole cells on a glutaraldehyde-activated macroporous amino group-containing copolymer based on 2-hydroxyethyl methacrylate-co-ethylenedimethacrylate (Mw _around 1 000000 daltons) are suspended in 50 ml of reaction solution. The reaction solution consists of a 5% solution of penicillin G (potassium salt) in a phosphate buffer (20 mM / liter) of pH 7.8 to which boric acid at a concentration of 10 mM / liter is added as a reversible inhibitor. The reaction is carried out at 35 ^° C. with stirring and addition of sodium hydroxide solution (0.1 M / liter) to maintain a constant pH in the reaction solution. The quantitative determination of the 6-aminopenicillanic acid formed from the penicillin G was carried out spectrophotometrically by the method with p-dimethylaminobenzaldehyde. By enzymatic side reaction caused formation of penicillin G acid and penile G acid could not be detected chromatographically in the reaction solution.

Claims

Invention claim:

1. A method for increasing the specificity of highly integrated biologically active systems used for the transformation of substances or in biosensors, such as microorganisms or cells of plant or animal origin, characterized in that reversible or irreversible inhibitors are added to the reaction mixture.

2. A method for increasing the specificity of item 1, characterized in that in a reversible inhibition, the inhibitors are supplied continuously.

3. A method for increasing the specificity according to item 1, characterized in that in an irreversible inhibition, the inhibitors are fed once before the metabolic conversion or analytical reaction.

Field of application of the invention

The invention relates to a method for increasing the specificity of highly integrated biologically active systems such as microorganisms or cells of plant or animal origin in metabolic processes and in biosensors. The method is suitable for use in microbiology, agriculture, food industry, medicine, biotechnology and environmental protection.

Characteristic of the known technical solutions

Biotechnological metabolism and biosensors are increasingly using more highly integrated biological systems. In practical use of these biologically active systems there are a number of advantages compared to the use of isolated biocatalytically active compounds, which are primarily due to the elimination of the isolation of enzymes from the more highly integrated systems in the economic field. Whole cells are suspended in the conversion of substances and in biosensors both in reaction solutions or used in immobilized form. As already described in many places (eg Klein, J. and Vorlop, K.-D., Comprehensive Biotechnology Vol III [1985] Chaper 12, in Press, Mattiasson, B., Immobilized Cells and Organelles, Vol. I P. 1-135 [1983] CRC, Press, Inc. Boca Raton, Florida), it is particularly convenient to use immobilized cells in the above applications. For the determination of natural substrates such as amino acids, carbohydrates, organic acids and alcohols, biosensors are increasingly replacing the conventional methods (Guilbaujt, G. g., Enzyme microbiol.Technol., 2,258-264 [1980], Suzuki, S. and Karube , I., Proc. G. Int. Ferm. Symp., London [Canada], Vol. Ill, pp. 355-360 [1980], Fukui, S. and Tanaka, A., Ann. Rev. Microbiol., 36, 145-172 [1982]). While enzyme electrodes are usually characterized by a high substrate specificity, microbiological electrodes, that is to say those produced with more highly integrated biologically active systems, are generally relatively unspecific because, in addition to the substances to be determined, other assimilable substances often interfere. Substance conversion with soluble or immobilized higher integrated biologically active systems has similar problems. The comparatively low specificity of these systems often leads to a large number of by-products. From an economic point of view, there is the disadvantage that when using these systems, whether in soluble or immobilized form and quite the opposite to the use of soluble or immobilized enzymes, to maintain the metabolism of the cells of the more integrated biologically active systems, a large part of the substrates for synthesis unwanted and thus the material conversion process economically affecting products is used. Inevitably, therefore, the amount of substrate used for the undesired synthesis performance of the desired product formation is not available. For example, improvements in favor of desired product performance in immobilized cell metabolism reactions are conceivable and described, inter alia, by pretreatment of the cells with low concentrations of bifunctional reagents such as glutaraldehyde, but which must be so low that no cross-linking of the cells occurs, such undesirable metabolic activities can be limited or be blocked. The disadvantage of this approach, however, is that the bifunctional reagents are quite unspecific and often suppress the desired synthesis capacity of the cells in an unacceptably high degree. The same goal - but with the same limitations - is often achieved through immobilization.

Object of the invention

The object of the invention is to reduce the abovementioned disadvantages in the use of highly integrated biologically active compounds for the conversion of substances and in biosensors, in order to achieve an improvement in the specific metabolic performances of these systems.

Explanation of the essence of the invention

The object of the invention is to determine previously or only inaccurate due to low specificity of the higher integrated biologically active systems determinable substrates by means of belonging to the biosensors microbiological electrodes in natural or complex solutions by increasing the specificity of said systems compared to said substrates ,