CN104198556A

CN104198556A - 一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法及其产品

Info

Publication number: CN104198556A
Application number: CN201410393649.4A
Authority: CN
Inventors: 吴晓静; 韩东成; 刘凯; 杨益明; 淳林
Original assignee: NANJING PERLONG MEDICAL EQUIPMENT CO Ltd
Current assignee: NANJING PERLONG MEDICAL EQUIPMENT CO Ltd
Priority date: 2014-08-11
Filing date: 2014-08-11
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明公开了一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法以及通过上述制备方法制得的乳酸氧化酶电极膜。将本发明的乳酸氧化酶电极膜用作乳酸传感器的组件，可以有效阻止样本中的还原性电活性物质到达电极表面发生氧化反应产生电信号，从而增大了电极的抗干扰能力；再者，由于采用适当孔径的聚碳酸酯膜作为扩散限制膜，提高了乳酸检测的线性且扩大了检测范围。

Description

一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法及其产品

技术领域

本发明涉及酶电极领域，具体涉及一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法及其产品。

背景技术

乳酸为人体内糖无氧降解的最终产物，乳酸中毒是代谢性酸中毒中最常见的类型之一，表现为血乳酸浓度增高。通过测量人体血液中的乳酸含量不仅可以揭示某些疾病的严重程度，便于诊断和治疗，也可以用于运动医学，科学的控制运动员的训练强度，达到最佳训练效果。

目前，血液乳酸检测主要是通过大型血液生化分析仪，这种方法不仅需血量较多，测量时间也较长，不能满足急诊对病人快速诊断的需求。

酶电极法是将含有酶的凝胶涂布于某种离子选择性电极的敏感膜上，所构成的电极称为酶电极。酶电极与样本或试剂接触后，酶会催化响应底物转化成产物，产物经酶凝胶层扩散至离子选择电极的敏感膜上，在适当的电压下发生得失电子的氧化还原反应，从而产生响应的电信号。该信号与底物浓度之间有一定的对应关系，从而可以计算出底物的浓度。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法。本发明的第二个目的是提供上述乳酸氧化酶电极膜。将这种电极膜与流动注入式氧电极组成乳酸传感器，可提高传感器的使用性能，可快速方便的检测血液中乳酸含量，应用于医疗器械和临床检测等生物医学领域。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，包括以下步骤1~3或者步骤1~4：

1）将醋酸纤维素溶解于环己酮中，得到1%～5%的无色醋酸纤维素成膜液，并将得到的成膜液均匀平铺在玻璃平板表面，待在空气中晾干即得一层醋酸纤维素薄膜；

2）将乳酸氧化酶溶解在含有0.4ml 10mM PBS、0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸钠的混合溶液中，搅拌均匀后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸得到混合物，将混合物超滤至0.4ml，最后加入0.4ml含稳定剂的10mM咪唑缓冲液混匀得到乳酸氧化酶终浓度为20~50mg/ml的酶液；

3）将步骤2）配制的酶液滴加到步骤1）制得的醋酸纤维素薄膜表面，并将第一层聚碳酸酯膜贴合其上，将多余溶液挤出，晾干后即得双层乳酸氧化酶电极膜；

4）将含50～120mg/ml牛血清白蛋白和0.2～0.5%戊二醛的混合物滴加至步骤3）制得的双层乳酸氧化酶膜的第一层聚碳酸酯膜上得到带有混合物的双层乳酸氧化酶膜，再用第二层聚碳酸酯膜贴合在带有混合物的双层乳酸氧化酶膜上，并将多余溶液挤出，晾干后即得三层乳酸氧化酶电极膜。

其中，所述步骤1）中的醋酸纤维素薄膜厚度为2～10mm。

其中，所述步骤2）中的稳定剂为海藻糖、蔗糖、甲壳素中的一种，其含量为10%~50%。

其中，所述步骤3）中第一层聚碳酸酯膜的孔径为10～30nm、厚度为5～15mm。

其中，所述步骤4）中第二层聚碳酸酯膜的孔径为15～50nm、厚度为4～20mm。

由所述的制备方法得到的乳酸氧化酶电极膜，为双层酶电极膜或者三层酶电极膜。

其中，所述双层酶电极膜包括醋酸纤维素薄膜和第一层聚碳酸酯膜，其中，醋酸纤维素薄膜和第一层聚碳酸酯膜中间夹附乳酸氧化酶层。

其中，所述三层酶电极膜包括醋酸纤维素薄膜、第一层聚碳酸酯膜和第二层聚碳酸酯膜，其中，醋酸纤维素薄膜和第一层聚碳酸酯膜中间夹附乳酸氧化酶层，第一层聚碳酸酯膜和第二层聚碳酸酯膜中间夹附牛血清白蛋白/戊二醛层。

有益效果：本发明由于采用适当孔径的聚碳酸酯（PC）膜作为扩散限制膜，降低了乳酸分子的扩散速度，而氧气却可以完全通过，使乳酸分子的扩散过程成为整个反应的控制过程，酶膜内的乳酸浓度始终保持在较低的浓度范围内，同时氧气足量，可使酶膜内较低浓度的乳酸完全被氧化，达到扩大乳酸电极检测范围和提高线性的目的；同时，由于外膜聚碳酸酯（PC）膜和内膜醋酸纤维素（CA）膜的物理阻隔，故可以有效阻止样本中的还原性电活性物质到达电极表面发生氧化反应，从而增大了电极的抗干扰能力；再者，由于外膜聚碳酸酯（PC）膜的孔径较小，还可以有效防止乳酸氧化酶大分子的泄漏，延长电极的使用寿命。

附图说明

图1为本发明实施例1的结构示意图；

图2为本发明实施例2的结构示意图；

图3为本发明乳酸浓度与传感器响应电压（mV）值关系图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，第一步，将醋酸纤维素（CA）溶解于环己酮中，得到1%的无色CA成膜液，并将得到的成膜液均匀平铺在玻璃平板表面，待在空气中晾干即得一层厚度为2mm的CA薄膜1；第二步，配制含0.4ml 10mM PBS、0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸钠的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶（LOD），搅拌均匀后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸，将混合物超滤至0.4ml，最后加入0.4ml含10%海藻糖的10mM咪唑缓冲液，混匀得到LOD终浓度为20mg/ml的酶液；第三步，将第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜1表面得到单层乳酸氧化酶膜，并将孔径10nm、厚度5mm的第一层聚碳酸酯（PC）膜3贴合在单层乳酸氧化酶膜上，将多余溶液挤出，晾干后即得双层乳酸氧化酶膜。

如图1，由上述制备方法制得的乳酸氧化酶电极膜为双层酶电极膜，所述双层酶电极膜包括醋酸纤维素薄膜1和第一层聚碳酸酯膜3，其中，醋酸纤维素薄膜1和第一层聚碳酸酯膜3中间夹附乳酸氧化酶层2。

如图1中，当样品中的乳酸分子流经电极通道时，直接穿过第一层聚碳酸酯膜3与乳酸氧化酶层2中的乳酸氧化酶（LOD）反应，生成的过氧化氢继续穿过醋酸纤维素薄膜1到达处于电解质溶液6之中的Pt电极4表面发生氧化还原反应，产生电信号，AgCl/Ag电极5作为反应的阴极。产生的电信号的强弱与样品中乳酸浓度的大小呈正相关，从而可以计算出样品中的乳酸浓度。

实施例2：

一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，第一步，将醋酸纤维素（CA）溶解于环己酮中，得到1%的无色CA成膜液，并将得到的成膜液均匀平铺在玻璃平板表面，待在空气中晾干即得一层厚度为2mm的CA薄膜1；第二步，配制含0.4ml 10mM PBS、0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸钠的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶（LOD），搅拌均匀后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸，将混合物超滤至0.4ml，最后加入0.4ml含10%海藻糖的10mM咪唑缓冲液，混匀得到LOD终浓度为20mg/ml的酶液；第三步，将第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜1表面得到单层乳酸氧化酶膜，并将孔径20nm、厚度10mm的第一层聚碳酸酯（PC）膜3贴合在单层乳酸氧化酶膜上，将多余溶液挤出，晾干后即得双层乳酸氧化酶膜；第四步，将含50mg/ml牛血清白蛋白（BSA）和0.2%戊二醛的混合物滴加至制得的双层酶膜的第一层PC膜3，用孔径50nm、厚度10mm 的第二层PC膜8贴合在带有混合物的双层乳酸氧化酶膜上，并将多余溶液挤出，中间形成一层膜为牛血清白蛋白/戊二醛层7，晾干后即得三层乳酸氧化酶电极膜。

如图2，由上述制备方法制得的乳酸氧化酶电极膜为三层酶电极膜，所述三层酶电极膜包括醋酸纤维素薄膜1、第一层聚碳酸酯膜3和第二层聚碳酸酯膜8，其中，醋酸纤维素薄膜1和第一层聚碳酸酯膜3中间夹附乳酸氧化酶层2，第一层聚碳酸酯膜3和第二层聚碳酸酯膜8中间夹附牛血清白蛋白/戊二醛层7。

如图2，样品中的乳酸分子流经电极通道时，首先穿过最外层的PC膜8和BSA/戊二醛层7到达第一层PC膜3，再穿过第一层PC膜3与乳酸氧化酶层2中的乳酸氧化酶（LOD）反应，生成的过氧化氢继续穿过醋酸纤维素（CA）薄膜1到达处于电解质溶液6之中的Pt电极4表面发生氧化还原反应，产生电信号，AgCl/Ag电极5作为反应的阴极。产生的电信号的强弱与样品中乳酸浓度的大小呈正相关，从而可以计算出样品中的乳酸浓度。

实施例3

一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，第一步，将醋酸纤维素（CA）溶解于环己酮中，得到5%的无色CA成膜液，并将得到的成膜液均匀平铺在玻璃平板表面，待在空气中晾干即得一层厚度为10mm的CA薄膜1；第二步，配制含0.4ml 10mM PBS、0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸钠的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶（LOD），搅拌均匀后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸，将混合物超滤至0.4ml，最后加入0.4ml含50%蔗糖的10mM咪唑缓冲液，混匀得到LOD终浓度为50mg/ml的酶液；第三步，将第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜1表面得到单层乳酸氧化酶膜，并将孔径15nm、厚度10mm的第一层聚碳酸酯（PC）膜3贴合在单层乳酸氧化酶膜上，将多余溶液挤出，晾干后即得双层乳酸氧化酶膜。

实施例4

一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，第一步，将醋酸纤维素（CA）溶解于环己酮中，得到5%的无色CA成膜液，并将得到的成膜液均匀平铺在玻璃平板表面，待在空气中晾干即得一层厚度为10mm的CA薄膜1；第二步，配制含0.4ml 10mM PBS、0.4ml 2.5%戊二醛和1.6ml 150mM草酸钠的混合溶液，并加入一定量的乳酸氧化酶（LOD），搅拌均匀后再加入0.1ml 0.5mM甘氨酸，将混合物超滤至0.4ml，最后加入0.4ml含30%蔗糖的10mM咪唑缓冲液，混匀得到LOD终浓度为50mg/ml的酶液；第三步，将第二步配制的溶液滴加到第一步制得的CA薄膜1表面得到单层乳酸氧化酶膜，并将孔径15nm、厚度15mm的第一层聚碳酸酯（PC）膜3贴合在单层乳酸氧化酶膜上，将多余溶液挤出，晾干后即得双层乳酸氧化酶膜；第四步，将含120mg/ml牛血清白蛋白（BSA）和0.5%戊二醛的混合物滴加至制得的双层酶膜的第一层PC膜3，用孔径30nm、厚度15mm 的第二层PC膜8贴合在带有混合物的双层乳酸氧化酶膜上，并将多余溶液挤出，中间形成一层膜为牛血清白蛋白/戊二醛层7，晾干后即得三层乳酸氧化酶电极膜。

实施例5

将实施例4中制备得到的电极膜与流动注入式氧电极组成如图2所示的乳酸传感器，当样品中的乳酸分子流经电极通道时，先穿过第二层聚碳酸酯膜8和牛血清白蛋白/戊二醛层7后，再穿过第一层聚碳酸酯膜3与乳酸氧化酶层2中的乳酸氧化酶（LOD）反应，生成的过氧化氢继续穿过醋酸纤维素薄膜1到达处于电解质溶液6之中的Pt电极4表面发生氧化还原反应，产生电流信号，AgCl/Ag电极5作为反应的阴极。产生的电流信号经过处理转化为电压信号，其强弱与样品中乳酸浓度的大小呈正相关，从而可以计算出样品中的乳酸浓度。将浓度分别为0.5, 2, 4, 10, 20 mM的乳酸溶液注入至上述制备得到的乳酸传感器中，30s内在0.7V电压下测试，每一个浓度平行测试三次，乳酸浓度与传感器响应mV值关系如图3所示，可见，乳酸浓度与传感器响应mV值之间呈良好的线性关系，因此只需测出传感器响应mV值即可方便快速的测出乳酸的含量。这种电极膜在4℃下干燥密封保存6个月酶的活性仍可达初始的95%，用其制备的乳酸传感器的线性范围为0~25 mM，使用寿命长达15d。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤1~3或者步骤1~4：

2.根据权利要求1所述的基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中的醋酸纤维素薄膜厚度为2～10mm。

3.根据权利要求1所述的基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中的稳定剂为海藻糖、蔗糖、甲壳素中的一种，其含量为10%~50%。

4.根据权利要求1所述的基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中第一层聚碳酸酯膜的孔径为10～30nm、厚度为5～15mm。

5.根据权利要求1所述的基于乳酸氧化酶电极膜的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中第二层聚碳酸酯膜的孔径为15～50nm、厚度为4～20mm。

6.由权利要求1~5任一项所述的制备方法得到的乳酸氧化酶电极膜，其特征在于，所述乳酸氧化酶电极膜为双层乳酸氧化酶电极膜或者三层乳酸氧化酶电极膜。

7.根据权利要求6所述的乳酸氧化酶电极膜，其特征在于，所述双层乳酸氧化酶电极膜包括醋酸纤维素薄膜和第一层聚碳酸酯膜，其中，醋酸纤维素薄膜和第一层聚碳酸酯膜中间夹附乳酸氧化酶层。

8.根据权利要求6所述的乳酸氧化酶电极膜，其特征在于，所述三层乳酸氧化酶电极膜包括醋酸纤维素薄膜、第一层聚碳酸酯膜和第二层聚碳酸酯膜，其中，醋酸纤维素薄膜和第一层聚碳酸酯膜中间夹附乳酸氧化酶层，第一层聚碳酸酯膜和第二层聚碳酸酯膜中间夹附牛血清白蛋白/戊二醛层。