DE2512586B2

DE2512586B2 - Mehrschichtiges analytisches element fuer die quantitative bestimmung des cholesteringehaltes von fluessigkeiten

Info

Publication number: DE2512586B2
Application number: DE19752512586
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Rochester; Risley Hugh Arthur Ontario; Snoke Roy Eugene Webster; Underwood Gary Marshall Rochester; N.Y. Goodhue (V.St.A.)
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1974-03-25
Filing date: 1975-03-21
Publication date: 1977-12-08
Also published as: DE2512586C3; FR2266170B1; DE2512586A1; GB1502152A; CA1056282A; JPS50137192A; JPS5645599B2; FR2266170A1

Description

(!) einem für Flüssigkeiten impermeablen, für Strahlungsenergie durchlässigen Schichtträger.

(2) einer Reagensschicht auf einer Seite des Schichtträgers mit einer in einem Bindemittel dispergierten Substanz mit Cholesterin-Oxidase-Aktivität und

(3) mindestens einer über der Reagensschicht angeordneten Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin der Flüssigkeit durchlässigen Medium, das die Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes Volumen der Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft,

dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht oder eine über der Reagensschicht angeordnete Schicht aus einem porösen für das Cholesterin durchlässigen Medium eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und eine Protease enthält.

2. Element nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß es als Substanz mit Cnolesterin-Oxidase-Aktivität ein Cholesterin-Oxidase-Enzym enthält.

3. Element nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht auf einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5, vorzugsweise 6,9 bis 7,0 abgepuffert ist.

4. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagensschicht ein Indikatorsystem aufweist, welches mit einem oder mehreren Reaktionsprodukten der durch die Cholesterin-Oxidase induzierten Zerfallsreaktion des Cholesterins reagiert, und zwar unter einer spektrophotometrisch quantitativ erfaßbaren Absorptionsverschiebung.

5. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Lipase enthält, die eine Esteraseaktivität aufweist, entsprechend der Freisetzung von mindestens 25 mg Cholesterin/100 ml in zwei Stunden bei 37°C unter Stickstoff, wenn 50 mg des Lipasepräparates in 5 ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 auf eine Dispersion von Cholesteryllinoleat, hergestellt durch Dispergieren von 200 mg Cholesteryllinoleat in 5 ml Äthyläther und 100 ml siedendem Wasser mit 430 mg Natriumcnolat angesetzt werden.

6. Element nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es die Lipase in der Reagensschicht in einer Konzentration von etwa 90 000 bis etwa 270 000 Einheiten/m- und die Protease in einer Konzentration von etwa 36 000 bis etwa 105 000 enthält.

7. Element nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ₍ zeichnet, daß die Reagensschicht auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,5 abgepuffert ist.

8. Element nach Anspruch b, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lipase eine mikrobiologische Lipase enthält. ₍

9. Element
zeichnet, daß

10. Element nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lipase Weizenkeimlipase, eine pancreatische Lipase oder eine Lipase von Candida L-ylindracca enthält.

11. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Bacillus subtilis-Proiease. eine Streptomyces griseus- Protease und/oder eine Aspergillus oryzae-Protease enthält.

12. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen der oder den Schichten aus einem porösen Medium und der Reagensschicht eine Trennschicht zur Verhinderung des Durchtritts der Protease in die Reagensschicht aufweist.

13. Element nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennschicht aus Agarose aufgebaut ist.

14. Element nach Anspruch I, dadurch gekennzeichne!, daß die poröse Schicht oder die porösen Schichten auf einen pH-Wert von 5 bis 9,5. insbesondere 5,5 bis 8.5, abgepuffert sind.

!5. Element nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der für Flüssigkeiten impermeable, für Strahlungsenergie durchlässige Schichtträger für Wellenlängen von etwa 200 bis etwa 900 mn durchlässig ist.

16. Element nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Schicht oder die porösen Schichten auf einen pH-Wert von etwa 6.0 bis 7.0 abgepuffert ist bzw. sind.

gewonnen wurde.

nach Anspruch 8, dadurch gckenndie Lipase aus Candida cylindracca Die Erfindung betriff!, ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehaltes von Flüssigkeiten mit:

(1) einem für Flüssigkeiten impermeablen, für Strahlungsenergie durchlässigen Schichtträger,

(2) einer Reagensschicht auf einer Seite des Sehiehiträgers mit einer in einem Bindemittel dispergierten Substanz mit Cholesterin-Oxidase-Aktiviun und

(3) mindestens einer über der Reagensschicht angeordneten Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin der Flüssigkeit durchlässigen Medium, das die Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes Volumen der Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft.

Die quantitative Analyse von Cholesterin in komplexen Mischungen, z. B. Blutserum, das sowohl freies als auch verestertes Cholesterin enthält, erfordert bekanntlich die Verwendung korrosiv wirkender Chemikalien zum Zwecke der Hydrolyse der Cholesterinester in das freie Cholesterin sowie im allgemeinen die Verwendung komplexer und nicht leicht zu automatisierender Methoden.

Aus der BE-PS 8 01 742 entsprechend der DT-C)S 32 760 sind bereits mehrschichtige analytische Elemente für die quantitative Analyse komplexer Flüssigkeiten, z. B. Blutserum und Urin bekannt, die bestehen aus: einem Schichtträger, einer Reagensschicht mit einem Testreagens, das einer quantitativen Reaktion mit einem Bestandteil der zu analysierenden und auf das Element aufgebrachten Flüssigkeit unterliegt, und einem porösen Medium, bestehend aus einer oder mehreren Schichten, durch welches der Bestandteil

jer zu analysierenden Flüssigkeit auf die Reagens-,ehicht gelangt, der mit dem in der Reagensschicht .enthaltenden Reagens umgesetzt vurd. Das poröse Medium ist dabei derart beschälen, daß es die auf das Element aufgebrachte, zu analysierende Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch konstantes Volumen der zu analysierenden Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft.

In der DT-OS 22 46 695 wird die Verwendung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms für die Bestimmung von freiem Cholesterin vorgeschlagen. Bei dem in der DT-OS vorgeschlagenen Verfahren handelt es sieh um ein Lösungen verwendendes Bestimmungsverfahren, das die Verwendung korrosiver Chemikalien zur Hydrolyse der Cholesterinester erfordert, welche J₃₀IJpIeIsWCiSe im Blutserum vorhanden sein können.

Aus der DT-AS 22 24 132 ist ferner .»in Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin bekannt, bei dem Cholesterin in wäßrigem Medium mit Cholesterin-Oxidase inkubiert und entweder der Sauerstoffverbrauch oder gebildetes HjOj bzw. Cholestenon bestimmt wird. Aus der DT-AS 22 24 132 ist es auch bekannt, vor der Bestimmung gebundenes Cholesterin durch enzymatische Verseifung mit Esterase, vorzugsweise mit Cholesterin-Esterase aus Leber oder Pankreas, in freies Cholesterin zu überführen.

Es hat sich jedoch gezeigt, daß die meisten im Serum enthaltenen Cholesterinester an Lipo-Protei^e gebunden vorliegen und daß sich diese Cholesterinester-Lipo-Proteinkomplexe mit einer Esterase allein nur schwierig oder sehr langsam verseifen lassen.

Der vorliegenden Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sich diese Schwierigkeit dadurch überwinden läßt, daß man zur Hydrolyse sowohl eine Lipase (mit Cholesterin-Esterase-Aktivität) als auch eine Protease verwendet. Durch die gleichzeitige Verwendung einer Protease werden die Cholesterinester für die Hydrolyse durch die Lipase zugänglich gemacht. Die Protease bewirkt dabei ganz offensichtlich die Aufspaltung der Ester-Lipo-Proteinkomplexe im Serum. Die Protease verursacht dabei entweder das Aufbrechen der Komplexe oder katalysiert das Aufbrechen. Außerdem kann die Protease selbst eine schwache Esterase-Aktivität aufweisen, welche die Hydrolyse begünstigt.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein mehrschichtiges analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Cholesteringehaltes von Flüssigkeiten mit:

(3) mindestens einer über der Reagensschicht angeordneten Schicht aus einem porösen, für das Cholesterin der Flüssigkeit durchlässigen Medium, das die Flüssigkeit derart ausbreitet, daß ein praktisch kontantes Volumen der Flüssigkeit auf eine Flächeneinheit der Reagensschicht auftrifft, das

dadurch gekennzeichnet isi, uuß die "cugcnsscruchi oder eine über der Reagensschicht angeordnete Schicht aus einem porösen für das Cholesterin durchlässigen Medium eine Lipase mit Cholesterin-Esterase-Aktivität und eine Protease enthält.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung kann die Reagensschicht zusätzlich ein lnclikator-System enthalten, welches mit einem oder mehreren Produkten der durch die Cholesterin-Oxidase "i induzierten Zerfallsreaktion des Cholesterins reagiert, und zwar unter Herbeiführung einer spektrophotometrisch quantitativ erfaßbaren Energie-Absorptions\ er Schiebung, vorzugsweise einer Farbänderung.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung in sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Die Schichtenanordnung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung ist aus der BE-PS 8 01 742 entsprechend der DT-OS 23 32 760 bekannt. Demnach eignen sich die erfindungsgemäßen Elemente |-> insbesondere für die Verwendung im Rahmen automatisierter quantitativer Analyseverfahren. Sie besitzen einen vergleichsweise einfachen Aufbau, lassen sich leicht herstellen, sind nicht kosispieiig und können in Form von endlosen Bändern oder Streifen verwendet JMi werden, obgleich sie auch eine andere Form aufweisen können, z. B. die eines Blattes oder kurzen Streifens oder Abschnittes, die gegebenenfalls auf Kennkarten oder Daten speichernde Karten aufgebracht werden können.

j-, Das Aufbringen einer zu analysierenden Flüssigkeit auf ein erfindungsgemäßes Element kann beispielsweise mittels einer automatisch arbeitenden Verteilervorrichtung erfolgen, die eine bestimmte Menge der zu testenden Flüssigkeit auf die richtige Stelle des jo Elements aufbringt.

Die quantitative Analyse von Cholesterin, von beispielsweise Blutserum, läßt sich unter Verwendung üblicher Spektrophotometer und anderer Meßgeräte durchführen, und zwar in schneller und genauer Weise, η wie sich aus der später folgenden Beschreibung noch ergeben wird.

In vorteilhafter Weise dient das aus einer oder mehrerer Schichten gebildete poröse Medium nicht nur zum Ausbreiten der zu analysierenden Flüssigkeit, .κι sondern vielmehr auch noch zur Filtration der /u testenden Flüssigkeit. Außerdem kann das poröse Medium auch noch dazu dienen, um die reflektierende spektrophotometrische Analyse durch die Schicluträgerseite des Elements zu erleichtern. .D Da das erfindungsgemäße Element eine integrale mehrschichtige Struktur aufweist, in welcher der Schichtträger und die verschiedenen Schichten miteinander verbunden sind und da es bei der Verwendung eines solchen Elements lediglich erforderlich ist, eine V) Probe der zu analysierenden Flüssigkeit auf die obere Schicht des Elements aufzubringen und das Element einer geeigneten Analyse-Vorrichtung zuzuführen, vorzugsweise einem Spektrophotometer, ist der Auf wand zur Durchführung der Analyse vergleichsweise v, gering.

Der Schichtträger eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung ist vorzugsweise für ultraviolettes und/oder sichtbares Licht durchlässig. Als besonders vorteilhaft haben sich Schichtträger erwiesen, die für Wellenlängen von etwa 200 bis etwa 400 mn durchlässig sind. Gegebenenfalls kann es vorteilhaft sein, einen Schichtträger zu verwenden, der liir bestimmte, vergleichsweise enge Wellenlängcnbereiche durchlässig ist und für andere Wellenlängen opak oder undurchlässig ist. Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen analytischen Elements können die verschieden sten polymeren Stoffe verwendet werden, beispielsweise Celluloseacetat, Polyethylenterephthalat. Polycarbo-

natc sowie Polystyrol. Der Schichtträger kann verschieden stark sein. Vorzugsweise liegt die Schichtslärke des Schichttriigers bei etwa 0.05 bis 0.254 nun.

Die Reagensschicht kann sich direkt auf dem Schichtträger befinden oder aber auf einer Haft- oder Zwischenschicht auf dem Schichtträger angeordnet sein, die Durchlässigkeitseigenschaften aufweist, die denen des Schichtträger entsprechen oder mindestens ähnlich sind. Mittels einer derartigen Haft- oder Zwischenschicht kann die Reagensschichi fester auf dem Schichtträger verankert werden.

Die Reagensschicht enthält mindestens einen Teil der Testreagenzien, die einer farbbildenden Reaktion unterliegen oder einer anderen strahlungserkennbarcn Reaktion mit Bestandteilen der Cholesterin enthaltenden, zu analysierenden Flüssigkeit. Auf diese Weise können Reaktionsprodukt-Konzentrationen pro Flächeneinheit schnell und leicht bestimmt werden.

Die Reagensschicht kann unter Verwendung üblicher bekannter hydrophiler kolloidaler Bindemitlei, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol und Agarose hergestellt werden. Gegebenenfalls kann die Reagensschichi auch aus mehreren diskreten Teilschichten bestehen, von denen eine jede eine bestimmte Funktion zu erfüllen hat. Gegebenenfalls können diese Teilschichten auch durch nicht störende Trenn- oder Zwischenschichten voneinander getrennt sein. Dies bedeutet, daß die Reagensschicht beispielsweise aus drei diskreten Teilsehichten bestehen kann, die gegebenenfalls durch nicht störende Trenn- oder Zwischenschichten voneinander getrennt sein können. In diesem Fall kann die erste dieser Teilsehichten die für die Cholesterinester-Hydrolyse erforderlichen Reagenzien enthalten, die zweite Schicht die Reagenzien für die Bestimmung des »freien« Cholesterin und die dritte Schicht farberzeugende Verbindungen oder ein anderes Indikatorsystem. Im folgenden wird die Erfindung an Hand der Beschreibung der in der Zeichnung dargestellten F i g. 1 bis 5 sowie an Hand von allgemeinen und speziellen Beispielen näher veranschaulicht.

In den F i g. 1 bis 5 sind stark vergrößerte Querschnitte der erfindungsgemäß verwendeten analytischen Elemente im Schema dargestellt. Im einzelnen sind dargestellt in:

F i g. 1 eine analytisches Element, bestehend aus dem Schichtträger 10, einer hierauf aufgetragenen Reagensschicht 12, einer hierauf aufgetragenen reflektierenden Schicht 14, welche einen weißen Hintergrund für spektrophotometrische Reflexionsmessungen durch den Schichtträger 10 bietet, eine Filterschicht 16 und eine Ausbreitschicht 18. Die Reagensschicht 12 kann dabei beispielsweise bestehen aus einer Dispersion von einem oder mehreren Test-Reagenzien in einem Bindemittel, z. B. Gelatine, während jede der Schichten 14.16 und 18 aus einer »blush«-Polymerschicht bestehen kann, mit einer Porengröße, die der besonderen Funktion der Schichten angepaßt ist,

F i g. 2 ein weiteres analytisches Element, bestehend aus einem Schichtträger 20 mit einer hierauf aufgetragenen Reagensschicht 22 und einer hierauf aufgetragenen Schicht 24, welche die Funktion einer Ausbreitschicht und einer Filterschicht ausübt und die des weiteren einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Reflexionsmessungen durch den Schichtträger 20 bietet. Andererseits kann die Schicht 24 derart beschaffen sein, daß sie nicht reflektiert, in welchem Falle die quantitative Messung nach der Transmissionsoder Durchlässigkeitsnicthode erfolgt. Die Schicht 24 kann beispielsweise eine »blush«-Polymerschichi sein, die auf die Schicht 22 aufgetragen ist oder eine Schicht aus einer mikroporösen Filtermembran, die auf die Schicht 22 auflaminiert ist.

-, F i g. 3 eine weitere Ausgestaltung eines analytischen Elements, bestehend aus dem Schichtträger 30. der Rcagensschicht 32, einer Dialyseschicht 34, die von einer semipermeable!! Membran gebildet wird und einer Schicht 36, z. B. einer »blushu-Polymerschicht, welche κι die Funktion hat, die zu analysierende Probe auszubreiten und zu filtrieren und welche des weiteren einen geeigneten Hintergrund für spektrophotometrische Reflexionsmessungen durch den Schichtträger 30 bietet. Fig. 4 eine weitere Ausgestaltung eines analytischen ii Elements, bestehend aus dem Schichtträger 40, einer ersten Reagensschicht 42, einer zweiten Reagcnsschiclit 44, einer Schicht 46, die als Filter- und lichtreflektiercnde Schicht wirkt und einer Ausbreitschicht 48. Die Schicht 46 kann beispielsweise aus einer Dispersion von Titandioxyd in Celluloseacetat bestehen, und die Schicht 48 kann beispielsweise aus einer Dispersion von Diatomeenerde in Celluloseacetat oder aus einer Dispersion von Glaskügelchen in Gelatine aufgebaut sein,

:·-, F i g. 5 eine weitere Ausgestaltung eines mehrschichtigen analytischen Elements, bestehend aus dem Schichtträger 50 mit einer hierauf aufgetragenen ersten Reagensschicht 52 mit einem Farbindikatorsystem, das im folgenden noch beschrieben wird, dispergiert in so einem geeigneten Bindemittel, einer Trennschicht 54, deren Zweck später noch beschrieben werden wird, einer zweiten Reagensschicht 56, welche die Komponente des Cholesterihester-Hydrolysesystems enthält, d. h. ein Lipasepräparat, welche Cholesterinesteraser> Aktivität zeigt und Protease und Cholestcrinoxidase enthält. Auf der Schicht 56 befindet sich eine kombinierte Ausbreit-. Filter- und reflektierende Schicht 58, einer Zusammensetzung, ähnlich der Zusammensetzung der Schichten 46 und 48 der in F i g. 4 an dargestellten Ausführungsform.

Es hat sich oftmals als zweckmäßig erwiesen, den Beschichtungsmassen Beschichtungshilfsmittel zuzusetzen, welche eine gleichförmige Beschichtung ermöglichen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Elemente können die verschiedensten üblichen Beschichtungshilfsmittel verwendet werden, solange sie die Lipase oder andere Reagenzien in einer der verschiedenen Reagensschichten nicht inhibieren. Als besonders in vorteilhafte Beschichtungshilfsmittel für diesen Zweck haben sich nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen erwiesen, beispielsweise Octylphenoxypolyäthoxyäthanole, die im Handel erhältlich sind, beispielsweise von der Firma Rohm & Haas Co., unter der ■n Handelsbezeichnung Triton, z.B. X-100. 102, 165. 305 und 405. Geeignete Beschichtungshilfsmittel sind des weiteren p-Nonylphenoxylglyzerine. die im Handel erhältlich sind, beispielsweise von der Firma Olin Mathieson Corp.. unter der Handelsbezeichnung Surfaces tant 1OG sowie ferner Polyäthylenglykole, die im Handel beispielsweise unter der Handelsbezeichnung Carbowax. Hersteller Union Carbide, USA. erhältlich sind.

Obgleich die Beschichtungshilfsmittel dazu dienen, to gleichförmige Schichten zu erzeugen, hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, wenn die Reagensschicht, welche die Cholesterin-Oxidase enthält, zusätzlich etwa 0.5 bis etwa 5 e/m^:. insbesondere etwa 1 bis

etwa 3 g/m-' einer oberflächenaktiven Verbindung enthält, welche eine Oxidation des freien Cholesterin?* durch das Oxidaseenzym gewährleistet. Konzentralionen an oberflächenaktiver Verbindung von über 5 g/m-' sollen vermieden werden, da bei Konzentrationen von über 5 g/m- eine Beeinträchtigung der physikalischen Eigenschaften des analytischen Elements oder Bandes erfolgen kann. In vorteilhafter Weise werden übliche bekannte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, beispielsweise Nonylphenoxypolyäthoxyäthylene, z. B. des Typs, der im Handel unter der Handelsbezeichnung Triton X-IOO, Hersteller Rohm & Haas, erhältlich ist.

Das Reagens-System einer bevorzugten Ausgestaltung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung läßt sich als ein aus drei Teilen

aufgebautes Reagens-System bezeichnen. Dabei können zwei Teile des Systems weggelassen werden, d. h. sie sind nicht unbedingt erforderlich und bei ihrem Weglassen werden dennoch vorteilhalte analytische Elemente erhallen. So kann beispielsweise das Farbindikatorsystem fortgelassen werden, wenn z. B. Cholest-4-en-3-on als Indikator verwendet wird und eine quantitative Fluoreszenzmessung erfolgt. Des weiteren kann beispielsweise das enzymatische Hydrolysesystem fortgelassen werden, wenn beispielsweise zur Analyse eine Lösung verwendet wird, die lediglieh »freies« Cholesterin enthält.

Die chemischen Reaktionen, die in einem besonders vorteilhaften mehrschichtigen analytischen Element nach der Erfindung ablaufen können, ergeben sich aus dem folgenden Schema:

1. Cholesterin-Fettsäure-Lipoprotein-Komplex + H₂O

Protease und oberflächenaktive Verbindung

Lipase mit Ϊ sterase-Aktivität

freies Cholesterin + Fettsäure

oberflächenaktive Verbindung

2. Cholesterin + O₂ ^y Cholestenon + H₂O₂

Cholesterin-Oxidase

OH

3. RNH₂ + HO

+ 2H₂O₂

Peroxidase

4H₁O

N-R

CH₃

Reaktion (1) veranschaulicht das Freisetzen von freiem Cholesterin aus Cholesterin und Cholesterinestern, komplexgebunden mit Serum-Lipoproteinen. Die Gleichung (2) veranschaulicht die Cholesterin-Oxidasereaktion. Die Reaktion (3) veranschaulicht eine der vielen möglichen Farbstoff-Peroxidase-Systeme, die angewandt werden können, um das gebildete H>0: zu bestimmen. Im Falle des angegebenen Schemas erfolgt eine Oxidation von 4-Aminoantipyrin und 1,7-Dihydroxynaphthalin zu einer Verbindung mit einem Absorptionsmaximum bei 490 nm. Ein solches Farbstoffsystem ist durch eine besondere Empfindlichkeit, Stabilität und ferner dadurch gekennzeichnet, daß andere .Serumkomponenten nicht stören.

Bei Verwendung von Elementen gleichen Aufbaues, jedoch ohne Oxidase. wurde keine wesentliche Änderung der optischen Dichte innerhalb der Zeiträume, die für die beschriebene Bestimmungsmethode angewandt wurden, erzielt.

Wie später noch näher beschrieben werden wird, können an Stelle des beschriebenen Reaktionssystems die verschiedensten anderen quantitativen Meßsystemc angewandt werden.

Die Grundlage des gesamten Reaktionssystems in einem erfindungsgemäßen analytischen Element ist das Cholesterin-Oxidase-Enzym. Dies Enzym, das die Oxidation von Cholesterin zu Chotest-4-n-3-on und Wasserstoffperoxyd in Gegenwart von Sauerstoff katalysiert, ist das Hauptreagens, welches es ermöglicht, daß eine Flüssigkeit mit Cholesterin und Cholesterinestern auf ein erfindungsgemäßes analytisches Elemem aufgetragen werden und eine direkte photometrischc oder fluorometrisch^ Messung der Cholesterinkonzen· tration im Element erfolgen kann.

Cholesterin-Oxidase kann man nach bekannter Methoden erhalten.

Eine Methode zur Herstellung des Enzyms is beispielsweise bekannt aus dem Buch von T. C S ladt ma η »Methods in Enzymology«, Bd. 1, fernei dem Buch von S. P. C ο 1 ο w i c k und N. O. Kaplan »Eds. Academic Press«, N. Y. 1955, S. 678 und der Arbci von T. C. Stadtman, A. Cherkes und ] A η f i η s c η in »Bio!. Chem.« (1954). Bd. 206, S. 511. Al besonders vorteilhaft hat sich ein Element nach de Erfindung erwiesen, das ein Cholesterin-Oxidasc-En zym enthält, das, wie in den DT-OS 22 46 695 un

709 549/3(

25 12 bO6 beschrieben, durch Züchtung von Mikroorganismen vom Typ Nocardia erhalten wird.

Da Cholesterin-Oxidase, wie die meisten Enzyme, nur innerhalb eines vergleichsweise engen pH-Wcrtbereiches besonders wirksam sind, ist es im allgemeinen erforderlich, die Reagensschicht, die dieses Enzym enthalt, auf einen pH-Wertbereich innerhalb des wirksamen pH-Wertbereiches des Enzyms abzupuffern. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, die Reagensschicht mit der Cholesterin-Oxidase auf einen pH-Wertbereich von etwa 5,5 bis 8,5, insbesondere von 6,0 bis 7,0 abzupuffern, obgleich auch außerhalb des angegebenen breiten Bereiches eine gewisse Enzymaktivität festgestellt werden kann. Zum Abpuffern der Reagensschicht können bekannte übliche Methoden angewandt werden, Dies bedeutet, daß in der Beschichtungsmasse zur Erzeugung der Reagensschicht Puffersubsianzen gelöst oder dispergiert werden können. Geeignete Puffersubstanzen zum Abpuffern des pH-Wertes werden näher beispielsweise beschrieben von Good in der Zeitschrift »Biochemistry«, 5, (1966), S. 467. Besonders vorteilhafte Pulfersubstanzen sind beispielsweise Phosphate, z. B. Kaliumphosphat, das sogenannte Tris (d.h. Tris(hydroxymethyl)aminomethan) und das sogenannte Hepes (d. h. N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthanstilfonsiiure) sowie Dimethylglutarat.

Ein erfindungsgemäßes mehrschichtiges analytisches Element kann ein beliebiges bekanntes Indikatorsystem für die Bestimmung von auf enzymatischem Wege erzeugtem Wasserstoffperoxyd aufweisen. Derartige Indikatorsysteme sind bekannt, insbesondere für die Ermittlung von Glukose und Harnsäure. Aus den US-PS 30 92 465 und 29 81 606 beispielsweise sind geeignete Indikator-Systeme, die sich zur Herstellung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung eignen, bekannt. Die Wasserstoffperoxid-Indikatorsysteme weisen im allgemeinen eine Substanz mit peroxidativer Aktivität, vorzugsweise Peroxidasc auf und einen Indikator, welcher einer Farbbildung oder Farbänderung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Sauerstoff unterliegt. Andererseits kann der Indikator aus einer oder mehreren Substanzen bestehen, welche keiner wesentlichen Farbver2nderung bei Oxidation in Gegenwart von H)O: und Peroxidase unterliegen, welche jedoch in ihrer oxidierten Form mit einer farbbildenden oder farbverändernden Verbindung reagieren, so daß eine quantitative Messung der stattgefundenen chemischen Reaktion ermöglicht wird. Ein solches Firb-Indikatorsystem ist beispielsweise aus der US-PS 29 81 606 bekannt. Ein solches Farbsystem, d. h. ein System, bei welchem eine farbige Substanz mittels einer Zwischenverbindung oder auf Grund einer Farbkupplungsreaktion erzeugt wird, läßt sich in besonders vorteilhafter Weise in einem mehrschichtigen analytischen Element nach der Erfindung verwenden. Bei Verwendung eines solchen Systems werden entweder der Reagensschicht mit der Cholesterin-Oxidase oder einer benachbarten Schicht oder einem besonderen Schichtteil der Reagensschicht die Komponenten des Farbindikatorsystems oder anderen Energie absorbierenden Systems oder anderen Energie emittierenden Insikatorsysteins einverleibt. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß die Komponenten des Indikatorsystems in der zur Erzeugung der Reagensschicht bestimmten bindemittelhaltigen Beschichtungsmasse dispergiert werden, beispielsweise in einer gelatinehaltigcn Beschichtungsmasse, worauf sie auf den Schichtträger aufgetragen werden, beispielsweise

1 10

der HE-PS 8 01742 beschriebener

nach dem in
Verfahren.

Eine Peroxidase ist bekanntlich ein Enzym, welche.¹ eine Reaktion katalysiert, bei welcher Wasserstoffper-

ι oxid eine andere Verbindung oxidiert. Bei der Peroxidasen handelt es sich im allgemeinen im konjugierte Proteine mit Eisenporphyrin. Peroxidast kommt beispielsweise bekanntlich in Meerrettich Kartoffeln, Feigenbaumsaft und Rübenkraut voi

κι (pflanzliche Peroxidase), ferner in Milch (Laeto-Peroxi dase) sowie in weißen Blutkörperchen (Verdo-Peroxida se) sowie ferner in Mikroorganismen. Außer dieser Peroxidasen können auch synthetische Peroxidasei verwendet werden, wie sie beispielsweise aus der Arbeit

ι "> von T h e ο r e 11 und M a e h I y in »Acta Cchm. Scantl. Bd. 4, S. 422 bis 434 (1950) bekannt sind. Wenigei geeignet sind Substanzen, wie Hämin, Methämoglobin Oxihämoglobin, Hämoglobin, Hämochromogen, alkali sches Hämatin, Häminderivate und andere Komponenten, welche peroxidativc oder Peroxidase-gleichc Aktivität enthalten, d. h. die Fähigkeit haben, die Oxidation von bestimmten Verbindungen mittel.¹ Wasserstoffperoxid und anderen Peroxiden zu katalysieren Es wird angenommen, daß die verschiedener

υ Peroxidasen Hämatin enthalten.

Andere Stoffe, welche keine Enzyme sind, jedoch eine Peroxidasegleiche oder ähnliche Aktivität entfalten sind beispielsweise Eisensulfocyanat, Eisentannat, Ferroferrocyanid, Chromisalze, z. B. Kaliumchromisulfat

ίο absorbiert in Kieselsäuregel u. dgl. Auch derartige Substanzen sind verwendbar, obgleich sie nicht ganz se vorteilhaft wie Peroxidase selbst sind.

Farberzeugende Substrate von Peroxidase und Peroxidase gleichen oder ähnlichen Substanzen, welche

r, zu einer Farberzeugung in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und Peroxidase führen und welche im Indikatorsystem eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise die im folgenden angegebe-

κι nen Substanzen, gegebenenfalls in Kombination mit einem Kuppler, falls erforderlich:

I.) Monoamine, z.B. Anilin und Anllinderivate sowie ortho-Toluidin. para-Toluidin u. dgl.;

r> 2.) Diamine. z.B. ortho-Phenylendiamin; N;N'-Dimethyl-para-phenylendiamin; N.N'-Diäthylphenylendiamin; Benzidin (welches einen blauen oder braunen Farbton hervorruft), Dianisidin (welches nach Grün oder Braun umschlägt) u. dgl.;

-.» 3.) Phenole, z.B. Phenol selbst (das einen gelben Farbton hervorruft). Thymol, ο-, m- und p-Kresole (die zu einem grüngelben Farbton, einem rosaroten Farbton bzw. einer milchigen Suspension führen), Λ-Naphthol (das zu einem purpurroten Farbton führt). /i-Naphthol (das zu einem weißen Niederschlag führt) u.dgl.;

4.) Polyphenole, z. B. Brenzcatechin, Guaiacol (welches einen orangen Farbton herbeiführt), Orcinol. Pyrogallol (welches einen rötlichen oder gelben

h(i Farbton herbeiführt), p.p-Dihydroxydiphcnyl iinil

Phloroglucinol;
5.) aromatische Säuren, z. B. Salicylsäure, 2,J-Dilndm-

xybenzoesäure und Gallussäuren; b.) Leukofarbstoffe, z. B. l.cukomalachitgrün. das /u

•ν. Melachitgrün führt, und l.eukophenolphthalein (das

zweckmäßig in einem alkalischen Medium verwendet wird):
7.) Farbstoffe, z. B. 2.6-Dichlorphenolindophenol;

8.) verschiedene biologische Substanzen, wie beispielsweise Epinphrin, die Flavone. Tyrosin, Dihydroxyphenylalanin (das zu einem orangerötlichen Farbton führt) und Tryptophan;

9.) weitere Substanzen, wie beispielsweise CJum guaiac, Guaiaconsüurc, Kalium-, Natrium- und andere in Wasser lösliche Iodide sowie Bilirubin (das zu einem grünlichen Farbton führt) und
10.) spezielle Farbstoffe, wie beispielsweise 2,2'-Azindi(3-äthylbenzothiazoliii-(b)-sulfonsäure) und }.}'-Diaminobenzidin.

Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung enthält das Farbindikatorsystem 4-Meihoxy-lnaphthol. das im oxidierten Zustand einer Selbstkupplung unterliegt, oder eine Kombination von 1.7-Dihydroxynaphthalin und 4-Aminoantipyrin (HCI). In dem zuletzt genannten System kuppelt die Pyrinverbindung mit dem Naphthalin. Die Konzentration der verschiedenen Farbindikatorsysteme in analytischen Elementen nach der Erfindung können sehr verschieden sein. Im wesentlichen hängen die im Einzelfalle günstigsten Konzentrationen von dem Cholesteringehalt der zu testenden Probe ab, der Arbeitsweise des Analysegerätes u. dgl Typische Konzentrationswerte ergeben sich aus den später folgenden Beispielen.

Eine besonders vorteilhafte Lipase, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist die Lipase M von Candida cylindracca, Hersteller Enzyme Development Co., USA, welche beispielsweise zu einer quantitativen Hydrolyse von Serum-Cholesterinestern in einer Zeitspanne von etwa 10 Minuten bei 50⁰C führt. Zur Erzielung maximaler Effekte der Lipase hat es sich als erforderlich erwiesen, ihr eine Protease zuzusetzen. Geeignet sind die verschiedensten mikrobiologischen Preteasen einschließlich Bromelain und die Proteasen vom Streptomyces griseus und Bacillus subtilis.

Die erfindungsgemäß verwendbare Lipase kann pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein, muß jedoch eine Esterase-Aktivität aufweisen. Vorzugsweise wird eine mikrobiologische Lipase verwendet, beispielsweise die Lipase von Candida cylindracca und Lipasen mit ähnlicher oder entsprechender Aktivität. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von handelsüblichen Lipasen, wie beispielsweise Weizenkeimlipase erwiesen, beispielsweise eine solche Weizenkeimlipase, wie sie von der Firma Miles Laboratories of Elkhart, Indiana, USA, vertrieben wird der eine Lipase vom Typ der Lipase 3000, die von der Firma Wilson Laboratories, angeboten oder Steapsin, die von der Firma Sigma Chemical Company, USA, vertrieben wird, wobei die beiden zuletzt genannten Enzyme pancreatische Enzyme sind, sowie die Lipase M (von Candida cylindracca). die von der Firma Enzyme Development Co., USA. hergestellt wird.

Zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente nach der Erfindung lassen sich somit handelsübliche Lipasen verwenden.

Zur Herstellung mehrschichtiger analytischer Elemente nach der Erfindung besonders geeignete Lipasen sind solche mit einer Cholesterin-Esterase-Aktivitäl. die einem Freisetzen von mehr als etwa 25 mg/100 ml Cholesterin entspricht.

hin geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Estcrasc-Aktivitäi von l.ipaseenzyrnen besteht darin, eine bestimmte Menge eines Lipasepräparates /u einer Standard-Choleslcryllinoleat-l.osung bei einem pH-Wert von 7,0 zuzugeben, das Ganze bei 37"C unter N_> zwei Stunden lang zu inkubieren und danach die in der Lösung verbliebene Estcrmenge nach der Hydroxylamin-Methode von ). Von hoe ff m a y r und R. Fried, veröffentlicht in Z. Klin. Chem. U. Klin. Biochem.,8,1 j4(1970)'/.u bestimmen.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Elemente können des weiteren die verschiedensten üblichen bekannten Proteasen verwendet werden, beispielsweise Chymotrypsin, Sireptomyces griseus Protease (im Handel erhältlich unter der Handelsbezeichnung »Pronase«), Proteasen von Aspergillus oryzae. Bacillus subtilis. Elastase, Papain und Bromelain. Auch können Mischlingen derartiger Enzyme verwendet werden.

Das Hydrolysesystem kann in die Cholesterin-Oxidase-Reaagensschieht eingebaut werden. Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Hydrolysesystem jedoch in die poröse Ausbreitschicht eingebaut, beispielsweise durch einfaches Dispergieren der Enzyme in einem lyophilisierteii Zustand in dem Beschichtungsmedium, das zur Erzeugung der Ausbreitschicht verwendet wird, worauf die Beschichtungsmasse auf die Reagensschicht aufgetragen wird.

Bei Verwendung eines solchen analytischen Elements erfolgen Ausbreiten der zu analysierenden Probe und Hydrolyse vorhandener Cholesterinestcr gleich/eilig, so daß auf die Reagensschicht nur freies Cholesterin auftrifft.

Alternativ kann das Hydrolysesystem jedoch auch in einer besonderen Schicht oder Teilschicht zwischen Ausbreitschicht und eigentlicher Reagensschicht oder der die Cholesterin-Oxidase enthaltenden Tcilschicht untergebracht werden, so daß eine Hydrolyse der Cholesterinester erfolgen kann, bevor diese auf die Reagensschicht mit der Cholesterin-Oxidase auftreffen.

Enthält ein erfindungsgemäßes analytisches Element ein enzymatisches Cholesterin Hydrolysesystem. so werden optimale Ergebnisse dann erhalten, wenn die Schicht oder Matrix, die das Hydrolysesystem enthalt, auf einen pH-Wert von 5 bis 9,5, insbesondere von etwa 7,0 bis 8,0 abgepuffert ist. Wird das Hydrolysesystem beispielsweise in die Reagensschicht oder in eine andere Schicht mit der Cholesterin-Oxidase eingebaut, so werden in der R?gel optimale Ergebnisse dann erhalten, wenn die Schicht einen pH-Wert von etwa 7,0 aufweist. Entsprechende oder ähnliche pH-Werte werc'en vorzugsweise angewandt, wenn das Hydrolysesystem in einer zweiten Reagenssehicht untergebracht wird.

Die Konzentration von Lipase und Protease kann sehr verschieden sein, in welcher Schicht auch immer das Hydrolysesystem vorhanden ist. Ganz allgemein jedoch haben sich Lipase-Konzentrationen von etwü 90 000 bis 270 000 E/m-¹ und Protease-Konzentrationei von etwa 36 000 bis etwa 105 000 E/m- als vorteilha! erwiesen. Höhere Konzentrationen können angewand werden, doch dürften derartige Konzentrationen von kommerziellen Standpunkt her wenig zweckmäßig sein Als vorteilhaft haben sich Lipase-Konzeiitrationen v;>i etwa 150 000 bis 200 000 E/m-' Pmteasekonzenir. Monei von etwa 72 000 bis etwa 90 000 E/m- erwiesen.

Wird die Protease in eine Reagensschicht eiligen bei let, tieren Bindemittel oder Matrix primär aus Gelatin besteht, so können sich gewisse Stabilitatsproblem ergeben, da die Protease die Gelatine angreifen kam Obgleich Elemente, welche die Protease und dem/ulo ge das Hydrolysesystem in einer GelaiineReasien¹ schient enthalten, für analytische Zwecke verwendb; sind, hat es sich doch als vorteilhaft erwiesen, d;

Hydrolysesystem in das polymere Bindemittel der Ausbreit-, Filter- und reflektierenden Schicht unterzubringen, welche gegenüber der Einwirkung von Protease resistent ist. Als weitere Maßnahme zum Schutz der Gelatine der ersten Reagensschicht vor der Einwirkung von Protease kann eine Schutz- oder Trennschicht, entsprechend der Schicht 54 von F i g. 5 vorgesehen werden. Bei einer solchen Ausgestaltung eines mehrschichtigen analytischen Elements nach der Erfindung kann es des weiteren vorteilhaft sein, die Cholesterin-Oxidase nahe zum Hydrolysesystem unterzubringen, derart, daß die Bestimmung in der ersten Reagensschicht 52 lediglich erfordert, daß die \ergleichsweise kleinen Wasserstoffperoxidmoleküle die Trenn-Schicht durchdringen können, wohingegen die größeren Protease-Enzymmoleküle daran gehindert werdeci. zwischen der ersten und der zweiten Reagensschieht zu wandern.

Trennschichten des beschriebenen Typs eignen sich in entsprechender Weise zum Schutz von Reagensschichten, welche die Cholesterin-Oxidase mit oder ohne Indikatorsystem enthalten, da sie den Durchtritt von freiem Cholesterin aus dem porösen Ausbreitmediuni in die Reagensschicht ermöglichen, während der Durchtritt der Protease verhindert wird.

Zur Herstellung der Trennschicht können die verschiedensten Stoffe verwendet werden. Vorzugsweise werden derartige Trennschichten aus hydrophilen Polymeren aufgebaut, welche einen Durchtritt oder eine Wanderung des Wasserstoffperoxids sowie von freiem Cholesterin ermöglichen, während sie gleichzeitig den Durchtritt des Proteaseenzyms verhindern. Vorzugsweise wird zur Erzeugung einer derartigen Trennschicht Agarose verwendet, und zwar in einer Schichtstärke von vorzugsweise etwa 0,1 bis 1 g/m². Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zur Herstellung einer derartigen Trennschicht Agarose in einer Konzentration von etwa 0.25 bis etwa 0,70 g/m² verwendet.

Die folgenden speziellen Beispiele sollen die Erfin- . dung noch näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Ein mehrschichtiges analytisches Element mit sämtlichen Reagenzien für die quantitative Analyse des . Gesamtcholesterins eines Blutserums wurde in folgender Weise hergestellt:

Auf einen Polyäthylenterephthalatfilmschichtträger mit einer Gelatinehaftschicht einer Stärke von 0,18 mm wurden die folgenden Schichten aufgetragen. Die im ■· folgenden angegebenen Konzentrationsangaben beziehen sich jeweils auf eine Schichtträgerfläche von 1 m²:

Eine Indikatorschicht aus 21,5 g Gelatine, 7000 Einheiten Peroxidase, 430 mg Bis(vmylsulfonylmethyl)äther, 1936 Einheiten Cholesterin-Oxidase, 2,7 g -, Octylphenoxypolyätlioxyäthanol (Triton X-100), 750 mg 4-Methoxy-1-naphthol, 215 mg S^-Dimelhyl-U-cyclohexandion und Phosphatpuffer zur Einstellung eines pH-Wertes von 6,43;

eine Zwischenschicht aus 323 mg Poly(n-isopropyl- b acrylamid) und eine Ausbreitschicht aus 9,7 g Celluloseacetat, 64,5 g Titandioxid, 1,08 g Lipase M, 2,15 <\-Chymotrypsin und 2,96 ύ Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-100).

Zur Ermittlung der Wirksamkeit des hergestellten _h Elements wurden eine Reihe von Blutserumproben mit 122, 244 und 366 mg Choiesterin/100 ml hergestellt. Auf das Element wurden dann 10 μΐ Tropfen aufgebracht.

worauf nach 12 Minuten bei 37"C spektrophotometrische ,Messungen mit einem 660 ηm Infrarotfilter durchgeführt wurden. Ermittelt wurde die Reflexiunsdichte (Dk) des Elements und es wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten:

Test-Serum Di<660nm (mg/100 ml (12 Min. bei 37 C) Cholesterin)

122	0,12
244	0,18
366	0,19

Beispiel 2

Es wurde ein weiteres analytisches Element für die quantitative Bestimmung des Gesamtcholesteringehaltes von Blutserum in folgender Weise hergestellt:

Auf einen Polyäthylenterephthalatfilmschichttrager mit einer Gebtinehaftschicht einer Stärke von 0,18 mm wurden die f lgenden Schichten aufgetragen. Die im folgenden angegebenen Mengen beziehen sich dabei jeweilsauf eine Schichtträgerfläche von 1 m-.

Eine Indikatorschicht aus 21,5 g Gelatine, 7000 Einheiten Peroxidase, 430 Einheiten Cholesterin-Oxidase, 656 mg 1,7-Dihydroxynaphthalin, 635 mg 4-Aminoantipyrinhydrochlorid und 10,8 mg 4-Amino-5,6-dihydroxy-2-methylpyrimidin bei einem pH-Wert von 7.0; eine Trennschicht aus 108 mg Agarose;

eine Zwischenschicht aus 323 mg Poly-n-isopropylacrylamid und eine Ausbreitschicht mit Hydrolyseenzymen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Das hergestellte Element wurde dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, getestet. Es wurden entsprechende Ergebnisse erhalten.

Beispiel 3

Es wurde ein weiteres analytisches Element für die quantitative Analyse des Gesamtcholesteringehaltes von Blutserum, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt, jedoch mit folgenden Ausnahmen:

1.) Die Indikatorschicht enthielt 750 ng 4-Methoxy-1-naphthol an Stelle von 1,7-Dihydroxynaphthalin und 4-Aminoantipyrin;

2.) die Cholesterin-Oxidase wurde diesmal in der Ausbreitschicht untergebracht, d. h. nicht in der Indikatorschicht. Die Konzentration der Cholesterin-Oxidase lag bei 450 Einheiten/m².

Das hergestellte Element wurde dann nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren getestet. Dabei wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

Test-Serum
(mg/100 ml
Cholesterin)

Dr 660 nm (12Min.bei37°C)

122	0,12
244	0,21
366	0,31
	Beispiel 4

Ein weiteres Element für die quantitative Analyse des Gesamtcholesterin-Gehaltes von Blutserum wurde nach

dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme jedoch, daß die Cholesterin-Oxidase nicht in der Indikattrschicht untergebracht wurde, sondern in der Ausbreitschicht, und zwar in einer Konzentration von 450 Einheiten/m^:.
Das hergestellte Element wurde, wie in Beispiel 1

beschrieben, getestet. Es wurden vergleichbare Ergebnisse, wie in Beispiel 3 angegeben, erhalten.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß sich die erfindungsgemäßen Elemente ausgezeichnet zur analytischen Bestimmung des Cholesterins von Blutserum eignen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

709 549/360

Claims

Patentansprüche:

Γ. Mehrschichtiges analytisches Eiern quantitative Bestimmung des Choleste; von Flüssigkeiten mit:

iir die -ehaltes