CH634108A5

CH634108A5 - Verfahren und vorrichtung zur laufenden bestimmung der konzentration eines enzymsubstrates.

Info

Publication number: CH634108A5
Application number: CH1130077A
Authority: CH
Inventors: Hermann Edelmann; Peter Kraft; Karlheinz Mann; Peter Dr Schuler; Alexander Dr Hagen
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1976-09-20
Filing date: 1977-09-15
Publication date: 1983-01-14
Also published as: HU180210B; DE2642232C3; ATA430077A; NL7707199A; CA1086616A; SE7709357L; DE2642232A1; IT1080795B; JPS5339198A; AT352293B; GB1530847A; BE858791A; FR2393306B1; US4153513A; DE2642232B2; FR2393306A1; DK376677A; DD132150A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines Enzymsubstrates in einer wässrigen Flüssigkeit gemäss Oberbegriff des Anspruches 1 und eine hierfür geeignete Vorrichtung gemäss Oberbegriff des Anspruches 11.

Die kontinuierliche Konzentrationsbestimmung mancher Substanzen wirft Probleme auf, die bei der Einzelanalyse von Proben des gleichen Untersuchungsgutes nicht oder in anderer Form auftreten. Dies ist beispielsweise dann der Fall, wenn während der Probenvorbereitungen oder Probenvorbehandlung bei der Einzelanalyse kinetische Vorgänge bis in ein endgültiges Gleichgewicht ablaufen können, die bei kontinuierlicher, direkter Probeneingabe dagegen nur unvollständig oder gar nicht ablaufen oder zumindest das Messergebnis verfälschen, auch wenn sie vollkommen ablaufen können, bevor der Detektor erreicht wird. Dieses Problem tritt beispielsweise bei der Glucosebestimmung aus Vollblut über die polarometrische Messung des Sauerstoffverbrauches bei der enzymatischen Oxydation der Glucose mittels Gluco.-seoxydase (GOD) durch die Sauerstoffsättigung des Haemo-globins auf. Bei der Bestimmung der Glucose nach diesem Verfahren im Serum tritt dieses Problem nicht auf, weil dabei das Haemoglobin vor der analytischen Probenverarbeitung entfernt wird.

Im Falle einer Einzelbestimmung von Glucose aus Vollblut ist es auch noch leicht möglich, das Haemoglobin mit Sauerstoff abzusättigen, bevor die Probe in das analytische System eingebracht wird. Der dann noch auftretende Sauerstoffverbrauch kann ebenso wie bei der Bestimmung im Serum nur noch durch die Glucose bedingt sein. Wird hingegen der Vene kontinuierlich Vollblut zur Überwachung der Glucose entnommen, so ist dies praktisch nicht mehr möglich. In einem solchen Fall wird man in der Regel das Vollblut durch einen Dialysator führen, in welchem die Glucose in den Dosierkreis für die Analyse übertritt, während das Haemoglobin zurückgehalten wird. Das aus der Vene kommende, an Sauerstoff verarmte Haemoglobin, nimmt jedoch sofort Sauerstoff auf, sobald es dazu in der Lage ist.

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Dies tritt jedenfalls im Dialysator auf, da dort im Messkreislauf eine sauerstoffgesättigte Flüssigkeit vorliegt und eine (h-Diffusion innerhalb des Dialysators von der Messkreisseite zur Probenkreisseite hin auftritt. Infolgedessen verarmt die Flüssigkeit an Sauerstoff. Eine Blockierung des Haemo-globins oder Sättigung mit Sauerstoff, ehe es in den Dialysator gelangt, ist mit vertretbarem Aufwand kaum zu erzielen, zumal bei Eintritt in den Dialysator auch die Konzentration des gelösten Sauerstoffes gleich sein müsste wie diejenige im Dosierkreispuffer.

Ganz ähnliche Probleme wie in dem vorstehend beispielhaft erörterten Fall treten bei zahlreichen anderen Bestimmungen ebenfalls auf, wenn sie kontinuierlich durchgeführt werden. Es besteht nun grundsätzlich die Möglichkeit, diese Probleme durch Verwendung eines zweiten Detektors auszuschalten, welcher die zu bestimmende Komponente des Systems vor der eigentlichen analytischen Reaktion misst. In zahlreichen Fällen scheitert dies jedoch an der Schwierigkeit, zwei vollständig gleiche Detektoren herzustellen. Schon in der Spektralphotometrie bemüht man sich deshalb durch komplizierte Anordnungen die beiden Lichtwege eines Doppelstrahlgerätes möglichst wieder auf einen Empfänger zu lenken, obwohl Photozellen noch leichter zur Übereinstimmung gebracht werden können als andere Messgeräte. Dieses Problem tritt insbesondere auf bei ionenempfindlichen Elektroden, Sauerstoffelektroden, Leitfähigkeitsmessungen sowie generell bei allen solchen Detektoren, die sich praktisch nicht mit völliger Genauigkeit reproduzieren lassen, wo also ein Detektor vom anderen auch bei grösster Sorgfalt in der Herstellung immer gewisse Abweichungen in der Anzeige ergibt. Aber auch dann, wenn dies möglich ist, wäre es von Vorteil, den für diese Übereinstimmungsgenauigkeit getriebenen Aufwand vermeiden zu können.

Dies soll am Beispiel der Sauerstoffelektrode näher erläutert werden. Die Eigenschaften derartiger Elektroden ändern sich mit unterschiedlichen (h-Diffusionswiderständen der Membran vor der Kathode. Sie sind damit von Bespannung zu Bespannung verschieden und die Erfahrung zeigt, dass allein hierdurch bis zu 50%ige Änderungen der Signalhöhe auftreten können. Weitere Veränderungen treten durch Verlegung der Mikroporen der zumeist aus Polytetrafluor-äthylen bestehenden Membran durch Verunreinigungen auf. Weiter spielen anströmungsbedingte Unterschiede in den Grenzschichtverhältnissen vor der Kathode eine Rolle und damit Fertigungsdifferenzen der Durchflusskammern von Exemplar zu Exemplar oder unterschiedliche Positionierungen der Elektrode in der Kammer von einer Montage zur anderen. Schliesslich treten auch Unterschiede in der Linea-rität der Signale, der Nullströme, der Steilheit wie auch im dynamischen Sprungverhalten oder der Übergangscharakteristik zur Sättigung auf. Hinzu kommt, dass bei Anordnung von zwei Detektoren mit getrennten Verstärkern auch Unterschiede zwischen den Verstärkern die Fehlergrösse erhöhen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die oben geschilderten Probleme zu beseitigen und ein einfaches Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, welche ohne grossen apparativen oder herstellungsbedingten Aufwand die kontinuierliche Überwachung einer Enzymsubstratkonzentration gestattet.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss durch das eingangs genannte Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der die zu bestimmende Probe enthaltende Pufferlösungsstrom abwechselnd einmal direkt durch die Messkammer unter Erzeugung eines Referenzsignales und einmal zuerst über das immobilisierte Enzym und danach durch die Messkammer unter Erzeugnung eines Messignals geleitet wird.

Vorteilhafte Ausführunsformen des Verfahrens nach der

Erfindung werden durch die Massnahmen der Ansprüche 2 bis 10 umschrieben.

Das Verfahren nach der Erfindung ist immer dann vorteilhaft anwendbar, wenn das erzeugte Messignal vorzugsweise ein Basissignal bzw. eine Basissignallinie benötigt und die Basissignallinie nicht konstant ist, sondern schwankt oder triftet. Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird lediglich die Reihenfolge, in der die probehaltige Lösung das immobilisierte Enzym und dié Messkammer durchströmt, in regelmässigen, möglichst kurzen, Abständen umgekehrt.

Beim erfindungsgemässen Verfahren misst man mit der gleichen Messkammer, beispielsweise einer O2-Elektrode, ionensensitiven Elektrode oder einer Leitfähigkeitsmessung, z.B. nur zeitlich versetzt vor dem immobilisierten Enzym die tatsächliche, von welchen Einflüssen auch immer bestimmte Konzentration der von der Messung erfassten Substanz und nach Kontakt mit dem immobilisierten Enzym den durch die Umsetzung der zu bestimmenden Substanz geänderten Gehalt an der Messubstanz, also beispielsweise den Sauerstoffgehalt vor und nach Oxydation des Blutzuckers.

Gegenüber bekannten Verfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Konzentation einer Substanz ist es durch die Erfindung möglich z.B. laufend eine Basismesslinie zu erhalten und damit auch Einflüsse durch Temperaturänderungen, Druckänderungen oder Strömungsgeschwindigkeitsänderungen auszuschalten. Denn in regelmässiger Zeitfolge steht z.B. immer wieder die Basismesslinie zur messtechnischen Bezugssetzung zur Verfügung. Das Verfahren der Erfindung stellt z.B. keine im strengen Sinn des Wortes kontinuierliche Bestimmung einer Enzymsubstratkonzentration dar, sondern eine laufende, aber intermittierende Bestimmung. Als Enzymsubstrat werden vorzugsweise alle durch enzymatische Analysenverfahren messbare Substanzen verstanden.

Der Begriff «immobilisiertes Enzym» wird hier in seiner üblichen Bedeutung gebraucht. Er umfasst z.B. trägergebundene Enzyme, ob kovalent oder adsorptiv, durch Einschluss, Verklebung oder Einpolymerisation, durch Vernetzung immobilisierte Enzyme und dergleichen. Das immobilisierte Enzym kann in Form eines Pulvers, Granulates oder dergleichen vorliegen oder an Membranen, Fasern oder Oberflächen von Formkörpern gebunden sein. Zwei bevorzugte Anwendungsweisen des immobilisierten Enzyms bestehen in der Anordnung einer mit granuliertem, enzymatisch aktivem Material gefüllten Enzymsäule im Puffelösungsstrom oder in der Anordnung einer Enzymstrecke, also einer Rohrleitung mit enzymatisch aktiver Oberfläche des Rohres. Im letzteren Fall können beispielsweise Kunststoffschläuche oder Rohre verwendet werden, die z.B. aus Polyamiden bestehen und an deren Oberfläche durch kovalente Bindung oder Verklebung das Enzym immobilisiert ist. Als Probe können beim Verfahren der Erfindung beispielsweise physiologische Flüssigkeiten wie Vollblut oder Harn oder Verfahrenslösungen verwendet werden. Das Verfahren eignet sich daher z.B insbesondere zur Überwachung von Körperfunktionen und der Zusammensetzung vonProzessströmen, beispielsweise Nährlösungen für Mikroorganismen oder dergleichen.

Die das zu bestimmende Substrat enthaltende Probe wird vorzugsweise kontinuierlich in die strömende Pufferlösung eingebracht. Es ist jedoch auch möglich z.B eine intermittierende Einführung vorzusehen, bei der das Probevolumen blockartig im Pufferlösungsstrom wandert. Eine hierfür geeignete Vorrichtung ist beispielsweise bekannt aus DT-OS 2130 308. Vorzugsweise wird eine zirkulierende Pufferlösung angewendet, wenn eine Regeneration derselben möglich ist oder/und akkumulierende Substanzen tolerierbar sind.

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Bei der bevorzugten kontinuierlichen Einführung der Probe wird diese zweckmässig z.B. über eine Dialysemembran mit dem Pufferlösungsstrom in Berührung gebracht, so dass die zu überwachende Substanz in die Pufferlösung eindialysiert werden kann. Auf diese Weise werden z.B. andere, nichtdialysierbare Substanzen, welche Störungen beim Kontakt mit dem Enzym oder in der Messkammer hervorrufen könnten, ausgeschlossen. Wahlweise ist es aber auch möglich, die zu bestimmende Probe z.B. direkt in den Pufferlösungsstrom einzuführen. Im letzteren Fall wird man beispielsweise die Probe vorher durch Zusatz von Pufferlösung, Heparinlösung oder dergleichen so verdünnen, dass keine Störungen durch suspendierte Feststoffe beim Kontakt mit dem immobilisierten Enzym oder in der Messkammer auftreten können und die Konzentration der zu bestimmenden Substanz sich dem Messbereich des Detektors anpasst. Störungen z.B. durch Verstopfung des immobilisierten Enzyms lassen sich vermeiden, indem z.B. möglichst offene Querschnitte gewählt werden, beispielsweise ein Schlauch mit einer enzymatisch aktiven Oberfläche als Enzymstrecke. Zweckmässig erfolgt z.B. die Vorverdünnung, indem die Probe zuerst in einen Pufferlösungszweigstrom eingegeben und dieser dann mit dem Hauptstrom des Puffers gemischt wird.

Die probehaltige Pufferlösung kann man jeweils so lange durch die Messkammer strömen lassen, bis z.B. ein konstantes Referenzsignal bzw. Messignal erhalten wird, ehe man wieder umschaltet, notwendig ist dies aber nicht. Auch muss die Enzymreaktion z.B. nicht vollständig ablaufen, es kann also noch Substrat nach Passieren des immobilisierten Enzyms vorhanden sein. Bei einer zirkulierenden Pufferlösung kann nicht umgesetztes Substrat in einer späteren Umsetzung mit weiterem immobilisierten Enzym vollständig entfernt werden. Auch z.B. andere Substanzen in der Pufferlösung, die nach Passieren der Messkammer bei erneuter Messung stören würden, werden beispielsweise in nichtstö-rende Substanzen umgewandelt oder daraus entfernt. Dies kann beispielsweise erfolgen durch eine weitere Kontaktie-rung mit geeignetem immobilisierten Enzym. Eine besonders zweckmässige Ausführungsform des Verfahrens ist hierbei z.B. die oben erwähnte Umkehrung der Reihenfolge, in der Enzym und Messkammer durchflössen werden, bei welcher z.B. solche Probelösung, die ohne vorherigen Kontakt mit immobilisiertem Enzym direkt in die Messkammer gerät und daher das gesamte Enzymsubstrat noch enthält, anschliessend mit dem immobilisierten Enzym in Kontakt gebracht und dadurch entfernt wird. Falls jedoch z.B. Bedingungen gewählt werden, die nicht zur vollständigen Umsetzung des Substrates, z.B. also der Glucose, führen, so wird in diesem Fall noch eine weitere Kontaktierung mit immobilisiertem Enzym vorgenommen.

Falls bei der enzymatischen Reaktion z.B. Substanzen gebildet werden, welche die Messreaktion beeinflussen oder durch diese erfasst werden, werden sie bevorzugt wieder aus der Pufferlösung entfernt, z.B. durch Adsorptionsmittel oder/und Ionenaustauscher. Dies ist beispielsweise der Fall bei Leitfähigkeitsmessungen. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es aber auch z.B. ohne solche Entfernung der störenden Substanzen im Kreislauf zu arbeiten, da ja bei jedem Kreislauf ein neues Basismessignal erzeugt wird, welches als Bezugspunkt für das Substratmessigaal dient und damit einen Einfluss der Anhäufung stör : r der Substanzen auf die Bestimmung selbst ausschalten kann.

Die Dauer z.B. eines Verfahrenszyklus, also von einer Umschaltung zur nächsten, hängt z.B. ab von der Strömungsgeschwindigkeit der Pufferlösung, der Länge der zu durchströmenden Strecken, der Ansprechzeit des Detektors und der Geschwindigkeit der Enzymreaktion. In der Praxis wird z.B. die Zeitspanne von einer Umschaltung zur nächsten zwischen einigen Minuten und einigen Sekunden liegen. Bei z.B. einer Umschaltzeit von 15 Sekunden würde man z.B. alle 30 Sekunden ein basisbezogenes Signal, d.h. ein Messignal, erhalten. Beispielsweise bei einer Sauerstoffelektrode ist eine gewisse Zeit nötig, um das Diffusionsgleichgewicht einzustellen.

Die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung enthält einen Puffervorratsbehälter, eine Probeeinführungsvorrichtung, immobilisiertes Enzym und eine Messkammer, die miteinander in dieser Reihenfolge durch Leitungen zu einem Kreislaufsystem verbunden sind und ist erfmdungsgemäss gekennzeichnet durch eine Überbrük-kungsleitung zwischen der Probeeinführungsvorrichtung und der Messkammer und ein Wechselventil, welches die Überbrückungsleitung abwechselnd sperrt.

Vorteilhafte Ausführungsformen der Vorrichtung nach der Erfindung sind durch die Massnahmen nach den Ansprüchen 12 bis 16 umschrieben.

Die Erfindung wird in Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen näher beschrieben, in der bedeuten:

Fig. 1 eine Vorrichtung zur laufenden Konzentrationsbestimmung eines Enzymsubstrates in einer ersten Schaltstellung in schematisher Darstellung;

Fig. 2 die Vorichtung von Fig. 1 in einer anderen Schaltstellung;

Fig. 3 eine andere Ausführungsform einer Vorichtung zur laufenden Konzentrationsbestimmung eines Enzymsubstrates in einer ersten Schaltstellung; Fig. 4 eine andere Schaltstellung der Vorrichtung von Fig. 3; und

Fig. 5 eine typische Messkurve, die mit der erfindungsge-mässen Vorrichtung aufgezeichnet wurde.

Die Vorrichtung nach Fig. 1 enthält einen Puffervorratsbehälter 1, eine Probeeinführungsvorrichtung 2, immobilisiertes Enzym 3 und eine Messkammer 4, die miteinander in dieser Reihenfolge durch Leitungen zu einem Kreislaufsystem verbunden sind. Zwischen der Probeeinführungsvorrichtung 2 und der Messkammer 4 liegen eine Überbrük-kungsleitung 5 und ein Wechselventil 6 vor, welches die Überbrückungsleitung 5 abwechselnd sperrt.

Das Wechselventil 6 weist drei Kanäle 61,62,63 auf, wobei in einer ersten Position des Wechselventils der erste Kanal

(61) die Überbrückungsleitung (5) bildet, der zweite Kanal

(62) den Abstrom von der Messkammer (4) zum immobilisierten Enzym (3) leitet und der dritte Kanal (63) den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der zum Behälter (1) führenden Leitung verbindet.

Die zweite Position des Wechselventils (6) von Figur 1 ist in Figur 2 dargestellt. Danach leitet der erste Kanal (61) zum Enzym (3), der zweite Kanal verbindet den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der Messkammer (4) und der dritte Kanal (63) den Abstrom von der Messkammer (4) mit der zum Behälter (1) führenden Leitung. In der in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ausführungsform enthält die Vorrichtung weiter zwei Pumpen (8 und 8a), welche die Strömung im Messkreislauf und im Probekreislauf aufrecht erhalten, einen Reaktor (9) zur Umwandlung von restlichem Substrat, eine Venenkanüle (10), mit der Vollblut über die Pumpe (8a) in die als Dialysator ausgebildete Probeeinführungsvorrichtung (2) und weiter zu einem Sammelgefäss (11) geleitet wird und einen Behälter (12) für Heparinverdün-nungslösung, die mit dem durch die Kanüle (10) abgenommenen Vollblut vermischt dem Dialysator (2) zugeführt wird.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist in den Figuren 3 und 4 dargestellt. Diese Ausführungsform ermöglicht eine Verkürzung der Umschaltzeiten. Während die

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gesamte Vorrichtung im wesentlichen der in den Figuren 1 und 2 beschriebenen entspricht, wird hier ein Wechselventil (6) mit zwei Kanälen (64,65) vorgesehen, wobei der erste Kanal (64) das immobilisierte Enzym (3) enthält. In einer ersten Position des Wechselventils verbindet der erste Kanal (64) den Abstrom von der Messkammer (4) mit der zum Behälter (1) führenden Leitung und der zweite Kanal (65) bildet die Überbrückungsleitung (5).

In der in Figur 4 dargestellten Position des Wechselventils verbindet der erste Kanal (64) den Abstrom von der Probe-einführungsvorichtung (2) mit der Messkammer (4) und der zweite Kanal (65) den Abstrom von der Messkammer (4) mit der zum Behälter ( 1 ) führenden Leitung.

Bei Betrieb der erfindungsgemässen Vorrichtung wird durch die Venenkanüle (10) Blut entnommen und gleichzeitig mit einer aus dem Vorratsbehälter (12) durch die Pumpe (8a) geförderten Heparinlösung in vorbestimmten Volumenverhältnissen verdünnt. Die dabei erhaltene Mischung von Vollblut mit Heparinlösung wird durch die Pumpe (8a) angesaugt und der als Dialysator ausgebildeten Probeneinführungsvorrichtung (2) zugeführt und von dort in den Sammelbehälter (11) weitergeleitet. Im Dialysator steht die Mischung von Vollblut mit Heparinlösung im Austausch mit durch die Pumpe (8) aus dem Vorratsbehälter (1) zugeführter Pufferlösung. Hierbei treten die dialysierbaren niedermolekularen Substanzen, wie z.B.Glucose, aus dem verdünnten Vollblut in den Messkreislauf über und gelangen in Kanal (61) bzw. (64) des Wechselventils (6). In der in den Figuren 1 und 3 gezeigten Position des Wechselventils bildet dieser Kanal einen Teil der Überbrückungsleitung (5) und die probehaltige Pufferlösung gelangt daher direkt in die Messkammer (4) unter Erzeugung eines entsprechenden Messignals, welches in einer hier nicht gezeigten Vorrichtuung angezeigt wird. Danach gelangt der Pufferlösungstrom wieder zurück in das Wechselventil in Kanal (62), kommt mit dem immobilisierten Enzym (3) in Kontkat und strömt dann in das Wechselventil und durch Kanal (63) über den Reaktor (9) in das Puffervor-ratsgefäss (1) zurück. Bei der Ausführungsform der Figuren 3 und 4 ist die Enzymstrecken den Kanal (64) verlegt, im übrigen ist die Betriebsweise jedoch genauso wie oben beschrieben.

Gegebenenfalls kann zwischen Probeeinführungsvorrichtung (2) und Wechselventil (6) noch ein Strömungsumkehrventil angeordnet werden, damit notfalls Gasblasen oder ähnliche Störungen kurzzeitig aus dem Kreislauf entfernt werden können. Zweckmässig wird dieses Strömungsumkehrventil dann so angeordnet, dass vor Erreichen des Behälters (1) noch der Reaktor (9) durchströmt wird.

Eine besonders vorteilhafte Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens und der Vorrichtung besteht in der Steuerung des Zusatzes von Substanzen in Abhängigkeit von den ermittelten Messwerten. Beispielsweise kann mit der oben beschriebenen Ausführungsform der Erfindung, bei welcher die Blutzuckerkonzentration gemesen wird, in Abhängikeit vom erhaltenen Messwert ein blutzuckersenkendes Mittel, wie Insulin oder eine blutzuckererhöhende Substanz zudosiert werden. In analoger Weise ist es aufgrund des Messwertes möglich, wenn diese zur Überwachung ablaufender Reaktionen eingesetzt werden, die Zugabe von Ausgangsstoffen für diese Reaktionen zu steuern u. ä. m..

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1

Es wird die sp den Figuren 1 und 2 dargestellte Vorrichtung verwendet. Eine handelsübliche Yenenkanüie 10, die eine Heparinisierung des Blutes direkt an ihrer Spitze erlaubt, entnimmt das Blut. Die Schlauchpumpe (8a) fördert hierzu aus dem Heparinlösungsvorratsgefäss (12) 5 ml/Stunde Heparinlösung (50 000 U/100 ml) zur Kanüle. Der zweite, in die Pumpe (8a) eingelegte Schlauch saugt aus der Kanüle eine Mischung von 5 ml/Stunde Heparinlösung und 5 ml/Stunde Blut an. Diese Mischung gelangt nun zur Primärseite des als Dialysator ausgebildeten Probeeinführungsgerätes (4) und von dort zu einem Abfallgefäss (11). Während der Verweilzeit im Dialysator tritt das heparinisierte Blut mit dem die Sekundärseite des Dialysators durchströmenden Puffer in Austausch. Die Laufstrecke im Dialysator beträgt 15 cm. Der Puffer (0,2 M Phosphatpuffer pH 6,0, enthaltend 0,02% Alka-liacid) wird von der Schlauchpumpe (8) einem 51 fassenden Vorratsbehälter (1) entnommen, welcher von Luft durchperlt wird, um den Puffer dauernd mit Sauerstoff zu sättigen. Die gesamte Anordnung ist thermostatisiert auf 30°C.

Von der Förderseite der Schlauchpumpe (8) gelangt der Puffer zur Sekundärseite des Dialysators. Dort wird er auf ca. 1% der Glucosekonzentration des heparinisierten Blutes gebracht. Wie in Zusammenhang mit den Figuren 1 und 2 beschrieben, strömt der glucosehaltige Puffer abwechselnd zuerst über die Messkammer (4) und dann über das immobilisierte Enzym (3) (Figur 1) und zuerst über das immobilisierte Enzym (3) und dann über die Messkammer (4) (Figur 2). Sowohl im Enzymreaktor (3) als auch im Enzymreaktor (9) befindet sich jeweils immobilisierte Glucoseoxydase (GOD).

Die in der Messkammer (4) erzeugten Mesströme werden über einen Verstärker auf eine Anzeigevorrichtung übertragen. Figur 5 zeigt eine typische Aufzeichnung der erhaltenen Ergebnisse. Der untere Wendepunkt der Kurve entspricht dem Basismessignal, der obere Wendepunkt dem Substratmesssignal. Mit A wird die Eichung angegeben, bei der ein Blutzuckerstandard von 320 mg/100 ml verwendet wurde. Bei B wurde auf die aus der Vene entnommene Probe umgeschaltet. Der erkennbare Basislinienanstieg ist auf das Hämoglobin zurückzuführen und würde das Glucosesignal um ca. 40 mg/100 ml verfälschen, wenn er nicht durch die erfindungsgemässe Inversionsanordnung korrigiert würde.

Beispiel 2

Es wurde die in den Figuren 3 und 4 dargestellte Vorrichtung verwendet. Die beiden Enzymstrecken (3) und (9) enthielten immobilisierte Urease. Die Messkammer (4) war zur Messung der Leitfähigkeit eingerichtet. Bei Überleitung einer harnstoffhaltigen Pufferlösung wird der Harnstoff durch die Urease unter Bildung von Amoniak und Kohlensäure gespalten. Diese Produkte verändern die Leitfähigkeit des Puffers und können daher auf diese Weise direkt bestimmt werden. Die Pufferlösung besteht aus 7 x 103 M Hepes (2-[4-Hydroxyäthyl)-piperazinyl-(l)-]äthansulfonsäure), mit 0,2 M Tris auf pH 7,4 eingestellt. Die Grundleitfähigkeit dieses Puffers beträgt ca. 150 Mikro-Siemens. Bei der Dialyse in der Probeeinführungsvorrichtung (2) steigt die Leitfähigkeit des Puffers durch übertretende Elektrolyten um etwa 200 MikroSiemens an. Je nach Höhe des Harnstoffgehaltes liefert der Harnstoffabbau im Enzym (3) weitere 50 bis 200 Mikro-Sie-mens.

Die Leitfähigkeitszelle misst von 5 bis ca. 15 000 MikroSiemens linear. Der Puffer kann daher so oft wieder verwendet werden, bis die Grundleitfähigkeit sich 15 000 MikroSiemens nähert und wird dann durch frischen Puffer ersetzt.

Alternativ kann im Reaktor (9) ein lonenaustauscherbett angeordnet werden, welches die gebildeten Ionen wieder entfernt. Statt dessen kann der Reaktor auch eine Elektrodialyse-eiüheit, lonenaustauschmembran oder ein anderes geeignetes Mittel zur Entfernung der die Leitfähigkeit erhöhenden Ionen enthalten.

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1. Verfahren zur laufenden Bestimmung der Konzentration eines Enzymsubstrates in einer wässrigen Flüssigkeit durch Einführung einer das zu bestimmende Substrat enthaltenden Probe in einen Pufferlösungsstrom, Umsetzung des Substrates an einem immobilisierten Enzym und physikalische Messung einer dadurch hervorgerufenen Änderung in der Lösung in einer Messkammer, dadurch gekennzeichnet, dass der die zu bestimmende Probe enthaltende Pufferlösungsstrom abwechselnd einmal direkt durch die Messkammer unter Erzeugung eines Referenzsignales und einmal zuerst über das immobilisierte Enzym und danach durch die Messkammer unter Erzeugung eines Messignales geleitet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die das zu bestimmende Substrat enthaltende Probe kontinuierlich in die Pufferlösung eingebracht wird.

(3) enthält, und in einer ersten Position des Ventils der erste Kanal (64) den Abstrom von der Messkammer (4) mit der zum Behälter (1) führenden Leitung verbindet und der zweite Kanal (65) die Überbrückungsleitung (5) bildet und in einer zweiten Position der erste Kanal (64) den Abstrom von der Probeeinführungsvorrichtung (2) mit der Messkammer (4) und der zweite Kanal (65) den Abstrom von der Messkammer

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in den Pufferlösungsstrom eindialysiert wird.

(4) mit der zum Behälter (1 ) führendenLeitung verbindet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende Probe direkt in den Pufferlösungsstrom eingeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die probehaltige Pufferlösung jeweils so lange durch die Messkammer strömen gelassen wird, bis ein konstantes Basissignal bzw. Messignal erhalten wird, ehe wieder umgeschaltet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Pufferlösung nach Passieren der Messkammer bei erneuter Messung störende Substanzen umgewandelt oder daraus entfernt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferlösung nach Passieren der Messkammer mit immobilisiertem Enzym so lange kontaktiert wird, bis in der Lösung enthaltenes Substrat vollständig umgesetzt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferlösung mit Adsorptionsmittel oder/und Ionenaustauscher kontaktiert wird unter Entfernung der störenden Substanz bzw. Substanzen aus der Pufferlösung.

9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bestimmende Probe mit einem Pufferlösungszweigstrom vorverdünnt und dann in den Pufferlösungshauptstrom eingeführt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine eiweisshaltige Probe wie Vollblut zuerst mit Heparinlösung verdünnt und dann in die Pufferlösung eindialysiert oder direkt eingeführt wird.

11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend einen Puffervorratsbehälter (1), eine Probeeinführungsvorrichtung (2), immobilisiertes Enzym (3) und eine Messkammer (4), die miteinander in dieser Reihenfolge durch Leitungen zu einem Kreislaufsystem verbunden sind, gekennzeichnet durch eine Überbrückungsleitung (5) zwischen Probeeinführungsvorrichtung (2) und Messkammer (4) und ein Wechselventil (6), welches die Überbrückungsleitung (5) abwechselnd sperrt.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Wechselventil (6) drei Kanäle (61,62,63) aufweist, wobei in einer ersten Position des Wechselventils der erste Kanal (61) die Überbrückungsleitung (5) bildet, der zweite Kanal (62) den Abstrom von der Messkammer (4) zum immobilisierten Enzym (3) leitet und der dritte Kanal (63) den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der zum Behälter (1) führenden Leitung verbindet und in einer zweiten Position der erste Kanal (61) die Leitung zum immobilisierten Enzym (3) bildet, der zweite Kanal (62) den Abstrom vom immobilisierten Enzym (3) mit der Messkammer (4) und der dritte Kanal (63) den Abstrom von der

Messkammer (4) mit der zum Behälter ( 1 ) führenden Leitung verbindet.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Wechselventil (6) zwei Kanäle (64,65) aufweist, wobei der erste Kanal (64) das immobilisierte Enzym

14. Vorrichtung nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch einen Reaktor (9) zur Entfernung bzw. Umwandlung störender Substanzen, der in der zum Behälter (1) führenden Leitung angeordnet ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktor (9)das gleiche immobilisierte Enzym wie die Enzymstrecke (3) enthält.

16. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Injektionsvorrichtung aufweist und das Messignal der Messkammer (4) die Einbringung einer bestimmten Menge einer Injektionsflüssigkeit in die Flüssigkeit, in der die Enzymsubstratkonzentration laufend bestimmt wird, in Abhängigkeit vom Messsignalwert steuert.