DE2130308B2 - Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen von enzymatisch umsetzbaren Probensubstanzen - Google Patents

Description

Zuckergehaltes bei einem Patienten bekannt, wobei der blockartig eingegebenen ProbenlösunB, _v „„„

am Patientenkörper extrem oder intern eine Dialyse- der zu bestimmenden Substanz) mit dem kreisenden vorrichtung angebracht wird, bei der Blut gegen eine Strom bewirkt. Die Vermischung kann beispielsweise enzyrohalüge Pufferlösung dialyslert wird. Hier wird durch Wirbelbildung durch mechanische Hindernisse ein anderes Problem, nämlich das der Überwachung, 5 im Lösungsstrom erfolgen. Die Vermischung soll gelöst und es ist nicht möglich, mit dem bekannten möglichst gering gehalten werden, um die Analysen-Verfahren und der bekannten Vorrichtung quantita- frequenz und die Empfindlichkeit der Methode nicht tive Bestimmungen einzelner Probensubstanzen zu verringern. Sie muß lediglich In solchem Umfung durchzuführen. Auch wird man zwar bei dem bekann- stattfinden, daß ein Kontakt der zu bestimmenden ten Verfahren im allgemeinen auch luftblasenfrei io Substanz mit den für die Umsetzung benötigten Subarbeiten, eine vorhandene Luftblase wird jedoch im stanzen gewährleistet ist und der für die Aktivität des Gegensatz zur Erfindung die Gesamtmessung nicht Enzyms gewünschte pH-Wert sich einstellt,
stören. Bei Verwendung eines trägergebundenen unlös-Das erfindungsgemäße Verfahren eignet ich allge- liehen Enzyms, welches zwischen Applikator und Demein zur quantitativen Bestimmung von in wäßriger ts tektor in den Lösungsstrom eingeschaltet wird, ergibt Lösung enzymatisch umsetzbaren Probensubstanzen, sich der gewünschte Vermischungsgrad ohne weiteres vorausgesetzt, daß sich bei dieser Umsetzung eine Ver- durch die im Enzymbett stattfindende Vermischung änderung in der Lösung ergibt, die physikalisch ge- bzw. Verdübelung. In diesem Fall kann auch die messen werden kann und proportional der Umset- Vermischung besonders gering gehalten werden, da zung bzw. der Menge der zu bestimmenden Substanz ao ein zufriedenstellender Kontakt mit dem Enzym auf ist. Unter quantitativer Bestimmung wird auch die jeden Fall gegeben ist.

Bestimmung von Enzym-Aktivitäten ' erstanden. Der- Soweit ein trägergebundeues Enzym verwendet

artige Substanzen und Umsetzungen sind in großer wird, sollte die spezifische Aktivität wenigstens

Zahl bekannt. Beispiele hierfür sind Umsetzungen, 10 U/g, vorzugsweise mehr als 50 U/g, betragen, um

welche sich so mit der Oxydation von reduzier- »5 ein großes Säulenvolumen und damit eine starke Ver-

tem Nicotinamid-Adenindinucleotid (NADH bzw. mischung des Probe-sBlocks« mit der Pufferlösung

NADPH) koppeln lassen, daß die Änderung der Ex- zu vermeiden.

tinktion von NADH der Umsetzung proportional ist. Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Auf diese Weise können beispielsweise bestimmt wer- Verfahrens besteht in der luftblasenfrei blockartigen den: Acetaldehyd, Pyruvat, Sorbose, Oxalacetat, 30 Einführung der Lösung, welche die zu bestimmende rt-Ketoglutarat, Glutamat- Pyruvat -Transaminase Substanz enthält, in den Pufferlösungsstrom. Die Lö-(GPT), GIutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) sung soll dabei unter möglichst geringer Vermischung U. v. a. mit dem Pufferlösungstrom so eingeführt werden, daß Andere derartige Reaktionen sind die Bestimmung sie nach Art eines Flüssigkeitspfropfens im fließenden von Harnstoff mittels Urease und Messung des ge- 35 Strom wandet. Eine derartige Einführung läßt sich bildeten Ammoniumcarbonat*, beispielsweise durch beispielsweise mit Hilfe eines Schiebers erzielen, wel-Bestimmung der Ammoniumionenkonzentration; Um- eher in einer Bohrung die abgemessene Menge der setzung von Saccharose mit Invertase und Messung Lösung enthält und so in den flitDenden Pufferder optischen Drehung mittels Polarimeter; Spaltung lösungsstrcm gebracht wird, daß die Probelösung von Lipiden mittels Lipase unter Bildung von Fett- 40 blockartig bzw. pfropfenartig in der Pufferlösung mitsäuren und Bestimmung der pH-Wert-Veränderung geführt wird.

mittels Glaselektrode; Bestimmung von Pyrophosphat Ein weiteres wesentliches Merkmal des erfindungsdurch Spaltung mittels Pyrophosphatase unter BiI- gemäßen Verfahrens besteht darin, daß ein mit kondung von Grthophosphat oder Bestimmung von GIu- stanter Geschwindigkeit fließender Strom einer gecose durch mit Glucoseoxydase katalysierte Oxyda- 45 eigneten Pufferlösung als Träger und Reaktionsmittel tion und Messung der Wärmetönung im Kalorimeter; für die Umsetzung verwendet wird. Unter konstanter Oxydation von Glucose oder Galactose, Harnsäure, Geschwindigkeit wird hierbei eine solche Konstanz Xanthin, Hypoxanthin, Cytochrom A, Aminosäuren, der Geschwindigkeit verstanden, bei der die unverpolyungesättigten Fettsäuren mit spezifischen Oxy- meidlich auftretenden Geschwtndigkeitsschwankundasen und Messung der Verringerung der Sauerstoff- 50 gen so gering sind, daß sie von dem mit dem Detekkonzentratioiv mittels Sauerstoffelektrode; Bestim- tor verbundenen Anzeigegerät praktisch nicht regimung von Wasserstoffperoxyd und anorganischen striert werden. Diese Bedingung ist ideal erfüllt, wenn Peroxyden mittels Katalase und Messung des gebil- konstant» Bedingungen angezeigt werden, solange deten Sauerstoffs, ebenfalls mittels Sauertoffelektrode, kein Probelösungsblock den Detektor passiert. Wird Bestimmung von Aminosäuren mit Aminosäuredecarb- 55 diese konstante Geschwindigkeit nicht eingehalten, so oxylase und Messung des gebildeten CO₂ u.v.a. kann durch das ständig anzeigende Gerät in Verbin-Für die obigen Umsetzungen unter Sauerstoffver- düng nut dem Detektor eine Umsetzung vergetäuscht brauch geeignete Enzyme sind beispielsweise GIu- werden. Eine solche Änderung kann auch vorgecoseoxydase, Galactoseoxydase, Uricase, Xanthin- täuscht werden, wenn bei der Einführung der Probeoxydase, Cytochromoxydase, Aminosäureoxydase 60 lösung Luftblasen in den Reagevizstrom gebracht und Lipoxygenase. werden.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Wesentlich ist weiter, daß die blockartige Einfüh-Enzyme können entweder im kontinuierlich zirkulie- rung der Probelösung keine Änderung der Strömungsrenden Lösungistrom gelöst vorliegen oder als träger- geschwindigkeit des mit konstanter Geschwindigkeit gebundene unlösiiche Enzyme teilchenförmig in Form «5 fließenden Stroms der Pufferlösung hervorruft, da eines Bettes, z. B. als Säule, im Lösungstrom ange- hierdurch die Gefahr einer Verfälschung des Meßordnet sein. Wi./; gelöstes Enzym verwendet, so wird efgebnisses entsteht,
durch geeignete Mittel eine geringfügige Vermischung Für die Regenerierung der verbrauchten Kompo-

nenten nach Durchlaufen des Detektors, nachdem Oxalacetat und Glutamat überführt weiden. Das geder Pufferlösungsstrom konstant im Kreislauf umge- bildete Oxalacetat wird mit dem im Lösungsstrom pumpt wird, ist es zweckmäßig, wenn verbrauchte kreisenden oder trägergebunden vorliegenden Enzym Komponenten wieder ergänzt werden. Wird bsispiels- Malatdehydrogenase in Malat überführt, wobei gleichweise das Verfahren unter Verwendung einer zu be- 5 zeitig in der Lösung vorhandenes NADH wieder in stimmenden Substanz durchgeführt, welche unter NAD umgewandelt wird.

Sauerstoffverbrauch oxydiert wird, so kann der Sauer- Die blockartige Eingabe der Probelösung ohne stoffgehalt der Pufferlösung wieder ergänzt werden, Änderung der Strömungsgeschwindigkeit wird vorindem beispielsweise Luft durchgeleitet wird. Dies zugsweise so durchgeführt, daß der Pufferlösungserfolgt zweckmäßig in einem etwas größeren Be- »o strom geteilt wird und die Teilströme abwechselnd halter mit entsprechender Verweilzeit der Pufferlö- unterbrochen werden und die die zu bestimmende sung. Falls die zu bestimmende Substanz unter Er- Substanz enthaltende Lösung (Probelösung) in den höhung des Sauerstoffgehaltes der Lösung reduziert jeweils unterbrochenen Strom eingegeben wird. Bewird, wird der gebildete Sauerstoff wieder entfernt. sonders günstig ist es hierbei, die Probe'ösung an dei indem in entsprechender Weise ein sauerstofffreies 15 Unterbrechungsstelle selbst zuzugeben. Hierbei wird Trägergas, beispielsweise Stickstoff oder ein Edelgas vorzugsweise ein Überschuß an Probelösung, beidurchgeleitet wird. spielsweise an Serum, zugegeben und durch Öffnung

Wird z. B. NADP zu NADPH reduziert (wie im des Teilstromes der Überschuß abgetrennt. Dies kann

Beispiel der Glucosebestimmung mit der gekoppelten beispielsweise wie oben bereits angedeutet erfolgen,

Hexokinase-Glucose-o-phosphat-Reaktion), so läßt ao indem in einen Teilstrom des Pufferlösungsstromes

sich gebildetes NADPH durch einen Redoxaus- eine schieberartige Vorrichtung eingeschaltet wird,

tauscher, der als Säule nach dem Detektor in den deren Schieber eine zur Aufnahme einer bestimmten

Strom eingeschaltet wird, laufend zu NADP reoxy- Menge Probelösung geeichte Bohrung enthält. Durch

dieren: Eintauchen dieser Schieberöffnung in überschüssige

Hydrierte Pyridincoenzyme (NADH und NADPH) 25 Probelösung, z. B. überschüssiges Probeserum, odei

können auch mit trägergebundener Glutamat-Dehy- öffnen dei Bohrung zu einem größeren Behälter, dei

drogenase reoxydiert werden (Säule in Strom), wenn derartige Probelösung enthält, und Einnießenlassen

man dem kreisenden Reagenz NH₄+-Ionen und der Probe wird eine abgemessene Menge Probe-

ft-Ketoglutarat zusetzt. Diese Substanzen stören die lösung bei Verschieben des Schiebers abgetrennt und

zu messende Reaktion im allgemeinen nicht. 30 blockartig in den Pufferlösungsstrom eingegeben.

Das Verfahren der Erfindung kann jedoch auch wenn die Bohrung des Schiebers in den unter-

ohne laufende Regenerierung durchgeführt werden, brochenen Teilstrom der Pufferlösung so gebrachl

bis die umgesetzten Komponenten verbraucht sind wird, daß durch diese Bohrung die öffnung des unter-

oder Reaktionsprodukte sich derart anhäufen, daß brochenen Stromes erfolgt. Vorzugsweise wird hier-

die zur Bestimmung herangezogene Reaktion gestört 35 bei gleichzeitig der andere, bis zu diesem Zeitpunkt

wird. Es wird dann entweder diskontinierlich regene- nicht unterbrochene Teilstrom unterbrochen, \va:

riert oder die Pufferlösung ausgetauscht. durch den gleichen Schieber erfolgen kann.

Die Pufferlösung selbst stellt eine wäßrige Lösung Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchfüheines für das jeweils verwendete Enzym geeigneten rung des oben beschriebenen Verfahrens mit einerr Puffers in üblicher Konzentration dar. Die geeigneten 40 Enzym enthaltenden Kreislaufsystem mit einem Puf-Puffer und Pufferkonzentrationen sowie die günstigen ferreservoir, einer Vorrichtung zum Einführen einei pH-Werte für die jeweils verwendeten Enzyme sind Probe, einem Reaktionsraum und Detektor mit Reim allgemeinen bekannt. gistriergerät und einer Pumpe mit konstanter Förder-

Die Pufferlösung kann gegebenenfalls noch andere leistung ist dadurch gekennzeichnet, daß die EinSubstanzen außer den puffernden Verbindungen ent- 45 richtung zum Einführen der Probe ein eine blockhalten, welche für die enzymatische Umsetzung not- artige Eingabe einer Probenlösung ohne Änderung dei wendig oder erforderlich sind. Beispiele hierfür sind Strömungsgeschwindigkeit erlaubender Appli'.atoi Salze, welche etwa erforderliche Ionen, wie z. B. (A) ist, der zwischen Pufferreservoir und Reaktions-Magnesiumionen, Sulfationen u. dgl. enthalten oder raum angeordnet ist.

stabilisierend wirkende Verbindungen, oberflächen- 50 Der Probeapplikator besitzt vorzugsweise wenigaktive Substanzen u. dgl. Weiter enthält die Puffer- stens zwei durch einen Sperrschieber mit wenigsten; lösung alle diejenigen Substanzen gelöst, die auch für zwei korrespondierenden Bohrungen abwechselnc eventuelle gekoppelte Reaktionen, die gleichzeitig ab- zu sperrende Durchlässe und eine der Bohrunger laufen, erforderlich sind. Insbesondere enthält sie steht mit einer Zuflußleitung für die die zu bestim Enzyme und Substrate für derartige Reaktionen. Wird 55 mende Probensubstanz enthaltende Lösung in Verbeispielsweise Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) bindung, wenn der korrespondierende Durchlaß gegemessen, so werden L-Alanin und ct-Ketoglutarat sperrt ist.

in der Pufferlösung gelöst und durch das mit der Gemäß einer besonders bevorzugten Ausfuhrungs-Probe zugefügte Enzym zu Glutamat und Pyruvat form steht der Applikator mit einer Vakuumpumpeir umgewandelt. Das Pyruvat wiederum wird in Gegen- 60 Verbindung, mit der die Zuflußleitung für die Probenwart des Hilfs- bzw. Indikatorenzyms Lactatdehydro- lösung und die damit verbundene Probenbohrung in genäse (LDH) und von NADH zu L-Lactat umge- Schieber evakuiert werden können,
wandelt unter Bildung von NAD⁺, wobei die beim Zweckmäßigerweise besteht der Applikator au; Verschwinden von NADH auftretende Änderung der einer Hülse mit verschiebbarem Kern, wobei Hüls« Extinktion im Ultravioletten gemessen wird. Falls die 6₅ und Kern je drei Durchlässe aufweisen, die durch Ver GIutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) bestimmt schieben des Kerns zur Deckung gebracht werder werden soll, so wird der Pufferlösung L-Aspartat können. Besonders zweckmäßig ist ein derartige! und «-Ketoglutarat zugesetzt, die von der GOT in Applikator gekennzeichnet durch eine Hülse mit einei

ersten und zweiten Rinlaßbcilnrung, einer ersten und zweiten Auslaßbohrung, ane.r Lufteinlaßbohrung, einer Vakuumbohrung und einer Probelösungsbohrung, sowie einem in der Hülse verschiebbar angeordneten Kern mit drei Bohrungen, die so angeordnet sind, rHß durch Verschieben des Kerns die erste Einlaß- mil der ersten Auslaßbohrung, die zweite Einlaß- mit der zweiten Auslaßltrohrung, die Lufteinlaßmit der Vakuumbohrung uBid die Probelösungsbohrung mit derVakuumbohrung verbunden werden können, wobei nicht gleichzeitig die erste Einlaßbohrung mit der ersten Auslaßbohrunj» sind die zweite Einlaßbohrung mit der zweiten AusLaßbohrung verbunden werden.

Ferner enthält die Vorrichtung eine Pumpe mit konstanter Förderleistung, vorzugsweise in der Leitung vor oder hinter dem Applikator. Hierbei kann beispielsweise eine Schlauchpumpe Verwendung finden. Eine für diesen Zweck bevorzugte Schlauchpumpe wird in der deutschen Patentschrift (Patent- ao anrneldung P 20 25 056.0) beschrieben.

Ferner enthalt die Vorrichtung zweckmäßig in der Leitung zwischen Applikator und Detektor eine Mischvorrichtung, welche beispielsweise aus einer Säule, die auf teilchen;förmii|»em Träger gebundenes »5 Enzym enthält, bestehen kann. Bei Anwendung von gelöstem Enzym besteht die Mischvorrichtung zweckmäf.ig in einem einfachen Einsatz in der Rohrleitung, der eine gewisse Verwirbelung: der durchströmenden Lösung verursacht.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung werden nachstehend an Hand der Zeichnung näher erläutert. In dieser stellt dar

Fig.1 eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

F i g. 2 eine schematische Darstellung der Führung des Puffer-Lösungsstromes am Detektor,

F i ζ. 3 eine Ansicht der Mischeinrichtung im Schnitt, 1

F i g. 4 eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Applikators mit Verbindungsleitungen im Längsschnitt und Querschnitt,

F i g. 5 eine mit dem Verfahren der Erfindung erhaltene Meßkurve,

Fig. 6 die sich aus der Meßkurve von Fig. 5 ergebende Eichkurve,

F i g. 7 eine Eichkurve für eine andere Ausführungsform der Erfindung,

F i g. 8 eine Meßkurve für eine weitere Ausfühmngsform der Erfindung,

F i g. 9 die Eichkurve zu der in F i g. 8 dargestellten Meßkurve,

Fig. 10 eine weitere Meßkurve und

Fig. 11 eine weitere Eichkurve.

Wie in Fig. 1 gezeigt, enthält ein ReservoirR einen Vorrat an Pufferlösung. Eiine; Pumpe P fördert die Pufferlösung aus dem Reservoir/? in einen Probenapplikator A und von dort über einen Mischeinsatz S weiter in einen Detektor D sovrie anschließend wieder in das Reservoir R zurück. In der gezeigten Ausführungsform sind am Detektor D ein elektronischer Verstärker V, der die Meßsignale des Detektors D verstärkt, und ein Registriergerat G, an welches die verstärkten Meßsignale weitergelieitet werden und welches beispielsweise ein Schreiber sein kann, angeschlossen.

Das Reservoir f? kann aus einem beliebigen Gefäß bestehen, welches eine Ablauföffnung und eine ZuI auf öffnung für Pufferlösung sowie zweckmäßig eine öffnung zur Einführung von zu ergänzenden Substanzen, Gasen u. dgl. aufweist. Das Reservoir ist zweckmäßigerweise thermostatisiert. Die Pumpe P, die zur Förderung des Pufferstromes und zur Aufrechterhaltung des Kreislaufs dient, kann wie bereits erwähnt als Schlauchpumpe oder auch als Kolbenoder Kreiselpumpe gestaltet sein. Zweckmäßigerweise ist ihre Förderleistung regelbar.

Der in F i g. 2 schematisch im Schnitt gezeigte Detektor besteht aus einer Durchflußzelle 1, die zweckmäßigerweise thermostatisierbar gebaut ist. Sie enthält die eigentliche Meßvorrichtung 2 sowie einen Lösungskanal 3, in den die Meßvorrichtung, beispielsweise eine Meßelektrode, eine Glasfaseroptik oder ein Temperaturfühler hineinragen kann.

Unter der Bezeichnung »Verstärker V« sind alle funktionalen Teile zu verstehen, die die Meßelektrode zur Arbeit benötigt, also Stromquelle, Anschlußleitungen zur Stromquelle, elektronische Verstärkung usw.

Das Registriergerät G dient zur Registrierung der Meßergebnisse. Es können beliebige Geräte verwendet werden, bevorzugt wird jedoch ein Schreiber, der an den Verstärker V angeschlossen werden kann. An Stelle des Schreibers können auch andere Analogoder Digitalgeräte verwendet werden. Für die Messung erforderlich ist nur die Anzeige des Meßsignals in Relation zum Zeitablauf.

Die in F i g. 3 im Schnitt gezeigte Mischvorrichtung S besteht aus einer Säulenwand 4, die zweckmäßigerweise zylindrische Form aufweist und an den Enden geschlossen ist und an einem Ende eine Einströmöffnung 5 und am anderen Ende eine Ausströmöffnung 6 für Pufferlösung aufweist. Sie ist gefüllt mit Körnern 7, die aus inertem Material oder aus Enzym auf festem unlöslichem Träger gebunden bestehen. Die Größe der Säule hängt vom gewünschten Vermischungsgrad von Probelösung unf Pufferlösung sowie im Falle eines trägergebundenen Enzyms von der gewünschten Meßempfindlichkeit, der Meßprobemenge und der Aktivität des Enzyms ab. Wird eine Säule mit trägergebundenem Enzym verwendet, so liegt diese zweckmäßigerweise in thermostatisiertei Ausführung vor. Zweckmäßig ist die Säule dann so gestaltet, daß sie durch einfaches Auf- oder Zuschrauben ausgewechselt werden kann, falls die Aktivität des trägergebundenen Enzyms nachgelassen hat oder aus einem anderen Grund ein Austausch erforderlich ist. Ein solcher Austausch kann beispielsweise erforderlich sein, um die Vorrichtung für die Bestimmung einer anderen Substanz einzurichten und damit ein anderes trägergebundenes Enzym einzuführer oder um den Vermischungsgrad von Prcbelösung und Pufferlösung bei Übergang auf eine andere Bestimmungsmethode zu ändern.

Der Probeapplikator A dient wie weiter oben bebereits beschrieben zum luftblasenfreien, blockartiger Einbringen der Probelösung in den Pufferstrom. Ei bewirkt die Abmessung der Probelösung und die ständige Aufrechterhaltung des Pufferstromes ohn< größere Geschwindigkeitsschwankungen.

In der in F i g. 4 gezeigten Ausfühnmgsiorm be steht der Applikator aus einer Hülse 10 und einen darin verschiebbaren Kern 11. Eine Einlaßleitung Ii für den Pufferstrom führt zur Bohrung 12 a in dei Hülse 10. Eine Zweigleitung 13 zweigt von der Lei

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9 IC

tung 12 ab und führt zur Bohrung 13 α der Hülse 10. keit der Pufferlösung und gegebenenfalls der Größe

Desgleichen führt eine Auslaßbohrung 14, die mit der der Säule 5 ab. Falls für die Bohrung 18 ein kapillarer

Bohrung 14 α verbunden ist und zum Auslaß der Durchmesser gewünscht wird, kann zur Erleichterung

Pufferlösung dient, an der anderen Seite der Hülse 10 des Füllvorgangs eine entsprechende öffnung in der

weiter. Eine Zweigleitung 15 verbindet die Auslaß- 5 Hülsel0gegenüberderTrichterbohrung21angebracht

bohrung 15 a in der Hülse 10 mit der Auslaßleitung werden. Die Probe wird nicht auslaufen können, da

14. Eine Leitung 16, die mit einer Bohrung 16 α in die Oberflächenspannung des unten hängenden

der Hülse 10 in Verbindung steht, ist an ein Vakuum Tropfens ein Abreißen verhindert,

ingeschlossen. Der verschiebbare Kern 11 weist Boh- Der Applikator A kann aus beliebigem Material

rungen 17, 18 und 19 auf, welche bei entsprechender io sein, soweit dieses Material gegenüber den verwen-

Schieberstellung jeweils die Bohrungen 12 a und 14 a, deten Lösungen inert ist und einen dichten Sitz von

13 α und 15 a sowie 16 α mit Lufteinlaßbohrung 20 und Kern 11 und Hülse 10 ermöglicht. Geeignete Ma-

Trichterbohrung 21 in der Hülse 10 verbinden terialien sind z. B. Glas, Kunststoff oder Metall. Der

können. Applikator A kann auch aus verschiedenen Ma-

Bei der in F i g. 4 a gezeigten Normalstellung des 15 terialien bestehen, beispielsweise aus Metall mit

Kerns 11 wird in die Trichterbohrung 21 die zu Oberflächen aus einem gleitfähigen Kunststoff, wie

untersuchende Probelösung, beispielsweise Serum, z. B. Polytetrafluorethylen.

eingegossen und von dort in die Bohrung 18 des Der Applikator A läßt sich im Rahmen des oben Kerns 11. Die Füllhöhe in der Trichterbohrung 21 der angegebenen Prinzips auch anders gestalten, z. B. zy-Hülse 10 spielt hierbei keine Rolle, soweit nur Boh- ao lindrisch entsprechend einem Mehrwegehahn. Der rung 18 im Kern 11 vollständig gefüllt wird. Während Parallelstrom wird in diesem Fall zweckmäßig in die Probe eingefüllt wird, fließt der Pufferstrom von einem zweiten Hahn gesteuert, dessen Kern auf der 13 a nach 15 a. Nach Abschluß des Füllens wird der gleichen Achse sitzt wie der Kern, in den die Probe-Kern 11 in Pfeilrichtung geschoben, bis sich die Boh- lösung appliziert wird.

rung 18 mit den Bohrungen 12 a und 14 a deckt. Die as Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfin-Probelösung, deren Volumen dem Volumen der Boh- dungsgemäße Vorrichtung weisen eine Reihe besonrung 18 im Kern 11 genau entspricht, wird vom Puf- derer Vorteile auf. Sie gestatten, außerordentlich ferstrom zur Säule S hin blockartig mitgeführt. Bei rasche Analysen durchzuführen, da das Meßergebnis dieser Stellung des Kerns 11 ist der Strom von 13 a im allgemeinen schon nach sehr kurzer Zeit vorliegt, nach 15 a unterbrochen, gleichzeitig wird die in der 30 Durch den konstanten Flüssigkeitsstrom wird eine Trichterbohrung 21 verbliebene Lösungsmenge durch sehr stabile Einstellung des Systems gewährleistet, die Bohrung 19, Bohrung 16 a und Leitung 16 abge- welche langwieriges Nacheichen überflüssig machi saugt. Sobald die Probelösung im Pufferstrom abge- und ständige Betriebsbereitschaft garantiert. Die Verleitet ist, wird der Kern 11 entgegen der Pfeilrichtung wendung geeichter Meßpipetten wird überflüssig, se verschoben, bis sich die Bohrung 18 mit der Luftein- 35 daß hieraus resultierende Fehlermöglichkeiten elimi-Iaßbohrung20 und der Auslaßbohrung 16 a deckt. niert werden. Durch die ständige Wiederverwendung Die Bohrung 18 wird dabei vom Puffer entleert und der eingesetzten Enzyme wird eine erhebliche Köder Pufferstrom von Bohrung 13 α zu Bohrung 15 a steneinsparung bzw. Materialeinsparung erzielt wieder freigegeben. Schließlich wird der Kern 11 wie- Durch einfaches Auswechseln dev Pufferlösung so\vi< der in Pfeilrichtung bis zur Ausgangsstellung bewegt, 40 gegebenenfallsdesträgergebundenenEnzymsund/odei und der Vorgang kann wiederholt werden. des Detektors läßt sich das Verfahren und die Vor

Die Größe des Applikators A, insbesondere das richtung rasch für eine andere Bestimmung einrichten

Volumen der Bohrung 18, hängt von der Empfind- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindunj

lichkeit des Verfahrens, der Strömungsgeschwindig- weiter.

Beispiel 1

Bestimmung von D-Glucose im Serum
Prinzip:

D-Glucose + ATP Glucose-6-phosphat + ADP

„, . , „,.«.,,. , „ ^ Glucose-S-phosphat-Dehydrogenase ,
Glucose-6-phosphat + NADP⁺ + H₂O -— - ^ _> 6-Phospho-gluconat

+ NADPH + H⁺ Die Bildung von NADPH wird im Photometer gemessen.

Es wurde die in Fig. 1 der Zeichnung dargestellte optischen Dichte erfolgte bei 366 nm. Zur Registrie

Vorrichtung verwendet. Die Säule S wies einen 60 rung war ein Kompensationsschreiber angeschlo:

Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 1 cm sen.

auf und war mit einer 2:1-Mischung von in Wasser Der verwendete Applikator A wies im Prinzip di

gequollener Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase auf in F i g. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion au

Träger der spez. Aktivität von 27 U/g und Hexo- Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte e;n Volumen vo

kinase auf Träger der spez. Aktivität von 80 U/g be- 65 10 μΐ. Der Applikator bestand aus V4A-Stahl/Tefloi

schickt. Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikoi

Als Detektor D wurde ein handelsübliches Photo- schlauch von 1 mm lichter Weite verbunden. Als Pu

meter mit Durchflußzelle verwendet. Die Messung der fer wurde 0,3 M Triäthanoiamin-Puffer pH 7,5 ve:

ES

wendet, enthaltend 4 mM Magnesiumsulfat; 0,44 mM NADP und 0,59 mM ATP.

In den Applikator wurden im Abstand von etwa 1 Minute Serumproben mit bestimmtem Glucosegehalt eingegeben. Proben 1 und 4 enthielten 200 mg Glucose/100 ml, Proben 2 und 3 100 mg/100 ml, Probe 5 300 mg/100 ml und Proben 6 und 7 50 mg/100 ml. Die auf dem Registriergerät aufgezeichneten Meßkurven zeigt Fig. 5. Die erhaltenen Werte sind in F i g. 6 als Eichkurve dargestellt und zeigen, daß die Höhe der Gipfel über der Nullinie des Meßschreibers direkt proportional dem Glueosegehalt der Lösung ist, wobei unter den beschriebenen Versuchsbedingungen der Proportionalitätsbereich bis zur Konzentration von 200 mg/100 ml reicht. Der An-

is stieg der Nullinie beruht darauf, daß gebildetes NADPH sich im Puffer anreichert.

Beispiel 2
Bestimmung von D-Glucose im Serum

Das Beispiel ist analog Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß die die Reaktion katalysierer, fin Enzyme in Lösung vorliegen. Als Mischeinrichtung 5 (vgl. F i g. 1 der Zeichnung) wurde eine einfache Glasspirale verwendet, die einen Innendurchmesser von 2,5 mm und eine Weglänge von 70 cm aufwies. Der Puffer enthielt als zusätzliche Komponenten 0,12 mg Hexokinase/ml (16,5 U/ml) und 0,12 mg Glucose-6-phosphat- Dehydrogenase (17 U/ml).

Das Versuchsergebnis entsprach dem aus Beispiel 1.

Beispiel 3

Bestimmung von Hexokinase in wäßriger Lösung Prinzip:

D-Glucose + ATT Qlucose-6-phosphat 4- ADP

_. , . . ,χτλτ-.τ,.,ττλ Glucose-ö-phosphat-Dehydrogenase

Glucose-6-phosphai + NADP⁺ + H₂O — - = _> 6-Phosphogluconat

+ NADPH + H⁺ . Die Bildung von NADPH wird im Photometer gemessen.

Da die Reaktionszeit zwischen Beginn der Reaktion und Messung im Detektor konstant ist, kann von der Menge des gebildeten NADPH auf die Aktivität der Hexokinase geschlossen werden.

Es wurde die in F i g. 1 der Zeichnung dargestellte Vorrichtung verwendet. Die Säule S wies einen Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 2 cm auf und war mit in Wasser gequollener Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase auf Träger der spez. Aktivität 27 U/g beschickt. Zwischen Detektor D und Reservoir Α war eine Glasspirale geschaltet, die einen Innendurchmesser von 2,5 mm und eine Weglänge von 70 cm aufwies. Diese Glasspirale war in einem Wasserbad auf 95° erwärmt. Sie diente dazu, die zuvor gemessene Hexokinase zu inaktivieren.

Als Detektor D wurde wiederum ein handelsübliches Photometer mit Durchflußzelle verwendet. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 366 nm. Zur Registrierung war derselbe Kompensationsschreiber angeschlossen.

Der verwendete Applikator A wies im Prinzip die in F i g. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf.

Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte ein Volumen von 10 μΐ. Der Applikator bestand aus V4A-Stahl/ Teflon.

Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikonschlauch von 1 mm lichter Weite verbunden. Als Puffer wurde 0,3 mM Triäthanolamin-Puffer pH 7 5 verwendet, enthaltend 4 mM Magnesiumsulfat, 0,4 mM NADP, 0,59 mM ATP und 2O»/o Glucose.

In den Applikator wurden im Abstand von etwa 1 Minute Proben von wäßriger Hexokinase-Lösung eingegeben. Es wurden 1:2 und 1 :4 verdünnte Hexokinase-Lösung eingesetzt, sowie u verdünnte Hexokinase-Lösung (0,1 mg Protein/ml). Die Eichkurve F i g. 7 gibt die Abhängigkeit der Höhe der Gipfel auf der Registrierkurve von der eingesetzten Hexokinase-Konzentration wieder. Es ist erkennbar, daß eine lineare Abhängigkeit besteht.

Beispiel 4 Bestimmung von D-Glucose im Serum mittels Glucoseoxydase nach der Gleichung:

Glucose + O_{2 +} H₂O _Guiconsäure + H₂O₂.

Es wurde die in F i g. 1 der Zeichnung dargestellte Vorrichtung verwendet. Die Säule 5 wies einen Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 1 cm auf und war mit in Wasser gequollener Glucoseoxydase auf Träger mit einer spezifischen Aktivität von 200 U/g beschickt.

Als Detektor D wurde eine im Handel erhältliche sauerstoff sensitive Elektrode mit einem SauerstoffmeE
gerät und angeschlossenem Potenüomeierschreibe
verwendet.

Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode betru
7,5 cm/Sek., der Durchmesser der Eintrittsbohruri
in die Durchflußzelle wie in F i g. 2 dargestellt 1 mii

Der verwendete Applikator A wies im Prinzip d

/ 14

in F ί g, 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf. Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte 2 mm Durchmesser und 10 mm Länge, Der Applikator bestand aus Glas.

Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikonschlauch von 1 mm Durchmesser verbunden. Als Puffer wurde 0,2 M Kaliumphoaphatpuffer pH 6,0 verwendet, enthaltend 18 mM Kaliumiodid, 7,5 mM Ammoniumheptamolybdat und 80OmM Natriumchlorid.

In den Applikator Λ wurden im Abstand von etwa einer Minute Seruroproben mit bestimmten Glucosegehalt eingegeben. Die Proben 1 bis 3 enthielten je 100 mg Glucose/100 ml Serum, Probe 4 enthielt 200, Probe 5 300, Probe 6 400 und Probe 7 500 mg/ 100 ml. Die auf dem Registriergerät 61 aufgezeichneten Meßkurven zeigt Fig.8. Die erhaltenen Werte sind in Fi g, 9 als Eichkurve wiedergegeben und zeigen, daß die Höhe der Gipfel über der Null-Linie des Meßschreibers direkt proportional dem Glucosegehalt der Probe ist.

Beispiel 5

Bestimmung von Harnsäure mittels Uricase nach der Gleichung:

Uricase

Harnsäure + 2H.,O +O.,

Allantoin + H_nO. + CO,.

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Anwendung der gleichen Vorrichtung zur Bestimmung von Harnsäure verwendet. Die Säule S war mit Uncabe ao auf Träger gefüllt. Die Säule S wies einen Durchmesser von 1 cm und eine Füllhöhe von 5 cm auf. Die spezifische Aktivität der trägergebundenen Uricase betrug 3 U/g.

E-, wurde die im Beispiel 1 beschriebene Vorrich- as lung verwendet. Die Anströmgeschwindigkeit der Elektrode betrug 3,5 cm/Sek., der Durchmesser der Eintrittsbohrung in die Durchfiußzelle, wie in Fig. 2 dargestellt, betrug 1 mm.

Der verwendete Applikator A wies im Prinzip die in F i g. 4 der Zeichnung gezeigte Konstruktion auf. Die Bohrung 18 im Kern 11 hatte einen Durchmesser von 2,5 mm und eine Länge von 13 mm. Der Applikator A bestand aus Glas.

Die einzelnen Vorrichtungsteile waren mit Silikonschlauch von 1 mm Durchmesser verbunden. Als Puffer wurde 0,2 M Boratpuffcr pH 6,5 verwendet, in dem 600 U/ml Katalase gelöst waren.

In den Applikator A wurden im Absland von etwa 6 Minuten Proben von Harnsäurelösungen bestimmten Gehaltes eingegeben. Probe 1 enthielt 5 mg Harnsäure/100 ml, Probe 2 10 mg, Probe 3 15 mg, Probe 4 30 mg, Probe 5 45 mg und Probe 6 60 mg/ 100 ml.

Die auf dem Registriergerät G aufgezeichnete Meßk'.irve zeigt Fig. 10 der Zeichnung. Die erhaltenen Werte sind in Fig. 11 als Eichkurve wiedergegeben Man erkennt daraus, daß die Höhe der Gipfel übei der Null-Linie des Meßschreibers direkt proportional dem Harnsäuregehalt der Probe ist.

Hierzu 9 Biatt Zeichnungen

Claims (8)

ι 2 Die Erfindung betritt eta Verfahren zum Bestim- Patentansprüche: men von enzymatiwb umsetzbaren Probehsubstanzen in wäßriger Lösung in einem Enzym enthaltenden, im

1. Verfahren zum Bestimmen von enzymatisch Kreislauf geführten Pufferlösungsstrom und Messung umsetzbaren Probensubstanzen in wäßriger 5 einer Veränderung in der Lösung mittels Detektor, Lösung in einem Enzym enthaltenden, im Kreis- wobei verbrauchte Komponenten gegebenenfalls regelauf geführten Pufferlösungsstrom und Messung neriert werden, sowie eine Vorrichtung zur Durcheiner Veränderung in der Lösung mittels Detek- führung dieses Verfahrens.

tor, wobei verbrauchte Komponenten gegebenen- Enzymatisch umsetzbare Probensubstanzen wer- falls regeneriert werden, dadurch gekenn- io den sowohl in der Technik als auch im klinischen zeichnet, daß zur quantitativen Bestimmung Labor in großem Umfang laufend quantitativ beeinzelner Proben unterschiedlicher Konzentration stimmt unter Ausnutsning ihrer Eigenschaft, durch be eine bestimmte Menge der Probenlösung block- stimmte Enzyme selektiv so umgesetzt zu werden, daß artig, luftblasenfrei und ohne Änderung der Strö- sich in der wäßrigen Lösung eine der Menge des gemungsgeschwindigkeit der zirkulierenden Puffer- 15 suchten Produktes proportionale Änderung, die leicht lösung in den Pufferlösungsstrom eingebracht und meßbar ist, ergibt. Diese Änderung kann beispiels- mit dem Enzym in Kontakt gebracht wird. weise im Auftreten oder Verschwinden bestimmter

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- Verbindungen oder in der Änderung spezieller Eigenkennzeichnet, daß das Enzym in der Pufferlösung schäften, wie des pH-Wertes u. dgl. bestehen. Bei dergelöst ist und die Pufferlösung mit der Proben- 30 artigen Bestimmungen besteht ganz allgemein das lösung vor Erreichen des Detektors gemischt Problem einer möglichst raschen und einfachen wird. Durchführung. Insbesondere sollte die Bestimmung

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- ohne Anwendung besonderer Reinigungs- und Trennkennzeichnet, daß der die Probenlösung enthal- verfahren durchführbar sein. Dieses Ziel wurde instende Strom über ein Bett von teilchenförmigen! »5 besondere durch Entwicklung von Analysenautomaten trägergebundenem unlöslichem Enzym geleitet angestrebt, in denen die gewünschten Umsetzungen wird. weitgehend automatisiert ablaufen gelassen und ge-

4. VerfaLren nach einem der vorhergehenden messen werden,

Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Die bisher hierfür entwickelten Methoden und Vor-

blockartige Eingabe der Prcoenlösung so erfolgt, 30 richtungen besitzen jedoch noch wesentliche Nach-

daß der Pufferlösungssirom ^reteilt wird, die Teil- teile. Diese bestehen insbesondere darin, daß die

ströme abwechselnd unterbrochen werden und die Analysenfrequenz noch zu gering ist, die Einbringung

Probenlösung in den unterbrochenen Strom ein- der zu analysierenden Probe Arbeitsschritte umfaßt,

gegeben wird. welche die Genauigkeit des Ergebnisses wesentlich

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch ge- 35 beeinflussen und der Reagenzien verbrauch, insbesonkennzeichnet, daß die Probenlösung an der Unter- dere der Verbrauch an Enzym, unerwünscht hoch ist. brechungssteile im Überschuß zugegeben und Aufgabe der vorliegenden iirfindung ist es, diese durch öffnen des Teilstromes der Überschuß ab- Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren und eine getrennt wird. Vorrichtung zu schaffen, welche Fehlerquellen bei der

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfah- +0 Dosierung der zu bestimmenden Substanz, beispielsrens nach Anspruch 1 mit einem Enzym enthal- weise Pipettieren, Abmessen u. dgl., ausschließen, mit tenden Kreislaufsystem mit einem Pufferreservoir, einem Mindestaufwand an Reagenzien eine sehr hohe einer Vorrichtung zum Einführen einer Probe, Analysenfrequenz erreichen und gleichzeitig leicht einem Reaktionsraum und Detektor mit Re- auswertbare Meßsignale und sehr exakte Resultate gistriergerät und einer Pumpe mit konstanter För- 45 liefern. Insbesondere ist es auch Aufgabe der Erfinderleistung, dadurch gekennzeichnet, daß die Ein- dung, die Eigenschaft der Enzyme, sich als Katalysarichtung zum Einführen der Probe ein eine block- toren praktisch nicht zu verbrauchen, in einem Verartige Eingabe einer Probenlösung ohne Ände- fahren der obenerwähnten Art technisch nutzbar zu rung der Strömungsgeschwindigkeit erlaubender machen.

Applikator (A) ist, der zwischen Pufferreservoir 50 Gelöst wird diese Aufgabe bei einem Verfahren

und Reaktionsraum angeordnet ist. der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch,

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch ge- daß zur quantitativen Bestimmung einzelner Proben kennzeichnet, daß der Applikator (A) wenigstens unterschiedlicher Konzentration eine bestimmte zwei durch einen Sperrschieber (11) mit wenig- Menge der Probenlösung blockartig, luftblasenfrei stens zwei korrespondierenden Bohrungen (17, 55 und ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit 18) abwechselnd zu sperrende Durchlässe (13 a, der zirkulierenden Pufferlösung in den Pufferlösungs- ISa; 12 a, 14 a) aufweist und eine der Bohrungen strom eingebracht und mit dem Enzym in Kontakt (18) mit einer Zuflußleitung (21) für die zu be- gebracht wird.

stimmende Substanz enthaltende Lösung in Ver- Wesentlich für das erfindungsgemäße Verfahren ist,

bindung steht, wenn der korrespondierende 60 daß die Merkmale luftblasenfreie und blockartige

Durchlaß (12 α, 14 α) gesperrt ist. Einführung der Probenlösungen in den Pufferlösungs-

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch ge- strom ohne Änderung der Strömungsgeschwindigkeit kennzeichnet, daß der Applikator (λ) mit einer der Pufferlösung gleichzeitig erfüllt werden. Erst die Vakuumpumpe zum Evakuieren der Zuflußlei- Kombination dieser drei Bedingungen ermöglicht die tung (21) und der damit verbundenen Bohrung 65 Erzielung der weiter unten näher aufgeführten Vor-(18) in Verbindung steht. teile.

Aus der US-PS 3 512 517 sind bereits ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Überwachung des Blut-