CS212729B2 - Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method - Google Patents

Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method Download PDF

Info

Publication number
CS212729B2
CS212729B2 CS718751A CS875171A CS212729B2 CS 212729 B2 CS212729 B2 CS 212729B2 CS 718751 A CS718751 A CS 718751A CS 875171 A CS875171 A CS 875171A CS 212729 B2 CS212729 B2 CS 212729B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
glycerol
lipase
phosphate
protease
nadh
Prior art date
Application number
CS718751A
Other languages
English (en)
Inventor
Giovanni Bucolo
Harold David
Original Assignee
Giovanni Bucolo
Harold David
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Giovanni Bucolo, Harold David filed Critical Giovanni Bucolo
Publication of CS212729B2 publication Critical patent/CS212729B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/04—Dairy products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y10S435/897—Streptomyces griseus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/939—Rhizopus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Estery glyeerolu a mastných kyselin, například sérové triglyceridy a mléčný tuk, ve vodných prostředích se stanovují úplnou enzymatickou hydrolýžou za, použití lipázy a proteázy na základě stanovení · takto · uvolněného glyeerolu. Způsob stanovení glycerolu má mnoho alternativ, které lze provádět vesměs v původním vodném prostředí, jako například: převedení na glycerol-l-fosfát pomocí glycerol-kinázy, převedení adenosintrifosfátu (ATP) na adenosindifosfát (ADP) toutéž reakcí s následným převedením ADP a fosfoenolpyruvátu za použití pyruvátkinázy na ATP a pyruvátový iont, který se pak stanoví. Alternativně je možno převést pyruvátový iont takto vytvořený s nikotinamídadenindinukleotidem (oxidovanou formou, NAD) za použití láktát-dehydrogenázy na laktátový iont a redukovanou formu nikotinamidadeninnukleotidu (NAĎA), která se pak stanoví optickým měřením.
' 3
Vynález se týká _ rychlého způsobu stanovení obsahu esterů ' glycerolu a mastných kyselin v různých vodných prostředích, jako v séru, mléce apod,
V mnoha oborech, zejména vsak v kliniccké biochemii, je důležité zjišťování obsahu esterů mastných kyselin a glycerolu ve vzorcích kapalin. Toto stanovení má význam zejména v lidském · séru, kde mají zvýšené hladiny těchto· esterů velkou diagnostickou hodnotu. Způsoby spočívající ve stanovení zbytků mastných kyselin a způsoby, při kterých glycerin uvolněný z jiných zdrojů přispívá k výsledku stanovení, mají různé nevýhody. Vzhledem k tomu, že až dosud známé způsoby nejsou obecně zcela uspokojivé, · existuje intenzívní snaha nalézt pro klinické účely rychlý a · přesný způsob stanovení, kterým by se výlučně, ale v celém rozsahu stanovily estery glycerinu a mastných kyselin.
Účelem vynálezu je nalézt rychlý a přesný způsob uvolňování glycerinu z jeho esterů s mastnými kyselinami, přítomných například ve vodných prostředích,· jako v séru, který by umožňoval stanovit glycerin různými alternativními způsoby, aniž by bylo nutno jej izolovat ze zkoušeného prostředí.
Další cíle vynálezu jsou zřejmé z dalšího popisu.
Způsob stanovení obsahu esterů glycerolu a · mastných kyselin . ve vodném · kapalném prostředí hydrolýzou uvedených esterů podle vynálezu spočívá v podstatě v tom, že se hydrolýza provádí jako enzymatická hydrolýza pomocí lipázy, s výhodou mikrobiální lipázy z Rhizopus delemar nebo· z Chromobacterium viscosum, jakož i proteázy vybírané ze skupiny· zahrnující chymotrypsin, trypsin, proteázu ze Streptomyces griseus, elestázu, papin a · bromelin, jakožto esenciálních činidel, přičemž poměr proteázy k lipáze činí s výhodou 5 až 500 mezinárodních jednotek na 1000 mezinárodních jednotek lipázy, načež se po hydrolýze provede stanovení takto· uvolněného glycerolu a z něho se odvodí obsah· uvedených esterů.
Způsob podle vynálezu se výhodně může provádět tak, že se po hydrolytickém uvolnění glycerolu v provádění enzymatické hydrolýzy pokračuje v přítomnosti adenosintrifosfátu a glycerolkinázy pro převedení glycerolu na glycerol-l-fosfát a adenosintrifosfátu na adenosindifosfát, načež se stanoví množství přítomného adenosindifosfátu nebo glycerol-l-fosfátu, které je úměrné původnímu obsahu esterů glycerolu a mastných kyselin.
V provádění enzymatické hydrolýzy vodného kapalného média obsahujícího glycerol-l-fosfát · se pak s výhodou pokračuje v přítomnosti nikotinamidadenindinukleotidu a glycerolfosfátdehydrogenázy pro převedení glycerol-l-fosfátu na dihydroxyacetonfosfát, a současně se převádí nikotinamidadenindinukleotid ze své oxidované formy na redukovanou formu, načež se pro zjištění původně přítomných esterů . glycerolu s mastnými kyselinami stanoví alespoň jeden z produktů uvedených přeměn.
Přitom lze postupovat také tak, že se v provádění enzymatické hydrolýzy vodného kapalného média, obsahujícího glycerol-1-fosfát a adenosindifosfát, pokračuje v přítomnosti fosfoenolpyruvátu a pyruvátkinázy pro· převedení fosfoenolpyruvátu na pyruvátový · iont, načež se stanoví množství pyruvátu, které · odpovídá množství původně přítomných esterů glycerolu a mastných kyselin.
Jinak je možno způsob podle vynálezu výhodně provádět tak, že se v provádění enzymatické hydrolýzy vodného kapalného média pokračuje v přítomnosti nikotinamidadenindinukleotidu s glyceroldehydrogenázy pro převedení glycerolu na dihydroxyaceton a nikotinamidadenindinukleotidu na redukovaný nikotinamidadenindinukleotid, načež se stanoví množství redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu, odpovídající množství původně přítomných esterů glycerolu z mastných kyselin.
Přitom še výhodně používá glyceroldehydrogenázy získané z mikroorganismu Enťerobacter aerogenes.
Předmětem vynálezu je rovněž enzymatické činidlo k provádění uvedeného způsobu stanovení, které obsahuje jednak (a) proteázu vybranou ze skupiny zahrnující chymotrypsin·,· · trypsin, proteázu ze Streptomyces griseus, elastázu, papain a bromelin, a jednak (b) llpázu z Rhizopus delemar nebo z Chomobacterium viscosum.
Toto· enzymatické · činidlo podle vynálezu s výhodou obsahuje 5 až 500 mezinárodních jednotek α-chymotrypsinu na 1000 mezinárodních jednotek lipázy z mikroorganismu Rh!zopus delemar.
Použitá lipáza může být původu rostlinného nebo živočišného, například lipáza z Chromobacterium viscosum, různých paralipolytik,. surových nebo přečištěných, lipáza . z Rhizopus delemar, přečištěná například · podle· Fukumoto a další: J. Gen. Appl. Mícrobiol., 10, 257 až 265 · (1964), a lipáza s podobným účinkem. Jako příklady proteáz, které ovšem rozsah vynálezu neomezují, kterých je možno použít, · lze uvést chymotrypsin, trypsin, Streptomyces griseus proteasa (obchodně dostupná pod chráněnou známkou „Pronase“), elastasa, papain a bromelin. Může· se použít i jejich směsí. Obvykle postačí použití této jednoduché směsi enzymů, i když se hydrolýza může poněkud · urychlit současným přidáním jednoduché bílkoviny, jako sérového albuminu, vaječného albuminu, globullnu apod.
Jak bude podrobně popsáno dále, glycerin uvolněný působením shora uvedené směsi enzymů se může stanovit různými způsoby, přednostně se však používá způsobu, jehož popis následuje.
Enzymatická hydrolýza působením kombinace lipázy a protaázy podle vynálezu se přednostně provádí v přítomnosti složek tří přídavných enzymatických transformačních systémů, a ' to tak, že · se zároveň uvolněný glycerin převede působením glycerinkinázy na α-glycerinfosfát za současné konverze adenosintrifosfátu na adenosindifosfát, za druhé proběhne konverze adenosindifosfátu zpět na adenosintrifosfát za současné konverze fosfoenolpyrohroznové kyseliny na pyruvátový ion působením pyruvátkinázy a. za třetí proběhne konverze pyruvátového iontu . na laktázový ion za současné. konverze nikotinamidadenindinkleotidu · z jeho· redukované formy na jeho oxidovanou formu působením laktát-dehydrog'enázy. Všechny složky těchto systémů jsou přítomny ve směsi současně, takže jak · pokračuje hydrolýza triglyceridu, klesá optická hustota roztoku při ' 340 nanometrech v důsledku oxidace dinukleotidu. Pořadí enzymatických konverzí lze schematicky znázornit následujícím způsobem (^světlení použitých zkratek viz níže):
triglyceridy enzymatická
.glycerol + VMK hydrolýza
GK glycerin + ATP
ADP . + PEP
o-GP + ADP
ATP + pyruvát pyruvát + NADH
laktát + NAD
· z 's
zbarvený * bezbarvý
při 340 nm při 340 nm
z
Vysvětlení zkratek:
VMK = volné mastné kyseliny
ATP = adenosintrifosfát α-GP = a · glycerolfosfát ADP = adenosindifosfát
PEP = . fosfonoenolpyrohroznová kyselina LDH = laktát-dehydrogenáza
GK = glycerol-kináza
PK = pyruvát-kináza
NAD a NADH = nikotinamidadenindinukleotid, oxidovaný a redukovaný u
* tj. absorbuje silně při 340 nm; molární extinkční koeficient aM = 6,22 X 1O3.
** tj. transparentní při 340 nm.
Vhodné.provedení způsobu podle vynále zu · zahrnuje činidlo· (směs) pro stanovení, obsahující výhodné složky, aby bylo· možno provést stanovení triglyceridů jednotlivě. Postupuje-li se podle výhodného provedení, tj. podle způsobu, který zahrnuje shora popsanou enzymatickou hydrolýzu za použití •kombinace· enzymů podle vynálezu, s následným popsanýmpřevedením .uvolněného· glycerolu, je účelné rozdělit činidlo pro. stanovení do dvou oddělených zásobníků, · jako například · skleněných nádobek, z nichž jedna bude · pro jednoduchost označena jako nádobka A; do ní se umístí všechny složky potřebné pro stanovení, s výjimkou glycerol-kinázy, která se umístí do· nádobky B. Složky je možno samozřejmě rozdělit i jným způsobem; do nádobky B se může, je-li to žádoucí, přidat kterákoliv ze složek uplatňujících se pouze při převádění glycerolu a v dalších stupních. Přednostně se však používá následující reakční směsi:
Nádobka A.
Ostojný roztok na bázi fosforečnanu draselného, 0,· M, pH 7 aspartát horečnatý 1,6mg dvojsodná sůl ATP 0,,9μΜ fosfoenolpyruvát 0·,9μΜ albumin z hovězího séra 5,0mg
NADH · do konečné absorpce 0,8 (optická hustota při 340 nm)
LDH 2 mezinár. jedn.
pyruvát-kináza 6 mezinár. jedn.
a-chymotrypsin 1100 N. F. jednotek lipáza z mikroorganismu
Rhizopus delemar 1200 lipázových jedn.
(Celkový objem: 3 ml)
Vysvětlivky: .
1) Jedna lipázová jednotka je takové množství enzymu, které uvolní mastné kyseliny ze substrátu trioleinu v takovém množství, že jejich neutralizaci po· 30 minutové inkubaci při 37 °C je třeba 1 ml 0,05 N hydroxidu draselného.
2) Jedna N. F. jednotka a-chymotrypsinu je takové množství enzymu, které způsobí změnu absorpce 0,0075 za minutu při 237 nm, je-li inkubován s ethylesterem N-acetyl-L-tyrosinu jako substrátem za podmínek stanovení. [
4¾. !
Nádobka B _ · J
Glycerol-kináza: 2 mezinárodní jednotky
Stanovení se podle vynálezu provádí tak, že se přidá alikvotní díl kapaliny obsahující stanovovaný triglycerid (například 50· μΐ séra) ke 3 ml směsi v nádobce A. Tato se pak inkubuje při teplotě 25 až 37 °C přibližně po dobu 10· minut. Pak se stanoví optická husto ta při 340 nm. Přidají se 2 mezinár. jedn. glycerol-kinázy z nádobky B, směs se nechá stát po dobu dalších 10 minut při téže teplotě, načež se znovu stanovuje optická hustota. Rozdíl je úměrný obsahu trlglyceridu v alikvotním dílu.
Základními složkami reakční směsi podle vynálezu, zvláště v baleních pro jednotlivá stanovení, jsou tedy: mikrobiální lipáza, proteáza, pyruvát-kináza, laktát-dehydrogenáza, NADH, ATP, fosfonolpyruvát, zdroj hořečnatých iontů, ústojná látka a glycerol-kináza.
Alternativní postup spočívá v tom, že se z výše popsané směsi vynechá NADH a. laktát-dehydrogenáza, takže proběhnou pouze první tři reakční stupně výše znázorněného sledu reakcí, a přidá se dostatečné množství dínitrofenylhydrazinu, aby proběhla reakce s pyrivátovým iontem vzniklým ve zmíněném třetím reakčním stupni. Reakční produkt se po alkalizaci zbarvuje a může být pohodlně zjištěn kolorimetricky.
Podle další alternativy se může postupovat tak, že se ze shora popsané reakční směsi vypustí fosfonenolpyruvát, pyruvát-kináza a laktát-dehydrogenáza a místo toho se přidá glycerolfosfát-dehydrogenáza, načež se a-glycerolfosfát převede na dihydroxyacetonfosfát a · NAD na. NADH. Množství vzniklého· NADH, které je úměrné množství původně přítomného triglyceridu, se může vhodně zjistit ze zvýšení fluorescence. Podle jednoho alternativního dílčího· postupu se přidává k systému ještě dostatečné množství dinitrofenylhydrazinu, čehož výsledkem je· vznik zbarveného reakčního produktu s uvolněným dihydroxyacetonfosfátem. Množství reakčního produktu se pak může stanovit kolorimetricky a je rovněž úměrné množství původně přítomného triglyceridu.
Ještě dalším alternativním způsobem je způsob, při kterém se · používá reakční směsi zajišťující pouze enzymatické převedení na glycerol, které je prvním reakčním stupněm znázorněným ve shora uvedeném schématu. Reakční směs však kromě toho rovněž obsahuje NAD a glycerol-dehydrogenázu. To má za následek, že se glycerol uvolněný v prvním stupni přemění na dihydroxyaceton za současné tvorby NADH. Měřítkem množství původně přítomného triglyceridu je pak, jak již bylo uvedeno, zvýšení optické hustoty při 340i nm. Vhodnou glycerol-dehydrogenázou je taková dehydrogenáza, kterou lze získat z mikroorganismu Enterobacter aerogenes; tento enzym lze získat v obchodě. Podle jednoho alternativního dílčího postupu se přidává dinitrofenylhydrazin, který tvoří s dihydroxyacetonem zbarvený reakční produkt, jehož množství lze zjistit kolorimetricky.
Při dvou z právě popsaných alternativních postupů, a to za prvé při postupu, při kterém se používá glycerolfosfátdehydrogenázy, a za druhé při postupu, při kterém se používá glycerol-dehydrogenázy, vzniká, jak již bylo uvedeno, ekvivalentní množství
NADH. Další dílčí postup, aplikovatelný na oba tyto · postupy, spočívá ve využití známého chování různých tetrazoliových solí, které redukcí přecházejí z bezbarvých vodorozpustných sloučenin na zbarvená barviva. NADH, který kvantitativně vzniká z triglyceridu, se může využít k tomu, aby přenášel svůj’ vodík na tetrazolíovou sůl (přičemž se · během postupu oxiduje), a to opět kvantitativně, prostřednictvím kteréhokoli Z několika známých látek, mezi nimiž se zejména přednostně používá diaforázy nebo alternativně fenazinmethosulfátu. Množství takto vzniklého· barviva se může· snadno stanovit kolorimetricky, tj. provedením měření změny optické hustoty ve viditelné oblasti.
Uvádět všechny podrobnosti právě uvedených dílčích postupů není nutné, poněvadž jsou plně dokumentovány v literatuře. Reprezentativními prameny ve kterých jsou též citovány odkazy na další literaturu, jsou následující články: Američan Journal of Clinical Pathology, svazek 45, č. 5, květen 1966: „Rapid Colorimetric (Tetrazolium Salt) Assay for Lactate Dehydrogenase“, autor R. O. Briere, J. A. Preston a J. G. Batsakis; Wethods of Enzymatíc Analysis“, autor H. U. Bergmeyer, Academie Press, New York, 1965; str. 953 až 955.
Co se týče vzájemného poměru zvolené lipázy (nebo směsi zvolených lipáz] ke zvolené proteáze (nebo· k jejich směsi), používá· se s výhodou na 1000 jednotek lipázy, přítomných ve směsi pro stanovení, ·5 až asi 500 mezinárodních jednotek proteázy. Nejlepším byl shledán rozsah 20 až 100 mezinárodních jednotek proteázy.
Lipázová jednotka již byla výše definována. Mezinárodní jednotkou proteolytické účlnnosti je to množství proteázy, které způsobují za minutu přeměnu 1 mikromolu substrátu, specifického pro konkrétní uvažovaný enzym, za podmínek blížících se optimu pro uvažovaný systém. Tak je pro chymotrypsin substrátem ethylester tyrosinu a míra přeměny se může stanovit různými způsoby, jako změnou optické hustoty při 237 nm nebo stanovením uvolněné aminokyseliny, jako tyrosinovými ekvivalenty fenolového reakčního činidla nebo formolovou titrací.
Jednotka N. F. (podle National Formulary) se příležitostně používá pro proteázy; tato jednotka je uvedena ve shora uvedeném příkladu. Jedna mezinárodní jednotka je ekvivalentní 28 jednotkám N. F., takže 1100· N. F. jednotek chymotrypsinu v uvedeném příkladu se rovná 39 mezinárodním jednotkám. Vzhledem k tomu, že ve směsi podle příkladu bylo přítomno 1200 lipázových jednotek, je zřejmé, že na každých 1000 lipázových jednotek v příkladu připadá asi 32 mezinárodních jednotek proteázy.
Z předešlého výkladu je patrno, že rozdělování složek výhodné směsi činidel pro stanovení mezi nádobky A a B má jedna z nádobek, například nádobka A, obsahovat alespoň lipázu a proteázu, zatímco druhá ná212729 dobka, například B, má obsahovat alespoň glycerol-kinázu. Ostatní složky mohou být rozděleny do· obou lékovek libovolně. Výhodné je však rozdělení, které bylo uvedeno výše.
Při postupu podle vynálezu dochází k úplné hydrolýze esterů glycerolu, takže se uvolní, jak již bylo· objasněno, stechiometrické· množství glycerinu. Nelze podat vysvětlení příslušného reakčního mechanismu, jímž k tomu dochází, ale je jasné, že to pochází ze společné přítomnosti lípázy a proteázy, jak to bylo popsáno a vyloženo výše.
Když se například postupuje podle výše uvedeného· podrobně popsaného příkladu provedení a jako· zkoušeného vodného prostředí se použije lidského séra, shledává se, že

Claims (8)

  1. PŘEDMĚT
    1. Způsob stanovení obsahu esterů glycerolu a mastných kyselin ve vodném kapalném prostředí hydrolýzou uvedených esterů, vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí jako enzymatická hydrolýza pomocí lípázy, s výhodou mikrobiální lípázy z Rhizopus delemar nebo z Chromobacterium viscosum, jakož i proteázy vybírané ze skupiny zahrnující chymotrypsin, trypsin, proteázu ze Streptomyces griseus, elastázu, papain a bromelin, jakožto esenciálních činidel, přičemž poměr proteázy k lipáze činí s výhodou 5 až 500 mezinárodních jednotek na 1000 mezinárodních jednotek lípázy, načež se po hydrolýze provede stanovení takto uvolněného glycerolu a. z něho se odvodí obsah uvedených esterů.
  2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že po hydrolytickém uvolnění glycerolu se v provádění enzymatické hydrolýzy pokračuje v přítomnosti adenosintrifosfátu . a glycerolkinázy pro převedení glycerolu na glycerol-l-fosfát a adenosintrifosfátu na adenosindifosfát, načež se stanoví množství přítomného· adenosinfosfátu nebo glycerol-l-fosfátu, které je úměrné původnímu obsahu esterů glycerolu a mastných kyselin.
  3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se v provádění enzymatické hydrolýzy vodného· kapalného média obsahujícího glycerol-l-fosfát pokračuje v přítomnosti nikotrnamidadenindinukleotidu a glycerolfosfátdehydrogenázy pro převedení glycerol-1-fosfátu na dihydroxyacetonfosfát, a současně se převádí nikotinamídadenindinukleotid ze své oxidované formy na redukovanou formu, načež se pro zjištění původně přítomných esterů glycerolu s mastnými kyselinami sta uvolněného glycerolu je takové množství, které lze očekávat na základě úplné hydrolýzy přítomných triglyceridů, jaké by se stanovilo též dobře známými standardními postupy.
    Výrazem «-gtycerolfosfát se označuje sloučenina označovaná také jako glycerol-l-fosfát, estery glycerinu a mastných kyselin v séru mohou být a všeobecně jsou · označovány prostě jako triglyceridy.
    Výrazem jedna lipázová jednotka se rozumí množství lipázy ekvivalentní jedné lipázové jednotce definované výše.
    Přesné podrobnosti týkající se složek a postupů, jak byly výše popsány, vynález neomezují; do rozsahu vynálezu náležejí i jeho další modifikace, samozřejmé pro odborníky.
    VYNÁLEZU noví alespoň jeden z produktů uvedených přeměn.
  4. 4. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se v provádění enzymatické hydrolýzy vodného kapalného média obsahujícího· glycerol-l-fosfát a adenosindifosfát pokračuje v přítomnosti fosfoenolpyruvátu a pyruvátkinázy pro převedení fosfoenolpyruvátu na pyruvátový iont, načež se stanoví množství pyruvátu, které odpovídá množství původně přítomných esterů glycerolu a mastných kyselin.
  5. 5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se v provádění enzymatické hydrolýzy vodného kapalného· média pokračuje v přítomnosti nikotinamidadenindinukleotidu a glyceroldehydrogenázy pro převedení glycerolu na díhydroxyaceton a nikotinamídadenindinukleotidu na redukovaný nikotinamidadenindinukleotid, načež se stanoví možství redukovaného nikotinamidadenindinukleotidu, odpovídající množství původně přítomných esterů glycerolu a mastných kyselin.
  6. 6. Způsob podle bodu 5, vyznačující se tím, že se používá glyceroldehydrogenázy získané z Enterobacter aerogenes.
  7. 7. Enzymatické činidlo k provádění způsobu stanovení podle bodu 1, vyznačující se tím, že obsahuje za a) proteázu vybranou ze skupiny zahrnující chymotrypsin, trypsin, proteázu ze Streptomyces griseus, dastázu, papain a bromelin, a za bj lipázu z Rhizopus delemar nebo· z Chromobacterium viscosum.
  8. 8. · Enzymatické činidlo podle bodu 7, vyznačující se tím, že obsahuje 5 až 500· mezinárodních jednotek a-ctLytmotrpsinu na 1000 mezinárodních jednotek lipázy z Rhizopus delemar.
CS718751A 1970-12-16 1971-12-16 Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method CS212729B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US9890470A 1970-12-16 1970-12-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS212729B2 true CS212729B2 (en) 1982-03-26

Family

ID=22271481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS718751A CS212729B2 (en) 1970-12-16 1971-12-16 Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method

Country Status (17)

Country Link
US (1) US3703591A (cs)
JP (2) JPS549518B1 (cs)
AU (1) AU475955B2 (cs)
BE (1) BE776034A (cs)
BR (1) BR7108185D0 (cs)
CA (1) CA955161A (cs)
CH (2) CH563404A5 (cs)
CS (1) CS212729B2 (cs)
DE (1) DE2162325C3 (cs)
ES (1) ES395956A1 (cs)
FR (1) FR2118454A5 (cs)
GB (1) GB1373106A (cs)
IL (1) IL38235A (cs)
IT (1) IT972079B (cs)
NL (1) NL180523C (cs)
SE (1) SE389919B (cs)
ZA (1) ZA717957B (cs)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2101796A1 (de) * 1970-01-21 1971-08-05 Baxter Laboratories Inc Verfahren zur Bestimmung von Tnglycenden im Blutserum
AT324282B (de) * 1972-06-19 1975-08-25 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und reagens zur bestimmung von triglyceriden
CS164231B2 (cs) * 1972-09-28 1975-11-07
JPS49113695A (cs) * 1973-02-27 1974-10-30
AT339505B (de) * 1974-03-14 1977-10-25 Boehringer Mannheim Gmbh Enzymatisches analysenverfahren
US3898130A (en) * 1974-03-18 1975-08-05 American Hospital Supply Corp Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides
CA1029644A (en) * 1974-03-20 1978-04-18 The Dow Chemical Company Method for determination of triglycerides and glycerol
US3884764A (en) * 1974-03-25 1975-05-20 Eastman Kodak Co Method and composition for blood serum cholesterol analysis
CA1056282A (en) * 1974-03-25 1979-06-12 Charles T. Goodhue Multilayer analytical elements for use in the assay of cholesterol
JPS50142090A (cs) * 1974-04-30 1975-11-15
JPS5169691A (en) * 1974-06-07 1976-06-16 Iatron Lab Ketsuseichuno chuseishibosokuteiyoshaku
US4014744A (en) * 1975-01-30 1977-03-29 Miles Laboratories Inc. Processes for measuring tri-, di- and monoglycerides
US4011045A (en) * 1975-02-14 1977-03-08 Bonderman Dean P Turbidity reduction in triglyceride standards
JPS5217085A (en) * 1975-07-30 1977-02-08 Ono Pharmaceut Co Ltd Method of quantitative determination of free fatty acids in serum usin g fatty acid activating enzymes
US4012287A (en) * 1975-11-18 1977-03-15 Dr. Bruno Lange Gmbh Method and reagent for the quantitative analysis of triglycerides
US4045297A (en) * 1975-12-15 1977-08-30 Monsanto Company Triglycerides determination method
DE2737286C2 (de) * 1976-08-19 1985-05-02 Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y. Mehrschichtige analytische Elemente für die Bestimmung von Triglyceriden und Glycerin in Flüssigkeiten
CA1100023A (en) * 1976-08-19 1981-04-28 Charles T. Goodhue Process and composition for the quantification of glycerol and triglycerides
US4275151A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
US4275152A (en) * 1977-02-03 1981-06-23 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound cholesterol esters
JPS6058746B2 (ja) * 1977-09-22 1985-12-21 中外製薬株式会社 高級脂肪酸エステル
US4195126A (en) * 1977-10-04 1980-03-25 The Board Of Trustees Of The University Of Alabama Albumin-dye complex for fatty acid determination
US4245041A (en) * 1977-12-07 1981-01-13 American Monitor Corporation Triglycerides assay and reagents therefor
US4241178A (en) * 1978-01-06 1980-12-23 Eastman Kodak Company Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides
US4223090A (en) * 1978-07-13 1980-09-16 American Hospital Supply Corporation Reagents for the enzymatic determination of triglycerides
DE2831580C2 (de) * 1978-07-18 1980-09-18 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin
DE2834704A1 (de) * 1978-08-08 1980-02-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur quantitativen enzymatischen bestimmung von adp
US4302536A (en) * 1978-08-15 1981-11-24 Longenecker Robert W Colorimetric immunoassay process
US4178285A (en) * 1978-12-20 1979-12-11 Felts James M Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system
US4264589A (en) * 1978-12-20 1981-04-28 Felts James M Separation of active α1 -acid glycoprotein and utilization in the lipoprotein lipase enzyme system
US4394445A (en) * 1979-02-22 1983-07-19 Nix Paul T Enzymatic glyceride hydrolysis
US4259440A (en) * 1979-05-21 1981-03-31 Miles Laboratories, Inc. Hydrolysis and assay of triglycerides
US4322496A (en) * 1980-04-17 1982-03-30 Eastman Kodak Company Inhibition of lactate oxidase
US4309502A (en) * 1980-06-30 1982-01-05 Beckman Instruments, Inc. Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein
US4338395A (en) * 1980-07-21 1982-07-06 Technicon Instruments Corporation Method for the analysis of triglycerides
JPS5754599A (en) * 1980-07-22 1982-04-01 Baker Instr Corp Improved glycerol detecting reagent
US4394444A (en) * 1982-06-21 1983-07-19 Miles Laboratories, Inc. Cofactor indicator compositions
JPS59140900A (ja) * 1983-01-28 1984-08-13 Toyo Jozo Co Ltd 新規な酵素的高感度測定法
JPS59196100A (ja) * 1983-04-21 1984-11-07 Amano Pharmaceut Co Ltd グリセロ−ルの測定法および測定組成物
US5310679A (en) * 1985-05-13 1994-05-10 Artiss Joseph D Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
US4626511A (en) * 1985-05-13 1986-12-02 Wayne State University Composition for reducing turbidity in samples of biological fluids
JPWO2002027012A1 (ja) * 2000-09-28 2004-06-10 アークレイ株式会社 タンパク質分解物の製造方法
WO2003029229A1 (fr) * 2001-09-28 2003-04-10 Arkray, Inc. Procede de stockage de compose tetrazolium, agent de stabilisation associe et solution de reactif a base de compose tetrazolium stocke au moyen de ce procede
AU2003297497A1 (en) * 2002-12-24 2004-07-22 Stacey Greenhill Method for determination of free and combined glycerin in biodiesel
WO2009077876A2 (en) * 2007-05-31 2009-06-25 Uti Limited Partnership Method for assessing trace element related disorders in blood plasma
EP2257646A1 (en) * 2008-02-29 2010-12-08 ISIS Innovation Limited Diagnostic methods
US9817001B2 (en) 2008-05-27 2017-11-14 Boston Heart Diagnostics Corporation Methods for determining LDL cholesterol treatment
US8470541B1 (en) 2008-09-27 2013-06-25 Boston Heart Diagnostics Corporation Methods for separation and immuno-detection of biomolecules, and apparatus related thereto
US8765377B2 (en) 2011-10-13 2014-07-01 Boston Heart Diagnostics Corporation Compositions and methods for treating and preventing coronary heart disease
US20140120559A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Boston Heart Diagnostics Corporation Diabetes panel
US9828624B2 (en) 2013-07-24 2017-11-28 Boston Heart Diagnostics Corporation Driving patient compliance with therapy
WO2016081471A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Boston Heart Diagnostic Corporation Cardiovascular disease risk assessment

Also Published As

Publication number Publication date
IL38235A0 (en) 1972-01-27
JPS549518B1 (cs) 1979-04-25
FR2118454A5 (cs) 1972-07-28
CH566003A5 (cs) 1975-08-29
ZA717957B (en) 1972-08-30
NL180523B (nl) 1986-10-01
ES395956A1 (es) 1974-09-01
DE2162325C3 (de) 1980-12-11
AU475955B2 (en) 1976-09-09
BR7108185D0 (pt) 1973-05-31
IL38235A (en) 1974-10-22
DE2162325B2 (de) 1980-04-24
GB1373106A (en) 1974-11-06
AU3641671A (en) 1973-06-07
NL180523C (nl) 1987-03-02
SE389919B (sv) 1976-11-22
BE776034A (fr) 1972-03-16
JPS53114493A (en) 1978-10-05
IT972079B (it) 1974-05-20
US3703591A (en) 1972-11-21
DE2162325A1 (de) 1972-06-22
CH563404A5 (cs) 1975-06-30
CA955161A (en) 1974-09-24
NL7117275A (cs) 1972-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS212729B2 (en) Method of determining glycerol ester and fatty acid contents in aqueous media,and an enzymatic agent for carrying out the method
Shimizu et al. Enzymatic microdetermination of serum free fatty acids
CA1125151A (en) Triglycerides assay and reagents therefor
US4543326A (en) Stabilization of oxidase
US4259440A (en) Hydrolysis and assay of triglycerides
US4242446A (en) Method for determining a substance in a biological fluid and reagent combination for use in the method
US3862009A (en) Determination of triglycerides
EP0695363B1 (en) Detection of biological material
US4056442A (en) Lipase composition for glycerol ester determination
EP0238352B1 (en) Method for the selective detection of microbial nucleotides
US3898130A (en) Rapid enzymatic hydrolysis of triglycerides
US4338395A (en) Method for the analysis of triglycerides
US4394445A (en) Enzymatic glyceride hydrolysis
US4066508A (en) Process and reagent for determining triglycerides
US4999289A (en) Lipase, its production and use for assay of triglycerides
US5962248A (en) Quantitative determination method for chloride ions
WO1980000260A1 (en) Determination of triglycerides and enzyme reagents
US4309502A (en) Enzymatic assay for glycerol and triglycerides and a reagent for use therein
JPS6357040B2 (cs)
EP0089210B1 (en) Reagent for assaying cholinsterase
US4247633A (en) Reagent for colorimetric determination of creative phosphokinase
Korzenovsky Bacterial metabolism of arginine
GB2050601A (en) An Improved Triglycerides Assay and Reagents Therefor
JPH0220297A (ja) コリンエステラーゼ活性の定量法及び定量用試薬
JPH05123194A (ja) リパーゼ活性測定用組成物及びその組成物を用いるリパーゼ活性測定方法