DE3729524A1 - Verfahren zur bestimmung von glutamat-oxalacetat-transaminase-isoenzymen im menschlichen serum - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von glutamat-oxalacetat-transaminase-isoenzymen im menschlichen serum

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur fraktionellen Bestimmung von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase- (nachstehend GOT genannt)-Isomzymen im menschlichen Serum, d. h. der Aktivität von cytoplasmischem GOT-Isoenzym (nachstehend s-GOT genannt) und von GOT-Isoenzym, welches in Mitochondrien lokalisiert ist (nachstehend m-GOT genannt) auf einfache Weise.
Die Bestimmung von Transaminasen (GOT, GPT) in Blut wurde bisher häufig mit altem durchgeführt, um Leber- und Herzkrankheiten während eines frühen Stadiums zu erkennen, um die Heilung zu verfolgen und zur prognostischen Diagnose. Im Falle der GOT-Isoenzyme wurde insbesondere das Karmensche Verfahren als Standardverfahren angesehen, wobei mehrere Verbesserungen vorgeschlagen worden sind. Die Bestimmung der Gesamt-GOT wird ebenfalls bei den automatischen Analysiervorrichtungen angewandt, mit denen automatisch gemessen wird.
In den letzten Jahren hat die Notwendigkeit für die differentielle Bestimmung von GOT-Isozymen zugenommen. Die differentielle Bestimmung von GOT-Isozymen im menschlichen Serum, insbesondere die Bestimmung der m-GOT-Aktivität im menschlichen Serum, stellt einen wichtigen Hinweis für die Diagnose von Krankheiten, wie alkoholische Lebererkrankungen, akute Hepatitis usw., sowie dafür dar, das Ausmaß der Störungen der Leberzellen festzustellen. Die klinische und diagnostische Bedeutung dieser Bestimmung ist außerordentlich groß. Die Bestimmung von m-GOT wird zunehmend als Routinetest eingesetzt, da pathologische Zustände vor und nach Operationen auftreten können.
Als Mittel zur differentiellen Bestimmung von GOT-Enzymen sind Ionenaustausch- Chromatographie-Verfahren und elektrophoretische Verfahren bekannt. Diese Verfahren erfordern jedoch komplizierte Behandlungen, beispielsweise sind eine Vorbehandlung und dgl. erforderlich.
Weiterhin weisen die Meßergebnisse, die mit diesen Methoden erhalten werden, keine gute Reproduzierbarkeit auf, um Routineuntersuchungen durchzuführen.
Es ist dann das einfache immunologische Verfahren entwickelt worden, welches eine hervorragende Spezifität der Differenzierung und eine gute Reproduzierbarkeit besitzt und das in letzter Zeit weitverbreitet angewendet wird.
Die Erfinder haben ebenfalls eine Vielzahl von immunologischen, fraktionellen Bestimmungsmethoden entwickelt (vgl. z. B. US-PS 43 06 019 und japanische Patentanmeldungen Nr. 11 47 443/77 und 2 53 728/85).
Diese immunologischen Methoden erfordern jedoch einen zentrifugalen Arbeitsgang zur differentiellen Bestimmung von GOT-Isoenzymen, wodurch die Anzahl der zu behandelnden Proben beschränkt wird. Diese bekannten immunologischen Methoden, welche zwingend den zentrifugalen Abtrennungsvorgang erfordern, stellen ein großes Hindernis für die automatische Bestimmung mit automatischen Analysiervorrichtungen dar, mit welchen in den letzten Jahren die klinische Prüfung der verschiedensten Gegenstände durchgeführt worden sind.
Demgemäß besteht der Wunsch nach einem Verfahren, welches keinen zentrifugalen Arbeitsvorgang erfordert und eine automatische Bestimmung mit automatischen Analysiervorrichtungen ermöglicht.
In den letzten Jahren ist eine fraktionelle Methode beschrieben worden, welche den Unterschied der Sensitivität von jedem GOT-Isoenzym unter Verwendung von Proteasen ausnutzt, welche von Linien erhalten werden, die zu der Gattung der Streptomycen gehören und eine Protease- Aktivität aufweisen, welche die s-GOT-Aktivität inhibiert, jedoch zu keiner Inhibierung der m-GOT-Aktivität führt (veröffentlichte ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 1 49 399/85).
Im Hinblick auf eine vergleichende Studie verschiedener Proteasen in dieser Veröffentlichung wird bezüglich der inhibierenden Wirkung gegenüber s-GOT berichtet, daß Serin-Protease, welche von einem Mikroorganismus stammt, insbesondere Serin-Protease, welche von einer Linie erhalten wird, die zur Gattung der Streptomycen gehört, eine starke Wirkung ausübt, während Trypsin und α-Chymotrypsin eine schwache Wirkung besitzen, was darauf hindeutet, daß mit diesen Enzymen GOT-Isozyme nicht fraktioniert werden können.
D. h. die von Mikroorganismen stammende Protease ist als Protease wirksam, welche s-GOT spezifisch inhibiert, und es wird deshalb eine differentielle Bestimmung von GOT-Isozymen nach dem gleichen Verfahren beschrieben.
Der Erfinder hat Untersuchungen über die inhibierenden Wirkungen verschiedener bekannter Protease gegenüber der menschlichen GOT-Aktivität in menschlichen Seren durchgeführt, wobei sich überraschenderweise herausgestellt hat, daß die erhaltenen Ergebnisse nicht mit jenen übereinstimmen, die bisher veröffentlicht worden sind.
Die Vorveröffentlichung wurde daher im einzelnen studiert, wobei sich herausstellte, daß eine Probe, die bei den inhibierenden Wirkungen zahlreicher Proteasen gegenüber der s-GOT- oder m-GOT-Isoenzym verwendet wurde, vom Schweineherzen stammte, nicht jedoch vom Menschen.
Das heißt, nach dem gegenwärtigen Stand der Dinge ist bisher keine einzige Untersuchung für eine einfache differentielle Bestimmung von Proteasen gegenüber Human-GOT-Isoenzym als Gegenstand der Bestimmung durchgeführt worden.
Der Erfinder hat in Betracht gezogen, daß die Tatsache, auf der diese Veröffentlichung beruht (H. Teranishi et al., J. Biol. Chem., Band 253, Nr. 24, Seiten 8842-8847 (1978)), also die vorstehend beschriebenen Ergebnisse auf GOT-Isoenzyme zurückzuführen sind, welche bei den einzelnen Tierarten unterschiedliche Proteinstrukturen aufweisen, insbesondere wurde ein deutlicher Unterschied der Proteinstruktur zwischen den korrespondierenden Isoenzymen (zwischen s-GOTen oder zwischen m-GOTen) hinsichtlich menschlichen GOT-Isoenzymen und den GOT-Isoenzymen anderer Tierarten festgestellt.
Es ist bekannt, daß verschiedene Proteasen gegenüber der Aminosäuresequenz von Enzymproteinen als ihren Substraten generell zu einer restriktiven Zersetzungsreaktion führen.
Aus diesem Grunde bauen einige Proteasen einige Enzymproteine restriktiv ab, so daß deren enzymatische Aktivität in manchen Fällen völlig verlorengeht.
Statt dessen können einige Enzymproteine ihre enzymatische Aktivität nach einem restriktiven Abbau beibehalten.
Die Spezifität irgendeiner Protease gegenüber ihrem Substrat (Enzymprotein) sollte deshalb experimentell demonstriert werden, wobei nur dann, wenn dies festgestellt worden ist, dies als Neuheit zu werten ist.
Das heißt, wenn auf eine differentielle Bestimmung von GOT-Isoenzymen in menschlichen Seren abgestellt wird, stellt es ein wesentliches Erfordernis dar, daß menschliche GOT-Isoenzyme das Ziel dieser Untersuchungen bilden.
Bisher wurde jedoch keine Untersuchung mit den vorstehend genannten Inhibitoren gemacht, welche auf menschliche GOT-Isoenzyme abgestellt waren.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfaches fraktionelles Bestimmungsverfahren für GOT-Isoenzyme in menschlichen Seren bereitszustellen.
Weiterhin soll durch die Erfindung ein Bestimmungsverfahren bereitgestellt werden, mit dem m-GOT ohne Abtrennung von s-GOT bestimmt werden kann.
Darüber hinaus wird durch die Erfindung ein differentielles Bestimmungsverfahren zur Verfügung gestellt, welches direkt und automatisch mit einer automatischen Analysiervorrichtung durchgeführt werden kann.
Nach der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur differenziellen Bestimmung GOT-Isoenzymen im menschlichen Serum bereitgestellt, bei dem Chymotrypsin tierischen Ursprungs eingesetzt wird, welches spezifisch die s-GOT-Aktivität inaktiviert, so daß allein m-GOT quantitativ bestimmt wird.
Der Erfinder hat umfangreiche Untersuchungen mit spezifischen Inhibitoren für s-GOT durchgeführt, welches eine Fraktionierung von GOT-Isoenzymen in menschlichen Seren ermöglicht, wobei ein menschliches Serum verwendet wird, welches GOT-Aktivität (gering oder stark) aufweist, und den menschlichen Seren gereinigte menschliche GOT-Isoenzyme zugesetzt werden.
Als Ergebnis wurde überraschenderweise festgestellt, daß Chymotrypsin, welches von tierischen Organen extrahiert und gereinigt worden ist, als Inhibitor, welcher die menschliche s-GOT-Aktivität spezifisch inaktiviert, jedoch kaum die menschliche m-GOT-Aktivität beeinträchtigt, wirksamer ist als irgendeine der zahlreichen im Handel erhältlichen Proteasen.
Das heißt, die vorliegende Erfindung ermöglicht nicht nur eine differentielle Bestimmung von GOT-Isoenzymen in menschlichen Seren durch spezifische Inaktivierung von s-GOT mit Chymotrypsin tierischen Ursprungs und anschließender Messung der verbleibenden m-GOT-Aktivität nach Routinemethoden zur Aktivitätsbestimmung, sondern auch die automatische Bestimmung mit einer Serie aller Arbeitsschritte unter Verwendung automatischer Analysiervorrichtungen.
Die Chymotrypsine, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind solche, die von Tieren stammen, in dem Sinn, daß sie sich von Proteasen, welche aus Mikroorganismen erhalten werden, unterscheiden. Das Chymotrypsin umfaßt die α, β und γ-Form sowie andere Formen, wobei jedoch jede Form gleichermaßen einsetzbar ist.
Es ist bekannt, daß Chymotrypsin durch Einwirkung von Trypsin auf Chymotrypsinogen erhalten werden kann. Die Erfindung umfaßt deshalb auch die Verwendung von Chymotrypsinogen, das durch Trypsin in Chymotrypsin umgewandelt wird.
Wenn Chymotrypsin verwendet wird, wird der Reaktionslösung Trypsin zugesetzt, so daß Chymotrypsin gebildet wird.
Das nachstehende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Erfindung ist jedoch darauf nicht beschränkt.
Beispiel
Die m-GOT-Aktivitäten in menschlichen Seren wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und zum Vergleich nach einem konventionellen immunologischen Verfahren bestimmt.
Die Ergebnisse, die unter Verwendung von 20 Fällen einer Gesamt-GOT-Aktivität abnormalen Niveaus als Proben menschlicher Seren und 20 Fällen von Gesamt-GOT- Aktivität normalen Niveaus als Proben menschlicher Seren erhalten wurden, sind in der Tabelle 1 bzw. 2 wiedergegeben. Die Herstellung der Reagentien und die Verfahren waren folgendermaßen.
Herstellung der Reagentien
Erstes Reagens: Eine Lösung von 20 mg α-Chymotrypsin (hergestellt von Sigma Co., Ltd., Typ II) in 20 ml 0,1 M Tris-hydrochloridpuffer (pH 8,0).
Zweites Reagens: Ein Reagens, das die nachstehende Zusammensetzung aufweist:
L-Asparaginsäure200 mM α-Ketoglutarsäure12 mM NADH₂0,16 mM MDH1600 Einheiten/l LDH1000 Einheiten/l Iris-Puffer80 mM
Das zweite Reagens hat einen pH von 7,8.
Verfahren
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde die Messung mit einem Hitachi-Modell 705 "Automatic Analyzer" (hergestellt von Hitachi Ltd.) durchgeführt, wobei 200 µl des ersten Reagens und 500 µl des zweiten Reagens je 10 µl menschlicher Serumprobe angewandt wurden.
Bei dem bekannten Verfahren (immunologisches Verfahren) wurde die Differenzierung durchgeführt, indem Anti-s- GOT-Antikörper und sensitivierter Anti-s-GOT-Antikörper von rotem Schafsblut zugesetzt wurden, worauf die Lösung zentrifugiert wurde. Wenn das vorstehend beschriebene zweite Reagens zu dem gebildeten Überstand zugegeben wurde, wurde die m-GOT-Aktivität in herkömmlicher Weise bestimmt.
Bei dieser Bestimmung der GOT-Aktivität werden Oxalessigsäure und Glutaminsäure durch die Wirkung des GOT in Gegenwart von Asparaginsäure und α-Ketoglutarsäure als Substrate gebildet, und die gebildete Oxalessigsäure wird in Apfelsäure in Gegenwart von MDH umgewandelt, wobei NADH₂ in NAD übergeht. Die m-GOT-Aktivität wurde bestimmt, indem die Abnahme der Absorption von NADH₂ je min bei der Wellenlänge 340 nm gemessen wurde.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 wiedergegeben.
Tabelle 1
Tabelle 2
Die Aktivitätswerte in den Tabellen sind in internationalen Einheiten ausgedrückt.
Vergleichsbeispiel
Um den Unterschied zwischen der Aktivität von Human- und Schweine-GOT-Isoenzymen, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit Chymotrypsin aktiviert worden sind, zu untersuchen, wurden die GOT-Aktivitäten nach der Reaktion jedes der GOT-Isoenzyme mit Protease bestimmt, wobei menschliche und Schweine-GOT-Isoenzyme als Proben verwendet werden. Die Ergebnisse, die in der Tabelle 3 wiedergegeben sind, wurden als Änderung (%) ausgedrückt, wobei der GOT-Aktivitätswert vor der Reaktion 100% ist.
Als Protease wurde α-Chymotrypsin eingesetzt.
Tabelle 3
Nach der vorliegenden Erfindung können die Reagentien direkt zur automatischen Bestimmung verwendet werden, da kein Arbeitsschritt zur zentrifugalen Abtrennung während der Fraktionierung erforderlich ist. Das heißt, die vorliegende Erfindung zeichnet sich durch eine einfache Arbeitsweise aus, wobei zahlreiche Proben innerhalb eines kurzen Zeitraums behandelt werden können.

Claims (4)

1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Glutamat- Oxalacetat-Transaminase-Isoenzymen im menschlichen Serum, bei dem cytoplasmische Glutamat-Oxalacetat- Transaminase in den Glutamat-Oxalacetat-Transaminase- Isoenzymen, welche im menschlichen Serum vorhanden sind, spezifisch inaktiviert und allein die Mitochondrien-Glutamat-Oxalacetat-Transaminase quantitativ fraktionell bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß von Tieren stammendes Chymotrypsin als cytoplasmischer Glutamat-Oxalacetat-Transaminase- Aktivitätsinhibitor verwendet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die fraktionelle Bestimmung mit einer automatischen Analysiervorrichtung durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Chymotrypsin in einer ausreichenden Menge verwendet wird, um die cytoplasmische Glutamat- Oxalacetat-Transaminase zu inaktivieren.
4. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Chymotripsin als cytoplasmischen Glutamat-Oxalacetat- Transaminase-Aktivitätsinhibitor umfaßt.
DE19873729524 1986-09-04 1987-09-03 Verfahren zur bestimmung von glutamat-oxalacetat-transaminase-isoenzymen im menschlichen serum Withdrawn DE3729524A1 (de)

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