CH653135A5 - Procedimento per la determinazione dell'attivita degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico-ossalacetico transaminasi nel siero o plasma. - Google Patents
Procedimento per la determinazione dell'attivita degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico-ossalacetico transaminasi nel siero o plasma. Download PDFInfo
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Description
La presente invenzione riguarda un procedimento per la determinazione dell'attività degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico-ossalacetico transaminasi nel siero o plasma, secondo il preambolo della rivendicazione 1.
La glutammico-ossalacetico transaminasi (L-aspartato:2-chetoglutarato aminotransferasi, EC 2.6.1.1.) siglata in letteratura cön GOT, AST o AAT, esiste in due forme distinguibili elettroforeticamente con diversa localizzazione subcellulare:
1) un isoenzima cationico associato ai mitocondri (m-GOT)
2) un isoenzima anionico presente nel citoplasma (s-GOT).
La misura dell'attività totale della GOT nel sangue è ampiamente utilizzato per la diagnosi discriminante di infarto del miocardio, ed il suo livello di attività nei liquidi fisiologici è stato utilizzato anche per la diagnosi di altre forme patologiche a carico del fegato o della muscolatura scheletrica.
I metodi di determinazione attualmente in uso nella pratica clinica consentono di misurare su campioni biologici l'attività totale dell'enzima, somma dei due isoenzimi.
Risulta però importante discriminare l'attività relativa delle due forme isoenzimatiche della gutammico-ossalacetico transaminasi al fine di possedere un più sofisticato mezzo di indagine relativo allo stato di nicrosi tissutale.
È stato infatti notato per altri enzimi, quali la lattico deidrogenasi e la creatine chinasi, che l'accurata determinazione dell'attività relativa alle varie forme isoenzimatiche consente un maggior potere discriminatorio nell'applicazione diagnostica.
I metodi di dosaggio attualmente esistenti per le due forme enzimatiche, citoplasmatica e mitocondriale, della glutammico-ossalacetico transaminasi sono basati su techniche elettroforeti-che, cromatografiche o immunologiche che richiedono in genere la preventiva separazione di un isoenzima dall'altro.
La presente invenzione ha per oggetto un nuovo procedimento di determinazione che consente di misurare singolarmente l'attività dei due isoenzimi in campioni di siero o plasma, senza dover ricorrere alla preventiva separazione degli stessi. Il procedimento è caratterizzato dai passi indicati nella rivendicazione 1, ed è essenzialmente basato sulla nota reazione della L-serina-O-solfato con la glutammicoossalacetico transaminasi citoplasmatica porcina che, dopo periodi vari di incubazione, viene inattivata mediante la formazione di un legame covalente tra un derivato del substrato ed un gruppo reattivo del sito attivo dell'enzima (R.A. John, P. Fasella: «The reaction of L-seri-ne-O-sulfate with Asparate Aminotransferase», Biochemistry, Voi. 8 N. 11, Novembre 1969). Sviluppi vantaggiosi si danno dalla rivendicazione 2. Un mezzo d'esecuzione ed una applicazione del procedimento si danno dalle rivendicazioni 3 e 4.
Nel corso delle esperienze effettuate si è riscontrato, contrariamente a quanto era da attendersi, che le condizioni di incubazione per l'inattivazione dell'isoenzima citoplasmatico umano in presenza di quello mitocondriale non determinano alcuna perdita di attività di quest'ultimo.
Risulta possibile, mediante una determinazione dell'attività GOT presente nel plasma o siero prima e dopo incubazione con L-serina-O-solfato, valutare nel primo caso l'attività totale somma dei due isoenzimi e nel secondo caso (dopo incubazione con serina-O-solfato) l'attività del solo isoenzima mitocondriale. Mediante semplice differenza si ottiene quindi il valore di attività dell'esoenzima citoplasmatico.
Si forniscono qui di seguito, a scopo illustrativo, le condizioni sperimentali di analisi per la determinazione dell'attività dei due isoenzimi mitocondriale e citoplasmatico della GOT.
Per la determinazione nel siero o plasma umani si procede preferibilmente utilizzando due aliquote identiche di uno stesso campione, una delle quali serve per le determinazione dell'attività totale (somma dei due isoenzimi) mentre dall'altra, previa incubazione con serina-O-solfato, si ottiene il valore del solo isoenzima mitocondriale.
Da uno stesso campione di siero o plasma si prelevano e si pongono in due provette diverse 0,5 mi. Nella prima provetta (A) si aggiungono 25 microlitri di una soluzione 2 M di serina-O-solfato in H2O, in modo da ottenere una concentrazione finale approssimativa di serina-O-solfato circa 30 mM, senza eccessiva diluizione del campione. Nella seconda provetta (B) si aggiungono invece 25 micro-litri di H2O per avere la stessa diluizione che si è ottenuta aggiungendo la serina-O-solfato alla provetta (A). Si lascia incubare per trenta minuti a temperatura ambiente, oppure per 20 minuti a 30°C. Al termine di questo periodo la reazione è completata, cioè nella provetta (A) un composto derivato dalla serina-O-solfato (acido aminoacrilico) ha formato un legame covalente con un gruppo presente al sito attivo dell'isoenzima citoplasmatico, inattivando completamente ed irreversibilmente, mentre tale periodo di incubazione non consente una analoga inibizione dell'isoenzima mitocondriale. Si determina quindi l'attività nelle due provette utilizzando la metodica derivata da Karmen, cioè seguendo il consumo di Nicotinamide Adenin-Dinucleotide ridotto (NADH) nella reazione accoppiata della glutammico-ossalacetico transaminasi con la malico deidrogenasi.
Si ottengono, ricavandoli dal Delta di densità ottica a 340 nm per minuto, i valori di unità enzimatiche per litro di siero o plasma che sono rispettivamente:
Provetta (B) = Unità/litro totali (isoenzima citoplasmatico
+ isoenzima mitocondriale).
Provetta (A) = Unità/litro del solo enzima mitocondriale.
Dalla differenza: Unità/litro (B) - Unità/litro (A) si ottiene il valore di unità/litro dell'isoenzima citoplasmatico che è stato completamente inattivo nella provetta (A).
Esempio
Al fine di dimostrare la validità del metodo e di esemplificare la sua applicazione sono stati preparati cinque pools di sieri umani contenenti diverse quantità dei due isoenzimi. La matrice dei cinque pools era costituita da siero umano scelto con bassissima attività endogena (5 UOL). A questo siero sono state aggiunte aliquote diverse dei due isoenzimi, purificati con la metodica descritta da E.J. Sampson ed altri (Clin. Chem. 24, 1805, 1978).
Al termine i 5 pools risultano così costituiti:
pool N. 1 120 U/l di solo isoenzima citoplasmatico pool N. 2 112,5 U/l di cui 90 U/l di isoenzima citoplasmatico e 22,5 U/l di isoenzima mitocondriale
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
3
653 135
pool N. 3 105 U/l di cui 60 U/l di isoenzima citoplasmatico e 45 U/l di isoenzima mitocondriale pool N. 4 97,5 U/l di cui 30 U/l di isoenzima citoplasmatico e 67,5 U/l di isoenzima mitocondriale pool N. 5 90 U/l di solo isoenzima mitocondriale.
Procedendo alla determinazione delle attività isoenzimatiche secondo la metodica descritta si sono ottenuti i risultati riportati nella tabella, media di sei differenti determinazioni (nella tabella l'isoenzima citoplasmatico è siglato come s-GOT e quello mitocondriale come m-GOT).
TABELLA
Valore teorico
Risultato
U/l sperimentale U/l pool N. 1 Attività totale
120
118,5
s-GOT
120
118,5
M-GOT
—
—
pool N. 2 Attività totale
112,5
114,7
s-GOT
90
91,2
m-GOT
22,5
23,4
pool N. 3 Attività totale
105
103,1
s-GOT
60
57,3
m-GOT
45
47,1
pool N. 4 Attività totale
97,5
101,3
s-GOT
30
31,3
m-GOT
67,5
67,9
pool N. 5 Attività totale
90
88,4
s-GOT
—
—
m-GOT
90
88,4
Dal confronto dei dati sperimentali ottenuti, rispetto a quel-25 li teorici della composizione isoenzimatica, risulta evidente la validità del metodo oltreché la sua precisione.
v
Claims (4)
1. Procedimento per la determinazione delle attività enzimatiche degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico-ossalacetico transaminasi (GOT) in campioni di siero o plasma seguendo il consumo di Nicotinamide Adenin Dinucleotide ridotto (NADH) nella reazione accoppiata della GOT con la malicodeidrogenasi, caratterizzato dal fatto che la inattivazione dell'isoenzima citoplasmatico con L-serina-O-sol-fato viene ottenuta mediante incubazione per trenta minuti a temperatura ambiente.
2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che l'inattivazione dell'isoenzima citoplasmatico con L-serina-O-solfato viene ottenuta mediante incubazione per 20 minuti a 30°C.
2
RIVENDICAZIONI
3. Kit per diagnostica quale mezzo per l'esecuzione del processo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere, come componente, la L-serina-O-solfato.
4. Applicazione del procedimento secondo la rivendicazione 1 alla determinazione delle attività enzimatiche degli isoenzimi citoplasmatico e mitocondriale della glutammico-ossalacetico transaminasi (GOT) in campioni di siero o plasma.
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Publications (1)
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|---|---|
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