SE448884B - Sett att bestemma cytoplasmatiska och/eller mitokondriska isoenzymer av glutamin-oxalettiksyra-transaminas och diagnostisk utrustning herfor - Google Patents

Description

35 448 884 två enzymatiska formerna, cytoplasmatisk och mitokondrisk, av glutamin-oxalättiksyra-transaminaxerna är baserade på elektro- foretiska, kromatografiska eller immunologiska tekniker, var- vid den föregående separationen av ett isoenzym från det andra erfordras.

Föreliggande uppfinning avser ett nytt doseringsförfarande, som tillåter den individuella bestämningen av aktiviteten av de två isoenzymerna i serum- eller plasmaprover utan att de tvâ iso- enzymerna behöver separeras.

Förfarandet är huvudsakligen baserat på den välkända omsättning- en av L-serin-O-sulfat med porcin, cytoplasmatiskt glutamin- -oxalättiksyra-transaminas som, efter olika inkuberingsperioder, deaktiveras genom bildningen av en kovalent bindning mellan ett derivat av substratet och en reaktiv grupp för det aktiva stäl- let på enzymet (R.A. John, P.Fasella: "The reaction of L-serine- -O-sulphate with Aspartate Aminotransferase", Biochemistry, Vol. 8 n.11. Nov. 1969).

När experiment utfördes visade det sig, i motsats till vad man kunde vänta sig, att inkuberingsbetingelserna för deaktivering- en av humant cytoplasmatisktisoenzym i närvaro av det mito- kondriska bestämmer inte eventuella aktivitetsförluster av de SEIIEIG .

Det är därför möjligt genom en bestämning av den GOT aktivitet, som föreligger i plasmat eller serumet, före och efter inkube- ring med L-serin-O-sulfat, att i det första fallet bestämma den totala aktivitetssumman av de två isoenzymerna, och i det andra fallet (efter inkubering med serin-O-sulfat) aktivite- ten av endast det mitokondriska ísoenzymet. Med hjälp av en enkel skillnad erhålles värdet för aktiviteten av det cytoplas- matiska isoenzymet.

De experimentella analysbetingelserna för bestämning av akti- viteten av de tvâ mitokondriska och cytoplasmatiska isoenzymerna av GOT, illustreras på följande sätt. m, 10 15 20 25 30 35 448 884 För bestämning i serum eller plasma är det fördelaktigt att använda två identiska delprover av samma prov, av vilka det ena användes för bestämning av den totala aktiviteten (summan av de två isoenzymerna) under det att man från det andra, som tidigare inkuberats med serin-O-sulfat, vilket utförts tidigare, erhåller värdet för endast det mitokondriska isoenzymet.

Från samma prov av serum eller plasma uttages 0,5 ml och pla- ceras i två olika provrör. Till det första provröret (A) sät- tes 25 mikroliter av en 2M serin-O-sulfat-lösning i vatten för att erhålla en slutlig approximativ koncentration av serin-O~ -sulfat på ca 50 mM utan en för stor spädning av provet. Till det andra provröret (B) sättes 25 mikroliter H20 så att man får samma spädning som erhölls genom att sätta serin-O-sulfatet till provröret (A).

Man låter inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur eller un- der 20 minutcr vid 30°C. I slutet av denna period är reaktionen fullständig, dvs. i provröret (A) har en förening härledd från serin-O-sulfat (amynoakrylsyra) bildat en kovalent bindning med en grupp, som föreligger i det aktiva stället på det cyto- plasmatiska isoenzymet, varvid detta fullständigt och irrever- sibelt inaktiverats, under det att denna inkuberingsperiod inte medger någon analog inhibering av det mitokondriska isoenzymet.

Därför kan aktiviteten i de två provrören bestämmas genom an- A vändning av Karmen's metod, dvs. genom att följa konsumtionen av den reducerade formen av nikotinamid~adenin-dinukleotid ( (NADH) i den kopplade reaktionen mellan glutamin-oxa1ättiksyra- -transaminas och maleinsyradehydrogenas.

Från skillnaden i optisk densitet vid 340 nm per minut erhålles värdena på de enzymatiska enheterna per liter serum eller plas- ma på följande sätt: Provrör (B) = totala antalet enheter/l (cytoplasmatiskt isoen- zym + mitokondriskt isoenzym) Provrör (A) = enheter/1 av endast det mitokondriska enzymet.

Från skillnaden: enhet/l (B) - enhet/1 (A) erhålles värdet 10 15 20 25 448 884 enhet/l för det cytoplasmatiska isoenzymet, som fullständigt inaktiverats i provröret (A). gxemgel För att demonstrera förfarandets giltiqhet och illustrera dess .lf tillämpning beredes 5 pxflerav humant serum innehållande olika mängder av de två isoenzymerna. Matrixen i de fem polarna be- står av humant serum med minsta möjliga endogenaaktivitet ( < 5 U/1). Till detta serum sättes olika mängder av de två isoenzymerna, renade med förfarandet enliqt E.J. Sampson et al.

(Clin. Chem. 24, 1805, 1978).

De 5 pmierna har slutligen följande sammansättning: Pool nr1-120 U/l av endast cytoplasmatiskt isoenzym Pool nr 2-112,5 U/l av vilka 90 U/1 är av cytoplasmatisktisoenzym och 22,5 U/l är av mítokondrisktisoenzym Pool nr 3-105 U/1 av vilka 60 U/1 är av cytoplasmatish:isoenzym och 45 U/1 är av mitokondriskt isoenzym Pafl.nr 4~97,5 U/l av vilka 30 U/l är av cytoplasmatiskzisoenzym och 67,5 U/l är av mitokondriskt isoenzym Pool nr 5-90 U/l av endast mitokondriskt isoenzym.

Bestämningen av de isoenzymatiska aktiviteterna med det beskriv- na förfarandet ger de resultat, som anges i nedanstående tabell, varvid värdena utgör medelvärdet av sex olika bestämningar. I tabellen anges det cytoplasmatiska enzymet som s-GOT och det mitokondriska som m-GOT. .g 448 884. 5 Tabell Teoretiskt Experiment- värde U/l data U/l pool Nr 1 total aktivitet 120 118,5 s-GOT 120 118,5 m-GOT ~ - pool Nr 2 total aktivitet 112,5 114,7 s-GOT 90 91,2 m~GOT 22,5 23,4 pool Nr 3 total aktivitet 105 103,1 s-GOT 60 57,3 m-GOT 1 45 ' 47,1 pool Nr 4 total aktivitet 97,5 101,3 s-GOT 30 31,3 m-GOT 67,5 67,9 pool Nr 5 total aktivitet 90 88,4 s-GOT - -f m-GOT 90 88,4 Vid jämförelse mellan de så erhållna experimentella siffrorna och de teoretiska siffrorna med avseende på den isoenzymatiska sammansättningen framgår tydligt förfarandets giltighet och dess precision.

Claims (6)

10 15 20 25 35 448 884 Patentkrav

1. Sätt att bestämma enskilda enzymatiska aktiviteter från de cytoplasmatiska och mitokondriska isoenzymerna av glutamin- -oxalättiksyra-transaminas (GOT) i serum- eller plasmaprovet, ~ k ä n n e t e c k n a t av att den GOT-aktivitet, som förelig- ger i serum eller plasma bestämmes före och efter inkubering 5,: med L-serin-O-sulfat så att man i första fallet erhåller ett enzymatiskt aktivitetsvärde motsvarande den totala summan av aktiviteten från de två isoenzymerna och i det andra fallet ett värde på enzymatisk aktivitet, som motsvarar aktiviteten av endast det mitokondriska enzymet, varvid aktiviteten av det cytoplasmatiska isoenzymet erhålles från skillnaden mellan de två ovan nämnda värdena.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att bestäm- ningen utföres på två identiska delprover av samma serum- eller plasmaprov.

3. Sätt enligt krav 1 och 2, k ä n n e t e c k n a t av be- stämningen av de enzymatiska aktiviteterna utföres genom att konsumtionen av den reducerade formen av nikotinamid-adenin- -dinukleotid (NADH) följes i den kopplade reaktionen mellan GOT och maleinsyradehydrogenas.

4. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att inakti- veringen av det cytoplasmatiska isoenzymet med L-serin-O-sulfat erhålles genom inkubering under 30 minuter vid rumstemperatur.

5. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att inakti- veringen av det cytoplasmatiska isoenzymet med L-serin-O-sul- fat erhålles genom inkubering under 20 minuter vid 30°C. ~'.>,~'

6. Diagnostisk utrustning för bestämning av enskilda enzyma- tiska aktiviteter av cytoplasmatiska och mitokondriska iso- enzymer av GOT vid utföring av förfarandet enligt kraven 1-5, k ä n n e t e c k n a d av att den som en av dess komponenter innehåller L-serin-O-sulfat.