JPS61274698A - ジアミンおよびポリアミンの定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本゛発明は生体試料中のジアミン及びポリアミンの定量
法に関するものである。

生体試料中のカダベリン、プトレシンなどのジアミン、
スペルミジン、スペルミンなどのポリアシ ンン及びこれらジアミンまたはポリアミンのアキル体で
あるアｊルボリアミンも含めた総ポリアミンの総量もし
くは個々の量は癌の発生もしくは進行状態と密接な関係
をもち、それらの定量は癌診断に有用な情報を与えるも
のとして臨床的意義が高い。

（従来の技術） ジアミン及びポリアミンの測定法として従来よく知られ
ているのは、液体クロマトグラフィや電気泳動法等によ
シ生体中よシアミンを分離し、続いて蛍光法やニンヒド
リン比色法による方法と最近開発された酵素を用いるポ
リアミンの測定法（特公昭５６−３６９１８号公報）、
つまりアミンオキシダーゼを用いて生じた過酸化水素を
４−アミノアンチピリン−フェノール−ペルオキシダー
ゼ系に導き、生じた色素を比色定量する方法がある。

（発明が解決しようとする問題点） 液体クロマトグラフィーや電気泳動法によるアミンの定
量法は処理操作が極めて煩雑で測定に要する時間も長く
、多くの検体の処理ができず、特殊な技術や設備、機器
を要するために臨床検査の場では一般的な方法とは言い
難い。一方、上記方法の欠点を改良すべく開発された酵
素法は、上記法に比べて著しく操作が簡単になり、特殊
な技術や機器を要せず比色計があれは十分定量可能とな
った。しかしこの酵素法は生体試料からジアミン、ポリ
アミンをカラム・を用いて分離する操作が必要なために
最近臨床検査の場で多く採用されている自動分析機への
適用が出来ない欠点がある。

（問題を解決する為の手段） 本発明者等はかかる従来の欠点を解消し、簡単な設備で
かつ簡単な操作で短時間に分析が出来て、しかも自動分
析機への適用が可能な定量法を見い出すべく種々鋭意検
討した結果、機器やカラムによる分離操作の不用な酵素
法によるジアミン及びポリアミンの定量法を見い出した
。

すなわち本発明は、試料にジアミンオキシダーゼ又は／
及びポリアミンオキシダーゼを作用させ、生成した過酸
化水素にアルコールの存在下、タカラーゼを作用させ、
生成したアルデヒドを測定することを特徴とする試料中
のジアミンおよびポリアミンの定量法である。

この場合必要があれば、ジアミン、ポリアミンジ のアミル体を前もって又は同時にアネルボリアミンアシ
ドヒドロラーゼと作用させ、ジアミン又はポリアミンに
遊離させてもよい。

本発明では生成したアルデヒドを化学法で直接比色定量
するか、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼの存在下、酸
化型ニコチンアミド補酵素を作用させ、生じた還元型ニ
コチンアミドを直接又はテトラゾリウム塩および電子伝
達体でホルマザン色素に変化させて測定することができ
る。

本発明に使用するジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）はい
かなる起源のものでもよいが、たとえば発芽大豆、麦等
の植物起源、ブタ腎等の動物起源、ミクロコツカス属、
カルブイア属、アスペルギル生 ス属等の微嚢物起源が産生ずるＤＡＯがある。

本発明に使用するポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）は
いかなる起源のものでもよいが、たとえばウシ血漿等の
動物起源、たとえば大麦等の植物起源、ペニシリウム属
、アスペルギルス属、ストレプトミセス属等の微生物起
源が産生ずるＰＡＯがある。

本発明に使用するアルコールとはタカラーゼの基質とな
るものであればいかなるものでも良いが好ましくは、メ
タノール、エタノールがあげられる０ 本発明で使用するＣＡとしては植物、動物及び微生物産
生のＣＡいずれでも良いが好ましくは動物由来のものが
良い。

本発明では使用するアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＪ
ＤＨ）とは、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＦＲ
Ｄ）も含むいかなるものでもよい。

たとえばその起源としては、動物臓器や、酵母、細菌由
来のものがあげられるが、好ましくは、シェードモナス
属由来のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼが良い。

またニコチンアミド補酵素としてはニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）又はニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰ）のどち
らでも良い。

テトラトリウム塩としては特に制限がないが、例えばニ
トロテトラゾリウムブルー、が３−（ヤーヨードフェニ
ル）−２−（ヤーントロフェニル）−５−フェニ゛ルテ
トツゾリウム゛などがある。

電子伝達体としてはフェナジンメトサルフェート１−メ
トキシ７エナジンメトサル７エートやジアホラーゼが使
用されつる。アルデヒドを定量する化学法としては、一
般に良く知られているアルデヒド試薬、例えばクロモト
ロープ酸、アセチルアセトン、４−アミノ−３−ヒドラ
ジノ−５−メルカプト−１，２，，４−）リアゾール（
ＡＨＭＴ）及び３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾン（ＭＢＴＨ）等がある。

各種酵素濃度（ＤＡＯ，ＰＡＯ，ＣＡ、ＦＲ４ｓ　）に
ついては特に制限がなく、測定時間反応条件、経済条件
等によって自由に設定できる。

アルコール濃度については酵素反応の阻害しない濃度で
最高の検出感度が得られる様な濃度であればいくらでも
よい。例えば０．１％〜１０％が適当である。

ＮＡＤ濃度についてはＦＲＤの反応を最高に発揮出来る
濃度で酵素反応阻害がない程度であればいかなる濃度で
も良いが、好ましくは（］、１１〜２０ｍが適当である
。

テトラゾリウム塩の濃度については特に制限ないが、好
ましくはＯＪ５ｍＭ〜５ｍＭが適当である。

る場合は０．ＩＵ／ｍＪ　以上あれば十分である。

上記酵素類及び発色剤を用いて試料中のＤＡ及び又はＰ
Ａを測定する場合は適当な緩衝液中で測定することが好
ましい。緩衝液の種類としてはｐＨ４−１０の範囲に保
つことが出来るものなら特に制限はない。又、反応温度
についても試薬が作用すればいかなる温度でも良いが、
好ましくは２Ｏ−４０ｔ：付近が良い。

本発明では各酵素反応及び発色反応を同時に行なっても
良く、又は別々に例えば酵素反応を行なってから発色反
応を、又は酵素反応を２段階以上に反応してから発色反
応を行なうようなことをしても良い。

本発明ではジアミンオキシダーゼ及び／又はポリアミン
オキシダーゼにより生成した過酸化水素にカメラーゼを
作用させるが、従来実施されている酵素法であるペルオ
キシダーゼの系では試料中よりジアミン及びポリアミン
をカチオン性のインオン交換樹脂により分離する操作が
必要であったが本性ではその分離操作が必要でなく、直
接に試料中のジアミン及びポリアミンを測定ができ、し
かも分離操作が不要な為に操作が煩雑でなく簡単でしか
も短時間に分析が可能となったので自動分析機への適用
も容易になり日常の臨床検査法として実用的有効な方法
となった。

（作用） 本発明法に従い試料中のジアミン及びポリアミンの測定
を実施する場合、煩雑な分離操作を必要とせず、又特殊
な技術や設備、機器も要することなく、短時間に簡便に
しかも正確に試料中のジアミン及びポリアミンを測定で
き、更に自動分析機への適用も可能なので広く日常臨床
診断法にとり入れることが可能とな９、癌の発見及び診
断治療に貢献する所大なるものがある。

（実施例） 以下実施例をあげて本発明の詳細な説明する。

シン溶液の定量を行ない、その時の検量線を第１図に示
す。

Ａ、試薬１ アシルポリアミンヒドロラーゼ　　４５０　Ｕプ費トレ
シンオキシダーゼ（ξクロコツカス属由来）４５Ｕ カタラーゼ（ペーリンガー社製）　４０，０００　Ｕメ
タノール　　　　　　　　　　　　１　ｍｌホルムアル
デヒドデヒドロゲナーゼ（東洋紡製）　　　　　　　　
　　　　　　　９０　Ｕジアホラーゼ（東洋紡製）　　
　　　１００　ＵＮＡＤ（酸化型）（輿入製）　　　　
　４５ｍｆニトロブルーテトラゾリウム（半井化学製）
　ｍＩ Ｏ，０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　全量１ｏｏ
ｒｒＬｌ試薬２ ０．５　　ＨＣＪ 試薬３ 試薬１よりプ＃トレシンオキシダーゼを抜、いたもの。

Ｂ、測定法 プトレシンの各種濃度検体を３００　ｆｉ！試験管にと
シ、試薬ｌを２　ｍＩ加え３７ｔ−１３０分間反応後試
薬２を１ＷＬＩｌ加えその吸光度を波長５７０　ｎｍで
測定する。

図１よシグトレシン濃度と吸光度との間に１０ｍＪｌ／
ｄｉまで直繊関係が得られジアミン及びプトレシンの比
色定量が可能なことがわかる。

実施例２　　実施例１の試薬用い尿中のジアミン及びプ
トレシンの給源を下記測定法に従い測定した結果を表２
に示す。

く測定法〉 試験管を２（１＋ｎ）本（ｎは検体数）用意して表１に
従って、検体、標準線、試薬１、試薬３を分注し、３７
″ｃ１３０分反応後、試薬２を加えて波長５７０　ｎｍ
で各試験管の吸光度を測定する。次いで下式に従って各
検体中のジアミン及びポリアミンの総量をプトレシン換
算で算出する。標準液としてはプトレシン５　ｍｇ　／
　ｄｊを用いる。

表２より尿中ポリアミン量が定量できることがわかる。

五２

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における検量線を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料にジアミンオキシダーゼおよび／又はポリア
   ミンオキシダーゼを作用させ、生成した過酸化水素にア
   ルコールの存在下、カタラーゼを作用させ、生成したア
   ルデヒドを測定することを特徴とする試料中のジアミン
   およびポリアミンの定量法。
2. （２）生成したアルデヒドにアルデヒドデヒドロゲナー
   ゼの存在下、酸化型ニコチンアミド補酵素を作用させ、
   生成した還元型ニコチンアミドを直接測定するか、又は
   テトラゾリウム塩および電子伝達体でホルマザン色素に
   変化させ、これを測定することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載のジアミンおよびポリアミンの定量法。