KR100836179B1 - 생체시료의 신규한 측정방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체시료에 대해서 6-포스포글루콘산을 생성할 수 있는 반응계를 이용하여 피검물질을 측정하는 경우에, 정확한 측정치를 얻을 수 있는 측정방법에 관한 것으로, 보효소로 글루코스를 측정하는 반응계의 최종생성물은 6-포스포글루콘산이고, 혈구 내의 6PGDH(6-포스포글루콘산탈수소효소)가 NADP를 보효소로서 반응하고, 그 결과 측정치에 정오차를 발생시키는데 주목하였다. 생체시료에 대해서 6-포스포글루콘산을 생성할 수 있는 반응계를 이용하여 피검물질을 측정하는 경우에 있어서 6-포스포글루콘산탈수소효소를 반응계 외부에 두는 방법에 의해 본 발명을 달성하였다.

측정반응계, 용혈성분, 6-포스포글루콘산

Description

생체시료의 신규한 측정방법{NOVEL METHOD OF MEASUREMENT FOR BIOMATERIAL SAMPLE}

도 1은 NAD 반응계에서의 용혈액의 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다 (실시예 1).

도 2는 NADP 반응계에서의 용혈액의 흡광도 변화를 나타낸 그래프이다 (실시예 1).

도 3은 글루코스 측정치의 변화를 나타낸 그래프이다 (실시예 2).

도 4는 중성지방 측정치의 변화를 나타낸다 (실시예 3).

본 발명은 생체시료에 대해서 효소반응을 이용한 측정반응계를 사용하여 피검물질을 측정하는 경우 시료에 함유된 용혈성분에 의해서 발생하는 측정오차를 회피하는 생체시료의 측정방법에 관한 것이다.

임상검사 분야에서는 보효소(NAD, NADP, NADH, NADPH, Thio-NAD, Thio-NAD, Thio-NADH, Thio-NADP, Thio-NADPH)의 변화량을 흡광도변화를 통해 파악하여, 목적성분을 정량하는 방법이 자주 이용된다. 검체로서는 일반적으로 혈청을 사용하지만, 혈청취득을 위한 채혈시에 물리적인 충격이 가해지거나 인위적인 오조작으로 인해 혈구가 파열되어 용혈하는 경우가 있다. 또한, 용혈성 질환을 갖고 있는 환자로부터 채혈된 경우에는 당해 질환에 기인하여 용혈이 나타나는 경우도 있다. 게다가, 최근에는 검사시간의 단축을 위하여 전혈을 검체로 하여 이용하는 측정법을 시도하는 경우도 있어 이러한 검체에서도 용혈이 나타나는 경우가 있다.

혈구가 파열하여 용혈상태가 되면 적혈구 내의 성분인 미오키나아제(아데닐산키나아제(이하「MK」라 약한다)), 글루코스6인산탈수소효소(이하「G6PDH」라 약한다)등의 효소가 혈청에 혼입하게 된다. 임상검사항목에 의하면, 이들 효소가 측정치에 영향을 주기 때문에 각각의 효소에 대한 대책이 시도되어져 왔다. 예를 들어, 글루코스성분을 측정하는 경우의 용혈로 인한 측정오차를 회피하기 위하여 NaF, MgCl₂, NaH₂PO₄ 및 항 응고제의 혼합물로 된 임상검사용 해당방지제를 이용하는 방법이 보고되어 있고(특개평5-126834공보), 또한 MK활성에 대해서는 AP5A가 보고되어 있다. 그러나, 효소반응을 이용하는 임상검사의 측정에 있어서 시료에 함유된 적혈구 내의 성분에 의해 발생하는 측정오차, 즉 용혈간섭의 문제는 아직 충분히 해결된 상황이라고 말할 수는 없다.

본 발명의 과제는 생체시료에 대해서 6-포스포글루콘산을 생성할 수 있는 반응계를 이용하여 피검물질을 측정하는 경우에, 정확한 측정치를 얻기 위한 생체시료의 측정방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기과제를 해결하기 위해 예의 검토한 결과, 보효소로 글루코스를 측정하는 반응계의 최종생성물은 6-포스포글루콘산(이하「6PG」라 약한다)인 점에 착안하여 혈구 내의 6PG탈수소효소(이하「6PGDH」라 약한다)가 NADP를 보효소로 하여 반응하고 글루코스 측정계의 결과인 6PG값에 정오차를 주는 것을 발견하였다.

그래서, 보효소로 글루코스를 측정하는 반응에 있어서, 6PGDH를 반응계 외부에 두는 것에 의해 정확한 글루코스의 측정치를 얻는 방법을 발견하였다. 종래에는 용혈시의 6PGDH 활성의 영향은 보고되어 있지 않고, 본 발명자가 최초로 발견한 것이다. 지금까지는 용혈의 영향을 MK 활성이나 혈구 내의 글루코스, 인산의 영향인 것으로 보아 문제시하지 않았던 것으로 보인다.

즉, 본 발명은,

1. 생체 시료에 대하여 6PG를 생성할 수 있는 반응계를 이용하여 피검물질을 측정하는 경우에 있어서, 6PGDH를 반응계 외부에 두는 것을 특징으로 하는 피검물질 측정방법,

2. 상기 1항에 있어서, 6PGDH를 반응계 외부에 두는 수단이 반응계에서 6PGDH와는 반응하지 않는 보효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 피검물질 측정방법,

3. 상기 2항에 있어서, 6PGDH와는 반응하지 않는 보효소로서 NAD 또는 Thio-NAD를 이용하는 것을 특징으로 하는 피검물질 측정방법,

4. 상기 1항에 있어서, 6PGDH를 반응계 외부에 두는 수단으로서 6PGDH 활성 저해제를 이용하는 것을 특징으로 하는 상기 1항에 기재된 피검물질 측정방법,

5. 상기 1항에 있어서, 6PGDH를 반응계 외부에 두는 수단으로서 항 6PGDH항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 피검물질 측정방법,

6. 상기 제 1항 내지 5항중 어느 한 항에 있어서, 그에 더하여 유산탈수소효소를 반응계 외부에 두는 것을 특징으로 하는 기재된 피검물질 측정방법,

7. 상기 제 6항에 있어서, 유산탈수소효소를 반응계 외부에 두는 수단으로서 옥살산 혹은 옥사민산, 또는 이들의 염류를 함유시키는 것을 특징으로 하는 피검물질 측정방법

8. 상기 제 1항 내지 7항중 어느 한 항에 있어서, 피검물질이 글루코스를 생성하는 반응계를 이용하여 측정가능한 물질인 것을 특징으로 하는 피검물질 측정방법

9. 상기 제 1항 내지 8항중 어느 한 항에 있어서, 피검물질이 적어도 헥소오스, 중성지방, 무기인, 크레아틴키나아제 혹은 이의 아이소자임 또는 아밀라아제 혹은 이의 아이소자임 중에서 선택된 1 또는 2 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 측정방법,

10. 용혈로 인하여 발생하는 6PGDH를 반응계 외부에 두는 점을 특징으로 하는 용혈간섭의 회피방법,

11. 상기 제 1항 내지 9항중 어느 한 항에 기재된 방법에 필요한 시약을 키트화하거나 또는 단품으로 구성한 시약으로 구성된다.

본 발명에 있어서, 생체 시료에 대해서 6PG를 생성할 수 있는 반응계를 이용하여 피검물질을 측정하는 경우란, 예를 들어 상기시료에 대하여 효소 반응을 이용하여 보효소로 헥소오스 혹은 인산화된 헥소오스를 측정하는 반응계를 들 수 있다. 여기서 헥소오스란, 6탄당을 말하고 대표적인 것으로 글루코스가 있다. 이와 같은 측정계를 이용하여 측정하는 임상검사 항목으로서 글루코스(GLU), 중성지방(TG), 무기인(IP), 크레아틴키나아제(CPK)등을 들 수 있다. 예를 들면, 식 1 및 식 2에 나타난 것과 같이, 글루코스나 중성지방에 대해서 측정을 수행할 때에 글루코스를 생성하는 반응계를 이용한 최종생성물은 6PG이다.

보효소로 헥소오스 혹은 인산화된 헥소오스를 측정하는 반응계에서는 시료에 용혈이 있는 경우 측정치에 정오차를 발생시키는 현상이 있으며 이러한 현상을 용혈간섭이라고 한다. 이는 용혈에 의해서, 혈구 내의 6PGDH가 측정계에서 NADP를 보효소로 하여 6PG와 반응하고, 그 결과 6PG의 정확한 측정치가 얻어지지 않는 간섭작용을 일으키는 것으로 생각되어졌다. 본 발명에서는 용혈로 인해 발생하는 6PGDH가 간섭작용을 일으키며, 또한 상기측정계에 있어서 6PGDH를 측정반응계 외부에 두는 것에 의해 용혈로 인해 발생하는 간섭작용이 회피되어지는 것을 발견하였 다.

이 6PGDH를 반응계 외부에 두는 수단으로서는 반응계에는 6PGDH와는 반응을 하지 않는 보효소를 이용하는 방법, 6PGDH의 활성저해제를 이용하는 방법, 6PGDH의 항체를 첨가하는 방법 혹은, 6PGDH를 면역제거하는 방법 등을 예로 들 수 있다. 게다가, 본 발명자는 6PGDH는 NADP와 보효소로서 반응하지만 NAD는 보효소로서 인식하지 않는 것을 밝혀내어 NAD로 반응계를 조직함으로써 6PGDH를 측정반응계 외부에 두도록 하는 방법을 발견하여 용혈의 영향을 회피하는 신규한 측정방법을 발명하였다.

또한, NAD혹은 NADH는 시료 중의 탈수소효소, 특히 유산탈수소효소 (이하「LDH」라 한다 ; NAD의존)의 영향을 받지만 옥살산, 옥사민산 혹은 이들의 염류를 함유시키는 방법으로써 완전하게 LDH의 영향도 회피할 수 있기 때문에, 이 측정방법과 조합되어 질 수 있다.

한편, 본 발명인 보효소로 헥소오스 혹은 인산화된 헥소오스를 측정하는 반응계는 보효소이외에 HK, G6PDH, 헥소오스, G6P 중에서 선택된 효소 또는 당을 하나 또는 둘 이상 조합하여 이용될 수 있다. 이러한 효소법들에 의한 글루코스의 측정법은 널리 공지되어 있다.

[식 1]

[식 2]

[실시예]

이하의 실시예에 본 발명을 설명하지만, 본 발명의 권리범위는 이러한 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

채혈관에 채혈한 후, 혈액을 3000rpm으로 원심분리하여 사람의 적혈구를 얻었다. 이 적혈구를 -20℃에서 동결하여, 다시 실온에서 용해시켰다. 이러한 과정을 통하여 혈구가 파열하여, 용혈성분을 얻었다. 이를 생리식염수로 희석하여, 헤모글로빈으로 500mg/dL가 되도록 하고, 이하에 나타낸 시약을 조제하였다.

0.1M 트리에탄올아민 완충액(pH 7.5)에 NADP 2.0mM, 6PG 1.0mM을 용해시킨 시약용액(시약 A) 0.1M 트리에탄올아민 완충액(pH 7.5)에 NAD 2.0mM, 6PG 1.0mM을 용해시킨 시약용액(시약 B)를 조제하였다.

시약 A 및 시약 B를 37℃에서 5분간 가열한 후, 용혈시킨 시료를 15㎕ 첨가하여, 파장 340~750nm에서의 흡광도를 1분간 방치 후 측정하였다. 이 용혈액을 측정하였더니 도 1에서와 같이 NAD를 이용한 경우에는 흡광도의 상승은 나타나지 않았다. 반면, 도 2에서와 같이 NADP를 보효소로서 반응시킨 경우에는 NADPH의 340nm에 있어서의 흡광도가 상승하였다. 이 결과는 NAD를 이용함으로써 용혈간섭을 회피할 수 있음을 시사하고 있다.

실시예 2

이하에 나타낸 시약을 조제하여, 글루코스(GLU)의 측정에 사용하였다.

(제1시약)

트리스 100 mM

HK 3.5 U/mL

G6PDH 5.0 U/mL

β-NAD 3 mM

초산마그네슘 10 mM

pH6.0

(제2시약)

트리스 200 mM

ATP 6 mM

pH9.0

또한, 상기의 시약조성에서 β-NAD 대신 β-NADP를 사용한 시약도 조제하였다.

(조작방법)

시료 5㎕에 제 1시약 210㎕, 제 2시약을 70㎕ 첨가하고, 주파장 340nm의 조건에서 일입7170형 자동분석장치를 이용하여 종말점분석(End Point Assay)을 행하여, 미리 작성한 검량선에 의해 글루코스의 농도를 산출하였다.

용혈액의 헤모글로빈 농도를 0, 100, 200, 300, 400, 500mg/dL로 하고, 사람의 혈청성분농도는 일정하게 하여 시료를 조제하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, NADP를 보효소로 한 시약 A는 글루코스 측정치가 헤모글로빈 농도가 높아짐에 따라 상승하였지만, NAD를 사용한 경우에는 측정치의 상승이 관측되지 않았으며, 용혈에 의해 정오차가 발생하지 않았다. 헤모글로빈 농도가 0mg/dL일 때의 글루코스의 농도는 80mg/dL이었다.

실시예 3

이하에 나타낸 시약을 조제하여, 중성지방(TG)의 측정에 사용하였다.

(1) 제1시약의 조성

Bicine 50 mM

염화칼륨 100 mM

염화마그네슘 10 mM

노니온A-10R 0.5 %

트립톤X-100 0.2 %

아지화나트륨 0.1 %

PEP 4.0 mM

ATP 3.0 mM

G6PDH 4.5 U/mL

PK 3.0 U/mL

GK 3.0 U/mL

pH8.5

(2)제 2시약의 조성

MES 50 mM

옥살산 100 mM

글루코스 80 mM

트립톤X-100 0.25 %

β-NAD 7.0 mM

아지화나트륨 0.1 %

ADP-HK 10.0 U/mL

리파아제 1500 U/mL

pH6.5

또한, 상기의 시약조성 β-NAD대신 β-NADP를 사용한 시약도 조제하였다. 측정조작은 글루코스 측정방법과 동일한 과정을 통해 중성지방을 측정하였다. 용혈액의 헤모글로빈 농도를 0, 100, 200, 300, 400, 500 mg/dL로 하고, 사람의 혈청성분농도는 일정하게 하여 시료를 조제하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, NADP를 보효소로 한 시약 B는 중성지방 측정치가 헤모글로빈 농도가 높아짐에 따라 상승하였지만, NAD를 사용한 경우에는 측정치의 상승이 관측되지 않았으며, 용혈에 의해 정오차가 발생하지 않았다. 헤모글로빈 농도가 0mg/dL일 때의 중성지방의 농도는 95mg/dL이었다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 생체시료에 대해서 6-포스포글루콘산을 생성할 수 있는 반응계를 이용하여 피검물질을 측정하는 경우에 있어서, 6-포스포글루콘산탈수소효소를 반응계 외부에 둠으로써 용혈간섭을 방지할 수 있고 피검물질의 정확한 측정치를 얻을 수 있는 효과가 있다.

Claims (11)

1. 중성지방을 측정하기 위한 시약 키트에 있어서,

   완충제, 계면활성제, 피루빈산 키나제(piruvate kinase, PK), 포스포에놀피루빈산(phosphoenolpyruvic acid, PEP), ATP, 마그네슘 이온, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로지나제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 및 글리세롤 키나제(glycerol kinase)를 유효성분으로 포함하는 제1시약; 및

   완충제, 글루코스, NAD 또는 Thio-NAD, ADP-헥소키나제, 리파제, 및 옥사민산(oxamic acid), 옥살산(oxalic acid) 및 이들의 염류로 구성된 군으로부터 선택되며 유산탈수소효소(lactate dehydrogenase)를 반응계 외부에 두는 것을 특징으로 하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 제2시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 중성지방을 측정하기 위한 시약 키트.
2. 제 1항에 있어서, 상기 제1시약 또는 제2시약이 아지화나트륨(sodium azide)을 유효성분으로 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중성지방을 측정하기 위한 시약 키트.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 제2시약이 계면활성제를 유효성분으로 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 중성지방을 측정하기 위한 시약 키트.
4. 제 1항 기재의 시약 키트를 이용하는 것을 특징으로 하는 생물학적 시료내의 중성지방을 인 비트로(In vitro) 측정하는 방법.
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