JPS63258600A - 総コレステロ−ル定量用一体型多層分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液等の各種生物体液、飲食物その他の水性
液体試料に含まれている総コレステロールを定量分析す
るための、乾式の一体型多層分析要素の改良に関するも
のである。

〔従来の技術および本発明が解決しようとする問題点］ リボプロティンの型で存在する血液等の体液中のコレス
テロールとコレステロールエステルの定量分析を乾式の
一体型多層分析要素を用いて行う場合、水性液体試料で
ある血液を水、生理的塩類水溶液、ｐＨバッファー等で
稀釈することなしに用いるために、分析要素中で呈色反
応が迅速に進まなかったり、体液中の共存物質（例、血
液中の中性脂肪）の干渉を受けて、正確な定量分析が困
難であった。この問題を解決するために、特開昭６１−
８５２００、ｒｃＬＩＮＩｃＡＬ　Ｃ）ＩＥＭＩＳＴＲ
ＹＪ冊、　１１．５９−１１６２　（１９８２）等に多
量のアルキルフェノキシポリエトキシエタノールを併用
することが提案されている。

しかし、これらの提案の技術においてもなお、以下のよ
うな問題点があることが判明した。

■コレステロールエステラーゼ活性が阻害される。

■乾式多層分析要素の使用前の保存時に、多層要素が水
を吸収する傾向が強く、そのために要素中の酵素活性が
減少又は失活するので、要素の性能が劣化しやすい。

■比較的に低い定量分析精度である。

本発明の目的は、上述の諸問題点（コレステロールエス
テラーゼ活性の阻害、保存経時での性能劣化、低い分析
精度等）が解決された優れた総コレステロール定量分析
用の乾式の一体型多層分析要素を提供することである。

本発明の他の目的は、中性指動の影響による測定誤差が
少なく、定量分析可能な総コレステロール含有量の範囲
が広く、かつ分析に要する時間を短縮して測定精度を高
く維持できる総コレステロール定量分析用の乾式の一体
型多層分析要素を提供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

リポプロテインリパーゼとコレステロールエステラーゼ
の組合せを含むコレステロールエステルを含めた総コレ
ステロール定量分析用試薬組成物を用いることにより、
コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素の活性阻
害が少く保存安定性が向上した乾式の一体型多層分析要
素が得られることが明らかになった。

また血液（全血、血漿、血清）のように呈色試薬組成物
の呈色反応に干渉する諸種の物質（特に中性脂肪）が共
存するような液体試料を用いる場合に、リポプロテイン
リパーゼとコレステロールエステラーゼを併用すること
により、呈色反応が円滑に進行し、大きな発色光学濃度
が得られて正確な総コレステロール含有量の比色分析が
可能なことが明らかになった。

すなわち、本発明は、光透過性水不透過性支持体の上に
少なくとも１層の親水性ポリマーを含む層（以下、親水
性層ということがある）及び多孔性層展開層がこの順に
一体に積層されており、前記のいずれかの層内にリポプ
ロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ活性を
有する少なくとも１種の酵素、コレステロールオキシダ
ーゼ、ペルオキシダーゼ、及び発色試薬組成物を含むコ
レステロール分析用呈色試薬組成物が含有されている総
コレステロール定量用一体型多層分析要素である。

〔発明の構成の詳細な説明〕

光透過性水不透過性支持体は一般の多層分析要素に使用
されている公知のものを利用すればよい。

その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（セルロースジアセテート、セルロー
ストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネー
ト等）などのポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１
ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲の
透明支持体を用いることができる。支持体の表面には必
要により前記の諸特許明細書等より公知の下塗層または
接着層を設けて支持体の上に設けられる親水性層等との
接着を強固にすることができる。

親水性層は呈色反応して発色した色素が蓄積される層で
あり、また呈色反応時のｐｌ＋を安定させるｐ　ｔｌ　
４１衝剤組成物を含有させることができる層であって、
親水性ポリマーバインダーにより形成され、ｉ水性ポリ
マーバインダーのみ又はこれと他の成分から形成される
ものである。親水性層は試薬成分を含まず吸水して膨潤
し、検出種を受容して蓄積する吸水層、検出種を媒染固
定できる陰電荷又は陽電荷を有する媒染剤を含みかつ吸
水して膨潤する検出層として機能させることができる。

親水性ポリマーバインダーは水吸収時の膨潤率が３０℃
で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％
から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマ
ーである。

その例として、特開Ｂ！５９−１７１８６４、特開昭６
０−１０８７５３等に開示のゼラチン（酸処理ゼラチン
、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（フタル化ゼ
ラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）
、アガロース、プルラン、プルランｍ４体、ポリアクリ
ルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ン等をあげることができる。

親水性層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍ、
好ましくは約３μｍから約５０μｍ、特に好ましくは約
５μｍから約３０μｍの範囲であり、また実質的に透明
であることが好ましい。

親水性層にはｐＨ緩衝剤、酵素、発色試薬組成物、その
他の必要により組合せられる試薬（例、フェロシアン化
物）の一部又は全部、さらには公知の媒染剤、塩基性ポ
リマー、酸性ポリマー等を含有させることもできる。こ
の場合には親水性層は試薬層又は呈色試薬層として機能
する。

展開層としては特公昭５３−２１６７７号公報等に開示
のメンブランフィルタ（プラッシュポリマ一層）、ポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水
性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有
多孔性層、特開昭５５−９０８５９号公報に開示のポリ
マーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ等が水で膨潤し
ないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微
空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物１１１）等
の非繊維質等方的多孔性展開層、特開昭５５−１６４３
５６号公報、特開昭５７−６６３５９号公報等に開示の
織物展開層、特開昭６０−２２２７６９号明細書に開示
の編物展開層、特開昭５７−１４８２５０号公報に開示
の有機ポリマー繊維パルプを含む抄造紙からなる展開層
等の繊維質多孔性展開層等があげられる。

展開層は直接あるいは必要により接着層を介して前記の
親水性層の上に積層される。展開層に酵素、発色試薬組
成物、所望により祖合せ含有されるフェロシアン化物そ
の他の試薬の一部又は全部を含有させることもできる。

特に酵素のうち、リポプロティンリパーゼ（ＬＰＬと略
記することがある）及びコレステロールエステラーゼ又
はコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素（これ
らを総称してコレステロールエステラーゼといい、ＣＥ
Ｈと略記することがある）は多孔性展開層に含有させる
ことが好ましい。

本発明の一体型多層分析要素には、前述の諸特許明細書
に開示の試薬層、光遮蔽層、光反射層、濾過層、半透膜
層、バリヤ層、拡散防止Ｎ（マイグレーシロン防止層）
等やこれら単独の層を有する機能を二つ以上併せもつ層
を組みこむことができる。

試薬層は酵素、発色試薬組成物、必要により組合せられ
るフェロシアン化物、その他の試薬の一部又は全部を含
有する層であり、非孔性で吸水性の層又は微多孔性で水
浸透性の層である。

実質的に非孔性で吸水性の試薬層に用いられる親水性ポ
リマーバインダーは、試薬を実質的に均一に溶解または
分散させる媒体として作用し、また液体試料中の水を吸
収して水とともに被検成分を試薬層に到達させる作用を
少なくとも有するものである。親水性ポリマーバインダ
ーとしては前記の親水性層に用いられる吸水性の親水性
ポリマ−バインダーと同じポリマーから適宜に選択して
用いることができる。実質的に非孔性の試薬層の乾燥厚
さは約３μｍから約５０μｍ、好ましくは約５μｍから
約３０ｐｍの範囲であり、また試薬層は実質的に透明で
あることが好ましい。

微多孔性で水浸透性の試薬層は固体微粒子とそのバイン
ダーである親水性ポリマーバインダーから構成される微
多孔性構造体層に試薬または試薬組成物が含有保持され
ている層である。ここでいう微多孔性構造体層とは微多
孔性微粒子または非多孔性微粒子と微粒子間を接着して
微多孔性連続空隙構造を保持する親水性ポリマーバイン
ダーからなる構造物の層である。

微多孔性試薬層に用いられる微多孔性微粒子または非多
孔性微粒子の例として微結晶性セルロース、セルロース
微粉末または微粒子等のセルロース微粒子、シリカ、珪
藻土等の二酸化珪素化合物の微粒子、沸石等の珪酸塩の
微粒子、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、
諸種のセラミックスビーズ等があげられる。親水性ポリ
マーバインダーとしては、前記の親水性層に用いられる
吸水性の親水性ポリマーと同じポリマーから適宜に選択
して用いることができるほか、特開昭５９−１４５９６
５等に開示の親水性構成繰返し単位を約２％以上含有す
るコポリマーの水性ラテックス等を用いることもできる
。微多孔性試薬層の乾燥層厚は約７μｍから約５０μｍ
、好ましくは約１０μｍから約３０ｐｍの範囲である。

試薬層には公知のｐＨ緩衝剤組成物、高分子ｐＨ１ｌ衝
剤、塩基性ポリマー１．酸性ポリマー、高分子媒染剤等
を含有させることができる。

試薬層と支持体の間に吸水層を配置する態様は好ましい
ｌ実施態様例である。また、親水性層に発色試薬組成物
を、多孔性展開層に酵素ＬＰＬとＣＥＨ２及び所望によ
り併用される、胆汁酸化合物及びアルキルフェノキシポ
リエトキシエタノールを、それぞれ含有させる態様は特
に好ましい１実施態様例である。

試薬層または親水性層の上に光遮蔽層を設けることがで
きる。光遮蔽層は光遮蔽性または光遮蔽性と光反射性を
兼ね備えた微粒子または微粉末（以下、単に微粒子とい
う）が少量の皮膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層
である。光遮蔽層状薬層又は親水性層における発色を光
透過性支持体側から反射測光する際に展開層に点着供給
された水性液体試料の色、特に全血試料に含まれるヘモ
グロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層または背
景層としても機能する。

光遮蔽性と光反射性とを兼ね備えた微粒子の例として二
酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはプル
カイト型の粒子径約０．１μｍから約１．２μｍの微結
晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子
または微小フレーク等が１．あり、光遮蔽性微粒子の例
としてカーボンブラック、ガスブラック、カーボンミク
ロビーズ等がある。これらのうちでは二酸化チタン微粒
子及び硫酸バリウム微粒子が好ましい、皮膜形成能を有
する親水性ポリマーバインダーとしては親水性層に用い
られるのと同じ親水性ポリマーのほかに弱親水性の再生
セルロース、セルロースアセテート等がある。これらの
うちでは、ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルア
ミド等が好ましい。ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の
硬化剤（架橋剤）を混合して用いることができる。

光遮蔽層は光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分
散液を公知の方法により試薬層または親水性層の上に塗
布し乾燥することにより設けることができる。光遮蔽性
微粒子と親水性ポリマーバインダーとの乾燥時の体積比
は光遮蔽性微粒子１０に対しポリマーバインダーが約２
．５から約７．５、好ましくは約３．０から約６．５の
範囲であり、光遮蔽性微粒子が二酸化チタン微粒子の場
合には重量比で二酸化チタン微粒子１０に対しポリマー
バインダーが約０．６から約１．８、好ましくは約０．
８から約１．５の範囲である。光遮蔽層の乾燥層厚は約
３μｍから約３０ａｍ、好ましくは約５μｍから約２０
１１ｍの範囲である。

展開層、光遮蔽層等を接着し積層するために接着層を設
けることができる。光遮蔽層の上に多孔性展開層を設け
る場合には接着層は必須である。

接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤
しているときに展開層を接着して一体化できる親水性ポ
リマーから主としてなる。接着層に用いうる親水性ポリ
マーとしては親水性層に用いるのと同じ親水性ポリマー
があげられ、これらのうちでゼラチン、ゼラチン誘導体
、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥層厚
は約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍか
ら約１０μｍの範囲である。接着層には界面活性剤を含
有させることができる。界面活性剤としてはノニオン性
界面活性剤、例えばオキシエチレン基またはオキシプロ
ピレン基が８〜１５個連なった鎖状構造を含むノニオン
性界面活性剤が好ましい。

接着層は親水性ポリマーと所望により加えられる界面活
性剤等を含む水溶液を公知の方法で試薬層、親水性層、
又は光遮蔽層の上に塗布して設けることができる。

次に本発明の総コレステロール定量用一体型多層分析要
素に含有されるコレステロール分析用呈色試薬組成物に
ついて説明する０本発明の要素に含まれるコレステロー
ル分析用呈色試薬組成物は、リポプロテインリパーゼ、
コレステロールエステラーゼ又はコレステロールエステ
ラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素、コレステロ
ールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、発色試薬組成物
、及び所望により併用される胆汁酸類、胆汁酸誘導体及
びそれらの塩からなる群から選らばれた少なくとも１種
の化合物、及び／又はポリオキシエチレン鎖を含むアル
キルフェノキシポリエトキシエタノールを含む、さらに
組成物中にはフェロシアン化物を含ませることができる
。

リポプロテインリパーゼ（ＥＣ３，１，１，３４）はリ
ボ蛋白中の中性脂肪（トリグリセリド、ジグリセリド、
モノグリゼリド）を脂肪酸とグリセロールに加水分解す
る酵素である。コレステロールエステラーゼ（ＥＣ０３
，１，１，１３）は試料中に含まれているコレステロー
ルエステルをコレステロールに変える酵素である。コレ
ステロールオキシダーゼ（ＥＣ９１，１，３，６）はコ
レステロールを酸化して過酸化水素を生成させる酵素で
ある。ペルオキシダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）はこ
の過酸化水素を利用して発色試薬組成物を酸化発色させ
る反応に関与する酵素である。コレステロールエステラ
ーゼとしてはＥＣ３，１，１゜１３に分類される酵素を
用いることができるだけでなく、コレステロールエステ
ラーゼ活性を有する他の単独の酵素（例、特公昭５６−
４５５９９に記載のコレステロールエステラーゼ活性を
存するリパーゼＭＯ、リパーゼ３０００ｅ）　、および
２種以上の酵素の組合せ（例、特公昭５６−４５５９９
に記載のコレステロールエステラーゼ活性を有するリパ
ーゼ（例、リパーゼＭＯ、リパーゼ３０００θ）、とプ
ロテアーゼ（例、キモトリプシン（ＥＣ３，４，２１゜
１）、パパイン（ＥＣ３，４，２１，２）、プロメライ
ン（ＥＣ３，４，２２，４）、プロナーゼＯ）との組合
せを用いることができる。

以下、コレステロールエステラーゼ又はコレス　゛チロ
ールエステラーゼ活性を有する単独の酵素又は２種以上
の酵素を単にコレステロールエステラーゼということが
ある。

コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ１，１，３゜６）は
コレステロールを酸化して過酸化水素を発生させる酵素
である。コレステロールオキシダーゼとしては、市販の
酵素から適宜に選択して用いることができる。必要に応
じて補酵素ＦＤＡ　（フラビン　アデニン　ジヌクレオ
チド）とともに用いることができる。

ペルオキシダーゼとしては特公昭５６−４５５９９号、
特公昭５７−５５２０号等に記載の植物起源および動物
起源のペルオキシダーゼ（ＥＣＩ、１１．１．７）、特
公昭５８−５０３５号等に記載の微生物起源のペルオキ
シダーゼ（ＥＣ１，１１，１，７）を用いることができ
る。これらのうちでは植物起源または微生物起源の非特
異的ペルオキシダーゼが好ましい。

好ましいペルオキシダーゼの例として西洋わさび、大根
から抽出したペルオキシダーゼ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌ
ｕｓ属、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ属の微生物から抽出した
ベルオキシダーゼ等がある。

胆汁酸類としては、コール酸、デオキシコール酸、リト
コール酸、ケノデオキシコール酸があげられる。胆汁酸
誘導体としては、タウロコール酸、グリコール酸、タウ
ロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸があげら
れる。胆汁酸類および胆汁酸誘導体の塩としては、上記
の酸のナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等があげ
られる。

本発明の多層分析要素においては、上記の胆汁酸類、胆
汁酸誘導体およびそれらの塩（本明細書ではこれらを総
称して胆汁酸化合物という）のうちの少なくとも１種の
化合物をいずれかの層に含有させることができる。胆汁
酸化合物は展開層又は展開層に隣接する層に含有させる
ことが好ましい。

胆汁酸化合物はアルキルフェノキシポリエトキシエタノ
ール、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステ
ラーゼとともに同じ層に含有させることが特に好ましい
。

ポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフェノキシポリエ
トキシエタノール（以下、単にアルキルフェノキシポリ
エトキシエタノールということがある。またこの化合物
の別名はポリオキシエチレン　アルキルフェニル　エー
テル）のアルキル基としては、各種のアルキル基が用い
うるが、好ましくはオクチル基、１，１，３．３−テト
ラメチルブチル基、ノニル基等の炭素原子数８又は９の
直鎖状又は分岐枝状のアルキル基である。ポリオキシエ
チレン鎖中のオキシエチレン単位数としては８から約６
０までの範囲のものを用いることができる。これらのう
ちで、好ましいものは１６から約６０までの範囲、最も
好ましいものは平均２０から５０までの範囲である。ア
ルキルフェノキシポリエトキシエタノールの例として、
オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（オキシエ
チレン単位９〜１１含有物の混合物、平均２０〜４０含
有物等）、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール（
オキシエチレン単位平均２０〜４０含有物等）、１．　
１．　３゜３−テトラメチルブチルフェノキシポリエト
キシエタノール（オキシエチレン単位平均２０〜４０含
有物等）がある、アルキルフェノキシポリエトキシエタ
ノールはリポプロティンリパーゼ、コレステロールエス
テラーゼ、所望により併用される胆汁酸化合物とともに
同じ層に含有させるか、相互に隣接する層に含有させる
ことが好ましい。アルキルフェノキシポリエトキシエタ
ノールは２種以上の化合物を組合せて用いることができ
るほか、他の種類の界面活性剤、とくに他のノニオン性
界面活性剤と併用することもできる。

発色試薬組成物は■色原体とカプラーを含み、ペルオキ
シダーゼの存在下に過酸化水素により色原体とカプラー
が酸化カプリングしてキノンイミン染料を形成して発色
する組成物、または■ロイコ色素でペルオキシダーゼの
存在下に過酸化水素により酸化されて色素になり発色す
る化合物である。

゛色原体としては、Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、＋　６　、２４−２７　（１９６９）に記載の４
−アミノアンチピリン（別名４−アミノフェナジン、す
なわち１−フェニル−２，３−ジメチル−４−アミノ−
３−ピラゾリン−５−オン）、特開昭５９−５４９６２
等に記載の１−（２，４，６−）ジクロロフェニル）−
２゜３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−
オン、Ｉ−（３，５−ジクロロフェニル）−２゜３−ジ
メチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等のト
リ置換−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン、特公
昭５５−２５８４０等に記載の１−フェニル−２，３−
ジメチル−４−ジメチルアミノ−３−ピラゾリン−５−
オン等の４−アミノアンチピリン類似体を用いることが
できる。これらの化合物のうちでは、４−アミノアンチ
ピリン、１−（２，４，６−トリクロロフエニル）−２
゜３−ジメチル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オ
ン、１−（３，５−ジクロロフェニル）−２゜３−ジメ
チル−４−アミノ−３−ピラゾリン−５−オン等が好ま
しい。

カプラーとしては、Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅ＋ｇ、＋　６　＋２４−２７　（１９６９）、特公昭
５５−２５８４０、特公昭５８−４５５９９、特公昭５
Ｂ−１８６２８、特開昭５５−１６４３５６、特開昭５
６−１２４３９８、特開昭５６−１５５８５２等に記載
のフェノール；２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン
酸、４−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸、３，５
−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン酸
、２−ヒドロキシ−３−メトキシ−１−ベンゼンスルホ
ン酸等のフェノールスルホン酸（アルカリ金属塩、アル
カリ土類金属塩を含む）＝１−ナフトール、２−ナフト
ール；１，７−ジヒドロキシナフタレン等のジヒドロキ
シナフタレン；１−ヒドロキシ−２−ナフタレンスルホ
ン酸、１−ヒドロキシ−４−ナフタレンスルホン酸等の
ナフトールスルホン酸（アルカリ金属塩、アルカリ土類
金属塩を含む）；その他のフェノールまたはナフトール
誘導体がある。これらの化合物のうちでは、１，７−ジ
ヒドロキシナフタレン、１−ヒドロキシ−２−ナフタレ
ンスルホンｆｉ（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）、３．
５−ジクロロ−２−ヒドロキシ−１−ベンゼンスルホン
酸（Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｌｉ塩を含む）が好ましい。

ロイコ色素として、特公昭５７−５５１９に記載の２−
（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフェニル）−４
，５−ビス〔４−（ジメチルアミノ）フェニルコイミダ
ゾール等のトリアリールイミダゾールロイコ色素；特開
昭５９−１９３３５２に記載の２−（３，５−ジメトキ
シ−４−ヒドロキシフェニル）−４−（４−（ジメチル
アミノ）フェニルツー５−フェネチルイミダゾール等の
ジアリールイミダゾールロイコ色素；特開昭６１−４９
６０に記載の２−（２−フェニル−３−インドリル）−
４，５−ジ「４−（ジメチルアミノ）フェニルイミダゾ
ール等のジアリールインドリルイミダゾールロイコ色素
；特開昭６１−２２９８６８に記載の２−（４−ヒドロ
キシ−３，５−ジメトキシフェニル）−３−アセチル−
４，５−ビス〔４−（ジエチルアミノ）フェニルコイミ
ダゾール等のトリアリールモノアシルイミダゾールロイ
コ色素；２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフ
ェニル）−３−メチル−４，５−ビス［４−（ジエチル
アミノ）フェニルイミダゾール等のトリアリールモノア
ルキルイミダゾールロイコ色素等がある。

コレステロール分析用呈色試薬組成物には、オプショナ
ル成分として、フェロシアン化物を加えることができる
。

フェロシアン化物としては、フェロシアンイオン（ヘキ
サシアノ鉄（■）酸イオン；すなわち（Ｆ　ｅ　（ＣＮ
）＆）　”　）を含有するか、または放出しうる化合物
を用いることができる。フェロシアン化物としてはへキ
サシアノ鉄（Ｉｆ）酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類
金属塩、これらの混合金属塩を用いることができる。

フェロシアン化物の具体例としては、フェロシアン化ナ
トリウムＮ　ａ　４　（Ｆ　ｅ　（ＣＮ）ｂ）　　；フ
ェロシアン化カリウムＫａ　（Ｆ　ｅ　（ＣＮ）ｉ）　
　ｉヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸リチウム；ヘキサシアノ
鉄（ＩＩ）酸マグネシウム；ヘキサシアノ鉄（ＩＩ）酸
カルシウムがある。これらのうちではフェロシアン化カ
リウム、フェロシアン化ナトリウムが好ましい。

上述のコレステロール分析用呈色試薬組成物の　　。

成分のうち、各酵素、及び所望により併用される胆汁酸
化合物、及びアルキルフェノキシポリエトキシエタノー
ルは多孔性展開層に含有させることが好ましい。発色試
薬組成物、さらにオプショナル成分であるフェロシアン
化物は多孔性展開層、多孔性展開層に隣接する層、独立
試薬層、親水性層、及び吸水層のいずれかＩＮ又は複数
の層に含有させることができる。

本発明の要素に用いられるコレステロール分析用呈色試
薬組成物の各成分の要素中の含有量（被覆ｆ）は次のと
おりである（被覆量は要素１ｒｒｒ当り）。

リポプロテインリパーゼ： 約２００〜約５万ＩＵ、好ましくは約５００〜約３万Ｉ
Ｕ コレステロールエステラーゼ又はコレステロールエステ
ラーゼ活性を有する少なくとも１種の酵素： 約３００〜約５万ｒＵ、好ましくは約５００〜約３万ｌ
Ｕ　（コレステロールエステラーゼ活性値として） コレステロールオキシダーゼ： 約５００〜約３万ＩＵ、好ましくは約１ｏｏｏ〜約２万
ＩＵ ペルオキシダーゼ： 約１千〜約１０万、好ましくは約２千〜約６万Ｉ色原体
又はロイコ色素： 約０．５〜約ｌＯミリモル、好ましくは約１〜５ミリモ
ル カプラー； 約２．５〜約５０ミリモル、好ましくは約５〜２５ミリ
モル フェロシアン化物： 約０．１〜約ｌＯミリモル、好ましくは約０．５〜５ミ
リモル 胆汁酸化合物： 約０．２ｇ〜約１０．０ｇ、好ましくは約０．５ｇ〜約
５．０ｇポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフェノキ
シポリエトキシエタノール： 約０．５ｇ〜約２０ｇ、好ましくは約０．８ｇ〜約１５
ｇ本発明の一体型多層分析要素には液体試料を適用して
の分析操作実施時のＰＨ値を約５．５から約９．０、好
ましくは約７．７から約８．５の範囲の所望の値に緩衝
できる公知の緩衝剤から適宜選択して含有させることが
できる。

用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学便覧　基
礎編」　（東京、丸善■、１９６６年発行）１３１２−
１３２０頁、ＲｏＭ、　　Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ
ｌ［ｒＤａｔｅｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ　Ｊ第２版（Ｏｘｆｏｒｄａｔ　ｔｈｅ　
Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９６９年発行）　
４７６−５０８頁、ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ５．
４６７頁以降（１９６６年）、ｒＡｎａｌｙｔｉｃｌ　
ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　１０４＋　３００−３１
０頁（１９８０年）等に記載のｐＨ緩衝剤系がある。

ＰＨ５，５〜９．０の範囲のｐＨｌ１衝剤の具体例とし
て、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉ
ｓ）を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼酸塩を含む
緩衝剤；拘鶴酸または杓蛙暮酸塩を含む緩衝剤；グリシ
ンを含む緩衝剤ｉＮ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル
）グリシン （Ｂｉｃｉｎｅ）　　；　Ｎ　−２−ヒドロキシエチル
ピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプＯ；インー３−ス
ルホン酸（ＨＥＰＰＳ）　Ｎ　ａ塩またはに塩等；Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−スルホン
酸（ＥＰＰＳ）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−（トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチルクー３−アミノプロパンスルホ
ン酸（ＴＡＰＳ）Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルビプラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（
ＨＥＰＥＳ）Ｎａ塩またはに塩等；およびこれらのいず
れかと必要により組合せられる酸、アルカリまたは塩が
ある。好ましい緩衝剤の具体例として、燐酸二水素カリ
ウム−燐酸水素二ナトリウムＨＴｒ　ｉ　ｓ−硼酸ナト
リウム；Ｔｒｉｓ−硼酸ナトリウム−ＥＤＴＡ＝２Ｎａ
塩；Ｔｒｉｓ＄Ｊ縫酸：杓Ｈ酸−燐酸二水素ナトリウム
；Ｂｉｃｉｎｅ；ＨＥＰＰＳ；ＨＥＰＰＳナトリウム塩
、ＥＰＰＳ、ＥＰＰＳナトリウム塩；ＴＡＰＳｉＴＡＰ
Ｓナトリウム塩等がある。

ＰＨ緩衝剤は酵素が含有されている層に存在するのが好
ましいので、−ａ的には酵素含有する多孔性展開層また
は試薬層にｐＨ′ａ衝剤を含有させるのが好ましい、一
方で低分子量のｐＨｆｆ１街剤は点着された水性液体試
料の媒体である水の浸透に従って眉間を移動しうるので
、酵素と発色試薬組成物が含まれる全ての層にｐＨ緩衝
剤が含有される必要はなく、例えば親水性層又は吸水層
だけにｐＨ緩衝剤を含有させてもよい。

多層分析要素中には架橋剤（硬化剤又は硬膜剤ともいわ
れる）を含有させることができる、態様によっては架橋
剤の含有が好ましいか必須の場合がある。架橋剤として
は、ハロゲン化銀ゼラチン写真乳剤技術分野で周知のゼ
ラチン用の諸種の無機及び有機架橋剤、蛋白化学分野及
び有機ポリマー化学分野で周知の諸種の無機及び有機架
橋剤を用いることができる。ゼラチン用の有機架橋剤と
しては、Ｔ、Ｈ，Ｊａｍｅｓ　ＩＱ　ｒＴｈｅ　Ｔｈｅ
ｏｒｙｏｆ　ＰｏｔｏｇｒａｐｈｉｃＰｒｏｃｅｓｓ　
Ｊ第４版（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｍａｃ−ｍｉｌｌａｎ　
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、　、　１９７７年）７８−
８９頁に記載のグルタルアルデヒド、グリオキサール、
ジアルデヒド澱粉に代表されるジアルデヒド頻；２＋５
−ヘキサンジオンに代表されるジケトン類；アジピン酸
ジ（１−ピリジニオメチル）エステル等のカルボン酸誘
導体類；ビス（ビニルスルホンメチル）エーテル、ビス
（ビニルスルホニルメチル）メタノール、ビス〔（ビニ
ルスルホニルメチル力ルボニル）アミノコメタン、ビス
（ビニルスルホニル）メタン、ビス（ビニルスルホニル
）メタン、ビス（ビニルスルホニル）メタンスルホニル
酸塩（例、Ｎａ塩）に代表されるビニルスルホン基含有
化合物１１；２．４−ジクロロ−６−ヒドロキシ−５−
）リアジン、１，３．５−トリアクリロイル−３−トリ
アジンに代表されるＳ−トリアジン類；ブタジェンオキ
シドに代表されるエポキシド類等がある。ポリビニルア
ルコール用の打機架橋剤としては、ジメチル尿素等があ
る。

これらの架橋剤のうちでは、ゼラチン用の架橋剤として
ビス（ビニルスルホニルメチル）メタノール、ビス（ビ
ニルスルホニルメチル）エーテル、ビス（ビニルスルホ
ニルメチルカルボニルアミノ）メタン、ビス（ビニルス
ルホニル）メタン、ビス（ビニルスルホニル）メタンス
ルホン酸Ｎａ塩；グルタルアルデヒドが好ましい。

架橋剤の多層分析要素中での含有量は、架橋硬化させる
目的の層の被覆量と硬化の程度に応じて選択しうるが、
一般的に被覆量で約５０■／ｒｒｒ〜約１０００ｍｇ／
ｎ？、好ましくは約８ＯＮ／ｒｒｒ〜約８００■／ポの
範囲である。架橋剤は吸水層、呈色試薬層、光遮蔽層、
接着層等のいずれかｌ１ｍに、又は２以上の層にふりわ
けて含有させることができる。これらの層のうちでは、
吸水層に含有させるのが、酵素含有呈色試薬組成物への
悪影響の可能性が僅少でかつ架橋剤の上側の層への移行
により架橋硬化可能な親水性ポリマーバインダ一層の硬
化が適度に生じる点で好ましい。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書に記載の公
知の方法により調製することができる。

本発明の多層分析要素は一辺約１５ｍ＋ａから約３０鵬
の正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断し、
特公昭５７−２８３３１、実開昭５６−１４２４５４、
特開昭５７−６３４５２、実開昭５８−３２３５０、特
表昭５８−５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて
化学分析スライドとして用いることが、製造、包装、輸
送、保存、測定操作等諸種の観点で好ましい、使用目的
によっては、長いテープ状でカセットまたはマガジンに
収めて用いること、または小片を開口のあるカードに貼
付または収めて用いることなどもできる。

測定試料はコレステロールを含有する水性試料であれば
特に制限されるものではなく、例えば全血、血漿、血清
等の血液のほか、その他各種体液、食品、さらにはコレ
ステロールを製造しあるいは利用している工場の工程管
理用試料などを含む。

本発明の多層分析要素は前述の諸特許明細書等に記載の
操作により液体試料中の総コレステロールの定量分析を
実施できる。すなわち約５μＬから約３０μし、好まし
くは８μＬから１５μＬの範囲の全血、血漿、血清、尿
等の水性液体試料滴を展開層に点着し、１分から１０分
の範囲で、約２０゛Ｃから約４０°Ｃの範囲の実質的に
一定の温度で、好ましくは約３５°Ｃから約４０°Ｃの
範囲又は３７°Ｃ近傍の実質的に一定の温度でインクベ
ーションし、要素内の発色又は変色を可視光又は紫外光
の吸収極大波長またはその近傍の波長の光を用いて光透
過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用
いて比色測定法の原理により液体試料中の総コレステロ
ール含有量を求めることができる。あるいは、要素内の
蛍光の強度を測光し、予め作成した検量線を用いて液体
試料中の総コレステロール含有量を求めることができる
０点着する液体試料の量、インクベーション時間及び温
度を一定にすることにより総コレステロールの定量分析
を高精度で実施できる。測定操作は特開昭６０−１２５
５４３、特開昭６０−２２０８６２、特開昭６１−２９
４３６７、特開昭５８−１６１８６７等に記載の化学分
析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実
施できる。

実施例１ ゼラチン下塗りが施されである厚さ１８０μｍのポリエ
チレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルム上に、ゼラチ
ン２６ｇ／ｎｆ、ノニルフェノキシポリエトキシエタノ
ール（オキシエチレン単位（以下、ｎと略記する）平均
９〜１０含有）０．０３ｇ／ボ、ビス（ビニルスルホニ
ルメチルカルボニルアミノ）メタン３０ｍｇ／ｒｒｌに
なるように塗布乾燥してゼラチン層（吸水Ｎ）を形成し
た。

次に、この吸水層に３０ｇ／ｒｒｆの割合で水を湿し水
として供給湿潤させたのちグロー放電で親水化したポリ
エチレンテレフタレート（ＰＥＴ）紡績糸（５０デニー
ル）からなるトリコツｌ−Ｗ物生地（平均厚さ２５０μ
ｍ）を圧着ラミネートして展開層を設けた。

ついで展開層中で下記の成分被覆量になるようにして、
編物展開層の上からコレステロール分析用呈色試薬組成
物水溶液を塗布含浸し乾燥して総コレステロール定量用
一体型多層分析要素を完成した。

コレステロール分析用呈色試薬組成物の成分被覆量（１
Ｍ当り） メチルセルロース（メトキシ基含有率２９％、２Ｗ％水
溶液２０°Ｃで粘度１１２ｃｐｓ）　　　　３．０　ｇ
二酸化チタン微粒子（ルチン型；粒子 サイズ０．２５〜０．４０　ｔｔ　ｍ　）　　　　　　
　　　２４　ｇオクチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール（オキシエチレン単位平均４０含有）　　　１．１
ｇリポプロテインリパーゼ （ＥＣ３，１，１，３４）　　　　　　２０００４１コ
レステロールエステラーゼ （ＥＣ３，１゜１．１３）　　　　　　　２５００１１
１コレステロールオキシダーゼ （ＥＣ１，１，３，６）　　　　　　　３５００１０ペ
ルオキシダーゼ （ＥＣ１，１１，１，７）　　　　　　　２９００１０
２−ヒドロキシ３．５−ジクロロベンゼンスルホン酸ナ
トリウム　　　　　　　　１．８ｇ４−アミノアンチピ
リン　　　　　　　０．３ｇ燐酸二水素ナトリウム　　
　　　　　　　７．３ｇ比較例１〜３ リポプロテインリパーゼを添加せず、次のように成分被
覆量を変更したほかは実施例１と同様にして比較用総コ
レステロール定量用多層分析要素２種を完成した。

比較例１ コレステロールエステラーゼ 被覆Ｎ１０３００ＩＵ／ポ 比較例２ オクチルフェノキシポリエト キシエタノールの被覆量　　　　１１．０　ｇ　／ｒｒ
ｆリポプロテインリパーゼを添加しなかったほかは実施
例１と同様にして比較用総コレステロール定量用多層分
析要素１種（比較例３）を完成した。

実施例１及び比較例１〜３で作成した総コレステロール
定量用一体型多層分析要素を１５ｍＸ１５ｍの正方形チ
ップに裁断し、特開昭５７−６３４５２に開示のプラス
チックマウントに収めて総コレステロール定量用化学分
析スライド４種を完成した。

性能評価　実験−１ 上述の化学分析スライドを４°Ｃ相対湿度５％以下と４
５°Ｃ相対湿度約４５％状能に３日間保存した時の発色
光学濃度値を比較した。各スライドにヘパリン採血した
コレステロール濃度約４９抛ｇ／ｄＬのヒト血漿をｌＯ
μＬ点着し３７°Ｃ６分間インキュベーションしたのち
中心波長５４０ｎｍの測定光でＰＥＴ支持体側から反射
光学濃度を測定した。

実験−２ 総コレステロール含有量の異なるヒト血漿について、標
準法としてＣ，Ｃ，Ａ１１ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの溶液法
（ｒｃＬＩＮＩｃＡＬ　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹＪ皿、　４
７０−４７５（１９７４））で総コレステロール値を求
めた。この値をもとにして、本発明および比較例の総コ
レステロール定量用一体型多層分析要素のヒト血漿用検
量線を作成した。

ついで中性脂肪温度約６２０＋ｗｇ／ｄＬのヒト血漿を
用い、実験−１と同様に操作して発色させ、前記検量線
から総コレステロール含有量を求めた。

Ａ１１ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの方法と上記の化学分析スラ
イドを用いて得られた実験−２のヒト血漿中の総コレス
テロール含有量の比（化学分析スライドの値／＾１１ａ
ｉｎ　ｅｔ　ａｌの値）は第１表のとおりであった。

第１表の値から、本発明の総コレステロール定量用一体
型多層分析要素は、４５°Ｃ４５％ＲＨａ日の加速劣化
促進試験後においても、発色光学濃度値の減少が実質的
にゼロときわめて少ないこと、標準測定法であるＣ、　
　Ｃ，Ａ１１ａｉｎ　ｅｔ　ａｌの溶液法と同様に血液
中の中性脂肪の干渉（約マイナス１％）総蛋白の干渉（
約マイナス３％）がきわめて少なく、総合性能として標
準法ときわめてよい相関を有することが明らかである。

実験−３発色速度の測定 実験−１で用いるコレステロール濃度的４９０　ｍｇ／
ｄＬのヒト血漿１０μＬを各分析要素に点着し、３７°
Ｃでインクベーシゴンしながら中心波長５４０ｎ＋＊の
可視光でＰＥＴ支持体側から要素内の発色の変化反射光
学濃度値の変化として測定した０発色速度の目安として
、血漿点着後１分ないし６分の反射光学濃度値から点着
後の２秒の反射光学濃度値を差引いた反射光学濃度値／
血漿点着後１５分の反射光学濃度値（飽和発色濃度値と
みなした）の比を求めて、第２表に示す。

第２表 第２表の比の値から、ＬＰＬとＣＨＥを併用した本発明
の総コレステロール定量用一体型多層分析要素は発色反
応が速く、比較的短時間で発色光学濃度値が大きくなり
、飽和するので、高精度の総コレステロール定量分析が
実施できることが明らかである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）光透過性水不透過性支持体の上に少なくとも１層
   の親水性ポリマーを含む層及び多孔性展開層がこの順に
   一体に積層されており、前記のいずれかの層内にリポプ
   ロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ活性を
   有する少なくとも１種の酵素、コレステロールオキシダ
   ーゼ、ペルオキシダーゼ、及び発色試薬組成物を含むコ
   レステロール分析用呈色試薬組成物が含有されているこ
   とを特徴とする総コレステロール定量用一体型多層分析
   要素。
2. （２）前記コレステロールエステラーゼ活性を有する酵
   素がコレステロールエステラーゼである特許請求の範囲
   第１項に記載の多層分析要素。
3. （３）分析要素内にさらに胆汁酸類、胆汁酸誘導体及び
   それらの塩からなる群から選らばれた少なくとも１種の
   化合物、及びポリオキシエチレン鎖を含むアルキルフェ
   ノキシポリエトキシエタノールを含有する特許請求の範
   囲第１項に記載の多層分析要素。
4. （４）前記胆汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩から
   なる群がコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、
   ケノデオキシコール酸、タウロコール酸、グリコール酸
   、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、
   及びこれらのナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩
   からなる群であり、前記アルキルフェノキシポリエトキ
   シエタノールのアルキル基が炭素原子数８又は９の直鎖
   状又は分岐アルキル基、ポリオキシエチレン鎖のオキシ
   エチレン単位の数が１６から６０の範囲である特許請求
   の範囲第３項に記載の多層分析要素。
5. （５）前記アルキルフェノキシポリエトキシエタノール
   のポリオキシエチレン鎖のオキシエチレン単位の数が平
   均２０から５０の範囲である特許請求の範囲第４項に記
   載の多層分析要素。
6. （６）前記コレステロールエステラーゼ活性を有する少
   なくとも１種の酵素、コレステロールオキシダーゼ、胆
   汁酸類、胆汁酸誘導体及びそれらの塩からなる群から選
   らばれた少なくとも１種の化合物、及びアルキルフェノ
   キシポリエトキシエタノールが前記展開層に含有されて
   いる特許請求の範囲第３項に記載の多層分析要素。