CZ2003705A3

CZ2003705A3 - Zkušební proužky pro detekci přítomnosti redukovaného kofaktoru ve vzorku a způsoby jejich použití

Info

Publication number: CZ2003705A3
Application number: CZ2003705A
Authority: CZ
Inventors: Tianmei Ouyang; Yeung Siu Yu
Original assignee: Lifescan, Inc.
Priority date: 2000-09-12
Filing date: 2001-09-07
Publication date: 2004-01-14
Also published as: HK1053856A1; ES2250472T3; NO20031116L; US6420128B1; EP1317563A2; CN1561397A; WO2002022855A3; PL363222A1; MXPA03002078A; MY119106A; AU8893501A; DK1317563T3; JP2004509618A; CA2422010A1; US20020132282A1; AR030650A1; DE60115261D1; IL154713A0; WO2002022855A2; ATE310832T1

Description

Zkušební proužky pro detekci přítomnosti redukovaného kofaktoru ve vzorku a způsoby jejich použití

Oblast techniky

Vynález se vztahuje na zkušební proužky a způsoby stanovení analytu s jejich použitím.

Dosavadní stav techniky

Stanovení analytů ve fyziologických tekutinách, například v krvi nebo v produktech z krve odvozených má v současnosti stále se zvyšující význam. Detekce analytů se používají v různých aplikacích zahrnujících klinická laboratorní vyšetření, vyšetření pacientem atd., kde výsledky uvedených vyšetření mají hlavní vliv na diagnózu a léčení různých chorobných stavů. Významné analyty zahrnují alkohol, formaldehyd,·glukosu, kyselinu glutamovou, glycerol, beta-hydroxybutyrát, L-laktát, leucin, kyselinu jablečnou, kyselinu pyrohroznovou, steroidy atd. Reakcí na uvedený zvyšující se význam stanovení je vývoj způsobů a zařízení pro jak klinické použití tak pro použití uživatelem.

V řadě způsobů a zařízení které byly dosud vyvinuté se ke zjištění přítomnosti hledaného analytu ve vzorku fyziologické tekutiny jako je krev používá signální systém produkující signál.

Přestože již byly vyvinuté různé signální systémy vhodné pro měření široké palety různých analytů, potřeba vývoje dalších systémů tohoto typu stále přetrvává.

Relevantní literatura:

Relevantní patentová literatura zahrnuje: EP 0 908 453 Al; WO 94/01578 a WO 94/01544.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje zkušební proužky a způsoby jejich použití pro detekci analytů ve vzorku. Zkušební proužky podle vynálezu jsou charakterizované tím, že obsahuji nejméně jednu ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl na povrchu pozitivně nabitého substrátu. Ve více provedeních tvoři uvedená ve vodě rozpustná tetrazoliová sůl součást analyt-oxidujícího signálního systému, kde uvedený signální systém obsahuje jednu nebo více dalších složek: enzym oxidující analyt např. analytdehydrogenasu nebo analyt-oxidasu; prostředek přenosu elektronů; a kofaktor enzymu. Vynález rovněž poskytuje systémy a kity používající zkušební proužky podle vynálezu. Zkušební proužky, systémy a kity podle vynálezu jsou vhodné pro stanovení široké palety analytů ve vzorku jakým je fyziologický vzorek například krev nebo frakce krve,, nebo ISF (intersticiální tekutina).

Popis obrázků na 'připojených výkresech '

Obr.l představuje hodnoty získané v testu stanovení glukosy o koncentraci 400 mg/dl provedeném na pozitivně nabité a nenabité membráně s použitím ve vodě rozpustného tetrazoliového indikátoru podle vynálezu.

Popis specifických provedeni

Vynález poskytuje zkušební proužky a způsoby jejich použiti pro detekci analytů ve vzorku. Zkušební proužky podle vynálezu jsou charakterizované tím, že obsahuji nejméně jednu ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl na povrchu pozitivně nabitého substrátu. Ve vice provedeních tvoří uvedená ve vodě rozpustná tetrazoliová sůl součást analyt-oxidujíciho signálního systému, kde uvedený signální systém obsahuje jednu nebo více dalších složek: enzym oxidující analyt např. analytdehydrogenasu nebo analyt-oxidasu; prostředek přenosu elektronů; a kofaktor enzymu. Vynález rovněž poskytuje systémy a kity používající zkušební proužky podle vynálezu. Zkušební proužky, systémy a kity podle vynálezu jsou vhodné pro stanoveni široké palety analytů ve vzorku jakým je fyziologický vzorek například krev nebo frakce krve, nebo ISF (intersticiální tekutina).

Před dalším popisem vynálezu je nutné upozornit, že vynález není omezený na jednotlivá provedení vynálezu popsaná níže, jelikož je možné provést určité obměny jednotlivých provedení které budou stále ještě v rozsahu připojených patentových nároků. Rovněž je nutné si uvědomit, že použitá terminologie je určená k popisu jednotlivých provedení vynálezu a vynález nijak neomezuje. Rozsah předloženého vynálezu je určený připojenými patentovými nároky.

V tomto popisu a v připojených patentových nárocích se výrazy, použité v jednotném čísle vztahují i na významy v množném čísle pokud ze souvislosti zřetelně nevyplývá jiný význam. Pokud není uvedeno jinak, všechny technické a odborné termíny použité v tomto textu mají význam obecně chápaný pracovníky oboru ke kterému předložený vynález náleží.

Kompozice

Jak je souhrnně popsané výše, předložený vynález poskytuje kompozice vhodné k detekci široké palety různých analytů obsažených ve vzorku. Uvedené kompozice obsahují pozitivně nabitý substrát a na povrchu substrátu obsahují ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl která je obvykle součástí oxidačního systému působícího na analyt a produkujícího signál. Kompozice podle vynálezu jsou obvykle v suché formě a jako takové.jsou obsažené reagenčnich zkušebních proužcích. Zejména vynález poskytuje zkušební proužky pro stanoveni konkrétního analytu v plné krvi nebo v její frakci, např. pro stanoveni glukosy, alkoholu, glykoproteinů atd. V širším významu reagenční zkušební proužky obsahují pozitivně nabitý substrát a oxidační systém působící na analyt a produkující signál, který je obsažený na povrchu substrátu a kde uvedený signální systém obsahuje ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl.

Výše uvedené prvky kompozic podle vynálezu jsou níže dále popsané podrobněji.

Pozitivně nabitý substrát

Pro předložený vynález je charakteristická přítomnost pozitivně nabitého substrátu. Pozitivně nabitým substrátem se rozumí substrát mající jeden nebo více, obvykle velké množství pozitivních nábojů, například vyskytujících se na pozitivně nabitých skupinách nebo částech obsažených na nejméně jednom z povrchů substrátu. Uvedený substrát může být vyrobený z jednoho materiálu nebo to může být kompozice obsahující dva nebo více různé materiály kde uvedené různé materiály mohou být smísené, vrstvené nebo jinak uspořádané s cílem získat požadovaný pozitivně nabitý povrch.

Kromě toho výše uvedený pozitivně nabitý substrát může být substrát buď savý nebo nesavý. Savým materiálem se rozumí materiál který vykazuje preferenční retenci jednoho nebo více složek, která se vyskytuje například u materiálů schopných absorbovat nebo zadržet jednu nebo více složek tak jak je tomu u materiálů používaných v chromatografických separacích. Příklady savých materiálů zahrnují, ale nejsou omezené jen na ně: nezpracovaný papír, nitrocelulosu a podobně, s jejichž použitím dochází ke chromatografické separaci složek obsažených v kapalinách při jejich průchodu uvedenými materiály.

Alternativně je možné použít materiály nesavé. Nesavé pozitivně nabité substráty zahrnují inertní porézní matrice tvořící nosiče různých prvků signálních systémů popsaných výše které mají pozitivní náboj. Uvedené matrice jsou obecně konfigurované tak, aby poskytovaly prostor pro aplikaci fyziologického vzorku např. krve, a detekci chromogenního produktu získaného pomocí barviva obsaženého v signálním systému. Uvedená matrice má tedy takovou strukturu, aby umožňovala průchod vodné tekutiny matricí a aby měla dostatečný volný prostor pro chemické reakce se systémem produkujícím signál které v matrici mají proběhnout. Již bylo vyvinuto více různých pozitivně nabitých porézních matric vhodných pro způsoby stanovení různých analytů, kde uvedené matrice se liší z hlediska použitých materiálů, velikosti pórů, rozměry a podobně, a reprezentativní matrice zahrnují matrice popsané v U.Ξ.patentech č.: 55,932,431; 5,874,099; 5,871,767; 5,869,077; 5,866,322; 5,834,001; 5,800,829; 5,800,828; 5,798,113; 5,670,381; 5,663,054; 5,459, 080; 5,459,078; 5,441,894 a 5,212,061; jejichž popisy jsou včleněné do tohoto textu odkazem. Rozměry a porózity zkušebního proužku se mohou značně lišit v závislosti na matrici, která může mít nebo nemusí mít gradientovou porozitu, například může mít větší póry v blízkosti místa aplikace vzorku nebo přímo v místě aplikace vzorku a menší póry v detekční oblasti. Pozitivně nabité membrány je možné připravit pomocí pozitivně nabitých polymerů jako je polyamid. Alternativně je možné uvedené membrány připravit různými způsoby zahrnujícími potah povrchu pomocí kationtově aktivních povrchově aktivních prostředků nebo polymerů. Potah je možné nanést namáčením, chemickým ošetřením, fotoroubováním, plasmovou polymerací atd. V ještě dalších provedeních je možné membrány připravit smísením jednoho nebo více pozitivně nabitých materiálů s polymerem tvořícím membránu. Příklady pozitivně nabitých polymerů zahrnují polyamid, polyvinylpyridin, polyvinylimidazol, polyallylamin, polyvinylbenzyldimetylammoniumchlorid, polylysin a chitosan. Příklady kationtově aktivních povrchově aktivních prostředků zahrnují prostředky obsahující primární, sekundární a kvartem! aminové skupiny. Výše popsaný materiál může obsahovat funkční skupiny umožňující tvorbu kovalentní nebo nekovalentní vazby s různými prvky signálního systému podrobněji popsanými v tomto popisu.

Ve více provedeních má uvedená matrice formu membránové zkušební vrstvy která je připojená k tuhému nosiči, který může být z plastické hmoty (jako je např. polystyren, nylon nebo polyester), může to být list kovu nebo může být z libovolného vhodného materiálu známého v oboru. Z celé řady provedení významné jsou konfigurace zkušebních proužků popsané v U.S.patentech č. 5,972,294; 5,968,836; 5,968,760; 5,902,731; 5,846,486; 5,843,692; 5,843,691; 5,789,255; 5,780,304; 5,753,452; 5,753,429; 5,736,103; 5,719,034; 5,714,123; 383,550; 381,591; 5,620,863; 5,605,837; 5,563,042; 5,526,120; 5,515,170; 367,109; 5,453,360; 5,426,032; 5,418,142; 5,306,623; 5,304,468; 5,179,005; 5,059,394; 5,049,487;

4,935,346; 4,900,66 a 4,734,360, jejichž popisy jsou včleněné do tohoto popisu odkazem.

Signální systémy

Jak je souhrnně popsané výše, charakteristické pro kompozice podle vynálezu je že obsahuji nejméně jednu ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl, která je obvykle obsažená ve spojeni s jedním'nebo více prvky oxidačního systému působícího na analyt a produkujícího signál. Specifickým rysem kompozic podle vynálezu je přítomnost ve vodě rozpustné tetrazoliové soli schopné přijmout hydrid za tvorby ve vodě rozpustného zbarveného formazanu. Ve vodě rozpustné tetrazoliové soli vhodné k použití podle vynálezu zahrnují soli popsané v EP 0 908 453 jehož popis je včleněný do tohoto textu odkazem. Jedna skupina, pro účely tohoto vynálezu významných ve vodě rozpustných tetrazoliových solí, zahrnuje soli znázorněné vzorc.em (2) na str.2, a popsané na řádcích 35 až 48 výše uvedené EP 0 908 453. Další skupina, pro účely tohoto vynálezu významných ve vodě rozpustných tetrazoliových soli, zahrnuje solí znázorněné vzorcem (1) na str.3, popsané na řádcích 10 až 25 výše uvedené EP 0 908 453.

Specifické ve vodě rozpustné tetrazoliové sloučeniny nebo soli významné pro účely vynálezu zahrnují, ale nejsou omezené jen na ně, následující: 2,2'-dibenzothiazolyl-5,5'-bis [4-di (2-sulfpethyl) karbamoylfenyl] -3,3'- (3,3'-dimethoxy-4, 4'-, -bifenylen)ditetrazolium, disodná sůl (WST-5); 2-benzothiazclyl-3“(4-karboxy-2-methoxyfenyl)-5-[4-(2-sulfoethylkarbamoyl)fenyl]-2H-tetrazolium (WST-4) a podobně; ve více provedeních je výhodné použití WST-5 pro snadnou rozpustnost této sloučeniny ve vodném médiu, které je pro biologické vzorky nej kompatibilnější. Dále, vzniklý formazan vykazuje silnou absorpci světla v červenomodré oblasti, a není tedy nutné provádět korekci na signál pozadí odpovídající hemoglobinu.

Jak je uvedeno výše, ve vodě rozpustná tetrazoliová sůl obvykle tvoří jeden prvek oxidačního systému působícího na analyt za vzniku signálu. Uvedený signální systém znamená soubor dvou nebo více sloučenin nebo molekul, který umožňuje po spojení složek jejich vzájemným působením produkovat detekovatelný signál který je indikativní pro přítomnost a často i pro množství cíleného analytu v daném vzorku. Výraz signální systém je použitý v širším smyslu a zahrnuje jak směs všech složek systému produkujícího signál tak systém, ve kterém jedna nebo více reagenčních složek jsou od zbytku reagenčních složek oddělené jak tomu může být například v případě kitu.

Jak je popsané výše, signální systém poskytovaný kompozicemi podle vynálezu a použitý ve zkušebních proužcích podle vynálezu je oxidační systém působící na analyt a produkující signál. Prostředek oxidující analyt je obvykle enzym schopný převzít z cíleného analytu hydrid a převést tak analyt na oxidovanou formu analytu. Enzymy oxidující analyt zahrnují analyt-oxidasy a analyt-dehydrogenasy. Analyt-oxidasy významné pro použití podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezené jen na ně: glukosaoxidasu (kde analytem je glukosa); cholesteroloxidasu (kde analytem je cholesterol); alkoholoxidasu (kde analytem je alkohol); bilirubinoxidasu (kde analytem je bilirubin); cholinoxidasu (kde analytem je cholin); formaldehyddehydrogenasu (kde analytem je formaldehyd); glutamátoxidasu (kde analytem je kyselina L-glutamová); glyceroloxidasu (kde analytem je glycerol); galaktosaoxidasu (kde analytem je galaktosa);

L-askorbátoxidasu (kde analytem je kyselina askorbová); laktátoxidasu (kde analytem je kyselina mléčná); leucinoxidasu (kde analytem je leucin); malátoxidasu (kde analytem je kyselina jablečná); pyruvátoxidasu (kde analytem je kyselina pyrohroznova); a urátoxidasu (kde analytem je kyselina močová); a podobně.

Analyt-dehydrogenasy významné pro použiti podle vynálezu zahrnuji, ale nejsou omezené jen na ně: alkoholdehydrogenasu pro alkohol; formaldehyddehydrogenasu pro formaldehyd; glukosadehydrogenasu pro glukosu; glukosa-6-fosfátdehydrogenasu pro glukosu-6-fosfát; glutamátdehydrogenasu pro kyselinu glutamovou; glyceroldehydrogenasu pro glycerol; beta-hydroxybutyrátdehydrogenasu pro beta-hydroxybutyrát; hydroxysteroiddehydrogenasu pro steroid; L-laktátdehydrogenasu pro L-laktát; leucindehydrogenasu pro leucin; malátdehydrogenasu pro kyselinu jablečnou; a pyruvátdehydrogenasu pro kyselinu pyrohroznovou.

Ve více provedeních vynálezu signální systémy podle vynálezu rovněž obsahují kofaktor enzymu který je schopný interagovat s oxidačním prostředkem způsobem při kterém cílený analyt se nejprve oxiduje oxidačním prostředkem a současně tento prostředek redukuje kofaktor enzymu. Kofaktory enzymů významné pro předložený vynález zahrnují, ale nejsou omezené jen na ně: tj. beta-níkotinamidadenindinukleotid (beta-NAD); beta-nikotinamidadenindinukleotidfosfát (beta-NADP); thionikotinamidadenindinukleotid; thionikotinamidadenindinukleotidfosfát; nikotinamid-l-N6-ethanoadenindinukleotid; nikotinamid-l-N6-ethanoadenindinukleotidfosfát; a pyrrolochinolonchinon (PQQ). Významné kofaktory enzymů pro použití v signálních systémech podle vynálezu zahrnujují: NADH nebo NAD(P)H.

Kromě prostředku oxidujícího analyt signální systémy podle vynálezu obvykle obsahují prostředek pro přenos elektronů. Prostředkem pro přenos elektronů se rozumí sloučenina nebo molekula umožňující přenos elektronů ve formě hydridového iontu z redukovaného kofaktoru enzymu do ve vodě rozpustného tetrazoliového produktu. Prostředky pro přenos elektronů zahrnují prostředky jak o nízké tak o vysoké molekulové hmotnosti. V tomto popisu nízká molekulová hmotnost znamená molekulovou hmotnost nepřevyšující asi 2000 daltonů, obvykle asi 1000 daltonů a ve více provedeních asi 500 daltonů. Vysoká molekulová hmotnost znamená molekulovou hmotnost nejméně asi 5000 daltonů a ve více provedeních 10 000 nebo 20 000 daltonů nebo vyšší. Většinou molekulová hmotnost prostředku pro přenos elektronů nepřevyšuje asi 100 000 daltonů. Ve více provedeních podle vynálezu je prostředek pro přenos elektronů o nízké molekulové hmotnosti neproteinová sloučenina, zatímco prostředek pro přenos elektronů o vysoké molekulové hmotnosti je proteinová sloučenina. Proteinovou sloučeninou se rozumí polypeptid nebo polymerní proteinmimetická sloučenina.

Pro účely vynálezu je významných více různých nízkomolekulárních neproteinových prostředků pro přenos elektronů. Mezi uvedené prostředky patří: flaviny jako ribolavin (RBF), alloxazin (ALL) a lumichrom (LC); fenaziny jako fenazin, fenazin-methosulfát (PMS), fenazin-ethosulfát,, methoxyfenazin-methosulfát a safranin; methyl-1,4-naftol (menadion), fenothiaziny jako PT a jeho radikálkation, PT⁺, thionin (TH), azur A (AA), azur B (AB), azur C (AC) methylenová modř (MB), methylenová zeleň (TG) a toluidinová modř 0 (TOL); fenoxaziny jako fenoxazin POA), zásaditá modř 3 (BB3) a briliantová kresylová modř ALD (BCBA), benzo-a fenazbxonium-chlorid (Medolova modř); indofenoly jako 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP); a indaminy jako Bindschedlerova zeleň fenylenová modř; a podobné. Z více různých provedení jsou zvláště významná provedení s použitím fenazinových sloučenin např. s použitím PMS, fenazinethosulfátu, methoxyfenázin-methosulfátu a safraninu, kde ve více provedeních je jako nízkomolekulární neproteinový prostředek přenosu elektronů použitý PMS.

Ve více provedeních se použije enzym jako vysokomolekulárni proteinový prostředek přenosu elektronů, jehož vlastností je že oxiduje redukovaný kofaktor např. NAD(P)H a současně redukuje tetrazoliovou sůl kde obě složky jsou obsažené v signálním systému. Ve více provedeních je jako enzymový prostředek přenosu elektronů použitá diaforasa jako je kyselina lipoová-dehydrogenasa, ferredoxin-NADPreduktasa, lipoamiddehýdrogenasa, NADPHdehydrogenasa atd. Je možné použít různé druhy diaforas které jsou obchodně dostupné, kde typické příklady obchodně dostupných diaforas které je možné použít v signálních systémech podle vynálezu zahrnují diaforasy izolované z kultur Bacillus, Clostridium, Vibrio a z prasat a podobně.

Signální systémy popsané výše jsou obecně tvořené kompozicemi podle vynálezu ve formě reagenčních kompozic. Ve více provedeních jsou uvedené reagenční kompozice ve formě suchých kompozic. Uvedené reagenční kompozice zahrnují kompozice, které minimálně obsahují ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl. Ve více provedeních však reagenční kompozice podle vynálezu dále obsahují kofaktor enzymu, enzym oxidující analyt a prostředek přenosu elektronů, kde uvedené složky jsou popsané výše.

Reagenční zkušební proužky

Zvláštní význam mají ve více provedeních vynálezu reagenční zkušební proužky které obsahují výše popsané kompozice a jsou určené pro stanovení přítomnosti nebo koncentrace analytu ve vzorku. Zejména vynález poskytuje suché proužky pro stanovení konkrétního analytu ve vzorku plné krve, například stanovení beta-hydroxybutyrátu, glukosy atd. V nejširším smyslu reagenční proužek podle vynálezu obsahuje pozitivně nabitý tuhý nosič a na něm suchou reagenční kompozici, kde uvedená suchá reagenční kompozice obsahuje všechny reagenční složky nutné v přítomnosti cíleného analytu k tvorbě detekovatelného signálu. Ve více provedeních vynálezu suchá reagenční kompozice obsažená ve zkušebním proužku podle vynálezu obsahuje následující složky: enzym oxidující analyt, kofaktor enzymu, prostředek přenosu elektronů, a ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl, kde každá z uvedených složek je podrobněji popsaná výše.

Ve více provedeních zkušební proužky podle vynálezu obsahují membránovou zkušební vrstvu připojenou k tuhému nosiči. Nosičem může být plastická hmota jako např. polystyren, nylon nebo polyester, nebo list kovu nebo každý jiný vhodný materiál známý v oboru. Reagenční kompozice je se zkušební vrstvou spojená, tj. je na ni nanesená nebo je do ní včleněná atd. Zkušební proužek může být rovněž uspořádaný složitějším způsobem například tak, že zkušební vrstva je obsažená mezi nosičem a povrchovou vrstvou, a jedna nebo více reagenčních složek použitých pro zpracování vzorku může být na uvedené povrchové vrstvě. Kromě toho zkušební proužek může obsahovat vedení nebo kanály pro tok tekutiny jak je v oboru známé. Z více známých provedení zkušebních proužků jsou zvláště významná provedení popsaná v U.S.patentu č.5,902,731, jehož popis je včleněný do tohoto textu odkazem.

Proužky podle vynálezu je možné vyrobit jakýmkoli vhodným způsobem. Jeden vhodný způsob zahrnuje uvedení alespoň části zkušební vrstvy proužku do styku s vodným roztokem obsahujícím všechny součásti reagenčni kompozice kterou má zkušební vrstva konečného reagenčního zkušebního proužku obsahovat. Vhodný způsob provedení zahrnuje ponoření zkušební vrstvy do vodné kompozice na dostatečně dlouhou dobu a následné vysušení čímž dojde ke spojení zkušební vrstvy reagenčního zkušebního proužku s reagenčni kompozicí. Jak je uvedeno výše, vodný roztok obsahuje různé složky reagenčni kompozice určené ke spojení se zkušební vrstvou reagenčního zkušebního proužku, kde jednotlivé složky reagenčni kompozice jsou obsažené v množstvích dostatečných k vytvoření reagenčni kompozice vzniklé na zkušební vrstvě. V případech, kdy prostředek pro přenos elektronů je neproteinový prostředek, je koncentrace prostředku pro přenos elektronů ve vodné kompozici typicky v rozmezí od asi 10 do 50 000, obvykle od asi 50 do 10 000 a ještě běžněji od asi 100 do 5000 pmol/l. V dalším provedení, kde se použije proteinový prostředek pro přenos elektronů, je koncentrace prostředku pro přenos elektronů ve vodné kompozici typicky v rozmezí od asi 10 do 10 000, obvykle od asi 50 do 5 000 a ještě běžněji od asi 100 do 3000 j/ml. Koncentrace tetrazoliové soli ve vodné kompozici je v rozmezí od asi 3 mmol/1 do 36 mmol/1, obvykle od asi 6 mmol/1 do 24 mmol/1. Pokud je přítomný kofaktor enzymu, jeho koncentrace v kompozici je od asi 1,5 mmol/1 do 28 mmol/1, obvykle od asi 3,5 mmol/1 do 14 mmol/1. Podobně koncentrace enzymového oxidačního prostředku analytu je, pokud je přítomný, v rozmezí od asi 100 j. do 2000 j., a obvykle od asi 200 j. do 1000 j. Způsob přípravy reagenčních zkušebních proužků podle vynálezu je podrobněji popsaný v příkladech provedení vynálezu této přihlášky.

Způsoby stanoveni analytu

Výše popsané signální systémy, reagenčni kompozice a zkušební proužky jsou vhodné pro detekci přítomnosti a často množství, tj. koncentrace analytu ve vzorku. Způsoby podle vynálezu je možné detekovat širokou paletu různých analytů zahrnující analyty popsané výše, např. alkohol, formaldehyd, glukosu, kyselinu glutamovou, glycerol, beta-hydroxybutyrát, L-laktát, leucin, kyselinu jablečnou, kyselinu pyrohroznovou, steroidy atd. I když v zásadě je možné způsoby podle vynálezu použít ke stanovení přítomnosti a v mnoha případech i ke stanovení koncentrace analytu v různých fyziologických vzorcích jako je moč, slzy, sliny a podobně, zvláště vhodné jsou způsoby podle vynálezu ke stanovení koncentrace analytu v krvi nebo v krevních frakcích, například ve vzorcích pocházejících z krve a zejména v plné krvi a ISF (intersticiální tekutina).

Ve způsobech podle vynálezu dochází ke spojení signálního systému a vzorku do jedné reakční směsi, která se nechá reagovat dostatečně dlouho ke tvorbě signálu indikujícího přítomnost (a v mnoha případech i množství) analytu ve vzorku, kde vzniklý signál se detekuje a uvede se'do souvislosti s přítomností (a v mnoha případech i množství) analytu ve vzorku. Výše popsané stupně probíhají na reagenčním zkušebním proužku popsaném v tomto popisu.

Charakteristické pro způsoby podle vynálezu je, že výše uvedený detekovatelný signál je ve formě nesmyvatelné skvrny která se vytvoří na povrchu substrátu proužku. Nesmyvatelnou skvrnu tvoří ve vodě rozpustný formazanový produkt, který se pevně naváže na povrch substrátu a není ho možné standardními způsoby promývání z povrchu vymýt. Standardními podmínkami promývacími podmínkami se rozumí podmínky vyzkoušené se substrátem v detekcích analytů, za kterých se z povrchu substrátu odstraňuje nenavázaná složka. Příkladem standardních podmínek vymýváni jsou například podmínky známé pracovníkům v oboru pro použití v hybridizačních stanoveních kyseliny nukleové s pomocí čipů, za kterých se nehybridizované nukleové kyseliny vymývají po hybridizačním stupni z čip. Uvedené podmínky jsou pracovníkům v oboru dobře známé. Pro způsoby podle vynálezu je tedy charakteristická tvorba nesmyvatelné skvrny na povrchu pozitivně nabitého substrátu, kde uvedenou nesmyvatelnou skvrnu tvoří ve vodě rozpustný formazanový produkt.

V praktickém provedení způsobů podle vynálezu první stupeň zahrnuje nanesení určitého množství fyziologického vzorku na zkušební proužek popsaný výše. Množství fyziologického vzorku, například krve, které se na proužek nanese může být různé, ale obecně je v rozmezí od asi 2 μΐ do 40 μΐ, obvykle od asi 5 μΐ do 20 μΐ. Vzhledem k provedení zkušebního proužku podle vynálezu je na tyto proužky nanášet relativně malé vzorky krve, v rozmezí objemů od asi 2 μΐ do 40 μΐ a obvykle od asi 5 μΐ do 20 μΐ. Pokud je uvedený fyziologický vzorek krve, je možné analyzovat krev o široké paletě různých hodnot hematokritu, kde hematokrit může být v rozmezí od asi 20 % do 65 %, obvykle od asi 25 % do 60 %.

Po aplikaci vzorku na zkušební proužek se vzorek nechá reagovat se složkami signálního systému k získání detekovatelného produktu, tj. nesmývatelné skvrny, která vznikne v množství úměrném množství cíleného analytu ve zkoumaném vzorku. Pak se urči množství detekovatelného produktu, tj. signálu poskytnutého signálním systémem ve formě nesmývatelné skvrny a podle velikosti signálu se určí odpovídající množství analytu ve vzorku. V některých provedeních se výše uvedená detekce a stupně pro vyhodnocení množství provedou pomocí automaticky pracujících přístrojů. Výše popsaná reakce, detekce a vyhodnocení, rovněž jako přístroje pro provedeniuvedených stupňů jsou dále popsané v U.S.patentech č.4,734,360; 4,900,666; 4,935,346; 5,059,394; 5,304,468; 5,306,623; 5,418,142; 5,426,032; 5,515,170;

5,526,120; 5,563,042; 5,620,863; 5,753,429; 5,573,452;

5,780,304; 5,789,255; 5,843,691; 5,843,691; 5,846, 486;

5,902,731; 5,968,836 a 5,972,294; jejichž popisy jsou včleněné do tohoto textu odkazem. Ve stupni zahrnujícím vyhodnocení se při stanoveni koncentrace analytu bere v úvahu konstantní příspěvek konkurenčních reakcí k pozorovanému signálu, získaný např. příslušnou kalibrací zařízeni.

Kity

Vynález rovněž poskytuje kity vhodné pro praktické aplikace způsobů podle vynálezu. Kity podle vynálezu obsahují přinejmenším signální systém popsaný výše, kde složky uvedeného systému mohou být spojené a obsažené v jedné reagenční kompozici, nebo uvedené složky mohou být oddělené, např. obsažené v samostatných nádobkách. V některých provedeních je signální systém popsaný výše obsažený v kitech ve formě reagenčního zkušebního proužku popsaného výše. Kity podle, vynálezu mohou dále obsahovat prostředky pro odběr fyziologického vzorku. Jestliže fyziologickým vzorkem je například krev, kity podle vynálezu mohou dále obsahovat prostředky umožňující získat vzorek krve jako je lanceta pro vpich do prstu, prostředky pro ovládání lancety a podobně.

Kromě toho mohou kity podle vynálezu obsahovat kontrolní roztok nebo standard, například kontrolní roztok analytu obsahující standardizovanou koncentraci analytu. V některých provedeních kity podle vynálezu rovněž obsahují automatický přístroj popsaný výše pro detekci množství produktu vytvořeného na proužku po aplikaci vzorku a uvedení . detekovaného produktu do vztahu s množstvím analytu ve vzorku. Kity rovněž obsahují instrukce pro použití složek které kit obsahuje pro stanovení koncentrace analytu ve fyziologickém vzorku. Uvedené instrukce mohou být umístěné na jednom nebo na více obalech, na příbalovém letáku, na lahvičkách obsažených v kitu a podobně.

Níže uvedené příklady slouží pouze k dalšímu znázornění vynálezu a vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Nylonová membrána o tloušťce 0,8 pm firmy Pali Corporation (East Hills, NY) se ponoří do reagenčního činidla podle tabulky 1 na dobu do nasycení membrány. Přebytek reagenčního činidla se šetrně seškrábne skleněnou tyčinkou. Zpracovaná membrána se zavěsí do sušárny a suší se 10 minut při 56 °C. Porex (o tloušťce 0,6 mm) se nechá nasáknout roztokem dusitanu podle tabulky 2, potom se zavěsí do sušárny a suší se 10 hodin při 100 °C. Nakonec se membrána laminuje mezi polyesterový základ (Melenex® o tloušťce 0,4 mm, polyester firmy ICI America, Wilmington, DE) a dusitanem impregnovaný Porex.

Příklad 2

Opakuje se postup popsaný v přikladu 1 s tím rozdílem, že první máčení se provede do reagenčního činidla popsaného v tabulce 3 a máčení popsané jako druhé se neprovede, protože se nepoužije Porex.

Tabulka 1

Reagenčni činidlo pro zkušební vrstvu citlivou na glukosu

složka	množství.
voda	100 ml
(2-[N-morfolino]ethansulfonová kyselina), sodná sůl MES (mol.hmotnost 217,2 Sigma, St.Louis, MO, USA. pH se upraví přídavkem HC1 6 mol/1 na 5-7	2,2 g
Tetonic 1307 (BASF Corporation, Mount Olive, New Jersey, USA)	1-3 g
PSSA, kyselina polystyrensulfonová, sodná sůl (mol.hmotnost 70 000, Polysciences lne., Warrington, PA, USA	2-4 g
krotein (Crota Inc., Parsippany, NJ, USA)	2-4 g
mannitol (mol.hmotnost 182, Sigma, St.Louis, MO, USA)	1-1Q g
fenazin-methosulfát (PMS, mol.hmotnost 306,34, Sigma, St.Louis, MO, USA)	30-300 mg
WST-5 (mol.hmotnost 1331,37, Dojindo Laboratory, Japonsko	0,8-4 g
glukosaoxidasa (GO, TOYOBO)	100-1000 j (KU)

Tabulka 2

Dusitanové činidlo

složka	množství
fosforečnanový tlumivý roztok s chloridem sodným pH 7,4 (P-3813, Sigma, St.Louis, MO, USA)	70 ml
ethanol	30 ml
dusitan sodný (mol.hmotnost 69, Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI, USA)	5 g
polyvinylpyrrolidin (mol.hmotnost.40 000, Sigma, St.Louis, MO, USA)	200 mg

Tabulka 3

Reagenčni činidlo pro zkušební vrstvu citlivou na glukosu

složka	množství
voda	1.00 ml
voda	100 ml
(2-[N-morfolino]ethansulfonová kyselina), sodná sůl MES (mol.hmotnost 217,2 Sigma, St.Louis, MO, USA.	2,2 g
póly(methylvinylether-alt-maleinanhydrid)* 6%	20 ml
úprava pH na 5,5-7 přídavkem 50% NaOH
Triton X-305 (BASF Corporation, Moun Olive, New Jersey, USA)	0,5-2 g
mannitol (mol.hmotnost 182, Sigma, St.Louis, MO, USA)	1-10 g
dusitan sodný (mol.hmotnost 69, Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI, USA)	1-5 g

Tabulka 3 (pokračování)

složka	množství
WST-5 (mol.hmotnost 1331,37 Doijindo Laboratory, Japonsko	0,8-4 g
Chlorid horečnatý (mol.hmotnost 203, Sigma, St.Louis, MO, USA)	3.-5 g
fenazin-ethosulfát (PES, mol.hmotnost 334,4, Sigma, St.Louis, MO, USA)	100-1000 mg
glukosaoxidasa (GO, TOYOBO)	100-1000 j. (KU)

*/ Poly(methylvinylether-alt-maleinanhydrid), mol.hmotnost 1 080 000, kat.č. 41632-0, Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI,USA. Do vody se odváží 6 % (hmotn./obj.) póly(methylvinylether-alt^maleinanhydridu) a suspenze se zahřívá 45 minut při 95 °C. Po ochlazení na teplotu místnosti je vzniklý roztok připravený k použití.

K hodnocení na nenabitých a na pozitivně nabitých membránách bylo hodnoceno několik různých standardů glukosy. Lineární signály byly získané v rozmezí koncentrací glukosy od 50 do 450 mg/dl. Na obr.l jsou znázorněné výsledky získané ponořením různých membrán do stejného potahového roztoku. Jednou membránou byla pozitivně nabitá nylonová membrána a druhou membránou byla polysulfonová membrána nenabitá pozitivním nábojem. Potažené membrány byly hodnocené s použitím roztoku glukosy o koncentraci 400 mg/dl.

Výše popsané zkušební proužky zahrnující proužky odlišující se použitím pozitivně nabité nylonové membrány a proužky obsahující pozitivním nábojem nenabité (nenabité) polysulfonové membrány byly zkoušené níže uvedeným postupem s použitím 10 μΐ vodného roztoku obsahujícího 400 mg/dl glukosy. Na čerstvě připravený zkušební proužek se vnese 10 μΐ výše uvedeného vodného roztoku. Proužek se pak vloží do reflektometru a začnou se zaznamenávat hodnoty reflektance. Reflektance vyhodnocovaného proužku se sleduje při 615 nm v jednosekundových intervalech po čtyřicetpět sekund. Pak se získaná data převedou z paměti reflektometru sériově připojeným pro tento účel přizpůsobeným kabelem do osobního počítače. Reakční profil se znázorní grafem K/S proti času v sekundách.

(K/S znamená způsob měření reflektance popsaný a definovaný v U.S. patentu č.4,935,346, sloupec 14, jehož popis je včleněný do tohoto textu odkazem).

Z výše uvedených výsledků a z připojeného popisu je zjevné, že předložený vynález poskytuje zlepšení ve srovnání s dosud užívanými typy reagenčních zkušebních proužků. Použití ve vodě rozpustné tetrazoliové soli ve spojení s pozitivně nabitým substrátem podle vynálezu si zachovává všechny výhodné vlastnosti tetrazoliových sloučenin a současně umožňuje poskytnout nesmývatelný reportérový signál zprostředkovaný ve vodě rozpustným formazanovým produktem. Předložený vynález tedy představuje významný příspěvek oboru.

Všechny publikace a patenty citované v tomto popisu jsou včleněné do tohoto popisu odkazem stejným způsobem, jako kdyby u každé jednotlivé publikace nebo patentu bylo specificky a jednotlivě uvedeno včlenění do textu odkazem. Citace každé publikace je z hlediska jejích význaků před datem podání této přihlášky a není na místě námitka, že nelze předjímat uvedenou publikaci následkem dřívějšího vynálezu.

I když předložený vynález je pro jasnější porozumění vynálezu podrobněji popsaný pomocí výkresů a příkladů, pracovníkům zkušeným v oboru bude po prostudování vynálezu zřejmé, že je možné provést určité změny a modifikace aniž by došlo k odchýlení od myšlenky vynálezu nebo od rozsahu připojených patentových nároků.

Claims

1. Kompozice vyznačující se tím, že obsahuje:

pozitivně nabitý substrát; a nejméně jednu ve vodě rozpustnou sůl na nejméně jednom povrchu uvedeného pozitivně nabitého substrátu.

2. Kompozice podle nároku lvyznačujicí se tím, že uvedený pozitivně nabitý substrát je savý substrát.

3. Kompozice podle nároku lvyznačujicí se tím, že uvedený pozitivně nabitý substrát je nesavý substrát.

4. Kompozice podle nároku lvyznačujicí se tím, že uvedená ve vodě rozpustná sůl tvoří součást analytoxiduj icího signálního systému.

5. Kompozice podle nároku 4vyznačující se tím, že uvedený analyt-oxidující signální systém obsahuje analyt-oxidasu.

6. Kompozice podle nároku 4vyznačujicí se tím, že uvedený analyt-oxidující signální systém obsahuje analyt-dehydrogenasu.

7. Kompozice podle nároku 4vyznačující se tím, že uvedený analyt-oxidující signální systém dále obsahuje prostředek přenosu elektronů.

8. Kompozice podle nároku 4vyznačující se tím, že uvedený analyt-oxidující signální systém dále obsahuje kofaktor enzymu.

9. Kompozice podle nároku 4vyznačující se tím, že uvedený analyt-oxidující signální systém je ve formě reagenční kompozice.

10. Reagenční zkušební proužek vyznačující se tím, že obsahuje:

pozitivně nabitý substrát; a analyt-oxidující signální systém obsažený na uvedeném pozitivně nabitém substrátu, kde uvedený analyt-oxidující signální systém obsahuje ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl.

11. Zkušební proužek podle nároku lOv.yznačuj ící se t i m , že uvedený pozitivně nabitý substrát je savý.

12. Zkušební proužek podle nároku 10 vyznačuj ící se t í m , že uvedený pozitivně nabitý substrát je nesavý.

13. Zkušební proužek podle nároku 10 vyznačuj ící se t i m , že uvedená ve vodě rozpustná tetrazoliová sůl přijímá hydrid za tvorby ve vodě rozpustného formazanového produktu.

14. Zkušební proužek podle nároku 10 vyznačující se t i m , že uvedený analyt-oxidující signální systém obsahuje analyt-oxidasu.

15. Zkušební proužek podle nároku 14 vyznačující se t i m , že uvedený analyt-oxidující signální systém dále obsahuje prostředek přenosu elektronů.

16. Zkušební proužek podle nároku 14 vyznačuj ící se t i m , že uvedený analyt-oxidující signální systém dále obsahuje kofaktor enzymu.

17. Zkušební proužek podle nároku 10 vyznačuj ící se t i m , že analyt-oxidující signální systém je signální systém oxidující glukosu.

18. Systém pro detekci nebo pro stanovení analytu vyznačující se tím, že obsahuje:

a) reagenční zkušební proužek obsahující;

i) pozitivně nabitý substrát; a ii) analyt-oxidující signální systém obsažený na uvedeném substrátu, kde uvedený signální systém obsahuje ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl schopnou přijmout hydrid za tvorby ve vodě rozpustného formazanu; a

b) automaticky pracující přistroj.

19. Způsob stanovení přítomnosti nebo stanovení koncentrace analytu ve vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) vnesení uvedeného fyziologického vzorku na reagenční zkušební proužek obsahující:

i) pozitivně nabitý substrát; a ii) analyt-oxidující signální systém obsažený na uvedeném substrátu, kde uvedený signální systém obsahuje ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl schopnou vytvořit ve vodě rozpustný formazanový produkt, kde uvedený formazanový produkt vytvoří na uvedeném substrátu nesmývatelnou skvrnu;

b) detekci uvedené nesmývatelné skvrny; a

c) vyhodnocení uvedené detekované nesmývatelné skvrny ve vztahu s přítomností nebo koncentrací analytu obsaženého ve vzorku.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačuj ící se tím, že uvedený signální systém dále obsahuje analyt-oxidasu.

21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedený signální systém dále obsahuje nejméně jeden prostředek přenosu elektronů.

22. Způsob podle nároku-19 vyznačující se tím, že uvedený vzorek je plná krev nebo krevní derivát.

23. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že stupně zahrnující detekci a vyhodnocení se provedou s použitím automaticky pracujícího přístroje.

24. Kit pro stanovení koncentrace analytu ve fyziologickém vzorku vyznačující se tím, že obsahuje:

a) reagenční zkušební proužek obsahující:

i) pozitivně nabitý substrát; a ii) analyt-oxidující signální systém obsažený na uvedeném substrátu, kde uvedený signální systém obsahuje ve vodě rozpustnou tetrazoliovou sůl schopnou vytvořit ve vodě rozpustný formazanový produkt; a

b) nejméně jeden prostředek ze skupiny zahrnující:

i) prostředky pro odběr fyziologického vzorku a ii) standard analytu.

25. Kit podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedeným prostředkem pro odběr fyziologického vzorku je lanceta.

26. Kit podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedený standard analytu zahrnuje standardní koncentraci známého činidla.

27. Kit podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedený kit obsahuje prostředky pro odběr fyziologického vzorku a standard analytu.