CH639491A5

CH639491A5 - Mit reagenzien beschichteter formkoerper zur ausfuehrung kolorimetrischer oder photometrischer bestimmungen.

Info

Publication number: CH639491A5
Application number: CH415679A
Authority: CH
Inventors: Wolfgang Fischer
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1978-05-05
Filing date: 1979-05-03
Publication date: 1983-11-15
Also published as: IT7948924A0; SE7903917L; BE876029A; BR7902629A; DE2819645A1; FR2425072A1; JPS54147095A; GB2020425B; GB2020425A; IT1116814B; US4275031A; NL7903541A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen mit Reagenzien beschichteten Formkörper aus nicht saugfähigem, wasserunlöslichem Material und auf die Verwendung des Formkörpers nach Patentanspruch 1 zur kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmung einer in wässriger Lösung vorliegenden Substanz. In der analytischen Chemie und besonders in der medizinischen Labordiagnostik wird häufig von kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmungen Gebrauch gemacht. Das gilt insbesondere für Reihenuntersuchungen, bei denen es auf eine praktische und schnelle Handhabung auch durch ungeschultes Personal und auf eine schnelle Auswertung ankommt.

Es hat nicht an Versuchen gefehlt, diese Methodik, der ja teilweise komplizierte chemische Reaktionen zugrundeliegen, zu vereinfachen. So sind Einweg-Tests und insbesondere auch Einweg-Messküvetten entwickelt worden. Einweg-Küvetten enthalten alle notwendigen Reagenzien, Enzyme z.B. in gefriergetrockneter Form. Es muss nur noch die Testlösung (z.B. eine Körperflüssigkeit wie Serum oder Harn) zugefügt und anschliessend die kolorimetrische oder photometrische Messung vorgenommen werden.

Indessen zeigen auch die Einweg-Küvetten noch erhebliche Nachteile. So ergibt sich z.B. oft die Schwierigkeit, einen dichten Verschluss herzustellen, was sich besonders bei empfindlichen Reagenzien unangenehm bemerkbar macht. Ausserdem ist die Herstellung der Einweg-Küvetten teuer.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die praktische Durchführung kolorimetrischer und photometrischer Methoden weiter zu vereinfachen und dabei die Nachteile vorbekannter Ausführungsformen, insbesondere die angegebenen Nachteile der Einweg-Küvetten zu vermeiden. Diese Aufgabe wurde durch die Bereitstellung des erfindungs-gemässen Formkörpers gelöst.

Es wurde gefunden, dass Reagenzien für kolorimetrische oder photometrische Bestimmungen mit Vorteil auf Träger in Gestalt von Formkörpern aufgetragen werden können, die aus nicht saugfähigem, wasser-unlöslichem Material bestehen. Dabei werden die Reagenzien auf dem Träger in feste oder wachsartige organische Polymere eingebettet, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden.

Durch die Einbettung sind die Reagenzien vor Einwirkungen der Atmosphäre und vor Feuchtigkeit geschützt und zeigen eine bessère Haltbarkeit als in gefriergetrockneter Form. Für die Ausführung kolorimetrischer oder photometrischer Bestimmungen taucht man beispielsweise den erfindungsge-mässen Formkörper in die zu untersuchende wässrige Lösung, wobei das Polymer aufgelöst wird und die Reagenzien in Freiheit gesetzt und zur Reaktion gebracht werden. Dabei kann sich die zu untersuchende Lösung in einem besonderen Reak-tionsgefäss befinden, in dem die Umsetzung mit dem Reagenz stattfindet: aus dem Reaktionsgelass kann ein aliquoter Teil des Gemisches in das Messgefäss (z.B. eine Küvette) übergeführt werden, das der eigentlichen Messung dient. Man kann aber auch die zu untersuchende Lösung in dem Messgefäss vorlegen, den beschichteten Formkörper eintauchen und nach dem Ende der Reaktion die Messung in dem gleichen Gefäss ausführen.

Falls ungelöste Stoffe untersucht werden sollen (z.B. in der Histologie), kann die durch Ablösen der Reagenzien entstandene Mischung auf den Stoff aufgetropft oder (nach dem Anfeuchten des zu untersuchenden Schnitts) eine Reagenzfolie aufgelegt werden. Das Lösungsmittel löst dann die Reagenzien auf und führt sie den nachzuweisenden Substanzen zu. Nach Abwarten der Reaktion werden diese durch eine Verfärbung deutlich erkennbar. Die Intensität der Färbung ist von der Menge bzw. der Aktivität der Substanzen abhängig. Die Auswertung erfolgt hierbei im allgemeinen unter dem Mikroskop.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung des beschriebenen Formkörpers zur kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmung einer in wässriger Lösung vorliegenden Substanz.

Der Ausdruck «optisch klare Lösung» bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Lösungen der verwendeten Polymere im Messungsbereich keinen störenden Einfluss auf die optischen Eigenschaften der zu messenden Lösung (z.B. keine Eigenabsorption) zeigen.

Art und Grösse der Formkörper können beliebig sein. Bevorzugt verwendet man Folien oder Stäbe; grundsätzlich sind alle beliebigen Formkörper brauchbar, sofern sie für den vorgesehenen Verwendungszweck geeignet sind. So können z.B. Röhrchen, Platten, Kugeln, Schläuche und schliesslich die Küvetten selbst als Formkörper verwendet werden. Von den Stäben sind solche mit rundem, quadratischem oder rechteckigem Querschnitt bevorzugt, das sie sich am leichtesten beschichten, verpacken und auch verwenden lassen.

Die Grösse der Formkörper wird zweckmässigerweise auf den jeweiligen Verwendungszweck, z.B. auf Form und Grösse der bei der Bestimmung verwendeten Küvetten abgestimmt.

Bei Verwendung von Küvetten der Grösse 10 x 10 x 50 mm werden z.B. zweckmässig Folienstücke oder Stäbe der Grösse 9 x 80 x 0,2 mm eingesetzt. Andererseits eignen sich für den gleichen Zweck z.B. auch Rundstäbe von etwa 75 mm Länge und 3 mm Durchmesser. Bei grösseren Küvetten oder Reakti-onsgefässen sind die Ausmasse der Formkörper entsprechend grösser, bei kleineren entsprechend kleiner. Bei diesen Abmessungen können die Folien bzw. Stäbe nach dem Ablösen der Reagenzbeschichtung auch zum Durchmischen der Reaktionslösung benutzt werden, z.B. durch Rühren oder durch Auf-und Abbewegen.

Das Material, aus dem die Formkörper bestehen, muss zweckmässig so beschaffen sein, dass keine Reagenzien darin absorbiert bzw. daran festgehalten werden. Es kommen daher z.B. saugfähige Träger, wie sie üblicherweise für Reagenzpapiere oder Reagenzstäbchen verwendet werden, nicht in Betracht. Ferner muss das Material wasserunlöslich sein,

damit es sauber wieder aus der Lösung entfernt werden kann. Im übrigen ist jedoch die Auswahl des Materials für die Fremdkörper nicht kritisch. Beispielsweise eignen sich wasserunlösliche Kunststoffe, z.B. Polymere und Polykondensate, wie Polyvinylchlorid (PVC), Polyester (z.B. Polyäthylente-rephthalat), Polyamide, Polycarbonate, Polystyrol, Polyurethane, Polyalkylene, wie Polyäthylen oder Polypropylen; andere hochmolekulare organische Stoffe, wie Cellulos-acetat; ferner Metalle, wie Stahl, Nickel oder Aluminium; Glas, Porzellan oder andere keramische Materialien.

Die Dicke der verwendeten Folien ist nicht kritisch; aus praktischen Gründen liegt sie zweckmässig zwischen 0,1 und 1 mm.

Die Beschichtung der Formkörper kann z.B. durch Bestreichen, Tauchen, Sprühen oder Drucken und anschliessendes Trocknen erfolgen.

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Als organische Polymere für die BeSchichtung, die mit Wasser eine optisch klare Lösung bilden, eignen sich bevorzugt feste oder wachsartige Polyvinylpyrrolidone (PVP), Poly-vinylalkohole, Polyäthylenglykole und oder Polyäthyleni-mine. ferner optisch klar wasserlösliche Copolymerisate, z.B. Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymerisate. Diese Polymere besitzen vorzugsweise Molekulargewichte zwischen 1000 und I 000000. Bevorzugt ist z.B. PVP mit einem Molekulargewicht zwischen 10000 und 1 000000 und einem K-Wert (in l""iger wässriger Lösung, mit Ubbelohde-Viskosimeter bestimmt) zwischen 20 und 100. Gut verwendbar sind weiterhin z.B. Polyvi-nylalkohole mit einem Molekulargewicht zwischen 10000 und 200000 und einer Viskosität zwischen 3 und 50 mPa-s (in 4'Viger wässriger Lösung bei 20 C). Von den Polyäthylengly-kolen sind solche mit Molekulargewichten zwischen 1000 und 1000000 gut geeignet; so ist z.B. handelsübliches Polyäthylen-glvkol mit einem mittleren Molekulargewicht von 3800-4800 ( Erstarrungspunkt 53-58 C ; nD25 1,455 ; Viskosität bei 25: 90-120 mPa-s verwendbar. Ein bevorzugtes handelsübliches Polyäthylenimin zeigt z.B. eine Dichte d> von etwa 1,07, eine Viskosität von 10000-20000 mPa-s nach Brookfield; bei 20 C und 20 min und einen pH-Wert von etwa 12. Von den Vinyl-pyrrolidon/Vinylacetat-Copolymerisaten sind z.B. solche geeignet. bei denen der Anteil an Vinylpyrrolidon 20-99 Molprozent, der Anteil an Vinylacetat dementsprechend 80-1 Molprozent beträgt; diese Polymerisate besitzen z.B. K-Werte zwischen 15 und 40, insbesondere zwischen 19 und 34.

Der erfindungsgemässe Formkörper kann auf vielen Gebieten eingesetzt werden, z.B. in der Metall- und Erzanalyse (vgl. z.B. O.G. Koch und G.A. Koch-Dedic, «Handbuch der Spurenanalyse», Springer-Verlag, Heidelberg, 1974), bei Trink-, Brauch- und Abwasseruntersuchungen (vgl. z.B.

GdCh, «Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser-und Schlamm-Untersuchung», Verlag Chemie, Weinheim, 1975), in der Lebensmittelanalytik und Hygieneüberwachung (vgl. z.B. J. Schormüller, «Handbuch der Lebensmittelchemie», Springer-Verlag, Heidelberg), in der chemischen Analyse in anderen Bereichen, in der medizinischen Diagnostik (vgl. z.B. H. H. Bergmeyer, «Methoden der enzymatischen Analyse», Verlag Chemie, Weinheim 1974), in der Histo- oder Cytochemie (vgl. z.B. Chayen, Bitensky, Butcher, «Histoche-mie», Verlag Chemie, Weinheim, 1975).

Im einzelnen können z.B. erfindungsgemäss bestimmt werden; anorganische Substanzen, Kationen und Anionen, wie Aluminium (mit Alizarinsulfonsäure, Aurintricarbonsäure, Chromazurol S, Eriochromcyanin oder 8-Hydroxychinolin), Antimon [mit Rhodamin B oder Silberdiäthyldithiocarbaminat (Silber-DDC)], Arsen (mit Silber-DDC), Beryllium (mit Aurintricarbonsäure, Chromazurol S oder Eriochromcyanin), Blei (mit Dithizon oder Natrium-DDC), Bor (mit 1,1'-Dianthri-mid), Cadmium (mit Dithizon), Calcium (mit Murexid), Cer (mit 8-Hydroxychinolin), Chlor (mit N,N-Diäthyl-p-phenylen-diammoniumsulfat), Chrom (mit Diphenylcarbazid), Eisen (mit Bathophenanthrolin, Bathophenanthrolindisulfonsäure, Dimethylglyoxim, 2,2'-Bipyridin, Nitroso-R-Salz, 1,10-Phe-nanthroliniumchlorid, Sulfosalicylsäure oder Thioglvkol-säure). Gold (mit Pyoktanin, Rhodamin B oder o-Tolidin), Indium (mit Dithizon), Jod (mit o-Tolidin), Kobalt (mit 1-Nitroso-2-naphthol, 2-Nitroso-l-napthtol, Nitroso-R-Salz oder Rubeanwasserstoff), Kupfer (mit 2,2'-Bichinolin, Neocu-proin, Bathocuproin, Blei-DDC, Diäthylammonium-DDC. Natrium-DDC, Oxalyldihydrazid, Oxalsäure-bis (cyclohexyli-denhydrazid) oder Rubeanwasserstoff), Magnesium (mit Eriochromschwarz T), Mangan (mit Formaldoxim oder Natrium-DDC), Molybdän (mit Phenylfluoron oder Toluol-3,4-dithiol), Nickel (mit Dimethylglyoxim oder Rubeanwasserstoff), Niob [mit 4-(2-Pyridyl-azo)-resorcin], Nitrat [mit N-( I-Naphthyl)-äthylendiammoniumdichlorid], Nitrit (mit Sulfa-

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nilsäure und 1-Naphthylamin oder mit anderen Azofarbstoff-Komponenten), Osmium (mit Diphenylcarbazid), Palladium (mit Bismuthiol I, Nitroso-R-Salz oder 2-Nitroso-l-naphthol), Platin (mit Dithizon), Quecksilber (mit Dithizon), Rhodium [mit l-(2-Pyridyl-azo)-2-naphthol], Scandium (mit Alizarinsulfonsäure). Selen (mit 3.3'-Diaminobenzidiniumtetrachlorid), Sulfat (mit N,N-Dimethyl-p-phenylendiammoniumdichlorid), Sulfid (mit N,N-Dimethyl-p-phenyIendiammoniumdichlorid). Thallium (mit Brillantgrün, Kristallviolett oder Rhodamin B), Titan (mit Brenzcatechin-3,5-disulfonsäure oder Chromotrop-säure), Uran [mit Glvoxal-bis(2-hydroxyanil) oder 1 -(2-Pyridy-lazo)-2-naphthoI], Vanadium (mit Variaminblau, Natrium-DDC oder N-Benzoyl-N-phenylhydroxylamin), Wismut (mit Bismuthiol I, Xylenolorange oder Dithizon), Zink [mit Dithizon, l-(2-Pyridyl-azo)-2-naphthol oderZincon], Zinn (mit Phenylfluoron), Zirkon (mit Phenylfluoron oder Xylenolorange).

Weiterhin können erfindungsgemäss wichtige diagnostische und biochemische Bestimmungen vorgenommen werden, z.B. die folgenden: Alkalische Phosphatase (mit p-Nitrophe-nylphosphat), a-Amylase (mit Amylose/Jod), anorganisches Phosphat (mit Molybdat/Reduktionsmittel), Ascorbinsäure (mit 2,6-Dichlorphenolindophenol), Bilirubin (mit diazotier-ter Sulfanilsäure), Blutzucker (mit Glucoseoxidase/Peroxida-se/4-Aminoantipyrin), Cholesterin (mit Cholesterin-Oxidase/ Jodid), Cholinesterase (mit 5-Butvlthiocholinjodid/5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure), Creatin-Kinase (CK; mit Crea-tinphosphat/ADP/Glucose/Hexokinase/ NADP/Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase), Creatin-Kinase-Isoenzym MB (CK-MB; wie Creatin-Kinase, aber unter Zusatz hemmender Antikörper), Creatinin (mit Pikrinsäure), Eisenbindungskapazität (EBK; Bestimmung des nicht gebundenen Eisens mit sul-foniertem Bathophenanthrolin). Gesamteiweiss (mit Kupfersulfat), Glutamat-Dehydrogenase (GLDH; mit 2-Ketoglutarat/NADH /ADP), Glutamat-Oxalacetat-Trans-aminase (GOT; mit 2-Ketoglutarat/Aspartat/NADH/LDH/ MDH), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT; mit 2-Keto-glutarat/L-Alanin/Lactat-Dehydrogenase/NADH), y-Gluta-myl-Transferase (y-GT; mit L-y-Glutamyl-3-carboxy-4-nitro-anilid/Glycylglycin), Hämoglobin (mit KCN/K.i[Fe(CN)6.]), Harnsäure (mit Uricase/Katalase/Kupfersulfat/Bathocupr-eindisulfonsäure), Harnstoff (mit Urease/Phenol/NaOCl oder mit Diacetylmonoxim/Thiosemicarbazid), 2-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase (HBDH: mit 2-Oxobutyrat/NADH), Lactat-Dehydrogenase (LDH; mit Pyruvat/NADH), Leucin-Arylami-dase (mit L-Leucin-4-nitroanilid), Magnesium (mit Xylindyl-blau), saure Phosphatase (mit p-Nitrophenylphosphat), Triglyceride (mit Lipase/Esterase/Glycerokinase/Pyruvatkinase/ LDH/NADH/Phosphoenolpyruvat/ATP).

In der Histo- oder Cytochemie lassen sich folgende Nachweise erfindungsgemäss durchführen: Nucleinsäuren (Feul-gen-Reaktion), Polysaccharide (PAS-Methode), C'ytochromo-xydase (Nadi-Reaktion), Peroxydase (Benzidin/H:0:), Phosphatase (Naphthylphosphat/Diazoniumsalz), Esterase (Indo-xylacetat-Methode oder Naphthylacetat/Diazoniumsalz), Suc-cinat-Dehydrogenase (Succinat/Tetrazoliumsalz), Glutamat-Dehydrogenase (Glutamat/Tetrazoliumsalz), Lactat-Dehydrogenase ( Lactat/Tetrazoliumsalz).

Die im erfindungsgemässen Formkörper verwendbaren Reagenzien dürfen natürlich weder mit dem Trägermaterial noch mit dem organischen Polymer reagieren, unterliegen aber sonst keinen Beschränkungen. Bei den in Frage kommenden Reagenzien handelt es sich in der Regel um Substanzen, die im sichtbaren oder im ultravioletten Bereich charakteristische Absorptionsmaxima zeigen, oder um Vorprodukte zur Bildung solcher Substanzen. Weiterhin können als Reagenzien die verschiedensten Hilfsstoffe verwendet werden, z.B. Enzyme, Oxydations- oder Reduktionsmittel, Säuren, Basen oder Salze, die z.B. als Puffer eingesetzt werden können.

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Als Lösungsmittel für die Herstellung der Einbettungen auf dem Träger (z.B. auf der Folie) eignen sich z.B. Wasser sowie organische Lösungsmittel, die jedoch das Formkörpermaterial nicht lösen dürfen, z.B. Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol; Ketone, wie Aceton; Amide, wie s Dimethylformamid; Sulfoxide, wie Dimethylsulfoxid oder andere aprotische Lösungsmittel; die letztgenannten werden in der Regel beim Trocknen nicht vollständig entfernt, sondern in der Einbettung mindestens teilweise erhalten und können bei dem Ablösen der Einbettung eine Lösungsvermittler- io Funktion ausüben.

Das Mengen-(Gewichts-)Verhältnis von Reagenzien zu Polymer kann sich in weiten Grenzen bewegen und ist nicht kritisch. Im allgemeinen liegt es zwischen 10:1 und 0,1:1.

Miteinander nicht verträgliche Reagenzien können auf 15 getrennten Formkörpern nacheinander eingesetzt werden,

aber auch auf einem Formkörper nebeneinander (räumlich getrennt) aufgetragen werden.

Die Küvetten können als «Einmal-Artikel» ausgebildet sein. So kann z.B. zu jedem Test eine Küvette und eine Folie 20 (oder ein Stab) gehören, wobei Form und Grösse der Folie (oder des Stabes) der Küvette angepasst sind. Nach Durchführung des Tests kann das Besteck weggeworfen werden.

Die beschriebenen Formkörper (insbesondere Folien) können auch in Analysenautomaten eingesetzt werden. 25

Es kann zweckmässig sein, im oberen Teil des Formkörpers die Codierung (z.B. Art der Messung, Messwellenlänge, Reaktionstemperatur und -zeit) Platz finden zu lassen.

In Fig. 1-3 der Zeichnungen sind beispielsweise besondere Ausführungsformen des erfindungsgemässen Formkörpers 30 dargestellt. In der Ausführungsform gemäss Fig. 1 ist die Rea-genz/Polymer-Lösung strichförmig auf die Folie (1) aufgetragen und anschliessend eine zweite Folie (2) über die Reagenzzone so aufgesiegelt (geklebt oder geschweisst), dass zwischen beiden Folien über der Reagenzzone (3) ein Hohlraum (4) 35 definierter Dicke verbleibt, der an zwei Seiten offen ist. Beim Eintauchen in die zu untersuchende Lösung füllt diese den Hohlraum aus und löst die Reagenzien heraus. Die jetzt entstehende Farbreaktion kann kolorimetrisch oder photometrisch ausgewertet werden. So wird die für die Messung zu to benutzende «Küvette» auf der Folie selbst gebildet und damit zu einem Bestandteil der Folie («Küvetten-Folie»), «Reagenzfolie» und «Küvette» bilden so eine Einheit. Der Hohlraum hat vorzugsweise rechteckigen Querschnitt, wobei in ihm der Abstand zwischen den beiden Folien 0,1 bis 10, bevorzugt 1-3 45 mm, beträgt.

Mehrere Reagenzzonen (3) mit aufgeschweissten Folien (2) können übereinander auf der «Grundfolie» ( 1 ) angeordnet sein, wobei eine Reagenzfolie zur Mehrfachanalyse (gleichzeitigen Bestimmung verschiedener Bestandteile) ausgebildet w wird (vgl. Fig. 2).

Für eine gleichmässige Verteilung der Reagenzien kann es manchmal günstig sein (vgl. Fig. 3), den Hohlraum (4) durch das Versiegeln zweier verformter Folien (1 ) und (2) zu bilden, nachdem jeweils vorher die Reagenzlösung(en) in den Vertie- 55 fungen der beiden Folien zur Trockne gebracht wurden.

Das in den nachstehenden Beispielen verwendete PVP ist ein Handelspräparat («Luviskol» K 90) mit einem Molgewicht von etwa 700000 und einem K-Wert vom 92 + 4.

Die nachstehenden prozentualen Konzentrationsangaben t>o sind gewichtsmässig.

Beispiel 1 : Reagenzfolie zur Bestimmung von Glucose

Man bereitet eine Lösung, die sich aus folgenden 4 Einzellösungen zusammensetzt: 65

1. In 240 ml Wasser werden 100 g Polyäthylenimin («Poly-min» P) gelöst. Durch Zugabe von 32 "oiger Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 5,3 eingestellt (Verbrauch: etwa 65ml).

2.In 400 ml Wasser werden 14,4 g Glucoseoxidase (12 U/mg) und 0,4 g Peroxidase (60 U/mg) gelöst.

3. In 400 ml Äthanol werden 4,8 g Tetramethylbenzidin und 34 g PVP gelöst.

4, In 100 ml Wasser werden 0,2 g Ascorbinsäure gelöst.

Diese Lösung wird mit Hilfe eines Schwammes gleichmäs-

sig auf eine 7 cm hohe und 0,2 mm dicke durchsichtige PVC-Folie aufgestrichen, so dass am unteren Ende der Folie eine 10 mm hohe beschichtete Zone entsteht. Nach dem Trocknen bei 60-80 °C (10 Minuten) wird die Folie in 9 mm breite Streifen zerschnitten.

Zur Analyse wird ein solcher Streifen, der sich am oberen Ende anfassen lässt, mit der Reagenzzone in die Küvette gestellt, die bis zu einer Markierung mit der zu untersuchenden Flüssigkeit gefüllt ist. Zur Beschleunigung des Lösevorgangs wird die Ifolie mehrmals hin- und herbewegt. Nach einer Wartezeit von 10 Minuten wird die kolorimetrische Bestimmung wie üblich bei 640 nm vorgenommen.

Beispiel 2: Reagenzfolie zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid

Eine durchsichtige PVC-Folie (7 cm hoch, 0,2 mm dick) wird mit einem Gemisch folgender 4 Einzellösungen beschichtet:

1. In 56 ml Wasser werden 30 g Polyäthylenimin («Poly-min» P) gelöst. Durch Zugabe von 32"/oiger Salzsäure wird der pH-Wert der Lösung auf 5,5 eingestellt (Verbrauch: etwa 19 ml).

2In 120 ml Äthanol werden 1,2 g Tetramethylbenzidin und 12 g PVP gelöst.

3. In 35 ml Wasser werden 3,5 mg Peroxydase (100 U/mg) gelöst.

4.In 10 ml Wasser werden 10 mg Ascorbinsäure gelöst.

Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung bei 640 nm).

Beispiel 3: Reagenzfolie zur Bestimmung von Ascorbinsäure

Es werden die folgenden beiden Reagenzlösungen hergestellt und übereinander (räumlich getrennt) auf die Folie (durchsichtiges PVC, Höhe: 7 cm; Dicke : 0,2 mm) in je 15 mm breiten Streifen mit 5 mm Zwischenraum aufgesprüht.

1. In 100 ml Äthanol werden 10 g Malonsäure und 5 g Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymerisat («Luviskol» -VA 73 E; Verhältnis Vinylpyrrolidon: Vinylacetat 70:30; K-Wert 34 ± 4) gelöst.

2. In 100 ml Äthanol werden 1,5 g 2,6-Dichlorphenolindo-phenol (Natriumsalz) und 3 g Vinylpyrrolidon/-Vinylacetat-Copolymerisat gelöst.

Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung bei 520 nm).

Beispiel 4: Reagenzfolie zur Bestimmung von Nitrit

In einem Gemisch von 200 ml Wasser und 500 ml Methanol werden nacheinander 30 g 2-Amino-4-(2-hydroxyäthylsul-fonyl)-benzoesäure, 5,5 g N-Naphthyl-(l)-äthylendiammonium-oxalat, 78 g Weinsäure und 50 g Polyäthylenglykol («PEG 4000» nach DAB 7) gelöst. Mit dieser Lösung wird eine PVC-Folie wie in Beispiel 1 beschichtet. Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung bei 525 nm).

Beispiel 6: Reagenzfolie zur Bestimmung von zweiwertigem Eisen

In einem Gemisch von 20 ml Wasser und 80ttil Äthanol werden nacheinander 10 g 1,10-Phenanthroliniumchlorid, 10 g Triäthanolamin und 5 g PVP gelöst. In diese Lösung werden Folienstücke aus Polyester (Polyäthylenterephthalat; Grösse 9 x 0,2 x 80 mm) 30 mm tief eingetaucht und anschliessend bei 70 CC (10 Minuten) getrocknet.

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Zur eigentlichen Bestimmung werden 3 ml der zu untersuchenden Lösung in Küvetten (10 x 10 x 50 mm) gefüllt, ein Folienstück wird eingetaucht, und durch mehrmaliges Auf-und Niederbewegen der Folie werden PVP und Reagenz abgelöst. In Abhängigkeit von der Menge der vorliegenden Fe+ +-Ionen erhält man eine rot bis braun gefärbte Lösung, deren Extinktion bei 510 nm nach 5 Minuten gemessen wird.

Beispiel 6: Reagenzfolie zur Chlor-Bestimmung

Es werden zwei Beschichtungslösungen hergestellt:

1.Man mischt eine Lösung von 10 g Natriumacetat in 80 ml Methanol mit einer Lösung von 3 g Polyvinylalkohol («Mowiol» N 50-88) in 20 ml Wasser.

2.Man mischt eine Lösung von 3 g N,N-Diäthyl-p-pheny-lendiammoniumsulfat in 10 ml Dimethylsulfoxid und 50 ml Äthanol mit einer Lösung von 5 g Polyvinylalkohol in 40 ml Wasser.

Die eine dieser Beschichtungslösungen wird auf die Vorderseite, die andere auf die Rückseite eines 90 mm breiten und 1000 ml langen Folienbandes (PVC, Dicke 0,2 mm) jeweils als 20 mm breite Schicht mit Hilfe einer Walze aufgetragen. Nach dem Trocknen (10 Minuten bei 60-80 °C) zerschneidet man das Folienband in 10 mm breite Streifen und verfährt im übrigen analog Beispiel 1 (Messung bei 680 nm).

Beispiel 7: Reagenzfolie zur Bestimmung von 2-Hydroxybuty-rat-Dehydrogenase

Man bereitet zwei Beschichtungslösungen:

1. Eine Lösung von 5 g PVP in 40 ml Wasser, 50 ml einer 10%igen Phosphatpuffer-Lösung (pH-Wert 7,5) und eine Lösung von 3 g äthoxyliertem Nonylphenol («Marlophen» 812) in 10 ml Äthanol werden gemischt.

2. Eine Lösung von 5 g NADH und 2,5 g Natrium-2-oxobutyrat in 30 ml 0,2%iger NaHCCb-Lösung wird mit einer Lösung von 5 g PVP in 70 ml Äthanol vermischt.

Die beiden Lösungen werden durch Siebdruck auf einen 80 mm breiten und 500 mm langen Folienstreifen (aus Celluloseacetat, Dicke 0,3 mm) in zwei jeweils 15 mm breiten Schichten (5 mm Abstand) aufgetragen. Im übrigen verfährt man analog Beispiel 1 (Messung der Extinktionsdifferenzen pro Minute bei 365 mm.

Beispiel 8: Reagenzfolie zur Bestimmung von Nitrit

Eine Polyesterfolie (200 x 1000 mm) wird mittels einer Walze mit der Reagenzlösung gemäss Beispiel 4 am unteren Ende in der Längsrichtung auf einem 30 mm breiten Streifen gleichmässig beschichtet. Nach dem Trocknen wird in 12 mm breite Streifen geschnitten. Eine Farbvergleichsskala wird hergestellt, indem man Reagenzgläser (Grösse 15 x 160 mm) mit je 10 ml wässriger Natriumnitritlösung folgender Konzentration füllt: 0,01 ; 0,05; 0,1 ; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 3,0; 5,0; 10,0 mg/l. Man gibt jeweils eine Reagenzfolie zu und rührt gut um. Nach 3 Minuten haben sich beständige Reaktionsfarben ausgebildet, so dass die Farbskala für den Vergleich bereit ist. Von der zu untersuchenden Lösung werden 10 ml in ein Reagenzglas (Grösse 15 x 160 mm) gefüllt. Man taucht eine Reagenzfolie ein, rührt gut um und bestimmt nach 3 Minuten die Nitrit-Konzentration durch Farbvergleich.

Beispiel 9: Reagenzstäbe zur Bestimmung von Ascorbinsäure a) Herstellung der Stäbe

Glasstäbe (Grösse 3 x 75 mm) werden für 3 Sekunden in die Reagenzlösung (2) gemäss Beispiel 3, 32 mm tief eingetaucht und in einem Luftstrom getrocknet. Das Reagenz wird vom unteren Ende wieder abgelöst, indem man die Stäbe anschliessend für 5 Minuten 17 mm tief in 25 °C warmes Wasser taucht. Schliesslich taucht man die Stäbe nach erneutem Trocknen 15 mm tief in die Reagenzlösung ( I ) gemäss Beispiel 3 und trocknet wieder in einem Luftstrom.

b) Durchführung der Bestimmung

3,0 ml der zu untersuchenden Lösung wird in eine Küvette ( 10 x 10 x 50 mm) gefüllt. Dazu wird einer der nach (a) hergestellten Stäbe gegeben. Durch Umrühren (eine Minute) werden die aufgetragenen Substanzen heruntergelöst und können nun mit der Ascorbinsäure reagieren. Die verbleibende Färbung wird bei 520 nm gemessen. Falls die auf dem Stab vorhandene Menge an 2,6-DichlorphenolindophenoI nicht ausreicht und die Lösung mithin völlig farblos bleibt, wird noch Reagenz von einem zweiten oder dritten Stab abgelöst, bis eine messbare Färbung bestehen bleibt.

Beispiel 10: Reagenzfolie zur Bestimmung von Peroxydase in Leukozyten

PVC-Folienstücke der Grösse 24 x 55 mm (Dicke 0,2 mm) werden mit folgender Lösung gleichmässig beschichtet: 3,84 g 4-Chlor-l-naphthol und 1 g PVP in 130 ml Äthanol werden mit 20,5 ml einer O^'oigen Natriumperborat-Lösung in Wasser gemischt. Nach der Beschichtung werden die Folien getrocknet.

Anwendung:

Ein luftgetrockneter Blutausstrich wird durch Einstellen (30 s) in eine Lösung von Formaldehyd/Äthanol (10ml 30%ige wässerige Formaldehyd-Lösung + 90 ml 95%iges Äthanol) fixiert und mit Wasser abgespült. Auf den noch feuchten Ausstrich wird ein Tropfen Äthanol getropft und die Folie aufgelegt. Nach einer Reaktionsdauer von 5 min nimmt man die Folie ab, spült den Ausstrich mit Wasser und färbt 10 s lang mit konz. Giemsa-Lösung nach. Es wird erneut mit Wasser gespült, getrocknet und schliesslich unter dem Mikroskop ausgewertet: Peroxydasepositive Leukozyten zeigen im Plasma dunkelviolett gefärbte Granula.

Beispiel 11 : «Küvetten-Folie» zur Bestimmung von Glucose

Eine durchsichtige und farblose PVC-Folie [Grösse 75 x 100 mm; (vgl. Fig. 1(1)] wird in der Längsrichtung 5 mm vom unteren Rand entfernt in einer 10 mm breiten Zone analog Beispiel 1 beschichtet und getrocknet. Auf diese Folie wird eine vorher verformte zweite Folie (2) der Grösse 20 x 100 mm aufgesiegelt (geklebt oder geschweisst). Durch die Verformung wird über der Reagenzzone (3) ein Hohlraum (4) ausgebildet, der später die zu untersuchende Lösung aufnimmt und als Reaktionsgefäss und Küvette zugleich dient. Im Hohlraum beträgt der Abstand zwischen den beiden Folien 2 mm. Anschliessend wird die Folie in 10 mm breite Streifen geschnitten.

Zur eigentlichen Bestimmung wird ein Streifen am oberen Ende gefasst und in die zu untersuchende Lösung getaucht, so dass die Lösung den Hohlraum ausfüllt. Die Reagenzien lösen sich auf und bilden bei Gegenwart von Glucose eine blaue Lösung. Nach 10 Minuten erfolgt die Auswertung visuell durch Vergleich mit einer Farbskala oder photometrisch durch Messung der Extinktion bei 640 nm.

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bO

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

639 491 PATENTANSPRÜCHE

1. Mit Reagenzien beschichteter Formkörper aus nicht saugfähigem, wasserunlöslichem Material, dadurch gekennzeichnet. dass die Reagenzien auf dem Formkörper in einem festen oder wachsartigen organischen Polymer eingebettet sind, das mit Wasser eine optisch klare Lösung bildet.

2. Verwendung des mit Reagenzien beschichteten Formkörpers nach Patentanspruch 1 zur kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmung einer in wässriger Lösung vorliegenden Substanz.