AT408661B - Testsystem zur vereinfachten bestimmung von nad(p)h - Google Patents
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Description
AT 408 661 B
Die Erfindung betrifft ein Testsystem und ein Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H bzw. von unter Bildung oder Verbrauch von NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen. Die Bestimmung klinischer Parameter erfolgt in der Mehrzahl der Falle über hochspezifische Dehydrogenase-Reaktionen, in deren Verlauf mittel- oder unmittelbar NAD(P)H gebildet oder verbraucht wird. Die dabei umgesetzte Menge NAD(P)H, absolut oder pro Zeiteinheit, ist ein Mass für die Konzentration der zu untersuchenden Substanz in einer Flüssigkeit. Als besonders vorteilhaft erweist sich die Dehydrogenase Reaktion in Bezug auf Stöchiometrie und geringe Störanfälligkeit. Nachteilig ist dagegen, dass aufgrund der Absorptionseigenschaften des Coenzymmoleküls eine Auswertung der Messreaktion nur mit Photometern mit UV-Messbereich möglich ist; eine rein visuelle Auswertung kann nicht erfolgen. Dies wird erst möglich durch Kopplung der eigentlichen NAD(P)H-bildenden Reaktion mit einer Farbreaktion. Es sind eine Vielzahl von Verfahren beschrieben, die dies durch direkte oder mit Hilfe von Elektronenüberträgern; wie Phenazinmethosul-fat oder Diaphorase vermittelte Übertragung der Redoxäquivalente auf unterschiedliche Redoxindikatoren erreichen. Zu diesen Substanzen zählen z.B. Cytochrome, komplexierte oder chelatisierte Eisenionen, Dichlorphenolindophenol, Tetrazoliumsalze usw.
Die Auswahl der für das erfindungsgemässe Testsystem verwendeten Redoxindikatoren erfolgt nach der Unterscheidbarkeit der bei der Umsetzung gebildeten Messsignale, vorzugsweise nach der Extinktionsänderung bei verschiedenen Wellenlängen (photometrische Auswertung) oder nach der unterscheidbaren Farbänderung der Testlösung (visuelle Auswertung). Im letzten Fall sind insbesondere Kombinationen von Redoxindikatoren geeignet, von denen je eine Form farblos bzw. nur schwach gefärbt ist. Nachstehend sind einige bevorzugte Redoxindikatoren mit ihren Normalpotentialen bei einem pH-Wert von 7 und die entsprechenden Farbänderungen aufgezählt.
Substanz Potential bei pH 7,0 NADH -0,32 DIP +0,23 MTT +0,11 INT +0,09 Thionin +0,06 Methylenblau +0,01
Farbe der Farbe der oxidierten reduzierten Form Form blau farblos farblos blau farblos rot violett farblos blau farblos
Aus der Tabelle geht hervor, dass die Kombination der Redoxindikatoren DIB/INT mit einem Farbübergang in der 1. Stufe von blau nach farblos und in der 2. Stufe von farblos nach rot besonders vorteilhaft ist. Beide Substanzen besitzen sowohl zwischen oxidierter und reduzierter Form einer jeden Substanz als auch zwischen den Substanzen deutliche Unterschiede im Absorptionsspektrum und im visuellen Farbeindruck. Eine Umsetzung der beiden Substanzen im Gemisch mit NAD(P)H führt zu einer unabhängigen Umsetzung von DIP und INT und damit zu einem gegenüber einem System mit nur je einer dieser Substanzen erheblich erweiterten Messbereich - Die Substanz mit dem höheren Normalpotential (DIB) wird nahezu vollständig vor der zweiten Substanz (INT) umgesetzt. Die photometrische Auswertung kann z.B. über eine Registrierung der Extinktion bei zwei verschiedenen Wellenlängen (460 und 650 nm) erfolgen. Bei der visuellen Auswertung lässt sich eine weitere Steigerung der erhaltenen Farbstufen durch Zusatz eines sogenannten Hintergrundfarbstoffes (Z.B. Titangelb) erhalten.
Das Testsystem nach der Erfindung kann prinzipiell für alle NAD(P)H-Bestimmungen sowie für alle NAD(P)H verbrauchenden oder bildenden Reaktionen verwendet werden. Die zu untersuchenden Proben sind vorzugsweise Körperflüssigkeiten wie Serum, Plasma, Urin usw.. Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt in der für enzymatische Methoden üblichen Weise, wobei man im allgemeinen zuerst die NAD(P)H - umsetzende Reaktion ablaufen lässt und danach das gebildete oder verbrauchte NAD(P)H bestimmt. Selbstverständlich ist bei NAD(P)H bildenden Reaktionen auch eine direkte Kopplung möglich. Auch lassen sich Enzymaktivitäten dadurch bestimmen, dass die Reaktion zu einer bestimmten Zeit gestoppt und das in dieser Zeit gebildete oder verbrauchte NAD(P)H bestimmt wird. Die Redoxindikatoren befindet sich erfin-dungsgemäss in einer polymerischen Schicht. 2
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Beispiel 1: Stand der Technik: Küvettentest Bestimmung von Lactatdehydrogenase im Serum
Zu 1,2 ml Reaktionslösung enthaltend 0,03 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,5 0,6 mmol/l Pyruvat und 0,5mmoi/l NADH werden 100 μΙ einer Serumprobe mit verschiedener LDH-Aktivität zugegeben (eingestellt durch Zugabe von LDH, überprüft mit Standardmethode). Nach 10 Minuten bei 25 °C werden 300 μΙ einer Lösung zugegeben, die 0,5 mol/l Citratpuffer, pH 5,8
1,34 mmol/l DIP
1,10 mmol/l INT
0,05 mmol/l PMS 0,13mmol/l Titangelbund 4 mmol/l Oxamidsäure enthalt. Nach weiteren 10 Minuten wird der Farbeindruck der jeweiligen Gesamttestlösung bestimmt. Man erhält folgende Resultate: LDH Resultierender Farbeindruck (U/l] der Testlösung 32 rot 96 rotbraun 160 braun 210 orange 225 ocker 255 gelbgrün 290 grün 370 blaugrün
Neben spezifischen Redoxindikatoren werden lonophore für ionenselektive Elektroden u. Optoden eingesetzt. lonophore sind lipophile Liganden, welche die Fähigkeit haben, gewisse Ionen selektiv zu komplexieren und diese mittels eines Carriermechanismus durch Membranen zu transportieren (W.E.Morf, W.Simon, Helv. Chim. Acta 69,1120(1986)). Unter diesen haben die elektroneutralen ionenaktiven Substanzen ein besonders breites Anwendungsgebiet als Komponenten in ionenselektiven Flüssigmembraneiektroden gefunden; z.B. als Polymer-Flüssigmembranelektroden in der klinischen Analytik (U.Oesch, D.Ammann, W.Simon, Clin. Chem. 32,1448(1986)), als Mikroelektroden in der Elektrophysiologie D.Ammann, lon-Selective Microelectrodes. Principles, Design and Application, Springer-Verlag. Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo (1986), in hoch selektivem lonentransport durch künstliche Membranen (W.Simon; Molecular Movements and Chemical Reactivity as Conditioned by Membranes (R. Lefever; A. Goldbeter, ed.), p.287, John Wiley & Sons, Inc., New York (1978)) und in Transportstudien in biologischen Systemen (Messungen im Zellbereich oder Einzelzelle) P. Caroni, P. Gazzotti, P. Vuilleumier, W. Simon, E. Carafoli; Biochim. Biophys. Acta 470,437(1977) und neuerdings in Optodenmembranen zur reversiblen optischen Detektion von geladenen und elektrisch neutralen Spezies (z. B. in der klinischen Chemie) W.E.Morf, K.Seiler; B.Lehmann, C.Behringer, K.Hartman, W.Simon, Pure Appl. Chem. 61,1613(1989) W.E.Morf, K.Seiler; B.Rusterholz, W.Simon, Anal. Chem. 62,738(1990).
Die lonophore, Chromoionophore, Weichmacher, Additive und Polymere in solchen lonen-sensitiven Membranen sind auf die Herstellung von Polymer-Flüssigmembranen abgestimmt. Die Verwendung geeigneter Komponenten, die optimale Membranzusammensetzung und ein zweck- 3
AT 408 661 B mässiges Herstellungsverfahren haben einen entscheidenden Einfluss auf das Verhalten des Sensors. Diese lonophore, Chromoionophore und Hilfsreagenzien genügen den Qualitätsanforderungen zur Herstellung von funktionstüchtigen ionenselektiven Elektroden und Optoden. Die Membranen werden hauptsächlich in Sensoren (z.B. klinische Analysatoren, Katheter) für die Messung von lonenaktivitäten in physiologischen Flüssigkeiten (Blut, Urin, Serum) verwendet, lonophore werden auch in Flüssigaustauscherphasen für Mikroelektroden eingesetzt. Der erfolgreiche Einsatz derartiger Mikroelektroden hängt von der entsprechenden Handhabung der Cocktails und der Herstellung der Mikropipetten ab. Die einwandfreie messtechnische Anordnung in Kapillarelektroden ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung.
Die Erfindung betrifft eine neuartige Aufbringung einer Sensorschicht eines optischen Sensors zur Bestimmung von NAD(P)H in einer Probe, mit einer homogen in der Polymermatrix der Sensorschicht immobilisierten Indikatorsubstanz, welche mit der Probe in zumindest indirektem Kontakt steht und bei einer Änderung des zu messenden Parameters zumindest eine ihrer optischen Eigenschaften ändert, vorzugsweise ein Paar von Redoxindikatoren wie zuvor beschrieben.
Es sind bereits eine Vielzahl von Indikatorsubstanzen bekannt, welche auf NAD(P)H-Konzen-trationsänderungen mit einer Änderung einer optischen Eigenschaft der Indikatorsubstanz reagieren. Die Änderung dieser Eigenschaft, beispielsweise Fluoreszenzintensität, Fluoreszenzabkling-zeit, Absorption u.s.w., kann mit bekannten optischen Verfahren und Messeinrichtungen erfasst und der zu messenden NAD(P)H zugeordnet werden.
Eine gemeinsame Anforderung an Sensorschichten, welche derartige Indikatorsubstanzen immobilisiert haben, besteht darin, dass diese Immobilisierung möglichst homogen erfolgen soll und die Indikatoren für das Probengut weitgehend unlöslich vorliegen sollen. Ein erfindungsgemässes Testsystem besteht aus einer polymerischen Schicht in der Indikatoren für NAD(P)H immobilisiert sind, diese wird vorzugsweise kombiniert mit einer darüber immobiliserten Schicht einer NAD(P)H bildenden Dehydrogenasse. Eine räumlich getrennte Kombination mit diesen und/oder anderen Enzymen ist ebenfalls möglich.
Als konkretes Beispiel wird weiters angeführt, dass die Indikatorbeweglichkeit im Polymer durch eine chemische Modifizierung der Indikatorsubstanz, z.B. Alkylierung mit längeren C-Ketten, eingeschränkt wird.
Durch die direkte Bindung der Indikatorsubstanz an C-Ketten bzw. an polymere Trägermaterialien, verlieren jedoch viele Indikatorsubstanzen Teile ihrer positiven Eigenschaften, sodass beispielsweise Ansprechzeit, Empfindlichkeit, Auflösung oder Signalhöhe durch diese Bindung beeinträchtigt werden.
Stand der Technik von sensitiven Verbindungen: 1) pH-sensitive Farbstoffe sind Verbindungen, deren optische Eigenschaften (Absorption, Fluoreszenzintensität, Abklingzeit) durch Aufnahme oder Abspalten eines Protons verändert werden. z.B. Chinin (kationischer Fluoreszenzfarbstoff) oder Bromkresolpurpur (anionischer Absorptionsfarbstoff) 2) Redoxpotential-sensitive Farbstoffe (Redoxindikatoren) sind z.B. Methylenblau (kationischer Fluoreszenzfarbstoff) oder Thioindigosulfonat (anionischer Absorptionsfarbstoff) 3) lonen-sensitive Farbstoffe (Metallindikatoren, Chromoionophore) z.B. Calcein (anionischer Fluoreszenzfarbstoff)
Da Fluoreszenzfarbstoffe auch eine Temperaturabhängigkeit zeigen, sind derartige Sensorschichten auch für die Temperatursensoren ersetzbar.
Zur Realisierung einer ionenselektiven Schicht kann als Farbstoff z.B. Rhodamin B verwendet werden, welcher mit bestimmten lonophoren funktionalisiert wird. Untenstehend sind lonophore für einige Ionen in der Nomenklatur der Firma FLUKA CHEMIE AG, Industriestrasse 25, CH-9470 BUCHS, Schweiz, angeführt:
Columns=3
HeadCoM: ETH-Nummer:
Head Col 2: Name:
Head Col 3: Produktnummer: ETH 129 Kalzium-Ionophor II 21193 ETH 149 Lithium-Ionophor I 62557 4
AT 408 661 B ΕΤΗ 227 Natrium-Ionophor i 71732 ETH 1001 Kalzium-Ionophor I 21192 ETH 1117 Magnesium-Ionophor 163082 ETH 1907 Wasserstoffion-Ionophor II 95295
Weiters ist es in diesem Zusammenhang aus der US 5030420 bekannt geworden, Farbstoffe, wie beispielsweise Komplexe der Platinmetalle mit Diimin- und Porphyrinliganden in Polymeren wie z.B. PVC, Plexiglas, Silikon- und Naturgummi, Polykarbonat, Teflon u.s.w. zu verwenden. Der Farbstoff kann durch Diffusion in das Polymer eingebracht oder mit dem Prepolymer vermischt werden. Schliesslich kann auch eine ionische oder kovalente Bindung an das Polymer erfolgen. Dadurch werden jedoch wiederum, wie bereits oben beschrieben, wesentliche Farbstoffeigenschaften negativ beeinflusst bzw. es eignen sich nicht alle Farbstoffe für die hier angeführten Immobilisierungsmethoden.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Sensorschicht vorzuschlagen, welche die Indikatorsubstanz möglichst homogen verteilt enthält, wobei jedoch die charakteristischen Eigenschaften des Farbstoffmoleküls durch die Immobilisierung nicht oder nur in geringem Umfang beeinträchtigt werden sollen. Trotzdem soll die Indikatorsubstanz durch die Probe nicht ausgewaschen oder beeinträchtigt werden. Weiters soll ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Sensorschicht vorgeschlagen werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass ein oder mehrere NAD(P)H sensitive Redoxindikatoren und Elektronenüberträger in einer polymerischen Schicht immobilisiert werden.
Es entstehen so rasch auf den Analyten ansprechende stabile Sensorschichten mit hoher Signalgüte. Es wird eine NAD(P)H sensitive Sensorschicht vorgeschlagen, welche in besonders einfacher und reproduzierbarer Weise die Messung von NAD(P)H erlaubt.
Beispiel 2:
Bestimmung von L-Camitin im Serum (1) In 500 μΙ Tetrahydrofuran werden gelöst: 52,2 mg Bis (2-ethylhexyl)phthalat 26,1 mg Polyvinylchlorid (2) In Methanol werden gelöst:
50 mM MTT
50 mM PMS 25 μΙ Polymerlösung (1) werden mit 10 μΙ (2) vermischt und auf einen Aluminium - Chip bei 4000 Umdrehungen gespinnt (30 Sek.). Der Chip wird mit einer Lösung (0,2 %) von Carnitindehydrogenase (CDH) inkubiert. Nach 30 Minuten werden 10 μΙ Serum zugegeben, das mit 0,1 M Tris-Puffer pH 8,5 verdünnt wurde.
Nach 5 Minuten wird der Farbeindruck der inkubierten Chips bestimmt. Man erhält folgende Resultate: L-Camitin Resultierender Farbeindruck (μπιοΙ/Ι) des Chips 1 rosa 2,5 rot 5 hellbraun 7,5 dunkelbraun 10 orange 15 gelbgrün 20 grün 25 hellblau
Aus der EP0578630 ist bekannt, dass besonders die Verankerung von Indikatorsubstanzen in 5
Claims (7)
- AT 408 661 B der polymerischen Schicht von grosser Bedeutung ist. Diese Verankerung kommt allerdings nur in Sensoren, die über einen längeren Zeitraum kontinuierlich verwendet werden, zum Tragen. Das erfindungsgemässe Testsystem soll vorallem in Einweg-Produkten und Testkits zur Anwendung kommen. Aus der US 4629697 ist bekannt, dass zumindest zwei Redoxindikatoren notwendig sind, um NAD(P)H in einem pysiologischen Senstivitätsbereich zu detektieren. Verschiedener dieser Re-doxpaare sind seit längerem Stand der Technik. Es ist grundlegend neu, dass der Einsatz zweier oder mehrer Redoxindikatoren auch in polymerischen Dünnschichten möglich ist, bzw. dass solche Indikatoren auch in relativ hydrophoben Schichten, in denen die Diffusion von hydrophilen Komponenten stark eingeschränkt ist ebenfalls zur Detektion von NAD(P)H mit Vorteil eingesetzt werden können. Die Immobilisierung der polymerischen Dünnschicht findet mit Vorzug auf einem Spiegel statt, wodurch eine Auswertung der Farbgebung mittels Reflexionsmessung ermöglicht wird. Beschreibung der Abbildungen: Die in den Abbildungen wiedergegebenen Testsysteme stellen beispielhafte Anordnungen dar. Die Komponenten werden wie folgt benannt: 1 ... fester Träger 2 ... polymerische Dünnschicht mit Weichmacher, Redoxindikatoren und Elektronenüber trägern 3 ... NAD(P)H-hältige Lösung 4 ... Spiegel 5 ... enzymhältige Schicht 6 ... analythältige Lösung PATENTANSPRÜCHE: 1. Testsystem zur vereinfachten Bestimmung von NAD(P)H, bzw. von unter Bildung oder Verbrauch von NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen, dadurch gekennzeichnet, dass es gleichzeitig mehrere, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als Elektronenakzeptor fungierende Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen in einer polymerischen Dünnschicht (2) immobilisiert enthält.
- 2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es gleichzeitig mehrere, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als Elektronenakzeptor fungierende Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen auf einem Spiegel (4) in einer polymerischen Dünnschicht (2) immobilisiert enthält.
- 3. Testsystem nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass es als Redoxindikatoren Dichlorphenolindophenol und ein Tetrazoliumsalz enthält.
- 4. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Elektronenüberträger Phenazinmethosulfat, Phenazinethosulfat, Methoxyphenazinmethosulfat, Meldolablau oder Gemische dieser Substanzen enthält.
- 5. Testsystem nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich einen Hintergrundfarbstoff enthält.
- 6. Verfahren zur Bestimmung von NAD(P)H bzw. von unter Bildung oder Verbrauch von NAD(P)H reagierenden Substraten oder Enzymen in wässriger Lösung (3,6), dadurch gekennzeichnet, dass eine polymerische Dünnschicht (2) gleichzeitig mit mehreren, unabhängig voneinander gegenüber NAD(P)H als Elektronenakzeptor fungierenden Substanzen mit verschiedenen elektrochemischen Potentialen immobilisiert wird, wobei während und/oder nach Analyteinwirkung verschiedene analytisch unterscheidbare Färbungen der Dünnschicht (2) entstehen, die messtechnisch oder visuell ausgewertet werden.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung in einer gepufferten wässrigen Lösung vom pH-Bereich 4,5 - 9,0, vorzugsweise 5,0 - 7,0 durchgeführt 6 wird. AT 408 661 B HIEZU 1 BLATT ZEICHNUNGEN 7
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