WO2017116277A1 - Способ оценки состояния организма по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно - Google Patents

Способ оценки состояния организма по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно Download PDF

Info

Publication number
WO2017116277A1
WO2017116277A1 PCT/RU2016/000297 RU2016000297W WO2017116277A1 WO 2017116277 A1 WO2017116277 A1 WO 2017116277A1 RU 2016000297 W RU2016000297 W RU 2016000297W WO 2017116277 A1 WO2017116277 A1 WO 2017116277A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
patients
saliva
biomarkers
pathology
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/000297
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Андрей Владимирович ТИТОВ
Людмила Владимировна БЕЛЬСКАЯ
Елена Александровна САРФ
Виктор Константинович КОСЕНОК
Original Assignee
Андрей Владимирович ТИТОВ
КОВАЛЕНКО, Дмитрий Анатольевич
Людмила Владимировна БЕЛЬСКАЯ
ХАРИТОНАШВИЛИ, Ираклий Теймуразович
ЗАЙЧЕНКО, Николай Михайлович
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Андрей Владимирович ТИТОВ, КОВАЛЕНКО, Дмитрий Анатольевич, Людмила Владимировна БЕЛЬСКАЯ, ХАРИТОНАШВИЛИ, Ираклий Теймуразович, ЗАЙЧЕНКО, Николай Михайлович filed Critical Андрей Владимирович ТИТОВ
Publication of WO2017116277A1 publication Critical patent/WO2017116277A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/20—Supervised data analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B45/00—ICT specially adapted for bioinformatics-related data visualisation, e.g. displaying of maps or networks

Definitions

  • the invention relates to methods for determining human pathological conditions due to biomarkers determined in saliva by one of a number of technological approaches, including, but not limited to, biochemical methods, enzyme immunoassay, capillary and gel electrophoresis methods, etc., as well as technologies for analyzing multidimensional data for diagnostic purposes.
  • Human saliva can be used as a biological fluid for the analysis of various markers, such as electrolytes, hormones, drugs, antibodies, etc. Such a diagnosis is justified, because in addition to
  • saliva water contains dissolved anions SG, P0 4 3 C0 3 2 " , SCN “ , G, Br “ , F “ , S0 4 2 ⁇ ; cations Na + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ and trace elements Fe 3+ , Fe 2+ , Cu 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ , Li + , Zn 2+ , etc .; organic substances - protein and its fractions (albumin, globulins), amino acids, mucin; enzymes - amylase, lactase, lysozyme, kallikrein, parotin, as well as cholesterol, glucose, lactic acid and vitamins C, B 1, B 12, N, K [Borovsky EV, Leontyev V.K.
  • saliva compared with blood is a dynamic environment that reflects daily changes in the body.
  • saliva composition diagnostics are non-invasive, painless and patient-friendly procedure. You can collect saliva samples at any time, day or night, this procedure can be performed in circumstances where blood sampling is not possible.
  • saliva can be an alternative to commonly used blood serum. Diagnostics by saliva may be in demand in such areas as sports medicine, psychology, pediatrics, gerontology and others. Saliva samples are stable for 7 days at room temperature, 4 weeks at 2-8 ° C, a long period at a temperature below -20 ° C. Such high stability makes it possible to conveniently arrange the logistics of sample delivery to the place of analysis, for example, makes it possible to send saliva samples by regular mail.
  • This biomaterial is widely used not only in clinical practice, but also in hygienic and toxicological studies, as well as for studying the pharmacodynamics of drugs and for special scientific purposes.
  • the applied analysis technique consists in a numerical comparison of two types of indicators and carries all the disadvantages characteristic of methods based on comparing the indicator value with the average norm - the impossibility of an accurate diagnosis of pathology (since deviations of one parameter can simultaneously indicate different pathologies), the need additional studies (the result of the analysis is only an indicator of the presence of pathology, but does not allow to identify it and determine it Character of).
  • the disadvantages of this method is the relatively low efficiency and high complexity of enzyme-linked immunosorbent assays with monoclonal antibodies, as well as the complexity and invasiveness of obtaining biological samples.
  • the disadvantage of this method is the limited scope of this group of biomarkers - only for the detection of lung cancer.
  • a method for determining lung cancer is known - Patent Application [WO 2011 100483, 08/18/2011], based on an analysis of the values of a group of biomarkers determined by flow cytometry methods or polymerase chain reaction, where saliva is proposed as a biological fluid.
  • the disadvantage of this method is the relatively high complexity and relatively low efficiency due to the use of biomarkers, which are determined by ELISA, PCR, and flow cytometry, which leads to an increase in the time of its conduct.
  • the disadvantage is the restriction of the scope of this group of biomarkers only for the detection of lung cancer.
  • Known also includes a method for the determination of gastric cancer [US 20130065769, 08.09.201 1], based on the determination in saliva of a group of biomarkers, which includes a group of micro-RNA molecules.
  • the disadvantages of the method are the relatively low efficiency and high complexity due to the process of conducting micro-RNA studies by PCR and mass spectroscopy, as well as a relatively narrow scope, limited only for the detection of gastric cancer.
  • the closest in technical essence to the proposed one is a method for predicting the development of malignant neoplasms [RU 2521393, C2, G01N33 / 50, 06.27.2014], including genotyping of biological environments of the body using real-time PCR and subsequent evaluation, which Saliva is used as the biological environment of the body, primer systems and allele-specific linearly degradable probes (TaqMan) are used, and in the presence of a combination of genotypes XRCC 1 280 (GG) hOGGl 326 (CC / CG) XPD1 751 (AA) GSTMl (-) NOS3 774 (TT / CT) predict high risk of developing maladies governmental neoplasms, and if any of Ma- millstone genotypes 1 XRCC 280G> A, XPD1 751A> C, hOGGl 326C> G, CYP2C 19 681G> A and NOS3 V TR predicted low risk of malignant neoplasm
  • the disadvantage of the closest technical solution is its relatively high complexity and low profitability, due to the use of biomarkers, which are determined by PCR.
  • the known method has a relatively narrow scope, since it does not allow to determine the actual presence of a malignant neoplasm, as well as to determine the organ affiliation of the tumor and does not apply to non-oncological pathologies.
  • the problem that is solved in the proposed method is to simplify the method and expand the scope of its application by creating a simple and economical way to determine the actual presence, type and organ affiliation of the disease.
  • the required technical result consists in simplifying the method and expanding the scope of its use when using saliva of a patient as a biological sample, which can be obtained non-invasively and which does not require specific storage and delivery conditions, as well as to compile a set of biomarkers, determining which, it is possible to diagnose various pathologies of the body, both oncological and non-oncological, and in improving the process of obtaining and interpreting biomarkers obtained from biological a liquid to detect the type and organ affiliation of a wide range of diseases without the use of complex techniques of PCR, micro-RNA and others, and would work with the parameters obtained as a result of standard operations and preparatory actions.
  • samples of biological fluid are analyzed, which use whole saliva obtained from patients according to the invention, make up a test set of biomarkers contained in samples obtained from patients of a test group, which includes a control group consisting of patients without a health pathology, as well as a study group, which includes patients with a diagnosed pathological condition, including the biomarker is included in the test kit based on the results of statistical analysis of its values determined in patients of the test group and determination of the Wilcoxon criterion between the control group and the study group, and the fact of the presence or absence of the pathological condition is determined by discriminant analysis of the values of the test biomarkers a set defined in the whole saliva of a patient with a diagnosed pathological condition and a test group, moreover, if the result of a discriminant analysis is hit, biomarkers of a test kit of a patient with a diagnosed pathological condition, the results of the control group conclude that there is no pathology, and if
  • the specified the problem was solved by changing the process — the procedure for preparing samples of whole saliva, which makes it possible to isolate biomarkers even in small volumes of samples, and by including computers in the procedure, which allows multidimensional discriminant analysis to be performed simultaneously for a group of parameters in their relationship rather than individually, including in relation to a small amount of biological material.
  • the basic set of biomarkers includes biochemical parameters that reflect the functional state of the organism as a whole. By combining them in different sequences, test kits can be formed for the diagnosis of specific diseases.
  • a kit includes at least the following biomarkers: indicators of mineral metabolism (ions of calcium, sodium, potassium, magnesium, barium, strontium, ammonium, iron, copper, zinc, selenium, lithium, phosphates, chlorides, fluorides, bromides, iodides, nitrites, nitrates, sulfates, carbonates, hydrocarbons, etc.); substrates (protein, protein fractions, mucin, albumin, glucose, lactic acid, pyruvic acid, nitric oxide, sialic acids, ceruloplasmin, hexosamines, fucose, creatinine, uric acid, xanthine, urea, ammonia, total glycoproteins, total a-amino acids, amino acids, amines, nitrosamines
  • the required technical result is achieved by the fact that the results of the analysis are not compared with the average indicators that are recognized as normal, but simultaneously with two groups of indicators, one of which is a control group consisting of patients without a health pathology, and the other - a comparison group that includes patients with various pathological conditions.
  • Such an analysis can be reliably performed only if the test set of biomarkers is correctly formed, that is, only certain parameters in their ratio and relationship can testify to a particular state of the body.
  • the test set of biomarkers is selected from the base set so that the latter is discriminatory between the control group and the comparison group.
  • the data obtained are compared with each other using a computer and using a multidimensional statistical analysis technique, using which they calculate the integral indicator from the values of the biomarkers of the test set, integral indicators for the control group and the comparison group.
  • the obtained integral indicators are represented graphically in the coordinate system and, based on the coordinates, the points of the integral indicator of the test group with two other groups make a conclusion about the probable presence or absence of pathology.
  • the integral indicator is calculated by simultaneously evaluating the values of at least five biochemical parameters selected from call set, by computing using a computer and using the discrimination function, the projection of the integral indicator on the coordinate system in two dimensions is obtained.
  • the required technical result is achieved by the fact that the study group is formed in such a way that patients having at least one oncological or non-oncological pathology are simultaneously included in its composition, while the group of patients with oncological pathology is formed so that the incoming in it, patients had signs of the following types of diseases: cancer of the lung, breast, colorectal, esophagus, stomach, liver, gall bladder, pancreas, prostate, ovary, neck uterus, uterine body, bladder, kidney, thyroid gland, brain, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, etc.
  • FIG. 1. the results of comparing the studied groups by age
  • FIG. 3. the results of comparing the biochemical composition of individual saliva samples during the week with an interval of 24 hours;
  • FIG. 4 results of comparing the biochemical composition of saliva samples depending on the region of residence: ia;
  • FIG. 5 classification functions depending on the region of residence
  • FIG. 6 the nature of the distribution of experimental data and the correlation between the studied parameters
  • FIG. 7 classification of patients with breast diseases
  • FIG. 8 - ratio of MSM 254/280 nm depending on age
  • FIG. 9 the result of multivariate analysis for a group of 30-39 years.
  • FIG. 10 the result of multivariate analysis for a group of 50-59 years
  • FIG. 1 1 the result of multivariate analysis for the control group, taking into account the TNM classification;
  • FIG. 12 results of the analysis of a group with pulmonary cancer of the lung (diamond shaped markers) with healthy people (square and round markers);
  • FIG. 13 the results of the analysis of groups with pulmonary malignant pulmonary disease (filled round markers) and benign diseases (all others);
  • FIG. 14 - division of benign diseases fibroma - square markers, hamartoma - round markers, tuberculoma - markers in the form of a rhombus;
  • FIG. 15 results of a discriminant analysis of the biomarker values of the patient being examined (example 1);
  • FIG. 16 results of a discriminant analysis of the biomarker values of the patient being examined (example 2);
  • FIG. 17 - results of a discriminant analysis of the biomarker values of the patient being examined (example 3);
  • FIG. 18 - results of a discriminant analysis of the biomarker values of the patient being examined (example 4);
  • table 2 biochemical composition of saliva in various age groups
  • table 8 correlation relationships of the content of purines in saliva in normal and with oncological pathology
  • table 9 biomarkers of endogenous intoxication are normal;
  • table 10 Biomarkers of endogenous intoxication in benign and malignant diseases of the mammary glands;
  • table 1 1 biomarkers of EI depending on the size of the tumor in breast cancer.
  • a method for assessing the state of an organism using samples of biological fluid obtained non-invasively is implemented as follows.
  • Whole saliva is used as diagnostic fluid samples, while saliva samples undergo standard preliminary training in order to isolate a predetermined group of biomarkers.
  • biomarker values can be determined by standard and already known methods: atomic absorption, atomic emission, ionometric, colorimetric, titrimetric, gravimetric, capillary electrophoresis, complexometric, photometric, fluorimetric, argentometric, or mercury electrochemical, potentiometric, enzymatic, radio immunological, gas chromatography methods, nephelometry enzyme immunoassay, chemiluminescence, g spruce electrophoresis, mass spectrometry, etc.
  • the probability of the presence of an oncological or non-oncological disease, or any other pathology is chosen.
  • biomarkers in saliva are determined in various groups of examined patients. Patients are selected in such a way that they can be grouped into one or more subsets based on the diagnostic value of various biomarkers for identifying various diseases. The measured biomarker values in saliva samples are compared in order to isolate a group that has significant differences in different subsets. A selected group of biomarkers can be used as the main or auxiliary tool in the diagnosis of various pathological conditions of a person.
  • a basic set of biomarkers was formed including, but not limited to, the following indicators: mineral metabolism (calcium, sodium, potassium, magnesium, barium, strontium, ammonium, iron, copper ions zinc, selenium, lithium, phosphates, chlorides, fluorides, bromides, iodides, nitrites, nitrates, sulfates, carbonates, hydrocarbons, etc.); substrates (protein, protein fractions, mucin, albumin, glucose, lactic acid, pyruvic acid, nitric oxide, sialic acids, seroglycoids, ceruloplasmin, hexosamines, fucose, creatinine, uric acid, xanthine, urea, ammonia, total glycoproteins, total ⁇ -amino acids, amino acids, amines, nitrosamines, nitrosothiols, arginine,
  • Arginase activity is usually determined by measuring the amount of urea formed during incubation of the enzyme preparation with arginine. In this case, urea accumulation is estimated as follows: after urea is destroyed by urease, the yield of carbon dioxide is manometrically measured, or ammonia formation is determined colorimetrically or titrimetrically.
  • arginase activity can be estimated by titration of de enzymatic reaction of ornithine. Other techniques include determining, using a modified Sakaguchi reaction, the excess arginine remaining in the reaction mixture after incubation.
  • Alpha-hydroxybutyrate dehydrogenase is determined by the kinetic photometric method.
  • Determination of the activity of aldolases is carried out by endpoint methods (the Meyerhof and Loman method, which is based on the determination of the content of inorganic phosphorus cleaved from triosophosphates in an alkaline medium, or by determination of the content of free trioses forming a colored complex with dinitrophenylhydrazine after alkaline hydrolysis) and kinetic methods (spectrophotometric based on the Warburg optical test).
  • endpoint methods the Meyerhof and Loman method, which is based on the determination of the content of inorganic phosphorus cleaved from triosophosphates in an alkaline medium, or by determination of the content of free trioses forming a colored complex with dinitrophenylhydrazine after alkaline hydrolysis
  • kinetic methods spectrophotometric based on the Warburg optical test.
  • Glucose is determined by the reductometric method, based on the property of glucose to reduce salts of heavy metals in an alkaline medium, colorimetric enzymatic (glucose oxidase reaction, hexokinase reaction, glucose oxidase peroxidase) and non-enzymatic methods (Folin-Wu, Selomuserius, Somoji-Cerofiei methods , reaction with 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline, ferrocyanide reaction, orthotoluidine reaction, reaction with aniline, anthrone reagent).
  • colorimetric enzymatic glucose oxidase reaction, hexokinase reaction, glucose oxidase peroxidase
  • non-enzymatic methods Folin-Wu, Selomuserius, Somoji-Cerofiei methods , reaction with 2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline, ferrocyanide reaction, orthotoluidine reaction
  • Determination of total protein is carried out by nitrogenometric methods (the classical Kjeldahl method and its modifications), methods based on the determination of density, gravimetric, nephelometric, spectrophotometric, consisting in measuring the degree of light absorption in the ultraviolet region, colorimetric, based on color reactions of proteins with certain reagents or non-specific dye binding, fluorimetric, polarimetric methods and others (amino acid analysis, atomic method Absorption spectrometry).
  • Mucin is precipitated with concentrated acetic acid.
  • the carbohydrate component is detected by reaction with ⁇ -naphthol (Molish reaction).
  • the Molisch reaction is based on the dehydration of pentoses and the formation of furfural under the action of concentrated sulfuric acid.
  • the resulting furfural in in the absence of sulfuric acid gives a pink-violet condensation product with ⁇ -naphthol.
  • albumin and protein fractions To determine albumin and protein fractions, electrophoretic fractionation of proteins (on cellulose acetate films, agar, polyacrylamide gel, chromatographic paper), chromatographic separation, gel filtration, salting out of globulins with sodium sulfate or sodium sulfite followed by determination of albumin in the supernatant by reaction with biuret reagent or Folin's reagent, sedimentation during ultracentrifugation, determination by immunochemical methods, using ion-selective electrodes ktrodov, fluorimetric method, direct colorimetric study (binding dyes), the method of capillary electrophoresis Nogo.
  • Total glycoproteins are determined by one of the constituent components (hexoses, hexosamines, fucose, sialic acids) or by the ability of sialic acids, fucose and other carbohydrates to give the reaction “iodic acid - Schiff reagent”. You can also use research methods for carbohydrate-protein complexes according to their protein part (turbidimetric, tyrosine protein, etc.). Glycoproteins interact with the orcine reagent and color the solution pink. To establish the content of hexosamines, a reaction with acetyl acetone can be used. Seroglycoids are determined by the Huergo turbidimetric method.
  • Color reactions are used to identify and quantify amino acids when specific reagents interact with the functional groups of amino acid radicals that make up a protein or peptide.
  • Universal color reactions can be used: biuret (for all proteins) and ninhydrin (for all amino acids, in total), as well as specific, only for certain amino acids, for example, Fole’s reaction (for amino acids containing weakly bound sulfur), Mil- bosom (to tyrosine), Sakaguchi reaction (to arginine), xanthoprotein reaction to the aromatic ring of amino acids, GmbHz-Raspail reaction (to tryptophane), Adamkevich reaction (to tryptophan), Pali reaction (to histidine and thyro 1 ⁇ zine), etc.
  • Mass fraction of amino acids arginine, lysine, tyrosine, phenylalanine, histidine, leucine and isoleucine (total), methionine, valine, proline, threonine, serine, alanine, glycine, cystine, aspartic acid and asparagine (total), glutamine acids and glutamine (in total) and tryptophan in the form of phenylisothiocarbamyl derivatives (hereinafter - FTK derivatives) can be determined by capillary electrophoresis, as well as using an amino acid analyzer or equipment for high performance liquid chromatography.
  • - FTK derivatives phenylisothiocarbamyl derivatives
  • the determination of the mass concentrations of volatile fatty acids can be carried out by gas chromatography, by capillary electrophoresis.
  • NEF non-esterified fatty acids
  • ketone bodies sodium nitroprusside in an alkaline medium reacts with ketone bodies, forming a complex colored in pink-lilac, lilac or purple.
  • Methods for determination of ketone bodies include: Lange test, modified Rothera test, Legal test and Lestrade test.
  • the concentration of ceruloplasmin is determined by immunoassay, a manometric method, a colorimetric method based on the oxidation reaction of r-phenylenediamine.
  • the diphenylamine method and the Hess method can be used (a mixture of acetic and sulfuric acids), by reaction with thiobarbituric acid (Aminov and Warren method), Svennerholm resorcinol method.
  • Pyruvic and lactic acids are determined by enzymatic, end-point and kinetic methods.
  • the content of total lipids is determined by gravimetric methods, oxidative methods, turbidimetric methods, methods based on the property of selectively staining and giving color reactions (sulfophosphovaniline reagent).
  • Methods for determining total cholesterol include chemical (direct and indirect, with colorimetric, turbidimetric, titrimetric, gravimetric, fluorimetric completion), physicochemical (chromatographic, polarimetric) and enzymatic (enzymatic).
  • Lipoproteins are isolated by electrophoresis on cellulose acetate, chromatographic paper, in agar, starch, polyacrylamide gel, by ultracentrifugation in salt solutions of various densities, by immunochemical methods, chemical (turbidimetric), based on the formation of heparin lipoprotein complex.
  • the content of triglycerides is determined by a colorimetric method in which glycerol liberated as a result of alkaline hydrolysis is oxidized to formaldehyde using sodium metaperiodate.
  • the resulting formaldehyde gives 3,5-diacetyl-1, 4-dihydrolutidine with acetylacetonm, the color intensity of which is proportional to the content of triglycerides.
  • the enzymatic colorimetric method for determining triglycerides is based on the sequential course of four enzymatic reactions carried out by triglycerides: lipoprotein lipase (LPL), glycerol kinase (HA), glycerol phosphatoxidase (HFO) and peroxidase (POD).
  • LPL lipoprotein lipase
  • HA glycerol kinase
  • HFO glycerol phosphatoxidase
  • POD peroxidase
  • Hydrogen peroxide in the presence of peroxidase reacts with p-chlorophenol and p-aminophenazone (p-aminoantitipyrine, PAP) to form a red-colored quinoneimine residue.
  • the color intensity of the quinoneimine derivative is directly proportional to the concentration of triglycerides in the sample.
  • the content of acyl hydroperoxides (diene conjugates)
  • diene conjugates primary lipid peroxidation products
  • triene conjugates and Schiff bases are determined by the method of I.A. Volchegorsky.
  • TBA-active substances malondialdehyde
  • the content of TBA-active substances is determined by the method based on the formation of a colored complex in the interaction of malondialdehyde with 2-thiobarbituric acid.
  • the level of carbonyl derivatives of proteins is judged by the reaction of oxidized amino acid residues of proteins with 2,4-dinitrophenylhydrazine to form 2,4-dinitrophenylhydrazones, which are recorded spectrophotometrically.
  • bithyrosine The content of bithyrosine is estimated spectrophotometrically.
  • the state of antioxidant protection is assessed by the level of reduced glutathione by the cadmium method.
  • the amount of reduced thiol groups of proteins is determined spectrophotometrically by the interaction of SH-rpynn with 5,5-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid.
  • Total antioxidant status is determined by coulometric or chemiluminescent methods.
  • the collection of whole saliva can be carried out in several ways: either by direct spitting it into a test tube, or by placing a cotton or paper swab in the oral cavity, followed by centrifugation at a speed of 3000-20000 rpm for 5-30 minutes.
  • There are special devices for collecting saliva directly from the ducts of the salivary glands such as the Krasnogorsky-Leshli-Yushchenko capsule and its various modifications.
  • saliva is collected in the morning on an empty stomach or 1-3 hours after a meal. Saliva is collected for 5-15 minutes.
  • a mandatory procedure that precedes the collection of saliva should be hygienic processing of the mouth, since plaque contains a large amount of protein and enzymes.
  • the next step was the study of diurnal fluctuations of biomarkers.
  • 120 samples of saliva were collected that were collected in the morning (maximum secretion time). Further, saliva samples were centrifuged.
  • biomarkers were determined, namely: potassium, sodium, magnesium, calcium, phosphate ions, as well as protein and urea.
  • the arithmetic mean value (M) was calculated, the standard error of the arithmetic mean (t), median (Me), the range of values was 5-95%.
  • two types of statistical criteria were used: parametric (t - Student's test) and nonparametric (U - Wilcoxon's test).
  • the study determined the indicators of mineral metabolism, as well as the protein and urea content in the saliva of healthy adults (47 people, 62% of women and 38% of men). The results are given in table 3.
  • the experiment revealed a relative constancy of the values of the analyzed parameters, insignificant concentration fluctuations were noted for calcium and phosphorus ions, but their Ca / P ratio remained constant during the experiment (Fig. 2a), which should be taken into account when assessing the saliva biochemical parameters in clinical laboratory diagnostics. The content of the remaining studied parameters remained within the statistical error of the experiment.
  • the parameters of mineral metabolism were selected as the studied parameters, namely: the concentration of calcium ions, inorganic phosphorus and chlorides (table 4).
  • Calcium plays an important role in the implementation of life processes: it affects the permeability of biological membranes, participates in neuromuscular conduction, the formation of bones and cartilage, affects the metabolism in cells, the secretion of hormones, biologically active substances, is an important factor in coagulation blood.
  • Inorganic phosphorus is one of the components of the acid-soluble fraction of phosphorus, which also includes pyrophosphates (ATP, ADP, etc.), hexose-, glycerophosphates, etc.
  • Chlorine ions are the most important osmotically active ions of blood plasma, lymph, cerebrospinal fluid, and cellular contents.
  • albumin performs three main functions: it creates colloidal osmotic pressure of plasma (and other biological fluids), serves as a rich and quickly realized protein reserve and vehicle; thanks to albumin, both water and mineral metabolism are largely regulated.
  • Alkaline phosphatase an enzyme present in each organ, is localized in the cell membrane and is involved in the transport of biologically important compounds.
  • Imidazole derivatives include the amino acid histidine and its metabolites (histamine, urocanilic acid, etc.) and characterize the proteolysis of salivary proteins and the course of inflammatory processes.
  • Purine nucleotides are essential components of human cells.
  • the dynamic equilibrium between their biosynthesis and decay characterizes the content of uric acid in body fluids [Pu- Stovalova L.M., Zagreba N.D. 2004.
  • the successes of modern science. 3: 32-33] including in human saliva [Noskov VB 2008. Saliva in clinical laboratory diagnostics. Clinical laboratory diagnostics. 6: 14-17; Kochurova E.V., Kozlov SV. 2014. Diagnostic capabilities of saliva. Clinical laboratory diagnostics. 1: 13-16; Velskaya L.V. 2015. Saliva as an object of clinical laboratory diagnostics. Omsk: Omskblankizdat. 148 s].
  • xanthine oxidase The limiting factor in the formation of uric acid is the enzyme xanthine oxidase, which is involved in two reactions: the conversion of hypoxanthine to xanthine, and then xanthine to uric acid.
  • Xanthine oxidase is an aerobic oxidoreductase whose prosthetic group contains flavin adenine dinucleotide (FAD), molybdenum and iron (III) ions, participating in the decay of purine bases.
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • III iron
  • the aim of the study was to determine the content of uric acid and the activity of xanthine oxidase in “normal” saliva and on the background of cancer pathology.
  • the main drugs used to correct this metabolic disorder are analogues of the purine base of hypoxanthine, which reduces uric acid levels by inhibiting xanthine oxidase [B. Galunska et al. 2004. Two-faced Janus biochemistry: uric acid - an oxidant or an antioxidant? Nephrology. 4 (8): 25-31].
  • their purpose allows to avoid delaying the start of cytostatic therapy, which is of particular importance in patients with intensively proliferating malignant neoplasms [Semenova A.I. 2006. Hypercalcemia and tumor decay syndrome. Practical oncology. 2 (7): 101-107].
  • Surgical non-invasive monitoring of uric acid and xanthine oxidase levels in saliva will allow timely correction of hyperuricemia to prevent the development of acute renal failure during treatment of cancer patients.
  • antioxidant activity is to study the kinetics of blocking radicals generated directly in the reaction medium, in particular, the xanthine / xanthine oxidase system.
  • one of the components of antioxidant protection is uric acid, capable of intercepting excessively produced free radicals.
  • An increase in xanthine oxidase activity at a relatively constant level of uric acid indicates an increase in the generation of reactive oxygen species, and as a result, an increase in the superoxide-forming and carcinogenic activity of xanthine oxidase. This effect is more pronounced for a group of patients with various types of cancer pathology.
  • breast cancer prognostic characteristics of biomarkers for the diagnosis of breast cancer (breast cancer). This study determined the markers of endogenous intoxication in the saliva of practically healthy people, as well as in a group of patients with benign and malignant pathologies of the mammary gland.
  • Endogenous intoxication is a cascade, staged, progressive generalized process, caused by the accumulation of toxic substances in concentrations exceeding the functional capabilities of natural systems of neutralization with subsequent damage to other organs and systems of the body.
  • EI Endogenous intoxication
  • MSM Medium molecular oligopeptides
  • MSM are proteins and their metabolic products, including products of the hydrolysis of fibrinogen, globulins, catabolism of glycoproteins, oligosugar, nucleotides, as well as hormones and their fragments.
  • Oxidative stress products whose markers are diene conjugates, malondialdehyde (MDA), etc., have a serious damaging and toxic effect.
  • MDA malondialdehyde
  • the functioning of enzymes of the antioxidant system can occur, in particular catalase [Bezruchko N.V. et al. (2012) Vestnik TSPU, 7 (122), 94-98.], as well as the concentration of the main antioxidants change [Olempieva EV, Ternova
  • a tumor has a depressive effect on the systems and structures of the whole patient’s body as a result of the influence of biologically active products of malignant growth metabolism [Okrut I.E., Shakerova D.A., Veselova T.A. (201 1) Bulletin of the Nizhny Novgorod University. N.I. Lobachevsky. Biology, 5 (1), 1 18-121. Belonogov R.N., Titova N.M., Dykhno Yu.A. et al. (2009) Siberian Oncology Journal, 4 (34), 48-51] ... Therefore, the control of endogenous intoxication markers, in particular MDA, DC and MSM, is a promising direction in the diagnosis and monitoring of treatment of cancer.
  • a detailed description of the studied groups is shown in Fig.7.
  • Saliva samples were collected on an empty stomach in the morning in sterile tubes, centrifuged at 7,000 rpm. The intensity of lipid peroxidation was evaluated by the level of the secondary product malondialdehyde (MDA) in the thiobarbituric acid test. The content of lipid peroxidation products (lipid peroxidation) (diene conjugates of DC, triene conjugates of TC, Schiff bases of OSh), the content of medium-weight molecules (MSM), and catalase activity were also determined.
  • MDA malondialdehyde
  • MSM medium-weight molecules
  • MDA is known to be an extremely toxic compound with high biological activity. Easily diffusing through membranes, MDA interacts with the nitrogenous components of proteins and nucleotide bases of DNA, forming even more toxic compounds, for example, Schiff bases, which can cause the start of degenerative processes in cells [Alferova V.V. (201 1) Social and clinical psychiatry, 3, 54-57].
  • the level of MSM is higher in the group of patients with breast cancer, for all age groups, except for the group of 60-69 years old.
  • An increase in the level of these substances in saliva indicates the formation of non-specific endogenous intoxication [Karyakina EV, Belova SV. (2004) Clinical and laboratory diagnostics, 3, 4-8].
  • the accumulation of MSM in biological fluids with normal renal function is the result of increased formation of non-physiological metabolites [Umansky MA (1991) Kiev: Naukova Dumka, 21 1-213].
  • MSM belong to protein toxins with a high content of dicarboxylic and low - aromatic acids.
  • a specific feature of the toxic effect of medium molecules is that they have a direct membrane-toxic effect and initiate the manifestation of peptides that are close in structure to bioregulators. It is possible to isolate two fractions of MSM containing aromatic amino acids (280 nm) and not containing aromatic amino acids (254 nm). The level of MSMs that do not contain aromatic amino acids is higher in all the studied groups (Tables 9, 10); normally, a slight increase in the level of both fractions (254 and 280 nm) with age (Tables 9) was noted.
  • Catalase activity is increased both in the group of patients with benign breast formations and in the group of patients with breast malignant neoplasms, which indicates impaired functioning of the antioxidant defense system in both cases (Tables 9, 10).
  • An increase in enzyme activity occurs as a result of intensification of membrane-destructive processes under the influence of activation of processes free radical oxidation, which in turn leads to an increase in endotoxemia [Degtyareva N.V., Pilipko A.A., Shushkova I.G. et al. (2008) Clinical Laboratory Diagnostics, 9, 59. Zaitsev VG, Ostrovsky OV (2008) Clinical Laboratory Diagnostics, 9, 61. Titov V.N., Krylin V.V., Dmitriev V.A., Yashin A.I. (2010) Clinical Laboratory Diagnostics, 7, 3-14].
  • results obtained at this stage confirm the promise of using biomarkers of oxidative stress and an antioxidant defense system in patients with oncological pathology when using human saliva as a biosubstrate.
  • the aim of the first study was to study the effectiveness of the technique in the case of the diagnosis of pulmonary malignancy. For this, a group of 65 patients of both sexes and all ages was assembled. Eighteen patients in the group had a histologically confirmed diagnosis of pulmonary heart disease. 47 patients had a conclusion on the result of computed tomography about the absence of a tumor process in the lungs and did not have significant health complaints.
  • Saliva was collected in the morning on an empty stomach in a disposable sterile tube. Each patient included in the study signed an informed consent and provided a complete medical history. The obtained biomarker values were processed by multivariate analysis, and the results were presented in graphical form. The results of using the technique in screening for pulmonary malignancy in the lung are shown in FIG. 12.
  • the next stage of the study was to verify the effectiveness of the method with the participation of patients with various non-oncological pathologies in the study.
  • a group of 70 patients was assembled in which 30 patients of both sexes had a histologically confirmed diagnosis of pulmonary malignancy.
  • 40 patients had a conclusion on the result of computed tomography about the absence of a tumor process in the lungs and had one or several concomitant diseases from the list: CHF, AH, COPD, CHD, AS, bronchitis, gastritis, diabetes, abscess, pneumonia, and no more than one non-cancerous tumor from the following list: fibrosis, tuberculoma, hamartoma.
  • One of the applications of the technique is the differential diagnosis of non-cancer diseases.
  • a group of 38 patients of both sexes was formed, in which 16 patients had a histologically confirmed diagnosis of lung fibroma, 8 patients had lung hamartoma and 14 patients had pulmonary tuberculosis.
  • Saliva was collected in the morning on an empty stomach in a disposable sterile tube. Each patient included in the study signed an informed consent and provided a complete medical history. The obtained biomarker values were processed by multivariate analysis, ,
  • Example 1 Patient A turned to the clinic with complaints of shortness of breath during physical exertion, intense coughing, hemoptysis, weakness, fatigue. After the initial examination, a diagnosis was made - acute bronchitis, treatment was prescribed. After treatment, an improvement was noticed after 2 weeks, all complaints began to grow again. The patient decided to check the diagnosis with the proposed method. He collected 5 ml of saliva in the morning on an empty stomach before brushing his teeth. The saliva sample was centrifuged to separate the sediment, then the values of the biomarkers were determined in it. test kit for the diagnosis of lung diseases.
  • the obtained biomarker values by the discriminant analysis method were compared with the results of biomarkers of groups of patients with a confirmed diagnosis of pulmonary malignancy, non-cancer lung diseases including: tuberculosis, pneumonia, abscess, as well as healthy patients.
  • a discriminant analysis of the biomarker values (Fig. 15) of the examined patient he fell into the group of patients with a diagnosis of pulmonary pulmonary obstruction, a conclusion was made - pulmonary pulmonary obstruction.
  • the MSCT of the OGK was appointed, the conclusion was made: CT signs of the central nervous system of the upper lobe of the right lung, with paracancrotic inflammatory changes, bronchoscopy was prescribed. According to the results of bronchoscopy, the presence of a tumor in the upper right lobe was established. The result of histological examination is squamous ZNO. Thus, the result of the conclusion on the proposed method coincided with the diagnosis.
  • Example 2 Patient B turned to the clinic with complaints of acute pain along the 10 ribs to the right from behind, directed for further examination. He performed the MSCT of OGKs as a result of which a formation in the lower lobe on the right with a size of 54.5x48x57.5 mm was detected. Appointed surgical treatment. The patient decided to check the diagnosis with the proposed method. He collected 5 ml of saliva on an empty stomach in the morning before brushing. The saliva sample was centrifuged to separate the sediment, then the biomarkers of the test kit were determined in it to diagnose lung diseases.
  • the obtained biomarker values by the discriminant analysis method were compared with the biomarker results of groups of patients with a confirmed diagnosis - pulmonary malignancy, non-cancer lung diseases including: tuberculosis, pneumonia, abscess, as well as healthy patients.
  • a discriminant analysis of the biomarker values of the examined patient Fig. 16
  • Example 3 Patient B turned to the clinic with complaints of compaction in the right mammary gland, examination: ultrasound. As a result of ultrasound, focal formation of the right breast was established, surgical treatment was prescribed in the scope of sectoral resection. The patient decided to check the diagnosis with the proposed method. She collected 5 ml of saliva in the morning on an empty stomach before brushing. The saliva sample was centrifuged to separate the sediment, then the biomarkers of the test kit for the diagnosis of breast diseases were determined in it.
  • the obtained biomarker values by the discriminant analysis method were compared with the biomarker results of groups of patients with a confirmed diagnosis of breast malignancy, non-oncological diseases of the mammary gland, including fibroadenoma and fibroadenomatosis, as well as healthy patients. According to a discriminant analysis of the biomarker values of the examined patient (Fig. 17), he was included in the group of patients with a diagnosis of fibroadenoma; a conclusion was made - fibroadenoma.
  • Example 4 Patient G found a focal lesion in the left mammary gland, went to the clinic where an ultrasound scan was performed. According to the results of ultrasound, focal formation of the right mammary gland was established, surgical treatment was prescribed in the volume of left-sided radical mastectomy with preservation of both pectoral muscles. The patient decided to check the diagnosis with the proposed method. She collected 5 ml of saliva in the morning on an empty stomach before brushing her teeth. The saliva sample was centrifuged to separate the sediment, then the biomarkers of the test set for the diagnosis of breast diseases were determined in it.
  • the obtained biomarker values by the method of discriminant analysis were compared with the results of biomarkers of groups of patients with a confirmed diagnosis of breast cancer, non-oncological diseases of the breast, including fibroadenoma and fibroaden nomatosis, as well as healthy patients. According to a discriminant analysis of the biomarkers of the examined patient (Fig. 18), he was included in the group of patients with a diagnosis of breast cancer, the conclusion was made - breast cancer.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Изобретение относится к методам определения патологических состояний человека за счет биомаркеров, определяемых в слюне одним из ряда технологических подходов, в том числе, но не ограничиваясь, биохимическими методами, иммуноферментным анализом, методами капиллярного и гелевого электрофореза и т.д., а также технологии анализа многомерных данных в диагностических целях. Требуемый технический результат, заключающийся в упрощении и расширении области применения, достигается способе, согласно котрому анализируют образцы биологической жидкости, в качестве которой используют цельную слюну, полученную от пациентов, составляют тестовый набор биомаркеров, содержащихся в образцах, полученных от пациентов тестовой группы, которая включает контрольную группу, состоящую из пациентов без патологии здоровья, а также исследуемую группу, которая включает пациентов с диагностируемым патологическим состоянием, при этом, включение биомаркера в тестовый набор осуществляется по результатам статистического анализа его значений определенных у пациентов тестовой группы и определения критерия Вил-коксона между контрольной группой и исследуемой группой, а факт наличия или отсутствия патологического состояния определяют путем дискриминантного анализа значений биомаркеров тестового набора определенных в цельной слюне пациента с диагностируемым патологическим состоянием и тестовой группы, причем, при попадании результата дискриминантного анализа значений биомаркеров тестового набора пациента с диагностируемым патологическим состояни-емв результаты контрольной группы делается заключение об отсутствии патологии, а при попадании в исследуемую группу делается заключение о наличии патологии.

Description

Способ оценки состояния организма
по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно
Изобретение относится к методам определения патологических состояний человека за счет биомаркеров, определяемых в слюне одним из ряда технологи- ческих подходов, в том числе, но не ограничиваясь, биохимическими методами, иммуноферментным анализом, методами капиллярного и гелевого электрофоре- за и т.д., а также технологии анализа многомерных данных в диагностических целях.
В последнее время возросло внимание исследователей к изучению свойств слюны человека, как материала с уникальными свойствами и диагностическими возможностями.
Исследование слюны относится к неинвазивным методам и проводится для оценки возрастного и физиологического статуса, выявления соматических забо- леваний, патологии слюнных желёз и тканей полости рта, генетических маркё- ров, мониторинга лекарственных средств и др. [Кочурова Е.В. Диагностические возможности слюны. Клиническая лабораторная диагностика. 2014. Ns 1. С.13— 16; Chiappin S., Antonelli G., Gatti R., De Palo E.F. Clinica Chimica Acta. 2007. Vol.383. P.30-40; Pereira Lima D., Garcia Diniz D., et al. International Journal of In- fectious Diseases. 2010. Vol.14. P.184-188; Хаустова C.A., Шкурников М.Ю., Гре- бенюк Е.С. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Т.148. J4°1 1. С.597-600.].
Слюна человека может использоваться в качестве биологической жидкости для анализа различных маркеров, таких как электролиты, гормоны, лекарства, антитела и т.д. Такая диагностика вполне оправдана, ведь помимо
99% воды слюна содержит растворенные в ней анионы СГ, Р04 3 С032 ", SCN", Г, Br", F", S04 2~; катионы Na+, K+, Ca2+, Mg2+ и микроэлементы Fe3+, Fe2+, Cu2+, Mn2+, Ni2+, Li+, Zn2+ и т.д.; органические вещества - белок и его фракции (альбумин, глобулины), аминокислоты, муцин; ферменты - амилазу, лактазу, лизоцим, калликреин, паротин, а также холестерин, глюкозу, молочную кислоту и витамины С, В 1 , В 12, Н, К [Боровский Е.В., Леонтьев В.К. Биология полости рта. М.: Медицина. 1991. 271с; Забросаева Л.И., Козлов Н.Б. Биохимия слюны. Омск. 1992. 44с; Вавилова Т.П. Избранные лекции по стоматологической биохимии. М. 1994. 28с; Денисов А.Б. Типовые формы патологии слюнных желез. М. 1993. 122с].
Высоки потенциальные возможности использования слюны с целью выявления системных заболеваний [Rudney J.D. Does variability in salivary protein concentrations influence oral microbial ecology and oral health? Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1995. .V.6 (4). PP.343-367] и локальных патологий [Bergdahl. M. Low un- stimulated salivary flow and subjective oral dryness: association with medication, anx- iety, depression, and stress. J. Dent. Res. 2000. V.79. JY«9. PP. 1652-1658].
Содержание макро- и микроэлементов во внутренних органах и средах определенным образом отражает гомеостатический статус организма, является весьма точным и чувствительным критерием, позволяющим служить сигналом наступивших в нем патологических изменений [Скальный. А.В. Химические элементы в физиологии и экологии человека. М.: Мир. 2004. 216 с]. Именно с этой точки зрения оцениваются сдвиги в содержании ряда микроэлементов в крови при клинических исследованиях [Скальный А.В. Биоэлементы в медицине. М.: Издательский дом «Оникс 21 век». 2004. 272 с; Ибрагимова. М.Я. Взаимосвязь дисбаланса макро- и микроэлементов и здоровье населения (обзор литературы). Казанский медицинский журнал. 201 1. Т. 92, N° 4. С. 606-609.].
Известно, что в составе слюны присутствуют все макро- и микроэлементы, что позволяет использовать данную биологическую жидкость для оценки состояния обмена химических элементов в организме и позволяет с достаточно высокой точностью судить об эффективности работы его морфофизиологических систем и риске развития тех или иных патологических состояний [Носков В. Б. Слюна в клинической лабораторной диагностике. Клиническая лабораторная диагностика. 2008. N° 6. С. 14-17; Вельская Л.В. Применение слюны в диагностических исследованиях. Омск: ИНТЕХ. 2013. 98 с].
Кроме того, слюна по сравнению с кровью является динамичной средой, отражающей ежедневные изменения в организме.
Основное преимущество проведения диагностики по составу слюны со- стоит в том, что сбор образцов слюны - это неинвазивная, безболезненная и удобная для пациента процедура. Собрать образцы слюны можно в любое время, днем и ночью, эту процедуру можно выполнить в обстоятельствах, когда отбор крови невозможен.
Таким образом, слюна может быть альтернативой широко используемой сыворотке крови. Диагностика по слюне может быть востребована в таких обла- стях как спортивная медицина, психология, педиатрия, геронтология и других. Образцы слюны стабильны 7 дней при комнатной температуре, 4 недели при 2- 8°С, длительный период при температуре ниже -20°С. Такая высокая стабиль- ность позволяет удобно наладить логистику доставки образцов до места прове- дения анализа, например, дает возможной пересылку образцов слюны обычной почтой.
Исследование слюны по многим клинико-биохимическим показателям имеет преимущество по сравнению с рутинными методами лабораторной диа- гностики с использованием крови, полученной из пальца или вены [Каминская Л.А. Российская стоматология. 2010. N°3. С.36-42].
Этот биоматериал широко используется не только в клинической практи- ке, но и при гигиенических и токсикологических исследованиях, а также для изучения фармакодинамики лекарственных средств и в специальных научных целях.
В области изобретательства известен способ выявления рака молочной железы патент [US 30251 10, 01.09.201 1], основанный на определении в образцах слюны человека, по меньшей мере, двух транскриптомных и протеомных биомаркеров и сравнении результатов исследования с данными, полученными от исследуемой и контрольной групп пациентов. Основным недостатком способа является относительно низкая оператив- ность, обусловленное использованием биомаркеров, которые определяются преимущественно иммуноферментным методом, что приводит к существенному удорожанию и увеличению времени диагностической процедуры. Также недостатком способа является относительно узкая узкая область применения биомаркеров, ограниченная только выявлением рака молочной железы. Кроме того, применяемая методика анализа заключается в численном сравнении двух видов показателей и несёт все недостатки, характерные для способов, основанных на сравнении значения показателя со среднестатистической нормой - невозможность точной диагностики патологии (так как отклонения одного параметра могут одновременно свидетельствовать о разных патологиях), необходимость проведения дополнительных исследований (результат анализа является только индикатором наличия патологии, но не позволяет её идентифицировать и определить её характер).
Известен также способ раннего выявления рака легкого [US 5455159, 03.09.1995], основанный на количественном определении взаимодействия биологических образцов с моноклональными антителами в присутствии антигенов, повышение которых коррелирует с развитием от рака легких, при этом, в качестве биологических образцов рекомендуется использовать любую жидкость из дыхательных путей, включая мокроту или бронхиальную жидкость, а также тканей легкого или лимфатических узлов.
Недостатками этого способа является относительно низкая оперативность и высокая сложность проведения иммуноферментных исследований с моноклональными антителами, а также сложность и инвазивность получения биологических образцов. Кроме того, недостатком этого способа является ограниченная область применения указанной группы биомаркеров - только для выявления рака легкого.
Кроме того, известен способ определения рака легких - Заявка на патент [WO 2011 100483, 18.08.2011], - основанный на анализе значений группы биомаркеров, определяемых способами проточной цитометрии или полимеразной цепной реакции, где в качестве биологической жидкости предлагается использовать слюну.
Недостатком способа является относительно высокая сложность и относи- тельно низкая оперативность, обусловленные использованием биомаркеров, которые определяются способами ИФА, ПЦР, а также проточной цитометрии, что приводит к повышению времени его проведения. Кроме того недостатком является ограничение области применения указанной группы биомаркеров только выявлением рака легкого.
Помимо указанных выше, известен способ определения заболеваний полости рта и пародонта, а также выявления рака полости рта и пародонта [US 201 10021370, 26.10. 2007], основанный на определении в слюне группы биомаркеров, в которую входят соединения группы цитокинов, а также ДНК, и сравнении уровня их экспрессии с уровнем, определенном в контрольной группе.
Недостатками этого известного способа является относительно низкая оперативность и высокая сложность, а также относительно узкая область применения, ограниченная только заболеваниями полости рта.
К известным относится и способ определения рака желудка [US 20130065769, 08.09.201 1 ], основанный на определении в слюне группы биомаркеров, в которую входят группа молекул микро-РНК.
Недостатками способа являются относительно низкая оперативность и высокая сложность, обусловленные процессом проведения исследований микро- РНК методами ПЦР и масс-спектроскопии, а также относительно узкая область применения, ограниченная только для выявления рака желудка.
Высокая сложность приведенных выше примеров обуславливает и их от- носительно высокую стоимость, что затрудняет массовое применение указанных способов диагностики, в том числе в профилактических целях, а также частое применение, в том числе в рамках периодической диспансеризации. Между тем, ранняя диагностика патологии является крайне важной в лечении большинства известных заболеваний, в том числе онкологических. Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ прогнозирования развития злокачественных новообразований [RU 2521393, С2, G01N33/50, 27.06.2014], включающий генотипирование биологиче- ских сред организма при помощи ПЦР в режиме реального времени и последу- ющую оценку, что в качестве биологической среды организма используют слю- ну, применяют системы праймеров и аллельспецифичные линейно-разрушаемые зонды (TaqMan) и при наличии комбинации генотипов XRCC 1 280(GG) hOGGl 326(CC/CG) XPD1 751 (AA) GSTMl(-) NOS3 774(TT/CT) прогнозируют высокий риск развития злокачественных новообразований, а при наличии любого из ма- жорных генотипов XRCC 1 280G>A, XPD1 751А>С, hOGGl 326C>G, CYP2C 19 681G>A и NOS3 V TR прогнозируют невысокий риск развития злокачествен- ных новообразований.
Недостатком наиболее близкого технического решения является его отно- сительно высокая сложность и низкая экономичность, обусловленные использо- ванием биомаркеров, которые определяются методом ПЦР. Кроме того, извест- ный способ обладает относительно узкой областью применения, поскольку не позволяет определять фактическое наличие злокачественного новообразования, а также определять органную принадлежность опухоли и не распространяется на неонкологические патологии.
Задача, которая решается в предложенном способе, заключается в упроще- нии способа и расширении области его применения путем создания простого и экономичного способа, позволяющего определять фактическое наличие, вид и органную принадлежность заболевания.
Требуемый технический результат заключается в упрощении способа и расширении области его применения при использовании в качестве биологиче- ского образца слюны пациента, которую можно получить неинвазивно и которая не требует специфичных условий хранения и доставки, а также в составлении набора биомаркеров, определяя которые, можно проводить диагностику различ- ных патологий организма, как онкологических, так и неонкологических и в усо- вершенствовании самого процесса получения и интерпретации биомаркеров, по- лучаемых из биологической жидкости, который позволял бы выявлять наличие, вид и органную принадлежность широкого спектра заболеваний без применения сложных методик ПЦР, микро-РНК и других, а работал бы с параметрами, полу- чаемыми в результате проведения стандартных операций и подготовительных действий.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат дости- гается тем, что, в способе анализируют образцы биологической жидкости, в ка- честве которой используют цельную слюну, полученную от пациентов, согласно изобретению, составляют тестовый набор биомаркеров, содержащихся в образ- цах, полученных от пациентов тестовой группы, которая включает контрольную группу, состоящую из пациентов без патологии здоровья, а также исследуемую группу, которая включает пациентов с диагностируемым патологическим состо- янием, при этом, включение биомаркера в тестовый набор осуществляется по ре- зультатам статистического анализа его значений определенных у пациентов те- стовой группы и определения критерия Вилкоксона между контрольной группой и исследуемой группой, а факт наличия или отсутствия патологического состоя- ния определяют путем дискриминантного анализа значений биомаркеров тесто- вого набора определенных в цельной слюне пациента с диагностируемым пато- логическим состоянием и тестовой группы, причем, при попадании результата дискриминантного анализа значений биомаркеров тестового набора пациента с диагностируемым патологическим состоянием в результаты контрольной груп- пы делается заключение об отсутствии патологии, а при попадании в исследуе- мую группу делается заключение о наличии патологии.
До появления заявленного способа базовые и общераспространённые био- маркеры не использовались для диагностики организма, в частности, по слюне и другим биологическим жидкостям, доступным неинвазивно, ввиду их относи- тельно малого содержания в объеме анализа (а уровень техники не позволял их получить или концентрировать в больших количествах, необходимых для прове- дения исследований), а также ввиду их подверженности многим внешним фак- торам, которые в большей степени характеризуют не состояние организма, а следы воздействия на него внешней среды или кратковременные состояния (например, голод, интоксикация и т.д.). В заявленном способе указанная про- блема решена за счет изменения процесса - процедуры подготовки образцов цельной слюны, позволяющей выделить биомаркеры даже в небольших объемах образцов, и за счет включения в процедуру применения ЭВМ, позволяющей реа- лизовать многомерный дискриминантный анализ одновременно по группе пара- метров в их взаимосвязи, а не по отдельности, в том числе и в отношении малого количества биологического материала.
В базовый набор биомаркеров включены биохимические параметры, кото- рые отражают функциональное состояние организма в целом. Комбинируя их в различных последовательностях можно формировать тестовые наборы для диа- гностики конкретных заболеваний. Такой набор включает, по крайней мере, сле- дующие биомаркеры: показатели минерального обмена (ионы кальция, натрия, калия, магния, бария, стронция, аммония, железа, меди, цинка, селена, лития, фосфаты, хлориды, фториды, бромиды, йодиды, нитриты, нитраты, сульфаты, карбонаты, гидрокарбонаты и т.д.); субстраты (белок, белковые фракции, муцин, альбумин, глюкоза, молочная кислота, пировиноградная кислота, оксид азота, сиаловые кислоты, церулоплазмин, гексозамины, фукоза, креатинин, мочевая кислота, ксантин, мочевина, аммиак, общие гликопротеиды, суммарные а- аминокислоты, иминокислоты, амины, нитрозамины, нитрозтиолы, аргинин, ги- стидин, тирозин, серии, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, трипто- фан, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, треонин, фенилаланин, метионин, ли- зин, пролин, белки богатые пролином, летучие жирные кислоты (пропионовая, уксусная, масляная, изовалериановая, янтарная, муравьиная, яблочная, лимон- ная), неэтерифицированные жирные кислоты, кетоновые тела, иммуноглобули- ны и т.д.); ферменты (альдолазы, аланинаминотрансфераза, аспартатамино- трансфераза, α-амилаза, креатинкиназа, лактатдегидрогеназа, щелочная фосфата- за, кислая фосфатаза, гаммаглутамилтрансфераза, а- гидроксибутиратдегидрогеназа, супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, ксантиноксидаза, орнитиндекарбоксилаза и т.д.); липиды (триглицериды, холе- стерин, β-липопротеиды) и показатели системы перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита (диеновые конъюгаты, триеновые конъюгаты, основа- ния Шиффа, малоновый диальдегид, окислительная модификация белков, общий антиоксидантный статус, уровень молекул средней массы и т.д.).
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что ре- зультаты анализа сравнивают не со среднестатистическими показателями, при- знающимися нормой, а одновременно с двумя группами показателей, одна из ко- торых является контрольной группой, состоящей из пациентов без патологии здоровья, а другая - группу сравнения, которая включает пациентов с различны- ми патологическими состояниями. Такой анализ возможно достоверно произве- сти только если правильно сформировать тестовый набор биомаркеров, то есть только определенные параметры в их соотношении и взаимосвязи могут свиде- тельствовать о том или ином состоянии организма. Тестовый набор биомаркеров выбирается из базового набора таким образом, что последний является дискри- минационным между контрольной группой и группой сравнения. Полученные данные сравнивают друг с другом с применением ЭВМ и использованием мето- дик многомерного статистического анализа, применяя который вычисляют инте- гральный показатель по значениям биомаркеров тестового набора, интегральные показатели для контрольной группы и группы сравнения. Полученные инте- гральные показатели представляют графически в системе координат и на основе координат точки интегрального показателя тестовой группы с двумя другими группами делают вывод о вероятностном наличии или отсутствии патологии.
Несмотря на то, что использование математических статистических мето- дов известно в медицине, применение метода многомерного дискриминантного анализа до настоящего времени оставалось неизвестным и не описано в доку- ментах, составляющих уровень техники, не следует из них с очевидностью.
Очевидно, что применение математических статистических методов до по- явления описываемого изобретения представлялось нецелесообразным, так как известные методики анализа предполагали сравнение нескольких (двух-трех) биомаркеров, а также ввиду технической невозможности использования ЭВМ для проведения расчетов и интерпретации результатов.
Интегральный показатель рассчитывается путем одновременной оценки значений, по крайней мере, пяти биохимических параметров, выбранных из ба- зового набора, путем вычислений с применением ЭВМ и использованием дис- криминационной функции получают проекцию интегрального показателя на системе координат в двух измерениях.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что иссле- дуемая группа формируется таким образом, чтобы в её состав одновременно включались пациенты, имеющие не менее одной онкологической или неонколо- гической патологии, при этом группа пациентов с онкологической патологией формируется таким образом, чтобы входящие в неё пациенты имели признаки следующих видов заболеваний: рак легкого, молочной железы, колоректальный, пищевода, желудка, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, предста- тельной железы, яичника, шейки матки, тела матки, мочевого пузыря, почки, щитовидной железы, мозга, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома и т.д.
На чертежах и иллюстрирующих материалах представлены:
фиг. 1. - результаты сравнения исследуемых групп по возрасту;
фиг.2а. - изменение рН, концентрации кальция и неорганического фосфо- ра;
фис.2б. - изменение концентраций натрия, калия, магния, мочевины и бел- ка;
фиг. 3. - результаты сравнения биохимического состава отдельных образ- цов слюны в течение недели с интервалом в 24 часа;
фиг. 4 - результаты сравнения биохимического состава образцов слюны в зависимости от региона прож:ивания;
фиг. 5 - функции классификации в зависимости от региона проживания; фиг. 6 - характер распределения экспериментальных данных и корреляции между исследуемыми параметрами;
фиг. 7 - классификация пациентов с заболеваниями молочной железы;
фиг. 8 - соотношение МСМ 254/280 нм в зависимости от возраста;
фиг. 9 - результат многомерного анализа для группы 30-39 лет;
фиг. 10 - результат многомерного анализа для группы 50-59 лет;
фиг. 1 1 - результат многомерного анализа для контрольной группы с учетом TNM классификации; - фиг. 12 - результаты анализа группы с ЗНО легкого (маркеры в форме ром- ба) со здоровыми людьми (квадратные и круглые маркеры);
фиг. 13 - результаты анагшза групп с ЗНО легкого (закрашенные круглые маркеры) и доброкачественными заболеваниями (все остальные);
фиг. 14 - разделение доброкачественных заболеваний: фиброма - квадрат- ные маркеры, гамартома - круглые маркеры, туберкулема - маркеры в форме ромба;
фиг. 15 - результаты дискриминантного анализа значений биомаркеров об- следуемого пациента (пример 1);
фиг. 16 - результаты дискриминантного анализа значений биомаркеров об- следуемого пациента (пример 2);
фиг. 17 - результаты дискриминантного анализа значений биомаркеров об- следуемого пациента (пример 3);
фиг. 18 - результаты дискриминантного анализа значений биомаркеров об- следуемого пациента (пример 4);
таблица 1 - Вариации биохимического состава слюны в зависимости от пола
таблица 2 - биохимический состав слюны в различных возрастных груп- пах;
таблица 3 - вариации биохимического состава слюны в зависимости от по- ла;
таблица 4 - показатели минерального обмена в зависимости от региона проживания;
таблица 5 - биохимические показатели слюны в зависимости от региона проживания;
таблица 6 - результаты дискриминантного анализа;
таблица 7 - результаты определения пуринов в слюне;
таблица 8 - корреляционные взаимосвязи содержания пуринов в слюне в норме и при онкологической патологии;
таблица 9 - биомаркеры эндогенной интоксикации в норме; таблица 10 - Биомаркеры эндогенной интоксикации при доброкачествен- ных и злокачественных заболеваниях молочных желез;
таблица 1 1 - биомаркеры ЭИ в зависимости от размера опухоли при ЗНО молочной железы.
Реализуется способ оценки состояния организма по образцам биологиче- ской жидкости, получаемой неинвазивно, следующим образом.
В качестве образцов диагностической жидкости используют цельную слю- ну, при этом образцы слюны проходят стандартную предварительную подготов- ку с целью выделения заранее заданной группы биомаркеров.
Значения биомаркеров могут быть определены стандартными и уже из- вестными методами: атомно-абсорбционным, атомно-эмиссионным, ионометри- ческим, колориметрическим, титриметрическим, гравиметрическим, методом капиллярного электрофореза, комплексонометрическим, фотометрическим, флу- ориметрическим, аргентометрическими или ртутнометрическими (осадочными), электрохимическими, потенциометрическими, энзиматическими, радиоиммуно- логическими, методами газовой хроматографии, нефелометрии иммунофермент- ного анализа, хемилюминесценции, гелевого электрофореза, масс- спектрометрии и др.
В качестве цели исследования состояния живого организма выбирают ве- роятность наличия онкологического или неонкологического заболевания, любой иной патологии.
В различных областях применения настоящего изобретения, определяются количественные значения биомаркеров в слюне у различных групп обследуемых пациентов. Пациенты выбираются таким образом, что они могут быть сгруппи- рованы в одно или несколько подмножеств на основе диагностической ценности различных биомаркеров для определения различных заболеваний. Измеренные значения биомаркеров в образцах слюны сравнивают для того, чтобы выделить группу, которая имеет значительные отличия в различных подмножествах. Вы- деленная группа биомаркеров может быть использована в качестве основного или вспомогательного средства в диагностике различных патологических состо- яний человека. Для оценки состояния организма опытным путём в ходе разработки и апробации заявляемого способа был сформирован базовый набор биомаркеров включающий в себя, но не ограничиваясь, следующие показатели: минерального обмена (ионы кальция, натрия, калия, магния, бария, стронция, аммония, железа, меди, цинка, селена, лития, фосфаты, хлориды, фториды, бромиды, йодиды, нит- риты, нитраты, сульфаты, карбонаты, гидрокарбонаты и т.д.); субстраты (белок, белковые фракции, муцин, альбумин, глюкоза, молочная кислота, пировино- градная кислота, оксид азота, сиаловые кислоты, серогликоиды, церулоплазмин, гексозамины, фукоза, креатинин, мочевая кислота, ксантин, мочевина, аммиак, общие гликопротеиды, суммарные α-аминокислоты, иминокислоты, амины, нит- розамины, нитрозтиолы, аргинин, гистидин, тирозин, серии, аспарагиновая кис- лота, глутаминовая кислота, триптофан, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, треонин, фенилаланин, метионин, лизин, пролин, белки богатые пролином, лету- чие жирные кислоты (пропионовая, уксусная, масляная, изовалериановая, янтар- ная, муравьиная, яблочная, лимонная), неэтерифицированные жирные кислоты, кетоновые тела, иммуноглобулины и т.д.); ферменты (альдолазы, аланинамино- трансфераза, аспартатаминотраисфераза, α-амилаза, креатинкиназа, лактатдегид- рогеназа, щелочная фосфатаза, кислая фосфатаза, гаммаглутамилтрансфераза, а- гидроксибутиратдегидрогеназа, супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, ксантиноксидаза, орнитиндекарбоксилаза, аргиназа); липиды (триглицериды, холестерин, β-липопротеиды) и показатели системы перекисное окисление ли- пидов - антиоксидантная защита (диеновые конъюгаты, триеновые конъюгаты, основания Шиффа, ТБК-активные вещества (малоновый диальдегид), карбо- нильные производные белков, битирозин, восстановленный глутатион, общий антиоксидантный статус, уровень молекул средней массы и т.д.).
Аргиназную активность обычно определяют при помощи измерения коли- чества образующейся мочевины во время инкубации препарата фермента с арги- нином. Накопление мочевины при этом оценивается так: после разрушения мо- чевины уреазой манометрически измеряют выход двуокиси углерода либо коло- риметрически или титриметрически определяют образование аммиака. С другой стороны, активность аргиназы можно оценить титрованием образующегося в хо- де ферментативной реакции орнитина. Другие методики включают определение при помощи модифицированной реакции Sakaguchi, избытка аргинина, остаю- щегося в реакционной смеси после инкубации.
Альфа-гидрокисбутиратдегидрогеназа определяется кинетическим фото- метрическим методом.
Определение активности альдолаз осуществляется методами конечной точки (метод Мейергофа и Ломан, основывающийся на установлении содержа- ния неорганического фосфора, отщепляемого от триозофосфатов в щелочной среде, или по определению содержания свободных триоз, образующих окрашен- ный комплекс с динитрофенилгидразином после проведения щелочного гидро- лиза) и кинетическими методами (спектрофотометрические, основанные на оп- тическом тесте Варбурга).
Глюкозу определяют редуктометрическим методом, основанным на свой- стве глюкозы восстанавливать соли тяжелых металлов в щелочной среде, коло- риметрические ферментативные (глюкозооксидазная реакция, гексокиназная ре- акция, глюкозооксидазно-пероксидазные) и неферментативные методы (методы Фолина-Ву, Сомоджи, Крезелиуса-Зейферта, реакция с 2,9-диметил-1,10- фенантролином, ферроцианидная реакция, ортотолуидиновая реакция, реакция с анилином, антроновым реактивом).
Определение общего белка проводят азотометрическими методами (клас- сический метод Кьельдаля и его модификации), методами, основанными на определении плотности, гравиметрическими, нефелометрическими, спектрофо- тометрическими, заключающимися в измерении степени светопоглощения в ультрафиолетовой области, колориметрическими, основанными на цветных ре- акциях белков с определенными реактивами либо на неспецифическом связыва- нии красителя, флуориметрическими, поляриметрическими методами и другими (аминокислотный анализ, метод атомно-абсорбционной спектрометрии).
Муцин осаждается концентрированной уксусной кислотой. Углеводный компонент обнаруживается реакцией с α-нафтолом (реакция Молиша). Реакция Молиша основана на дегидратации пентоз и образовании фурфурола при дей- ствии концентрированной серной кислотой. Образовавшийся фурфурол в при- сутствии серной кислоты дает с α-нафтолом продукт конденсации розово- фиолетового цвета.
Для определения альбумина и белковых фракций применяют электрофоре- тическое фракционирование белков (на ацетатцеллюлозных пленках, агаровом, полиакриламидном геле, хроматографической бумаге), хроматографическое раз- деление, гель-фильтрацию, высаливание глобулинов сульфатом или сульфитом натрия с последующим определением альбумина в надосадочной жидкости по реакции с биуретовым реактивом или реактивом Фолина, седиментацией при ультрацентрифугировании, определение иммунохимическими методами, с ис- пользованием ионоселективных электродов, флуориметрический метод, прямое колориметрическое исследование (связывание с красителями), метод капилляр- ного электрофореза.
Общие гликопротеины определяют по одному из входящих в их состав компонентов (гексозам, гексозаминам, фукозе, сиаловым кислотам) или по спо- собности сиаловых кислот, фукозы и других углеводов давать реакцию «йодная кислота - реактив Шиффа». Также можно использовать методы исследования углеводно-белковых комплексов по их белковой части (турбидиметрические, по тирозину белка и т.д.). Гликопротеины взаимодействуют с орциновым реакти- вом, окрашивают раствор в розовый цвет. Для установления содержания гексо- заминов может быть применена реакция с ацетил ацетоном. Серогликоиды опре- деляют турбидиметрическим методом по Хуэрго.
Для идентификации и количественного определения аминокислот исполь- зуют цветные реакции, когда происходит взаимодействие специфических реак- тивов с функциональными группами радикалов аминокислот, входящих в состав белка или пептида. Можно использовать универсальные цветные реакции: би- уретовая (на все белки) и нингидриновая (на все аминокислоты, суммарно), а также специфические, только на определенные аминокислоты, например реак- ция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу), реакция Мил- лона (на тирозин), реакция Сакагучи (на аргинин), ксантопротеиновая реакция на ароматическое кольцо аминокислот, реакция Шальце-Распайля (на трипто- фан), реакция Адамкевича (на триптофан), реакция Пали (на гистидин и тиро- 1 β зин) и т.д. Массовою долю аминокислот: аргинина, лизина, тирозина, фенилала- нина, гистидина, лейцина и изолейцина (суммарно), метионина, валина, пролина, треонина, серина, аланина, глицина, цистина, аспарагиновой кислоты и аспара- гина (суммарно), глутаминовой кислоты и глутамина (суммарно) и триптофана в форме фенилизотиокарбамильных производных (далее - ФТК-производных) можно определять методом капиллярного электрофореза, а также с применением аминокислотного анализатора или оборудования для высокоэффективной жид- костной хроматографии.
Определение массовых концентраций летучих жирных кислот (уксусная, пропионовая, изомасляная, масляная, валериановая, янтарная, яблочная, лимон- ная, муравьиная) можно проводить газохроматографическим методом, методом капиллярного электрофореза.
Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖ ) проводят с использованием колориметрического метода определения медных солей по Лауреллу и Тибблингу.
Принцип обнаружения кетоновых тел: нитропруссид натрия в щелочной среде реагирует с кетоновыми телами, образуя комплекс, окрашенный в розова- то-сиреневый, сиреневый или фиолетовый цвет. К методам определения кетоно- вых тел относятся: проба Ланге, модифицированная проба Ротеры, проба Легаля и проба Лестраде.
Для выделения молекул средней массы могут быть использованы извест- ные стандартные способы ультрафильтрации на мембранах, гель-фильтрация на колонках, а также методы, базирующиеся на различии в растворимости отдель- ных компонентов в спиртах и способности осаждаться трихлоруксусной кисло- той, а также прямая спектрометрия депротеинизированного супернатанта, полу- ченного после осаждения белков раствором трихлоруксусной кислоты.
Концентрацию церулоплазмина определяют методами иммуноанализа, ма- нометрическим методом, колориметрическим методом, основанным на реакции окисления р-фенилендиамина.
Для определения уровня сиаловых кислот могут быть использованы дифе- ниламиновый метод, метод Гесса (в качестве реактива используется смесь ук- сусной и серной кислот), по реакции с тиобарбитуровой кислотой (метод Ами- нова и Уоррена), резорциновый метод Свеннерхольма.
Определение пировиноградной и молочной кислот проводят ферментатив- ными методами, методами конечной точки и кинетическими.
Определение содержания общих липидов проводят гравиметрическими методами, окислительными методами, турбидиметрическими методами, метода- ми, основанными на свойстве избирательно окрашиваться и давать цветные ре- акции (сульфофосфованилиновый реактив).
Методы определения общего холестерина включают химические (прямые и непрямые, с колориметрическим, турбидиметрическим, титриметрическим, гравиметрическим, флуориметрическим завершением), физико-химические (хроматографические, поляриметрические) и ферментные (энзимные).
Липопротеины выделяют методами электрофореза на ацетатцеллюлозе, хроматографической бумаге, в агаровом, крахмальном, полиакриламидном геле, путем ультрацентрифугирования в солевых растворах различной плотности, им- мунохимическими методами, химическими (турбидиметрическими), базирую- щимися на образовании гепаринлипопротеинового комплекса.
Определение содержания триглицеридов проводят колориметрическим ме- тодом, в котором освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерол окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовавшийся формальдегид дает с ацетилацетонм 3,5-диацетил-1 ,4-дигидролютидин, интен- сивность окраски которого пропорциональна содержанию триглицеридов. Фер- ментативный колориметрический метод определения триглицеридов основыва- ется на инициируемом триглицеридами последовательном протекании четырех ферментативных реакции, осуществляемых: липопротеиновой липазой (ЛПЛ), глицеролкиназой (ГК), глицеролфосфатоксидазой (ГФО) и пероксидазой (ПОД). Перекись водорода в присутствии пероксидазы вступает в реакцию с р- хлорфенолом и р-аминофеназоном (р-аминоантитипирин, ПАП) с образованием окрашенного в красный цвет хинонеиминового остатка. Интенсивность окраски производного хинонеимина прямо пропорциональна концентрации триглицери- дов в пробе. Содержание ацилгидроперекисей (диеновых конъюгатов) проводят спек- трофотометрически по поглощению липидным спектром монохроматического светового потока у ультрафиолетовой области спектра.
Содержание диеновых конъюгатов (первичных продуктов ПОЛ), триено- вых конъюгатов и оснований Шиффа определяют методом И.А. Волчегорского.
Определение содержания ТБК-активных веществ (малонового диальдеги- да) проводят методом, основанным на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии малонового диальдегида с 2-тиобарбитуровой кислотой.
Об уровне карбонильных производных белков судят по реакции взаимо- действия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4- динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, кото- рые регистрируют спектрофотометрически.
Содержание битирозина оценивается спектрофотометрически.
Состояние антиоксидантной защиты оценивают по уровню восстановлен- ного глутатиона кадмиевым методом. Количество восстановленных тиоловых групп белков определяют спектрофотометрически по взаимодействию SH-rpynn с 5,5-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой.
Общий антиоксидантный статус определяют кулонометрическим или хе- милюминесцентным методом.
Сбор цельной слюны может осуществляться несколькими способами: либо прямым сплевыванием ее в пробирку, либо помещением ватного или бумажного тампона в полость рта с последующим его центрифугированием при скорости 3000-20000 об/мин в течение 5-30 мин. Существуют специальные приспособле- ния для сбора слюны непосредственно из протоков слюнных желез типа капсулы Красногорского- Лешли-Ющенко и различные ее модификации. Для правильной оценки результатов исследования состава слюны необходимо учитывать условия ее сбора. Обычно сбор слюны производят утром натощак или через 1-3 ч после приема пищи. Собирают слюну в течение 5-15 мин. Обязательной процедурой, предваряющей сбор слюны, должна быть гигиеническая обработка рта, так как в зубном налете содержится большое количество белка и ферментов. Кроме того, необходимо учитывать циркадианный ритм секреции некоторых веществ, в частности гормонов, а также колебания гормональной активности, обусловлен- ные, например, менструальным циклом.
В качестве основного способа хранения и консервации слюны используют замораживание. Замораживание является обязательным условием для сохране- ния в биоматериале гормонов и циклических нуклеотидов. Для определения бел- ков и ферментов рекомендуют использовать свежесобранную слюну или хра- нившуюся на холоде не более 6 - 12 часов. Фосфаты, амилазу, азот, мочевину можно определять в слюне, хранившейся в холодильнике до 2 - 3 суток. В тече- ние нескольких месяцев может храниться слюна для определения минералов и аминокислот. При хранении образцов нативной слюны при комнатной темпера- туре применяют бензоат натрия, лимонную кислоту, этил- и пропиларабенты.
Для разработки алгоритма диагностики и оценки возможности применения методов многомерной статистики и дискриминантного анализа был проведен ряд исследований. Первоначально было оценено влияние половозрастных осо- бенностей на значения биомаркеров. Для этого было проведено исследование состава слюны у 47 добровольцев. Пробы слюны отбирали в утренние часы (время максимальной секреции) в течение 10 минут, после чего центрифугиро- вали. Для каждой пробы определяли 20 показателей белкового, углеводного, ли- пидного и минерального обмена, в том числе активность ряда ферментов. Спи- сок параметров показан в (табл.1 ).
Как видно из приведенных данных, статистически достоверных отличий между составом слюны мужчин и женщин по основным биохимическим показа- телям не выявлено, в связи с чем корректировка показателей нормы для здорово- го взрослого среднестатистического человека по половому признаку представля- ется нецелесообразной.
Дополнительно для каждой группы были рассчитаны коэффициенты кор- реляции по Спирмену. Показано, что половозрастные особенности проявляются в различных корреляционных взаимосвязях между определенными показателями метаболизма в слюне человека. Так например, с возрастом увеличивается содер- жание альбумина и железа в слюне, одновременно уменьшается рН. Для женщин характерна корреляция между содержанием кальция и магния, тогда как для мужчин содержание кальция коррелирует с неорганическим фосфором, что можно объяснить спецификой обменных процессов в организме человека.
Для изучения возрастных особенностей состава слюны проведено сравне- ние трех групп: группа N° 1 - средний возраст 16,46±0,75, группа N° 2 - средний возраст 20,48±0,24, группа Ν° 3 - средний возраст 59,6±4, 1. Результаты опреде- ления биохимического состава слюны в исследуемых группах приведены в табл.2.
Результаты многомерного анализа всех параметров для различных воз- растных групп показаны на фиг. 1.
Согласно представленным данным, с возрастом наблюдается изменение всех биохимических показателей, включенных в исследование. Таким образом, необходимо определять состав слюны в «норме» для каждой возрастной группы при использовании слюны в качестве диагностического материала.
Следующим этапом стало изучение суточных колебаний биомаркеров. Для этого было проанализировано 120 образцов слюны которые были собраны в утренние часы (время максимальной секреции). Далее образцы слюны центри- фугировали. Для каждой пробы определяли биомаркеры, а именно: ионы калия, натрия, магния, кальция, фосфаты, а также содержание белка и мочевины. После этого рассчитывали среднюю арифметическую величину (М), стандартную ошибку от средней арифметической (т), медиану (Me), интервал значений 5- 95%. В зависимости от формы распределения применяли два вида статистиче- ских критериев: параметрические (t - критерий Стьюдента) и непараметрические (U - критерий Вилкоксона).
На первом этапе исследование провели определение показателей мине- рального обмена, а также содержание белка и мочевины в слюне здоровых взрослых людей (47 человек, 62 % женщин и 38 % мужчин). Результаты приве- дены в табл.3.
Показано (табл.3), что половая принадлежность не оказывает значительно- го влияния на состав слюны человека, поэтому при дальнейшем исследовании в группы были включены добровольцы обоих полов. Известно, что элементный баланс организма человека подвержен значи- тельным колебаниям, зависящим от генетических, временных, биосоциальных и климатических факторов [Neyraud Е. et al. 2012. Variability of human saliva corn- position: Possible relationships with fat perception and liking. Archives of Oral Biolo- gy. 57: 556-566.]. В связи с этим дополнительно проведено исследование воспро- изводимости биохимического состава слюны человека при заборе образцов у од- ного и того же человека в течение недели с интервалом в 24 часа. В исследова- нии приняли участие 5 добровольцев в возрасте 20 лет, из них две женщины и трое мужчин. Результаты исследования на примере изменения ряда параметров слюны одного из участников эксперимента приведены на фиг.2а,б.
В ходе эксперимента выявлено относительное постоянство значений ана- лизируемых параметров, незначительные колебания концентраций отмечены для ионов кальция и фосфора, однако их соотношение Са/Р в течение эксперимента оставалось постоянным (фиг.2а), что необходимо учитывать при оценке биохи- мических показателей слюны в целях клинической лабораторной диагностики. Содержание остальных исследуемых параметров оставалось в пределах стати- стической погрешности эксперимента.
Применение методов многомерной статистики подтверждает полученные закономерности (фиг.З). Точки, соответствующие параметрам слюны одного че- ловека, группируются в поля одного цвета на диаграмме рассеяния канониче- ских значений.
Таким образом, показана стабильность значений биохимических показате- лей слюны при исследовании с временным интервалом в 24 часа.
Следующим этапом стало исследование региональных особенностей и их влияния на значение биомаркеров.
В исследовании принимали участие 50 добровольцев в возрасте 18.71±0.62 лет, проживающие последние 5 лет на территории г. Омска (9 добровольцев), г. Курган (20 добровольцев), р. Казахстан (5 добровольцев) и Ханты-Мансийский автономный округ (16 добровольцев).
В качестве исследуемых параметров были выбраны показатели минераль- ного обмена, а именно: концентрация ионов кальция, неорганического фосфора и хлоридов (табл.4). Кальцию принадлежит важная роль в осуществлении про- цессов жизнедеятельности: он влияет на проницаемость биологических мембран, участвует в нервно-мышечной проводимости, формировании костей и хряща, воздействует на обмен веществ в клетках, секрецию гормонов, биологически ак- тивных веществ, является важным фактором свертывания крови. Неорганиче- ский фосфор представляет собой один из компонентов кислоторастворимой фракции фосфора, включающей в себя также пирофосфаты (АТФ, АДФ и др.), гексозо-, глицерофосфаты и т.д. Ионы хлора являются наиболее важными осмо- тически активными ионами плазмы крови, лимфы, спинномозговой жидкости, клеточного содержимого.
Как видно из приведенных данных (табл.4), минеральный состав слюны существенно варьирует в зависимости от региона проживания добровольцев, наблюдаются локальные минимумы и максимумы значений изучаемых показа- телей, что необходимо учитывать при формировании критериев нормы и патоло- гии в том или ином регионе. Для диагностики различных патологических состо- яний важное значение имеет установление количественного соотношения между содержанием кальция и неорганического фосфора. Показано (табл.4), что данное соотношение также существенно отличается в региональных пределах, причем отличия между группами с минимальным и максимальным значением данного параметра статистически достоверны.
Дальнейший эксперимент включал определение содержания альбумина, имидазольных соединений и активности щелочной фосфатазы (табл.5). Альбу- мин выполняет три основные функции: создает коллоидно-осмотическое давле- ние плазмы (и других биологических жидкостей), служит богатым и быстро реа- лизуемым резервом белка и транспортным средством, благодаря альбумину во многом регулируется как водный, так и минеральный обмен. Щелочная фосфа- таза - фермент, присутствующий в каждом органе, локализуется в клеточной мембране и участвует в процессе транспорта биологически важных соединений. Имидазольные производные включают аминокислоту гистидин и ее метаболиты (гистамин, уроканиловая кислота и др.) и характеризуют протеолиз белков слю- ны и протекание воспалительных процессов. Согласно данным, приведенным в табл.5, региональные различия концен- траций определяемых компонентов также статистически достоверны, что харак- теризует особенности протекания обменных процессов и должно учитываться как при определении нормальных значений, так и в процессе адаптации людей, меняющих регион проживания, во избежание возникновения патологических процессов.
Региональные особенности биохимического состава слюны подтвержда- ются методами многомерного анализа. На фиг.4 выделяются поля, соответству- ющие выделенным для изучения регионам, что позволяет сформировать соот- ветствующие функции классификации (фиг.5).
Показано, что вид функции классификации одинаков для каждой группы, где а - рН, Ъ, d, с, е, f- концентрации кальция, фосфора, хлоридов, альбумина, имидазольных соединений соответственно, g - активность щелочной фосфатазы. Однако коэффициенты регрессии в каждой функции различны, что определяет возможность дифференциации данных групп между собой.
Обоснованность включения определяемых параметров слюны в формиро- вание функций классификации подтверждается данными расчета лямбды Уилкса и толерантности (табл.6). Показано, что значение всех коэффициентов в столбце 2 близко к 0.0 (полная дискриминация), а в столбце 7 близко к 1.0, что свиде- тельствует об избыточности данных переменных для предложенной модели дис- криминации.
Таким образом, на примере выбранных параметров показано, что суще- ствует однозначная зависимость биохимического состава слюны и региона про- живания, что необходимо учитывать при формировании критериев нормы и па- тол огии.
Дальнейшие исследования были посвящены исследованию биомаркеров в норме и при онкологических патологиях.
Пуриновые нуклеотиды - обязательные компоненты клеток организма че- ловека. Динамическое равновесие между их биосинтезом и распадом характери- зует содержание мочевой кислоты в биологических жидкостях организма [Пу- стовалова Л.М., Загреба Н.Д. 2004. Влияние витамина С на гомеостаз мочевой кислоты в слюне человека. Успехи современного естествознания. 3 : 32-33], в том числе и в слюне человека [Носков В. Б. 2008. Слюна в клинической лабора- торной диагностике. Клиническая лабораторная диагностика. 6: 14-17; Кочурова Е.В., Козлов СВ. 2014. Диагностические возможности слюны. Клиническая ла- бораторная диагностика. 1 : 13-16; Вельская Л.В. 2015. Слюна как объект клини- ческой лабораторной диагностики. Омск: Омскбланкиздат. 148 с]. Лимитирую- щим фактором в образовании мочевой кислоты является фермент ксантинокси- даза, участвующий в двух реакциях: превращении гипоксантина в ксантин, а за- тем ксантина - в мочевую кислоту. Ксантиноксидаза - аэробная оксидоредуктаза, простетическая группа которой содержит флавинадениндинуклеотид (ФАД), ио- ны молибдена и железа (III), участвуя в распаде пуриновых оснований. Ксанти- ноксидаза генерирует большое количество активных форм кислорода, что при- водит к активации перекисного окисления липидов и повреждению ДНК [Нико- лаев И.В. и др. 2008. Антиоксидантная и пероксидазная активность слюны при воспалительных заболеваниях пародонта и возможность их коррекции. Биоме- дицинская химия. 4 (54): 454-462]. Это может приводить к трансформации нор- мальной клетки в раковую. Одновременно с этим, накопление мочевой кислоты в биологических жидкостях организма и снижение выведения ее почками приво- дит к развитию подагры.
Целью исследования являлось определение содержания мочевой кислоты и активности ксантиноксидазы в «нормальной» слюне и на фоне онкологической патологии.
В исследовании принимали участие 177 здоровых добровольцев (кон- трольная группа) и 684 пациента Клинического онкологического диспансера г. Омска с гистологически подтвержденным диагнозом (основная группа).
Результаты определения мочевой кислоты по стандартной методике, а также ксантина и ксантиноксидазы приведены в табл.7.
Установлено, что статистически достоверных различий между исследуе- мыми группами по содержанию ксантина и мочевой кислоты не наблюдается, однако стандартный метод применяется более широко за счет удобной интер- претации значений, получаемых в ммоль/л или мкмоль/л. Активность ксанти- ноксидазы в группе пациентов с онкологической патологией достоверно выше (а=0,05), что может быть использовано как на этапе диагностики, так и на этапе подбора и контроля лечения, поскольку известно, что ингибиторы ксантинокси- дазы могут быть эффективны для лечения и профилактики онкозаболеваний. Следует отметить, что гиперурикемия, или повышенное содержание мочевой кислоты, также требует безотлагательного лечения, поскольку она играет основ- ную роль в развитии острой почечной недостаточности. Основными препарата- ми, используемыми для коррекции этого метаболического нарушения, являются аналоги пуринового основания гипоксантина, который снижает уровень мочевой кислоты путем ингибирования ксантиноксидазы [Галунска Б. и др. 2004. Двули- кий Янус биохимии: мочевая кислота - оксидант или антиоксидант? Нефроло- гия. 4 (8): 25-31 ]. В частности, их назначение позволяет избежать отсрочек нача- ла цитостатической терапии, что имеет особенное значение у больных с интен- сивно пролиферирующими злокачественными новообразованиями [Семенова А.И. 2006. Гиперкальциемия и синдром распада опухоли. Практическая онколо- гия. 2(7): 101-107]. Оперативный неинвазивный контроль содержания мочевой кислоты и ксантиноксидазы в слюне позволит осуществлять своевременную коррекцию гиперурикемии, чтобы предотвратить развитие острой почечной не- достаточности на фоне лечения пациентов онкологического профиля.
На следующем этапе исследования были рассчитаны коэффициенты кор- реляции между исследуемыми показателями, включая параметрические и непа- раметрические методы статистики (табл.8).
Показано, что наибольший коэффициент корреляции наблюдается между показателями мочевая кислота/ксантин (табл.8). Между значениями концентра- ций мочевой кислоты, определенных различными методами также наблюдается корреляция, подтвержденная как по Стьюденту, так и по Спирмену. Установле- но, что характер распределения для ксантина и мочевой кислоты не соответству- ет нормальному, однако в результате расчета соотношения содержания ксанти- ноксидазы получаются значения максимально приближенные к нормальному распределению (фиг.6). Учитывая близкие значения коэффициентов корреляции (табл.8), рассчи- танные с учетом параметрической и непараметрической статистики, для обра- ботки экспериментальных данных можно применять методы параметрической статистики без существенных искажений получаемых результатов.
Известно, что одним из подходов к оценке антиоксидантной активности является исследование кинетики блокирования радикалов, генерируемых непо- средственно в реакционной среде, в частности система ксантин/ ксантиноксида- за. Тогда как одним из компонентов антиоксидантной защиты является мочевая кислота, способная перехватывать избыточно продуцируемые свободные ради- калы. Увеличение активности ксантиноксидазы при относительно постоянном уровне мочевой кислоты свидетельствует об усилении генерирования активных форм кислорода, и как следствие, увеличении супероксидообразующей и канце- рогенной активности ксантиноксидазы. Этот эффект более выражен для группы пациентов, имеющих различные виды онкологической патологии.
Следующая работа была посвящена исследованию прогностических харак- теристик биомаркеров для диагностики РМЖ (рака молочной железы). В данном исследовании проведено определение маркеров эндогенной интоксикации в слюне практически здоровых людей, а также у группы пациентов с доброкаче- ственными и злокачественными патологиями молочной железы.
Эндогенная интоксикация (ЭИ) - это каскадный, стадийный, способный к прогрессированию генерализованный процесс, обусловленный накоплением токсических веществ в концентрациях, превышающих функциональные возмож- ности естественных систем обезвреживания с последующим повреждением дру- гих органов и систем организма. В настоящее время существует множество спо- собов оценки степени эндогенной интоксикации [Карякина Е.В., Белова СВ. (2001) Научно-практическая ревматология, 1, 152-159.; Титов В.Н. (2009) Кли- ническая лабораторная диагностика, 4, 3-15]. Универсальными маркерами эндо- генной интоксикации считают среднемолекулярные олигопептиды (МСМ) - ве- щества массой от 500 до 5000 дальтон. По своей природе МСМ относятся к бел- ковым токсинам с высоким содержанием дикарбоновых и низким содержанием ароматических кислот. Особенностью токсического действия средних молекул является то, что они обладают прямым мембранотоксическим действием и ини- циируют появление пептидов, по структуре близких к биорегуляторам. В 80% случаев МСМ - это белки и продукты их метаболизма, в том числе продукты гидролиза фибриногена, глобулинов, катаболизма гликопротеидов, олигосахара, нуклеотиды, а также гормоны и их фрагменты.
Среди множества процессов нарушения метаболизма при ЭИ первостепен- ное значение имеет свободнорадикальная патология. Серьезным повреждающим действием и токсическим эффектом обладают продукты «окислительного стрес- са», маркерами которых являются диеновые конъюгаты (ДК), малоновый диаль- дегид (МДА) и др. В условиях окислительного стресса может происходить нарушение функционирования ферментов антиоксидантной системы, в частно- сти каталазы [Безручко Н.В. и др. (2012) Вестник ТГПУ, 7(122), 94-98.], а также изменяться концентрация основных антиоксидантов [Олемпиева Е.В., Терновая
A. А., Злобина В. П. (2013) Медицинский альманах, 3(27), 138-139.; Ващенко
B. И., Ващенко Т.Н. (2006) Психофармакология и биологическая наркология, 3(6), 1254-1269.].
В патогенезе многих заболеваний одно из ведущих мест принадлежит реактивным кислородным радикалам и связанными с ними нарушениями молекулярных механизмов их детоксикации[Горожанская Э.Г. и др. (2013) Селен и окислительный стресс у онкологических больных // Биомедицинская химия, 5 (59), 550-562].
Имеется достаточное количество данных, свидетельствующих о том, что у онкологических больных даже на начальных стадиях злокачественного заболе- вания возрастают нарушения в окислительно-восстановительной системе, и про- исходит разбалансировка системы антиоксидантной защиты, в результате чего в организме накапливаются токсические продукты пероксидации [Горожанская ЭТ., Зубрихина Г.Н., Свиридова СП. (2010) ГОУ МГ ФСО, М., 45 с. ].
Опухоль оказывает депрессивное влияние на системы и структуры всего организма больного в результате воздействия биологически активных продуктов метаболизма злокачественного роста [Окрут И.Е., Шакерова Д.А., Веселова Т.А. (201 1 ) Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Биология, 5 (1), 1 18-121. Белоногов Р.Н., Титова Н.М., Дыхно Ю.А. и др. (2009) Сибирский онкологический журнал, 4 (34), 48-51]... Поэтому перспективным направлением в диагностике и мониторинге лечения онкологической патологии является кон- троль маркеров эндогенной интоксикации, в частности МДА, ДК и МСМ.
В исследовании принимали участие 473 женщины, среди которых выдели- ли контрольную группу (144 человека), группу пациентов с доброкачественными заболеваниями молочной железы (ДНО, 1 1 1 человек) и группу пациентов со зло- качественными новообразованиями молочной железы (ЗНО, 218 человек). Груп- пы обследуемых были сформированы согласно правилам проведения клиниче- ских испытаний после получения информированного согласия. Данные обо всех участниках исследования включали: возраст (полных лет); диагноз; стадирова- ние по системе TNM; локализацию метастазов в случаях их наличия; результаты гистологического исследования; выписку из истории болезни, включающую ви- ды проведенного лечения, а также информацию о сопутствующих заболеваниях. Детальное описание исследуемых групп приведено на фиг.7. Возраст пациентов составил от 20 до 75 лет, для более удобного представления результатов группы были дополнительно разбиты на подгруппы с интервалом в 10 лет.
Образцы слюны собирали утром натощак в стерильные пробирки, центри- фугировали при 7 000 об/мин. Интенсивность перекисного окисления липидов оценивали по уровню вторичного продукта - малонового диальдегида (МДА) в тесте с тиобарбитуровой кислотой. Также определяли содержание продуктов пе- рекисного окисления липидов (ПОЛ) (диеновых конъюгатов ДК, триеновых конъюгатов ТК, оснований Шиффа ОШ) содержание молекул средней массы (МСМ) и активность каталазы.
На первом этапе проведено определение МСМ, МДА и продуктов пере- кисного окисления липидов (ПОЛ) в группе практически здоровых людей с уче- том деления на возрастные группы (табл.9). Поскольку количество человек в группах моложе 30 лет и старше 70 недостаточно для корректной статистиче- ской обработки результатов, данные возрастные группы были исключены из дальнейшего рассмотрения. Статистически достоверных отличий между значениями определяемых па- раметров в норме не выявлено, что подтверждает принципиальную возможность использования значений показателей контрольной группы без поправки на воз- раст. Однако следует отметить, что наиболее близки между собой значения био- химических параметров групп 40-49 лет и 50-59 лет, что можно объяснить фи- зиологическими процессами и особенностями гормонального статуса женщин в более молодом (30-39 лет) и более пожилом (60-69 лет) возрасте.
Дальнейшие исследования включали группы пациентов с доброкачествен- ными и злокачественными заболеваниями молочных желез, у которых на момент забора слюны лечение не осуществлялось (табл.10).
У больных ЗНО молочной железы содержание МДА выше, чем в группе пациентов с ДНО молочной железы и контрольной группе, за исключением воз- растной группы 30-39 лет (табл.10). Известно, что МДА является чрезвычайно токсичным соединением, обладающим высокой биологической активностью. Легко диффундируя через мембраны, МДА взаимодействует с азотистыми ком- понентами белков и нуклеотидных оснований ДНК, образуя еще более токсиче- ские соединения, например, основания Шиффа, что может обуславливать запуск дегенеративных процессов в клетках[ Алферова В. В. (201 1) Социальная и кли- ническая психиатрия, 3, 54-57].
По-видимому, на фоне протекающего неопластического процесса наблюдается более интенсивное образование оснований Шиффа, поэтому их уровень в группе пациентов со ЗНО молочной железы выше. Данное предположение проверено путем расчета коэффициентов корреляции по Спирмену между содержанием МДА и оснований Шиффа в слюне пациентов со ЗНО молочной железы (г=0.58, =0.95) и с ДНО молочной железы (г=0.23, а=0.95). Таким образом, при протекании опухолевого процесса происходит накопление как самого МДА, так и токсичных продуктов его метаболизма.
Согласно приведенным данным (табл.10) уровень МСМ выше в группе пациентов со ЗНО молочной железы для всех возрастных групп, кроме группы 60-69 лет. Повышение уровня этих веществ в слюне свидетельствует о формировании неспецифической эндогенной интоксикации [Карякина Е.В., Белова СВ. (2004) Клиническая и лабораторная диагностика, 3, 4-8]. Накопление МСМ в биологических жидкостях при нормальной функции почек является следствием усиленного образования нефизиологических метаболитов [Уманский М.А. ( 1991) Киев: Наукова Думка, 21 1-213].
МСМ относятся к белковым токсинам с высоким содержанием дикарбоно- вых и низким - ароматических кислот. Особенностью токсического действия средних молекул является то, что они обладают прямым мембранотоксическим действием и инициируют проявление пептидов, по структуре близких к биорегу- ляторам. Возможно выделение двух фракций МСМ, содержащих ароматические аминокислоты (280 нм) и не содержащих ароматические аминокислоты (254 нм). Уровень МСМ, не содержащих ароматические аминокислоты, выше во всех ис- следуемых группах (табл.9, 10), в норме отмечено незначительное повышение уровня обоих фракций (254 и 280 нм) с возрастом (табл.9). Однако в случае па- тологических изменений тенденция варьирования уровня МСМ неоднозначная: при переходе от возрастной группы 30-39 лет к группе 40-49 наблюдается значи- тельное увеличение содержания МСМ, затем к возрасту 60-69 лет постепенное снижение практически до первоначального уровня. При этом относительное со- держание фракций (МСМ 254/280 нм) в норме остается практически неизмен- ным (фиг.8), для группы пациентов с доброкачественными заболеваниями мо- лочной железы с возрастом удельный вес фракции 280 нм возрастает, тогда как для пациентов со ЗНО молочной железы наблюдается увеличение доли фракции 254 нм (фиг.7). По-видимому, это обусловлено спецификой протекающего забо- левания и особенностями нарушений метаболизма клеток при опухолевом про- цессе.
Активность каталазы повышена как в группе пациентов с доброкачественными образованиями молочной железы, так в группе пациентов со ЗНО молочной железы, что свидетельствует о нарушениях функционирования системы антиоксидантной защиты в обоих случаях (табл.9, 10). Повышение активности фермента происходит в результате интенсификации мембранодеструктивных процессов под влиянием активизации процессов свободно-радикального окисления, что в свою очередь приводит к нарастанию эндотоксикоза [Дегтярева Н.В., Пилипко А.А., Шушкова И.Г. и др. (2008) Клиническая лабораторная диагностика, 9, 59. Зайцев В.Г., Островский О.В. (2008) Клиническая лабораторная диагностика, 9, 61. Титов В.Н., Крылин В.В., Дмитриев В. А., Яшин А. И. (2010) Клиническая лабораторная диагностика, 7, 3- 14].
Следует отметить, что в целом при сравнении показателей эндогенной интоксикации в норме и при патологии (табл.9, 10) статистически достоверных отличий выявлено не было, поэтому дальнейшие расчеты проведены с использованием методов многомерной статистики. Показано, что использование метода дискриминантного анализа позволяет разделить между собой контрольную группу и больных, включая пациентов с доброкачественными и злокачественными патологиями (фиг.9).
При этом в молодом возрасте (30-39 лет) различия между эндогенной ин- токсикацией на фоне патологий (ЗНО и ФА) практически отсутствуют, на диа- грамме они выделяются единым полем, тогда как в более пожилом возрасте (50- 59 лет) видны дискриминационные различия между названными группами (фиг.10), что позволяет провести дифференциацию данных групп между собой.
В ходе дальнейших исследований провели сравнение между собой пациен- тов со ЗНО молочной железы с учетом размера опухоли по TNM классификации (табл.1 1).
Установлено, что содержание продуктов окислительного стресса (ДК, ТК, ОШ и МДА) с увеличением размера опухоли также возрастает, при этом законо- мерно снижается содержание каталазы, как основного фермента антиоксидант- ной защиты (табл. 1 1). Уровень среднемолекулярных токсинов снижается, при- чем различие между группами Т1 и ТЗ статистически достоверно. Следует отме- тить, что соотношением МСМ 254/280 нм при этом также уменьшается, т.е. с ро- стом размера опухоли доля фракции токсинов, содержащих ароматические ами- нокислоты, растет.
Несмотря на различия между группами с учетом TNM классификации, ме- тодом дискриминантного анализа показано, что совокупности рассматриваемых маркеров эндогенной интоксикации недостаточно для дифференциации между собой пациентов с различным размером опухоли, однако отличия от контроль- ной группы во всех случаях статистически достоверны (фиг.1 1).
Полученные на данном этапе результаты подтверждают перспективность использования биомаркеров окислительного стресса и системы антиоксидантной защиты у пациентов с онкологической патологией при использовании в качестве биосубстрата слюны человека.
Для проверки методики на базе Омского клинического онкологического диспансера были проведены несколько исследований.
Целью первого исследования ставилось исследование эффективности ме- тодики в случае диагностики ЗНО легкого. Для этого была собрана группа из 65 пациентов обоих полов и всех возрастов. 18 пациентов в группе имели гистоло- гически подтвержденный диагноз ЗНО легкого. 47 пациентов имели заключение по результатом компьютерной томографии об отсутствии опухолевого процесса в легких и не имели существенных жалоб на состояние здоровья.
Сбор слюны осуществлялся утром, натощак в одноразовую стерильную пробирку. Каждый пациент, включенный в исследование, подписывал информи- рованное согласие и предоставлял полный анамнез своего заболевания. Полу- ченные значения биомаркеров обрабатывались методом многомерного анализа, результаты представлялись в графическом виде. Результаты по использованию методики в скрининге ЗНО легкого показаны на фиг. 12.
По результатам видно, что один пациент с диагнозом ЗНО легкого попал в группу здоровых пациентов, что соответствует одному ложноотрицательному результату. Все здоровые пациенты выделились в отдельную группу и ни один не попал в группу пациентов с диагнозом ЗНО. Таким образом можно сделать заключение, что чувствительность метода применительно к скринингу составля- ет 94,4%, специфичность 100%, общая точность метода составляет 98,5%. Также стоит отметить, что в исследовании участвовали практически здоровые пациен- ты и полученные результаты не являются достоверными. Это утверждение спра- ведливо так как в повседневной практике ЗНО как правило возникает на фоне большого количество неонкологических заболеваний и маскируется на их фоне. Следующим этапом исследования стало проверка эффективности метода при участии в исследовании пацентов с различными неонкологическими патоло- гиями. Для этого была собрана группа из 70 пациентов в которой 30 пациентов обоих полов имели гистологически подтвержденный диагноз ЗНО легкого. 40 пациентов имели заключение по результатом компьютерной томографии об от- сутствии опухолевого процесса в легких и имели одно или несколько сопут- ствующих заболеваний из списка: ХСН, АГ, ХОБЛ, ИБС, АС, бронхит, гастрит, диабет, абсцесс, пневмония, а также не более одной неонкологической опухоли из следующего перечня: фиброз, туберкулема, гамартома.
Сбор слюны осуществлялся утром, натощак в одноразовую стерильную пробирку. Каждый пациент, включенный в исследование, подписывал информи- рованное согласие и предоставлял полный анамнез своего заболевания. Полу- ченные значения биомаркеров обрабатывались методом многомерного анализа, результаты представлялись в графическом виде. Результаты исследования пока- заны на фиг. 13.
По результатам видно, что три пациента, не имеющие онкологического за- болевания попали в группу с диагнозом ЗНО легкого. Это соответствует трем ложноположительным результатам. Все пациенты с подтвержденным диагнозом ЗНО легкого выделились в отдельную группу и ни один не попал в группу паци- ентов с доказанным отсутствием ЗНО легкого. Таким образом можно сделать за- ключение, что чувствительность метода составляет 100%, специфичность 92,5%, общая точность метода составляет 95,7%.
Одной из областей применения методики является дифференциальная диа- гностика неонкологических заболеваний. Для проверки эффективности метода была сформирована группа из 38 пациентов обоих полов в которой 16 пациентов имели гистологически подтвержденный диагноз фиброма легкого, 8 пациентов - гамартома легкого и 14 пациентов туберкулема легкого.
Сбор слюны осуществлялся утром, натощак в одноразовую стерильную пробирку. Каждый пациент, включенный в исследование, подписывал информи- рованное согласие и предоставлял полный анамнез своего заболевания. Полу- ченные значения биомаркеров обрабатывались методом многомерного анализа, ,
34 результаты представлялись в графическом виде. Результаты исследования пока- заны на фиг. 14.
По результатам видно, что в целом заболевания довольно четко разделя- ются на группы. Есть единичные случаи перемешивания, которые не нарушают общую картину. Так 3 результата, которые были гистологически верифицирова- ны как туберкулема, были определены как фиброма. Также один результат кото- рый был гистологически верифицирован как гамартома не попал в свою группу и был диагностирован как фиброма. Таким образом можно сделать заключение, что общая точность метода составляет 90,5%.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что указанный метод может быть изменен без существенного изменения сущности и объема за- явленного изобретения. Следует понимать, что модификации изобретения, в его различных аспектах, будут очевидны соответствующим специалистам в данной области, некоторые из них очевидны после изучения настоящего изобретения, остальные являются технологическими нюансами биохимического анализа и способами многомерного анализа данных. Ни один признак, функция или свой- ство описанного в настоящем тексте варианта не является существенным. Воз- можны другие варианты определения биомаркеров их анализа, или использова- ние метода для диагностики других заболеваний. Таким образом, объем изобре- тения не должен быть ограничен конкретными вариантами осуществления, опи- санными здесь, а ограничивается только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Пациент А обратился в поликлинику с жалобами на одышку при физической нагрузке, интенсивный кашель, кровохарканье, слабость, быструю утомляемость. После первичного обследования был выставлен диагноз - острый бронхит, назначено лечение. После лечения было замечено улучшение состояния по прошествии 2-х недель все жалобы стали нарастать заново. Больной решил проверить диагноз предложенным методом. У него было собрано 5 мл слюны утром натощак до чистки зубов. Образец слюны подвергся центрифугированию для отделения осадка затем в нем были определены значения биомаркеров те- стового набора для диагностики заболеваний легкого. Полученные значения биомаркеров методом дискриминантного анализа были сравнены с результатами биомаркеров групп пациентов с подтвержденным диагнозом - ЗНО легкого, не- онкологическими заболеваниями легких включая: туберкулез, пневмонию, аб- сцесс, а также здоровых пациентов. В результате дискриминантного анализа значений биомаркеров (фиг. 15) обследуемого пациента он попал в группу боль- ных с диагнозом ЗНО легкого, было сделано заключение - ЗНО легкого.
Было назначено МСКТ ОГК сделано заключение: КТ-признаки ЦЗНО верхней доли правого лёгкого, с параканкрозными воспалительными изменениями, назначена бронхоскопия. По результатам бронхоскопии было установлено нали- чие опухоли в правой верхней доле. Результат гистологического исследования - плоскоклеточное ЗНО. Таким образом результат заключения по предложенному методу совпал с диагнозом.
Пример 2. Пациент Б обратился в поликлинику с жалобами на острые боли по ходу 10 ребра справа сзади, направлена на дообследование. Выполнил МСКТ ОГК в результате которого выявлено образование в нижней доле справа разме- ром 54,5x48x57,5 мм. Назначено оперативное лечение. Больной решил проверить диагноз предложенным методом. У него было собрано 5 мл слюны утром нато- щак до чистки зубов. Образец слюны подвергся центрифугированию для отделе- ния осадка затем в нем были определены значения биомаркеров тестового набо- ра для диагностики заболеваний легкого. Полученные значения биомаркеров ме- тодом дискриминантного анализа были сравнены с результатами биомаркеров групп пациентов с подтвержденным диагнозом - ЗНО легкого, неонкологиче- скими заболеваниями легких включая: туберкулез, пневмонию, абсцесс, а также здоровых пациентов. По в результате дискриминантного анализа значений био- маркеров обследуемого пациента (фиг. 16) он попал в группу больных с диагно- зом туберкулез, было сделано заключение - туберкулез легких.
В результате оперативного лечения было выполнено гистологическое ис- следование образца опухоли, сделано заключение - туберкулез. Таким образом результат заключения по предложенному методу совпал с диагнозом. Пример 3. Пациентка В обратилась в поликлинику с жалобами на уплотне- ние в правой молочной железе, проведено обследование: УЗИ. В результате вы- полнения УЗИ установлено очаговое образование правой молочной железы, назначено оперативное лечение в объеме секторальной резекции. Больная реши- ла проверить диагноз предложенным методом. У неё было собрано 5 мл слюны утром натощак до чистки зубов. Образец слюны подвергся центрифугированию для отделения осадка затем в нем были определены значения биомаркеров те- стового набора для диагностики заболеваний молочной железы. Полученные значения биомаркеров методом дискриминантного анализа были сравнены с ре- зультатами биомаркеров групп пациентов с подтвержденным диагнозом - ЗНО молочной железы, неонкологическими заболеваниями молочной железы вклю- чая: фиброаденому и фиброаденоматоз, а также здоровых пациентов. По в ре- зультате дискриминантного анализа значений биомаркеров обследуемого паци- ента (фиг. 17) он попал в группу больных с диагнозом фиброаденома, было сде- лано заключение - фиброаденома.
В результате оперативного лечения было выполнено гистологическое ис- следование образца опухоли, сделано заключение - интраканаликулярная фиб- роаденома. Таким образом результат заключения по предложенному методу совпал с диагнозом.
Пример 4. Пациентка Г обнаружила очаговое образование в левой молоч- ной железе, обратилась в поликлинику, где было произведено УЗИ. По результа- там УЗИ установлено очаговое образование правой молочной железы, назначено оперативное лечение в объеме левосторонней радикальной мастэктомии с со- хранением обеих грудных мышц. Больная решила проверить диагноз предло- женным методом. У неё было собрано 5 мл слюны утром натощак до чистки зу- бов. Образец слюны подвергся центрифугированию для отделения осадка затем в нем были определены значения биомаркеров тестового набора для диагностики заболеваний молочной железы. Полученные значения биомаркеров методом дискриминантного анализа были сравнены с результатами биомаркеров групп пациентов с подтвержденным диагнозом - ЗНО молочной железы, неонкологи- ческими заболеваниями молочной железы включая: фиброаденому и фиброаде- номатоз, а также здоровых пациентов. По в результате дискриминантного анали- за значений биомаркеров обследуемого пациента (фиг. 18) он попал в группу больных с диагнозом ЗНО молочной железы, было сделано заключение - ЗНО молочной железы.
В результате оперативного лечения было выполнено гистологическое ис- следование образца опухоли, сделано заключение - инфильтрирующая протоко- вая карцинома. Таким образом результат заключения по предложенному методу совпал с диагнозом.
Таблица 1 - Вариации биохимического состава слюны в зависимости от
Figure imgf000040_0001
Таблица 2 - Биохимический состав слюны в различных возрастных груп- пах
Figure imgf000041_0002
Таблица 3. Вариации биохимического состава слюны в зависимости от по-
Figure imgf000041_0001
Таблица 4 Показатели минерального обмена в зависимости от региона п оживания
Figure imgf000042_0002
- максимальное значение, - минимальное значение
Таблица 5 Биохимические показатели слюны в зависимости от региона проживания
Figure imgf000042_0003
- максимальное значение, - минимальное значение
Figure imgf000042_0001
Кальций 0,017 0,477 3,65 0,0520 0,5128 0,4872
Фосфор 0,027 0,295 7,97 0,0052 0, 1756 0,8244
Хлориды 0,025 0,318 7, 13 0,0076 0, 1 168 0,8832
Альбумин 0,041 0, 191 14,09 0,0007 0, 1642 0,8358
Имидазольные
0,050 0, 158 17,81 0,0002 0, 1485
соединения 0,8515
Щелочная
0,021 0,378 5,48 0,0173
фосфатаза 0,3308 0,6692
Таблица 6. Результаты дискриминантного анализа, где
1 - Лямбда Уилкса, значение меняется от 1.0 (нет дискриминации) до 0.0
(полная дискриминация);
2 " Частная лямбда Уилкса - чем ниже ее значение в этом столбце, тем больше одиночный вклад соответствующей переменной в степень дискримина- ции;
3 - F-включение и р-значение - при наибольшем значении величины F- включения эта переменная будет введена в модель на следующем (первом) шаге;
4 - Толерантность и R-квадрат - значение толерантности дает информа- цию об избыточности данной переменной.
Таблица 7 Рез льтаты оп еделения п инов в слюне
Figure imgf000043_0002
различие между группами статистически достоверно (а=0,05)
Таблица 8 Корреляционные взаимосвязи содержания пуринов в слюне в норме
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Таблица 9. Биома ке ы эндогенной интоксикации в но ме
Figure imgf000044_0002
Таблица 10. Биомаркеры эндогенной интоксикации при доброкачествен- ныхи злокачественных заболеваниях молочных желез
Груп- Возрастная г эуппа
Параметр
па 30-39 лет 40-49 лет 50-59 лет 60-69 лет
0.237±0.04 0.301±0.05 0.267±0.07 0.227±0.01
ДНО
МСМ 254 2 2 6 3
нм, у.е. зно 0.244±0.03 0.429±0. 0.341±0.02 0.219±0.08
2 053 1 1
0.209±0.03 0.261±0.04 0.231±0.06 0.208±0.09
ДНО
МСМ 280 3 3 2 7
нм, у.е. зно 0.217±0.09 0.364±0.04 0.282±0.05 0.168±0.06
8 5 7 2
Катала- ДНО 5.10±0.89 6.27±0.92 5.28±1.20 5.58±1.06 за,- 105
мкат/л зно 5.82±1.75 4.61±1.87 5.00±0.95 5.80±1.29
ДНО 6.22±0.37 6.10±0.39 5.65±0.59 6.29±0.58
ДК, у.е. зно 5.89±0.67 6.79±0.58 6.42±0.37 6.18±0.38
ДНО 3.51±0.24 3.41±0.17 3.32±0. 27 3.35±0.26
ТК, у.е.
ЗНО 3.23±0.35 4.03±0.50 3.53±0.18 3.58±0.38
ДНО 1.82±0.07 1.79±0.06 1.76±0.10 1.88±0.1 1
ОШ, у.е. зно 1.74±0.13 1.,97±0.28 1.94±0.05 1.75±0.05 57
Figure imgf000045_0002
Таблица 1 1. Биомаркеры ЭИ в зависимости от размера опухоли при ЗНО молочной железы
Figure imgf000045_0001

Claims

Формула изобретения
1. Способ определения состояния живого организма путём анализа образ- цов биологической жидкости, получаемых неинвазивно, основанный на том, что, анализируют образцы биологической жидкости, в качестве которой используют цельную слюну, отличающийся тем, что составляют тестовый набор биомарке- ров, содержащихся в образцах, полученных от пациентов тестовой группы, ко- торая включает контрольную группу, состоящую из пациентов без патологии здоровья, а также исследуемую группу, которая включает пациентов с диагно- стируемым патологическим состоянием, при этом факт наличия или отсутствия патологического состояния определяют путем дискриминантного анализа значе- ний биомаркеров тестового набора определенных в цельной слюне пациента с диагностируемым патологическим состоянием и тестовой группы, причем, при попадании результата дискриминантного анализа значений биомаркеров тесто- вого набора пациента с диагностируемым патологическим состоянием в резуль- таты контрольной группы делается заключение об отсутствии патологии, а при попадании в исследуемую группу делается заключение о наличии патологии.
2. Способ по п.1 , отличающийся тем, что, включение биомаркера в тесто- вый набор осуществляется по результатам статистического анализа его значе- ний, определенных у пациентов тестовой группы, и определения критерия Вил- коксона между контрольной и исследуемой группой.
3. Способ по п.1 , отличающийся тем, что, в тестовый набор биомаркеров включает, по крайней мере, показатели минерального обмена (ионы кальция, натрия, калия, магния, бария, стронция, аммония, железа, меди, цинка, селена, лития, фосфаты, хлориды, фториды, бромиды, йодиды, нитриты, нитраты, суль- фаты, карбонаты, гидрокарбонаты и т.д.); субстраты (белок, белковые фракции, муцин, альбумин, глюкоза, молочная кислота, пировиноградная кислота, оксид азота, сиаловые кислоты, церулоплазмин, гексозамины, фукоза, креатинин, мо- чевая кислота, ксантин, мочевина, аммиак, общие гликопротеиды, суммарные а- аминокислоты, иминокислоты, амины, нитрозамины, нитрозтиолы, аргинин, ги- стидин, тирозин, серии, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, трипто- фан, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, треонин, фенилаланин, метионин, ли- зин, пролин, белки богатые пролином, летучие жирные кислоты (пропионовая, уксусная, масляная, изовалериановая, янтарная, муравьиная, яблочная, лимон- ная), неэтерифицированные жирные кислоты, кетоновые тела, иммуноглобули- ны и т.д.); ферменты (альдолазы, аланинаминотрансфераза, аспартатамино- трансфераза, α-амилаза, креатинкиназа, лактатдегидрогеназа, щелочная фосфата- за, кислая фосфатаза, гаммаглутамилтрансфераза, а- гидроксибутиратдегидрогеназа, супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза, ксантиноксидаза, орнитиндекарбоксилаза и т.д.); липиды (триглицериды, холе- стерин, β-липопротеиды) и показатели системы перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита (диеновые конъюгаты, триеновые конъюгаты, основа- ния Шиффа, малоновый диальдегид, окислительная модификация белков, общий антиоксидантный статус, уровень молекул средней массы и т.д.).
4. Способ по п.1 , отличающийся тем, что, результаты анализа сравнивают одновременно с двумя группами показателей, одна из которых является кон- трольной группой, состоящей из пациентов без патологии здоровья, а другая - группу сравнения, которая включает пациентов с различными патологическими состояниями.
5. Способ по п.1 , отличающийся тем, что, тестовую группу формируют из условия, чтобы в её состав одновременно включают пациентов, имеющих не ме- нее одной онкологической или неонкологической патологии, при этом, группу пациентов с онкологической патологией формируют так, чтобы входящие в неё пациенты имели признаки следующих видов заболеваний: рак легкого, молочной железы, колоректальный, пищевода, желудка, печени, желчного пузыря, подже- лудочной железы, предстательной железы, яичника, шейки матки, тела матки, мочевого пузыря, почки, щитовидной железы, мозга, лимфома Ходжкина, не- ходжкинская лимфома.
6. Способ по п.1 , отличающийся тем, что, в качестве цели исследования состояния живого организма выбирают вероятность наличия онкологического или неонкологического заболевания, любой иной патологии.
7. Способ диагностики онкологических патологий живого организма путём анализа образцов биологической жидкости, получаемых неинвазивно, в качестве которых используется слюна, отличающийся тем, что для его осу- ществления составляют тестовый набор биомаркеров, содержащихся в образцах, полученных от обследуемого субъекта, и результаты анализа сравнивают с ре- зультатами анализа биомаркеров образцов, полученных от субъектов тестовой группы, которая включает контрольную группу, состоящую из субъектов без па- тологии здоровья, а также группу сравне-ния, которая включает субъектов с раз- личными патологическими состояниями, при этом тестовый набор биомаркеров выбирается из базового набора таким об-разом, что последний является дискри- минационным между контрольной груп-пой и группой сравнения, при этом ана- лиз проводят с использованием методик многомерного статистического анализа, при котором вычисляют интегральный показатель по значениям биомаркеров те- стового набора, интерпретацию резуль-татов проводят графически по сравне- нию с интегральными показателями, рас-считанными для контрольной группы и групп сравнения, при этом вероятность наличия или отсутствия патологии опре- деляют по удаленности интегрального показателя от соответствующих значений для контрольной группы и группы сравнения. Интегральный показатель рассчи- тывается путем одновременной оценки значений, по крайней мере, пяти биохи- мических параметров, выбранных из базового набора, путем подстановки в дис- криминационную функцию, позволяющую получить проекцию интегрального показателя на плоскость.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что группа сравнения формиру- ется таким образом, чтобы в её состав одновременно включались субъекты, имеющие не менее одной онкологической или неонкологической патологии
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что группа сравнения формиру- ется таким образом, чтобы в её состав одновременно включались субъекты, имеющие не менее одной онкологической или неонкологической патологии, при этом группа пациентов с онкологической патологией формируется таким обра- зом, чтобы входящие в неё субъекты имели признаки следующих видов заболе- ваний: рак легкого, молочной железы, колоректальный, пищевода, желудка, пе- чени, желчного пузыря, поджелудочной железы, предстательной железы, яични- ка, шейки матки, тела матки, мочевого пузыря, почки, щитовидной железы, моз- га, лимфома Ходжкина, неходжкинская лимфома и т.д.
PCT/RU2016/000297 2015-12-30 2016-05-17 Способ оценки состояния организма по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно WO2017116277A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201600076 2015-12-30
EA201600076A EA201600076A1 (ru) 2015-12-30 2015-12-30 Способ оценки состояния организма по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017116277A1 true WO2017116277A1 (ru) 2017-07-06

Family

ID=59226017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/000297 WO2017116277A1 (ru) 2015-12-30 2016-05-17 Способ оценки состояния организма по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA201600076A1 (ru)
WO (1) WO2017116277A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023170526A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Uniwersytet Medyczny W Białymstoku Salivary biomarker for use in the diagnosis, differentiation and neuropsychological evaluation of stroke patients

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110144914A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-16 Doug Harrington Biomarker assay for diagnosis and classification of cardiovascular disease
RU2535025C2 (ru) * 2012-10-10 2014-12-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Способ индивидуальной количественной оценки риска развития гипертонической болезни

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110144914A1 (en) * 2009-12-09 2011-06-16 Doug Harrington Biomarker assay for diagnosis and classification of cardiovascular disease
RU2535025C2 (ru) * 2012-10-10 2014-12-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Способ индивидуальной количественной оценки риска развития гипертонической болезни

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEFFREY L. EBERSOLE ET AL.: "Targeted salivary biomarkers for discrimination of periodontal health and disease(s).", FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY, vol. 5, August 2015 (2015-08-01), pages 1 - 12, XP055397398 *
SHANGYUAN FENG ET AL.: "Surface-enhanced Raman spectroscopy of saliva proteins for the noninvasive differentiation of benign and malignant breast tumors.", INT J NANOMEDICINE, vol. 10, 2015, pages 537 - 547, XP055397405, [retrieved on 20150112] *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023170526A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Uniwersytet Medyczny W Białymstoku Salivary biomarker for use in the diagnosis, differentiation and neuropsychological evaluation of stroke patients

Also Published As

Publication number Publication date
EA201600076A1 (ru) 2017-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ngamchuea et al. Chemical analysis in saliva and the search for salivary biomarkers–a tutorial review
McCaman et al. Fluorimetric method for the determination of phenylalanine in serum
Celec et al. Salivary markers of kidney function—Potentials and limitations
Gomez et al. Normal reference-intervals for 20 biochemical variables in healthy infants, children, and adolescents.
CN101503732B (zh) 一种葡萄糖氧化酶单一液体测定试剂
US10591495B2 (en) Device and methods of using device for detection of hyperammonemia
Al-Neamy et al. Occupational lead exposure and amino acid profiles and liver function tests in industrial workers
Bernard et al. Urine protein 1: a sex-dependent marker of tubular or glomerular dysfunction.
EP0491936B1 (en) Very rapid detection of fungal infections
Mellerup Colorimetric method for rapid determination of serum arginase
Hood A–Z of clinical chemistry: a guide for the trainee
WO2017116277A1 (ru) Способ оценки состояния организма по образцам биологической жидкости, получаемой неинвазивно
Büttner The need for accuracy in laboratory medicine
US6309816B1 (en) Methods for diagnosing cancer by measuring creatine kinase
Asp Improved method for the assay of phenylglycosidase activity with a 4-aminoantipyrine reagent
Tarannum et al. Facile titrimetric assay of lysophosphatidic acid in human serum and plasma for ovarian cancer detection
Devgun Delay in centrifugation and measurement of serum constituents in normal subjects
Vucijak-Grgurevic et al. Significance of nitric oxyde saliva concentration of the patients with renal failure on hemodialysis
Peterson et al. Blood phenylalanine estimation for the patient with phenylketonuria using a portable device
JP3164165B2 (ja) カルシウムの定量方法
RU2802446C2 (ru) Способ прогнозирования исходов у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта
Hoffer et al. Nutritional status of Quebec Indians
EP0776979B1 (en) Method and reagent for measuring an ion by using maltose derivatives
CN106338606A (zh) 一种稳定的磷脂氧化酶法检测试剂盒
Bruns et al. Creatine kinase-MB activity: clinical and laboratory studies of specific immunochemical technique with optimized enzymatic assay

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16882178

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205A DATED 05/11/2018)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16882178

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1