JPS60176600A - グアナ−ゼ活性測定方法 - Google Patents
グアナ−ゼ活性測定方法Info
- Publication number
- JPS60176600A JPS60176600A JP3476084A JP3476084A JPS60176600A JP S60176600 A JPS60176600 A JP S60176600A JP 3476084 A JP3476084 A JP 3476084A JP 3476084 A JP3476084 A JP 3476084A JP S60176600 A JPS60176600 A JP S60176600A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- guanase
- xanthine
- activity
- formazan
- absorbance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、グアナーゼ活性の正確、迅速かつ簡易な定量
方法に関する。
方法に関する。
肝疾患の診断指標として、ＨＢＳ抗原、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランヌアミナーゼ（Ｇ Ｐ ’ｒ’ ）、グ
ルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧｏＴ）
等の検査が行なわれている。しかし、これらの検査項目
は、ヒ）Ａ型、Ｂ型肝炎の診断指標として有効ではある
が、非−Ａ型、非−Ｂ型肝炎の診断には役立たないもの
であり、輸血後に発症する非−Ａ型、非−Ｂ型肝炎は発
症率が高いにもかかわらず、未だその対策は確立されて
いない。
ルビン酸トランヌアミナーゼ（Ｇ Ｐ ’ｒ’ ）、グ
ルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧｏＴ）
等の検査が行なわれている。しかし、これらの検査項目
は、ヒ）Ａ型、Ｂ型肝炎の診断指標として有効ではある
が、非−Ａ型、非−Ｂ型肝炎の診断には役立たないもの
であり、輸血後に発症する非−Ａ型、非−Ｂ型肝炎は発
症率が高いにもかかわらず、未だその対策は確立されて
いない。
近時、この非−Ａ型、非−Ｂ型、肝炎の有効な診断指標
としてグアナーゼ活性の測定が注目され、各種の測定法
が提案されている。
としてグアナーゼ活性の測定が注目され、各種の測定法
が提案されている。
グアナーゼは、生体内のヌクレオシド′代謝系において
グアニンをキサンチンに変換する化学反応を触媒する酵
素であり、このものは前記（］０１”やＧ Ｐ ｉ’が
多く含まれている骨格筋、心筋、膵などには殆んど含ま
れていない。直情中グアナーゼ活性は００’ｌ”、ＧＰ
’ｒよりも肝に特異的であるため、心筋梗塞、多発生筋
炎との鑑別等に利用できる点でもそのｔ１１１定意義は
高い。
グアニンをキサンチンに変換する化学反応を触媒する酵
素であり、このものは前記（］０１”やＧ Ｐ ｉ’が
多く含まれている骨格筋、心筋、膵などには殆んど含ま
れていない。直情中グアナーゼ活性は００’ｌ”、ＧＰ
’ｒよりも肝に特異的であるため、心筋梗塞、多発生筋
炎との鑑別等に利用できる点でもそのｔ１１１定意義は
高い。
現在知られているグアナーゼ活性ｉ’ｌｌｌ＋定法とし
てラウシュ・−ノリス法ＣＡｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
２ ｇ 。
てラウシュ・−ノリス法ＣＡｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
２ ｇ 。
１２４〜１２９（１９５０））、カルツカ−法（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１ ６７．４２９〜４４４．４４５
〜４５９（１９５７））、アンモニア定量法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 Ｍｅｄ、 ５．８８０〜８９１（１９７２）
〕、伊藤らの方法〔臨床病理２３．７３３〜７３６（１
９７５）：］、過酸化水素測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ２４
．２４７−２５４（１９７９）：］、杉浦らの方法〔日
本薬学金網、生体成分の分析化学シンポジウム構演要旨
集４１〜４４ （４９７９））、オクタらの方法（：
Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １３０．２９５〜３０
１（１９８３）：］などがある。これらの泪り定法は、
いづれも操作性や正確性の点で問題が多く、−膜検査法
として利用し得るものは１、伊藤らの方法、オクタらの
方法、杉浦らの方法に限られる。しかし、伊藤らの方法
〔グアニンを基質とする反応により生成したアンモニア
量を、インドフェノール反応を利用して測定する方法〕
にして収３ステップの操作を必要とするため、一般の市
販自動分析装置に適用することは多くの場合不可能であ
り、しかも低グアナーゼ活性域ではブランクの測定値が
検体血清の測定値よりも高くなることかしばしばみられ
る。捷だ杉浦らの方法およびオクタらの方法〔キサンチ
ンが尿酸に変換する際に副成する過酸化水素をパーオキ
シダーゼの存在下に３−メチ／ｌ／−２−ベンゾチアソ
リノンヒドラゾンおよびジノチルアニリンと反応さぜ、
生成するインダミン色素の特性吸収帯の吸光度を７１１
す定する方法〕においても、３種の試薬を用いる３段階
の反応操作を必要とするので、自動分析装置への適用は
殆んど不可能である。
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１ ６７．４２９〜４４４．４４５
〜４５９（１９５７））、アンモニア定量法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、 Ｍｅｄ、 ５．８８０〜８９１（１９７２）
〕、伊藤らの方法〔臨床病理２３．７３３〜７３６（１
９７５）：］、過酸化水素測定法（Ｅｎｚｙｍｅ ２４
．２４７−２５４（１９７９）：］、杉浦らの方法〔日
本薬学金網、生体成分の分析化学シンポジウム構演要旨
集４１〜４４ （４９７９））、オクタらの方法（：
Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １３０．２９５〜３０
１（１９８３）：］などがある。これらの泪り定法は、
いづれも操作性や正確性の点で問題が多く、−膜検査法
として利用し得るものは１、伊藤らの方法、オクタらの
方法、杉浦らの方法に限られる。しかし、伊藤らの方法
〔グアニンを基質とする反応により生成したアンモニア
量を、インドフェノール反応を利用して測定する方法〕
にして収３ステップの操作を必要とするため、一般の市
販自動分析装置に適用することは多くの場合不可能であ
り、しかも低グアナーゼ活性域ではブランクの測定値が
検体血清の測定値よりも高くなることかしばしばみられ
る。捷だ杉浦らの方法およびオクタらの方法〔キサンチ
ンが尿酸に変換する際に副成する過酸化水素をパーオキ
シダーゼの存在下に３−メチ／ｌ／−２−ベンゾチアソ
リノンヒドラゾンおよびジノチルアニリンと反応さぜ、
生成するインダミン色素の特性吸収帯の吸光度を７１１
す定する方法〕においても、３種の試薬を用いる３段階
の反応操作を必要とするので、自動分析装置への適用は
殆んど不可能である。
本発明は上記実情に対処するためになされたものである
。
。
本発明のグアナーゼ活性測定法は、グアニンを基質とし
て、これをグアナーゼによりキサンチンに変化さぜ、こ
のキサンチンをキサンチンオキシダーゼの存在下に尿酸
に変化させ、その変換反応に伴って生成するスーパーオ
ギサイドアニオン（０２）により酸化型テトラゾリウム
を還元型テトラゾリウム（ホルマザン）に還元し、生成
したホルマザンの特注吸収帯の吸光度から体液試料中の
グアナーゼ活性をめるものである。この反応過程を図式
的に示すと次のとおりである。
て、これをグアナーゼによりキサンチンに変化さぜ、こ
のキサンチンをキサンチンオキシダーゼの存在下に尿酸
に変化させ、その変換反応に伴って生成するスーパーオ
ギサイドアニオン（０２）により酸化型テトラゾリウム
を還元型テトラゾリウム（ホルマザン）に還元し、生成
したホルマザンの特注吸収帯の吸光度から体液試料中の
グアナーゼ活性をめるものである。この反応過程を図式
的に示すと次のとおりである。
１
Ｈ
本発明方法によれば、グアニン、酸化型テトラゾリウム
またはそのハロゲン化物、キサンチンオキシダーゼを含
む■）Ｈ６〜９の緩衝液を測定試薬とし、これに体腋試
判を加えて上記反応を生起させ、生成するホルマザンの
特性吸収における吸光度から体液試料中のグアナーゼ活
性かめられる。
またはそのハロゲン化物、キサンチンオキシダーゼを含
む■）Ｈ６〜９の緩衝液を測定試薬とし、これに体腋試
判を加えて上記反応を生起させ、生成するホルマザンの
特性吸収における吸光度から体液試料中のグアナーゼ活
性かめられる。
酸化テトラゾリウムとしては、例えばニトロブルーテト
ラゾリウム ーインドフエニｚｕ−３−ニトロフェニル−５−フが゛ エニルテトラゾリウムクロライト゛など好捷しく用△ いられる。曲者を使用した場合に生成するホルマザンの
特１１．吸収帯は５３０〜５ ８Ｑ ｒ＋ｒｎであり、
後者の使用により生成するホルマザンの特性吸収帯は４
８０ 〜５１０ｎｍである。
ラゾリウム ーインドフエニｚｕ−３−ニトロフェニル−５−フが゛ エニルテトラゾリウムクロライト゛など好捷しく用△ いられる。曲者を使用した場合に生成するホルマザンの
特１１．吸収帯は５３０〜５ ８Ｑ ｒ＋ｒｎであり、
後者の使用により生成するホルマザンの特性吸収帯は４
８０ 〜５１０ｎｍである。
本発明に使用される４１１１定試薬は、例えば、グアニ
ン： ０．０ ０ １ 〜０． １ ２ ５ ｍ １ｒ
ｌｔＪ／ｌ 酸化型テトラツリウム（塩）：１０〜２
０ ０ ｍ（？／ ｅｌ キサンチンオキシダーゼ：５
〜７ ０ Ｌｌ ／ ｌを含むｐ■−＋’６〜９の緩ｒ
ＩＩｔｒ 液＜ ＩＪン酸緩衝液、クツ１−゛緩衝液、
トリス綾線１１４そなと）である。
ン： ０．０ ０ １ 〜０． １ ２ ５ ｍ １ｒ
ｌｔＪ／ｌ 酸化型テトラツリウム（塩）：１０〜２
０ ０ ｍ（？／ ｅｌ キサンチンオキシダーゼ：５
〜７ ０ Ｌｌ ／ ｌを含むｐ■−＋’６〜９の緩ｒ
ＩＩｔｒ 液＜ ＩＪン酸緩衝液、クツ１−゛緩衝液、
トリス綾線１１４そなと）である。
ホルマザンの特性吸収の吸光度によるグアナーゼ活性の
定量は、反応を希塩酸などで停止１ニさせるエンドポイ
ント法により、反応前後の吸光度の増加量からめること
ができ、あるいはホ／Ｌ／マザン生成反応過程における
ホルマザンの特性吸収の吸光度の変化率（単位時間当り
の吸光度の増加量〕が、グアナーゼ活性量に比例するよ
うな反応条件下に反応を行なわしめ、その反応過程での
吸光度の変化率を測定するシー１−アッセイ法によりグ
アナーセ活性をめることもできる。
定量は、反応を希塩酸などで停止１ニさせるエンドポイ
ント法により、反応前後の吸光度の増加量からめること
ができ、あるいはホ／Ｌ／マザン生成反応過程における
ホルマザンの特性吸収の吸光度の変化率（単位時間当り
の吸光度の増加量〕が、グアナーゼ活性量に比例するよ
うな反応条件下に反応を行なわしめ、その反応過程での
吸光度の変化率を測定するシー１−アッセイ法によりグ
アナーセ活性をめることもできる。
次に、本発明のクアナーゼ活性測定方法について実施例
により具体的に説明する、 実施例１ 〔１〕試薬処方（１，１ヌケールの調製）グア＝ン：
０．０１〜１．２５ｍ ｍｏｌ酸化型テトラゾリウム塩
（２、２−ｄｉ −Ｐ −ニトロフェニル−５、５’−
ジフェニル−３、３’−シメ’＋・キシ−４，４′−ジ
フェニレン）ンテトラゾリウムクロライ＋”） ： １
ｏ ｏｍｑ、キザンチンオキシターゼ：５〜２０ｕ 上記成分を含むｐＨ６〜９のリン酸緩衝溶液〔２〕訓定
操作 丘記反応試薬２ｍｌに検体血清１０〜１．００ ｍｌ！
を加え、３７℃で３０分間反応し、５００〜６００ｎｍ
において吸光度を測定する。クアナーゼ活性既知の標準
血清についても上記と同じ操作を行い、５００〜６００
ｎｍにおける吸光度を測定し、下式により検体血清の
グアナーゼ活性をめる。
により具体的に説明する、 実施例１ 〔１〕試薬処方（１，１ヌケールの調製）グア＝ン：
０．０１〜１．２５ｍ ｍｏｌ酸化型テトラゾリウム塩
（２、２−ｄｉ −Ｐ −ニトロフェニル−５、５’−
ジフェニル−３、３’−シメ’＋・キシ−４，４′−ジ
フェニレン）ンテトラゾリウムクロライ＋”） ： １
ｏ ｏｍｑ、キザンチンオキシターゼ：５〜２０ｕ 上記成分を含むｐＨ６〜９のリン酸緩衝溶液〔２〕訓定
操作 丘記反応試薬２ｍｌに検体血清１０〜１．００ ｍｌ！
を加え、３７℃で３０分間反応し、５００〜６００ｎｍ
において吸光度を測定する。クアナーゼ活性既知の標準
血清についても上記と同じ操作を行い、５００〜６００
ｎｍにおける吸光度を測定し、下式により検体血清の
グアナーゼ活性をめる。
上記測定結果を第１図に示す。図示のように、クアナー
ゼ活性鎖約３ｏ工Ｕ／ｅまで直線的に測定可能であるこ
とがわかる。
ゼ活性鎖約３ｏ工Ｕ／ｅまで直線的に測定可能であるこ
とがわかる。
実施例２
市販の遊離アンモニア比色法用試薬〔（株）フッモト・
タイアクノスティックヌ製〕を使用した用手法による血
清クアナービ活性ｌＩ！ＩＩ定ｆ的と本発明による測定
値（用手法）との相関々係を第２図に示す。１月し、Ｖ
＝ １．００７ Ｘ＋ｏ、ｏ ０１、ｆ ＝０．９７８
８、ｎ−５０、である。
タイアクノスティックヌ製〕を使用した用手法による血
清クアナービ活性ｌＩ！ＩＩ定ｆ的と本発明による測定
値（用手法）との相関々係を第２図に示す。１月し、Ｖ
＝ １．００７ Ｘ＋ｏ、ｏ ０１、ｆ ＝０．９７８
８、ｎ−５０、である。
両測定１］６は良好な相関性を有することがわかる。
以上のように、本発明によれば、ｆｆｔ’ｉ車な測定操
により、従来のアンモニア比色法と同等の」「確な測定
値を得ることができる。特に、本発明の６１１１定法は
１試薬測定系であり、１段階の操作で測定することがで
きるので、従来の各種方法に比し、自動分析装着への通
用が容易である。捷だ、感度、正確性の点でもすぐれて
いる。
により、従来のアンモニア比色法と同等の」「確な測定
値を得ることができる。特に、本発明の６１１１定法は
１試薬測定系であり、１段階の操作で測定することがで
きるので、従来の各種方法に比し、自動分析装着への通
用が容易である。捷だ、感度、正確性の点でもすぐれて
いる。
第１図は本発明によるクアナーゼ活性１則定結果を示す
グラフ、第２図は本発明方法および従来法（アンモニア
比色法）によるグアナーゼｆｆｉ性？ｌ１ｌＩ 定値の
相関性を示すグラフである。 代理人弁理士宮崎新八部 第１ａａ
グラフ、第２図は本発明方法および従来法（アンモニア
比色法）によるグアナーゼｆｆｉ性？ｌ１ｌＩ 定値の
相関性を示すグラフである。 代理人弁理士宮崎新八部 第１ａａ
Claims (1)
- （１）・ グアニンを基質とし、これを体液試料中のグ
アナーゼによりキサンチンに変化させ、このキサンチン
をキサンチンオギシダーゼの存在下に尿酸に変換し、そ
の変換反応に伴って生成するスーパーオキサイド−アニ
オン（Ｏｉ）にて酸化型テトラゾリウム化合物を還元型
テトラゾリウム化合物（ホルマザン）に還元し、生成す
るホルマザンの特性吸収帯の吸光度から体液試料中のグ
アナーゼ活性をめることを特徴とするグアナーゼ活性測
定方法。 ・
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3476084A JPS60176600A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | グアナ−ゼ活性測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3476084A JPS60176600A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | グアナ−ゼ活性測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60176600A true JPS60176600A (ja) | 1985-09-10 |
Family
ID=12423269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3476084A Pending JPS60176600A (ja) | 1984-02-24 | 1984-02-24 | グアナ−ゼ活性測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60176600A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5191064A (en) * | 1988-09-30 | 1993-03-02 | The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) | Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide |
| CN102279181A (zh) * | 2011-04-18 | 2011-12-14 | 中国农业大学 | 一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56102797A (en) * | 1980-01-19 | 1981-08-17 | Maruko Seiyaku Kk | Reagent for measuring enzyme activity participating in purine metabolism |
-
1984
- 1984-02-24 JP JP3476084A patent/JPS60176600A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56102797A (en) * | 1980-01-19 | 1981-08-17 | Maruko Seiyaku Kk | Reagent for measuring enzyme activity participating in purine metabolism |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5191064A (en) * | 1988-09-30 | 1993-03-02 | The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) | Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide |
| CN102279181A (zh) * | 2011-04-18 | 2011-12-14 | 中国农业大学 | 一种测定玉米种胚脂肪氧化酶活性的方法 |
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