KR0164850B1

KR0164850B1 - 신규한 폴리펩티드와 이들을 코드하는 발현가능한 dna 시퀀스 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR0164850B1
Application number: KR1019900018536A
Authority: KR
Inventors: 뻬뜨르 도미니끄; 세르비로드 에디스; 프랑소와 마이옥 쟝; 예 빠트리스
Original assignee: 사바나 자키스; 혼느 쁠렝 쌍뜨
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1999-01-15
Also published as: CN1052508A; CA2030073A1; ATE152481T1; AU6661490A; IE904115A1; US5766918A; DE69030615D1; DE69030615T2; EP0433117A1; FI102971B1; IL96309A0; ZA909071B; HU907151D0; JPH04218379A; FI102971B; FR2655660A1; KR910012245A; DK0433117T3; HUT56138A; EP0433117B1

Abstract

본 발명은 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 활성을 가진 폴리펩티드와 이들 폴리펩티드의 발현을 위한 유전물질, 즉 DNA 시퀀스와 그들을 제조하기 위한 미생물학적 방법 및 이들 폴리펩티드의 사용과 라세믹 아미드에서 산, 바람직하게는 프로피온산, 더욱 바람직하게는 (S)-아리-2-프로피온산과 아릴옥시-2-프로피온산의 거울상 이성질체의 선택적인 합성을 위한 변형된 미생물의 사용에 고안한 것이다.

Description

신규한 폴리펩티드와 이들을 코드하는 발현가능한 DNA 시퀀스 및 그의 제조방법

제1도의 a는 Brevibacterium R312에서 정제된 아미다제에서 얻어진 펩티드의 시퀀스(N-터미널과 내부구조)와 b는 내부의 펩티드 절편에서 유도된 올리고뉴클레오티드 프토브이고,

제2도의 a는 Brevibacterium R312의 아미다제에서 유도된 펩티드 절편을 N-터미널부터 프로브 Sq918의 합성 전략을 나타낸 것이고, b는 특이성을 가지는 프로브 Sq918이며,

제3도의 a는 프로브 Sq918과, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, SmaI과 SphI으로 분해된 Brevibacterium R312의 제놈성 DNA와의 혼성 프로필이고, b는 프로브 Sq762와 BamHI, BglII, EcoRI, KpnI, PstI, SalI, SmaI, SphI, SstI과 XHoI으로 분해된 Brevibacterium R312의 제놈성 DNA와의 혼성 프로필이며,

제4도는 플라스미드 pXL1650과 pXL1651의 제한효소 지도이고,

제5도는 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 유전자를 함유하는 5.4kb PstI 절편의 제한효소 지도이며,

제6도는 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 이마다제 유전자를 함유하는 BamHI-PstI 절편의 시퀀싱 전략을 나타낸 것이고,

제7도는 시퀀스된 절편의 개방판독을 분석한 것이며,

제8도는 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 유전자의 뉴클레오티드와 펩티드의 시퀀스이며,

제9도는 플라스미드 pXL1724의 제한효소지도이고,

제10도는 플라스미드 pXL7151의 제한효소지도이고,

제11도는 플라스미드 pXL1752의 제한효소지도이며,

제12도는 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 젤을 쿠마시블루로 염색하여 E.coli B와 E.coli K12 E103S 균주에서 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 발현을 나타낸 것이고, 각각의 줄은 O.D 2.1(E103S) 또는 0.7(E.coli B)에서 배양체 60μL에 함유된 단백질량이며, pXL1029와 pXL906을 초음파 분해한 T는 PRCIts나 Ptrp 프로모터를 각각 대조한 IL1-β이다.

제13도는 Rhodococus(플라스미드 pXL1836의 BamHI절편)의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 유전자의 뉴클레오티드와 펩티드 시퀀스이며,

제14도는 셔틀벡터 pSV73의 제한효소지도이고,

제15도는 발현플라스미드 pYG811B의 제한효소지도이며,

제16도는 발현플라스미드 pYG817B의 제한효소지도이고,

제17도는 발현플라스미드 pYG822의 제한효소지도이다.

본 발명은 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 활성을 가진 폴리펩티드와 이들 폴리펩티드의 발현을 위한 유전물질, 그들을 제조하기 위한 미생물학적 방법, 이들 폴리펩티드의 사용과 라세믹 아미드에서 산, 바람직하게는 프로피온산, 더욱 바람직하게는 (S)-아릴-2-프로피온산과 아릴옥시-2-프로피온산의 거울상 이성질체에 선택적인 합성을 위한 변형을 미생물의 사용에 관한 것이다.

비대칭 탄소는 많은 분자들에서 서로 거울상이 되는 두개의 명백한 입체이성질체 R과 S를 만든다. 아릴-2-프로피온산도 이경우에 해당된다. 대개의 분자들은 이들 두개 이성질체의 혼합비가 거의 동등한 라세믹 혼합물로 존재하는데, 어떤 경우에는 단 하나의 특정한 이성질체만이 요구되며, 그래서 두개의 이성질체를 분리하거나 필요한 이성질체와 입체특이적 합성을 실시하는 방법이 필요하다.

본 발명은 거울상 이성질체에 선택적인 방법으로 아미드 특히 라세믹 아릴-2-프로피온아미드를 (S)-아릴-2-프로피온산으로 또한 라세믹 아릴옥시-2-프로피온아미드를 (R)-아릴옥시-2-프로피온산으로 가수분해 할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.

이러한 효소활성을 보이는 미생물로는 Brevibacterium과 Corynebacterium이 우수하고(유럽특허 제89 400197.3호), 특히, Brevibacterium R312(CBS 717.73)이 바람직하며, Rhodococcus도 이러한 효소활성을 가진다.

본 발명은 이러한 거울이성질체에 선택적인 아미다제 활성의 특성화 및 정제, 이들의 발현을 위한 유전물질의 클로닝과 시퀀싱을 포함한다. 다음에서 Amd란 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 의미하며, Amd 시퀀스란 상기 아미다제 활성을 코드하는 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다.

본 발명의 목적은 특히 재조합 DNA 기술을 사용하여 서로 다른 숙주에서 이들 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 고도로 발현하는 것으로 특별히 라세믹 아릴-2-프로피온아미드에 대해 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 시퀀스는 본 발명 목적 중의 하나이다. Brevibacterium R312(제8도)나 Rhodococcus(제13도)의 거울상 입체이성질체에 선택적인 아미다제를 코드하는 뉴클레오티드 시퀀스 뿐만 아니라 동일한 폴리펩티드를 코드하는 어떤 축퇴된 시퀀스도 본 발명 구현예의 대상이 되며, 또한 본 발명은 상기 DNA 시퀀스나 그의 절편과 혼성결합하거나 거울상이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 시퀀스와 상기 DNA 시퀀스를 함유하는 유전자에 대한 것이다.

이들 아미다제의 펩티드 시퀀스간의 동질성에 관한 연구에서 관찰되어진 활성을 고도로 보존하는 영역이 발견되었다. 이 영역은 제13도(뉴클레오티드 618 내지 788)에 나타난 펩티드 시퀀스의 아미노산 137 내지 193과 전기한 Brevibacterium R312 아미다제의 펩티드 시퀀스중에 아미노산 159 내지 215에 해당하며 거의 동질성(67%)을 유지하고 있다.

또한 본 발명의 목적은 앞에서 언급한 바와 같은 제13도에서 아미노산 137 내지 193, 또는 제8도와 아미노산 159 내지 215, 적어도 50%의 동질성을 가지는 펩티드 시퀀스를 코드하는 시퀀스에 의해 특징지워지는 DNA 시퀀스, 바람직하게는 제8도 또는 제13도에서 나타난 Amd 시퀀스의 전체 또는 일부나 그들의 변형체를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 시퀀스이다. 이때 변형체는, 본 발명의 목적에 따라, 초기 시퀀스의 작용을 보유하는 모든 시퀀스, 유전자 코드의 변이, 제거, 삽입 또는 축퇴 등에 의한 변성을 포함하는 시퀀스 모두를 의미하며 상기 DNA 시퀀스는 제8도 또는 제13도에 나타내어진 시퀀스를 함유한다.

이러한 시퀀스는 다양한 방법에 의해 얻어질 수 있는데 일반적 방법은 정제된 폴리펩티드에서 유도된 뉴클레오티드 프로브로 원하는 폴리펩티드를 코드하는 제놈성 DNA 절편을 클론하는 것으로 프로이머의 연장, 제한효소, 어댑터의 삽입이나 연결 뉴클레오티드의 접합 등의 다양한 방법을 사용하여 원하는 DNA를 함유하는 뉴클레오티드를 삽입할 수 있고 유전자 지도를 만들어 문헌에 기재된 방법으로 시퀀스 할 수 있다.

다른 방법으로는 DNA 및/또는 부분이나 총체적인 화학적 합성을 이용하여 가능한데 이 방법은 잘 알려진 것으로 제8도와 제13도에 기재된 구조는 동일 시퀀스로 어떤 미생물에서도 일반적인 기술을 사용하여 분리할 수 있다.

사실 본 발명은, 거울상이성질체에 선택적인 서로 다른 아미다제 간에 동질성을 나타내는, 어떤 제놈은행에서도 혼성 유전자(충분한 동질성을 가진)의 확인이 가능한 프로브를 생산할 수 있으며 그와 같은 유전자가 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 코드하는 것을 증명하는 일은 간단하며 그러한 방법으로 어떤 미생물에서도 다량의 아미다제를 얻을 수 있고 거울상 이성질체에 선택적인 신규한 아미다제 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 가지는 폴리펩티드에 관한 것으로 적어도 다음 펩티드 시퀀스중 하나를 함유한다.

-제13도에서 아미노산 137 내지 193에 해당하는 시퀀스.

-제8도에서 아미노산 159 내지 215에 해당하는 시퀀스.

-상기 시퀀스를 가지는 적어도 50%의 동질성을 가진 시퀀스.

본 발명의 또 다른 목적은 앞에서 기재된 DNA 시퀀스에서 유도된 구조를 가지며 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 포함하는 신규한 폴리펩티드이다. 이들 폴리펩티드는 자연적인 또는 재조합된 미생물의 배양체를 추출하고 정제하여 얻어지는데 배양체에서 초기 추출물을 만들고 이 추출물을 암모니움 설페이트로 분별시켜 크로마토그래피와 젤 여과로 정제하는 연속적인 단계에 의해 정제할 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세할 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 Brevibacterium R312와 Rhodococcus의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제와 상기에서 언급된 DNA 시퀀스의 발현 카세트를 적어도 하나를 함유하는 변형된 미생물에 관한 것으로 상기 발현 카세트는 바람직하게는 본 발명에 따르는 DNA 시퀀스를 함유하며 원하는 숙주에서 그것의 발현이 보장되는 조절 DNA 시퀀스의 지배하에 있다. 상기 카세트는 숙주 제놈에 통합될 수 있으며 또는 선택한 마커와 숙주에서 복제 기능유발을 가져오는 플라스미드로 삽입될 수 있다.

인위적 조건하에서 상기 폴리펩티드의 발현도 본 발명의 관심이 있는 분야중의 하나로 즉, 배양조건이 특별히 양호한 어떤 세포에서 이종의 시퀀스의 발현, 및/또는 생산의 증식 및/또는 배양조건을 개선하기 위해서 적어도 부분적으로 이종인 조저시그널 지배하에서 동종시퀀스를 발현하는 것이다.

DNA 시퀀스의 발현을 조절하는 DNA 시퀀스는 전사와 번역의 초기 영역에서 실시되는 것이 바람직하다. 이 영역은 프로모터를 포함하며 펩티드 생성물의 영역과 동종이거나 이종인 리보좀 결합부위를 갖는다.

조절 영역을 선택하는 것은 사용되는 숙주세포에 따라 다르며 특히 원핵숙주의 경우, 이종의 프로모터는 트립토판 오페론 Ptrp, 락토오스 오페론 Plac의 프로모터, 박테리오파지 람다 PR과 PL의 좌,우 프로모터와 corynebacteria 파아지의 강력한 프로모터 등과 같은 강력한 박테리아성 프로모터나 corynebacteria의 동종 프로모터 가운데서 선택할 수 있는데 상세하게는 람다의 우향성 프로모터의 경우 온도에 민감한 PRcIts가 바람직하다. 효모와 같은 진핵 생물의 경우에는 포스포글리세레이트 키나제(PGK), 글리세르알데히드-3-포스페이트데히드로게나제(GPD), 락타제(LAC4)와 엔올라제(ENo) 등의 유전자의 프로모터와 같은 효모의 해당 유전자 프로모터들을 사용할 수 있다.

숙주를 원핵생물로 사용할 때 리보소옴 고정부위는 람다의 cII 유전자나 Corynebacteria의 동종유전자에서 유도되는 것이 바람직하다.

숙주에서 전사와 번역을 중단하는 작용을 가진 영역을 코딩시퀀스의 '방향에 위치하며, 플라스미드는 재조합 숙주의 선택을 가능하게 하는 하나 또는 수개의 마커를 운반하는데 암피실린이나 스트렙토마이신 같은 항생물질이나 그밖의 독성물질에 내성을 가지는 유력한 마커가 바람직하다.

사용될 미생물 숙주는 E. coli와 같은 장내 세균과 Corynebacterium, Brevibacterium이나 Rhodococcus류의 Corynebacteria 등을 포함한다. 물론 같은 원리에 근거한 다른 형의 세포들이 사용될 수도 있다.

적어도 하나의 전사 및 번역 개시영역과 원하는 폴리펩티드를 코드하는 DNA 시퀀스, 선택가능한 마커를 함유하는 앞에서 언급된 플리스미드와 라세믹아미드에서 거울상이성질체에 선택적으로 산을 합성하는 용도로서 뿐만 아니라 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 제조에 이들을 적용하는데 사용되는 상기에서 언급한 변성 미생물도 본 발명의 목적이다.

거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 제조방법은 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 코드하는 시퀀스의 발현이 일어날 수 있는 조건하에서 상기에서 언급한 미생물의 배양과 생산된 아미다제에서 미생물의 분리 등이 포함된다. 더욱 상세하게는 라세믹 아릴-2-프로피온아미드에서 아릴-2-프로피온산의 거울상 이성질체에 선택적인 합성을 위해 재조합 미생물이나 이미 언급된 폴리펩티드를 이용하는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 바람직한 방법은 해당하는 라세믹 아미드에서 유기산의 입체이성질체를 제조하는 것이며 라세믹아미드는 전기한 바와같이 변형된 미생물 존재하에 또는 전기한 바와같이 얻어진 폴리펩티드 존재하에 두어 생성된 입체이성질체를 회수하는 것을 특징으로 한다.

이러한 과정을 사용할 수 있는 아미드 가운데 케토프로펜 라세믹 아미드는 약제학에서 유용한 S(+)케토프로펜으로 제조될 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명의 다른 특성과 이점을 제시할 것이며 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

[Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 확인 및 정제]

1.1 확인

R,S-(히드록시-4-페녹시)-2-프로피온아미드(HPPA미드), 아릴옥시-2-프로피온아미드 유도체가 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 기질로서 아릴-2-프로피온아미드 유도체, 특히 페닐-2-프로피온아미드와 (벤조일-3-페닐)-2-프로피온아미드 보다 우수하다. HPPA미드의 R 이성질체와 마주하는 아미다제의 선택성은 또한 아릴-2-프로피온아미드 유도체의 S 이성질체에 대한 선택성을 나타낸다. 결국, 거울상 이성질체에 선택적인 효소활성은 기질로서 (히드록시-4-페녹시)-2-프로피온아미드를 사용하여 확인된다.

상기 반응은 pH 7.0, 50mM 인산나트륨 완충용액에서 Brevibacterium R312 존재하에 25℃에서 진탕하면서 반응시키고 0.05M 인산, 아세토니트릴, 1N 염산을 55/40/5(v/v) 비율로 혼합한 용액으로 반응을 중단한다. 배양체를 원심분리하고 상징액을 혼합한 용액으로 반응을 중단한다. 배양체를 원심분리하고 상징액을 HPLC(Hibar-Merck RP-18, 5㎛)로 분석하고 0.05M 인산과 아세토니트릴(85/15(V/V) 용액으로 용출하였다. HPPA미드와 HPP산 각각의 농도는 용출피크를 표준물질과 비교하여 측정하였다.

기질에 있어서 과량의 거울상 이성질체는 R과 S가 HPP산의 R,S 이성질체의 각 농도에서 (R-S)/(R+S)×100으로 정의된다. 과량은 거울상 이성질체는 편광계를 이용하여 589nm(Na)에서 측정되거나 키랄컬럼을 사용하여 HPLC로 측정된다.

전체세포와 가용성 추출물로 얻어진 활성을 각각 15U/mg과 24U/mg 단백질이었으며 (1U=시간당 생성되는 1μmol HPP산), (R)-HPP산 거울상 이성질체 량은 95%였다. 이러한 결과는 Brevibacterium R312가 S산에 해당하는 라세믹 아릴-2-프로피온아미드를 가수분해할 수 있는 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 포함함을 나타낸다. 상기와 같은 사실은 라세믹 페닐-2-프로피온아미드와 라세믹(벤조일-3-페닐)-2-프로피온아미드를 각각의 S-형 산으로 93%보다 높은 비율로 가수분해함으로써 증명되었다.

1.2. 정제

정제는 4℃에서 실시하며 세포(40g의 건조된 Brevibacterium R312)는 완충액 A(pH 7, 50mM 인산나트륨, 5mM β-메르캅토에탄올) 300ml에 녹여 현탁한다. 세포를 초음파 분해하여 남은 멤브레인은 2,000rpm에서 30분동안 원심분리하여 제거하고 상징액 30ml에 10% 황산 스트렙토마이신 용액 25ml를 저어주면서 천천히 가한다. 45분후 맑은 용액이 되면 상징액을 암모니움설페이트로 처리하여 30.8% 내지 56.6% 암모니움설페이트 농도 사이에서 침전된 단백질 부분을 원심분리로 모아 완충액 A35ml에 녹이고 같은 완충액으로 천천히 투석시킨다. 얻어진 용액을 20% 암모니움 설페이트로 처리하여 원심분리하고 20% 암모니움 설페이트와 완충액 A로 평형시킨 페닐-세파로스 CL-4B 컬럼에 적재하여 활성을 가진 부분은 동일한 완충액으로 용출하고 Amicon Diaflo PM10셀을 이용한 한외여과로 18ml까지 농축한다. 10% 글리세롤을 농축된 용액에 가하고 생성된 용액을 50mM 트리스-염산 pH 7, 100mM, NaCl로 전처리한 Ultrogel Acl 44컬럼(IBF-Biotechnics, France)에 적재한다. 가장 높은 활성을 가진 부분(적재된 시료에 대해 약 32%의 전체활성을 함유하는)을 모아 농축하여 같은 젤로 다시한번 여과한다. 가장 높은 활성을 가진 부분(적재된 시료에 대해 약 30%의 전체활성을 함유하는)을 SDS-PAGE로 분석하여 저장하고 정제된 단백질의 거울상 이성질체 선택성을 정량하였다.

상기 정제방법으로 815U/mg의 활성을 가지는 약 80% 정도 순도의 효소를 얻었으며 SDS-PAGE에서 총단백질의 80%에 해당하는 분자량 59±5KD의 뚜렷한 띠가 관찰되었다. 또한 HPLC TSK 3000 컬럼에서 용출된 아미다제가 분자량 122KD에 해당하여 상기 효소가 다이머 형태임을 시사하였다.

표 1은 서로 다른 부분의 특성을 나타낸 것이며 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 각각의 정제단계를 기재한 것으로 40g의 습기있는 세포가 사용되었으며 황산 스트렙토 마이신으로 침전되었고 1단위(U)는 아래에 기재된 조건에서 시간당 생성되는 HPP산 1μmol에 해당한다.

[실시예 2]

[Brevibacterium R312의 거울상 입체 이성질체에 선택적인 아미다제의 클로닝]

2.1 단백질 시퀀스의 용도

Brevibacterium R312의 거울상 입체 이성질체에 선택적인 아미다제의 N-터미널(27잔기)과 트립식 내부 절편(21잔기) 각각에 해당하는 펩티드 시퀀스는 정제된 효소를 이용하여 결정하였다.

아미다제 3nmol을 환원 및 카프복시 메틸레이션 시키고 주요 단백질 성분은 탈염시켜 가역상 HPLC로 균질이 되도록 정제한다. N-터미널 시퀀스는 Applied Biosystems Model 470A를 이용하여 에드만(Edman)의 자동 시퀀스 분해법으로 결정하였다. 제1도 a에 나타낸 시퀀스는 상기 방법으로 얻어진 것이다. 부가적인 내부 시퀀스를 얻기위해 동량의 단백질을 트립신으로 가수분해하여 환원 및 카르복시메틸레이션된 절편을 0.07% 트리플루오로 아세트산과 아세토니트릴을 0에서 50%까지 차동 혼합하는 용출 완충액을 사용하여 가역상 HPLC(컬링 2.1×10mm, 유출속도:0.2ml/분)로 분리하여 분리결과가 좋은 피크(40.8% 아세토니트릴)에서 용출된 펩티드를 시퀀스하였다(제1도 a).

2.2 뉴클레오티드 프로브의 구조

두가지 방법이 사용되었는데 첫번째는 Brevibacterium lactofermentum(6개의 시스트론을 함유하는 7.7kb 시퀀스:Matsul et.al., Mol. Gen. Genet, 209p, 299, 1987)의 트립토판 오페론에서 코돈을 사용한다는 것을 주지하고 내부절편(소량의 평균적인 축퇴를 보이는)의 IDGALGSYDV 시퀀스를 이용하여 29-개 프로브(최소 59%의 동질성을 유지하는)를 만들었다. 코드되지 않은 가닥은 G:T쌍의 상대적인 열역학적 중립성을 고려하고 관련된 코돈(선택된 코돈에 약 80%)의 이론적인 평균 빈도를 최대화하기 위한 몇몇의 축퇴를 삽입하여 합성하여 약 69%의 프로브에서 GC쌍을 유도하였다. 상기 프로브(Sq 762)의 시퀀스는 제1도 b에 제시하였다.

두번째 방법은 Girges 등(Nucleic Acids Res. 16, p.10371, 1988)의 PCR 방법이 고도로 축토된 코돈에 해당하는 펩티드에서 정확한 뉴클레오티드 프로브를 얻기위해 사용되었는데 N-터미널 펩티드 시퀀스의 첫번째 또는 마지막 5개의 코돈을 코딩하는 모든 가능성에 해당하며 EcoRI과 HindIII 부위에서 각각 운반되는 25-개 올리고 뉴클레오티드(제2도 a의 밑줄부분)가 5' 말단에서 합성되었다.

상기 25개의 올리고 뉴클레오티드는 Brevibacterium R312 제놈성 DNA의 효소를 증식하는 프라이머로서 사용된다. 30회의 증식후에 젤로 예비절편을 정제하고 박테리오파아지 M13mp19의 HindIII와 EcoRI 부위에 삽입된다. 두개의 서로다른 프라이머 혼성 온도(45℃와 48℃)를 사용하여 두개의 예비 절편을 만든다. 절편을 클로닝한 후 각각의 온도에 있는 몇 개의 군체들을 시퀀스하여 비교하여 그 결과를 제2도 a에 제시하였다. 프라이머로 삽입된 축퇴와는 별개로 아미다제의 N-말단을 코딩하는 DNA벌편(프타이머 가운데 독특한)이 잘 증식된 것을 볼 수 있다. 상기 내부 절편에 해당하는 40개의 합성된 올리고뉴클레오티드((sq918)는 그러므로 아미다제의 N-말단에 대한 정확한 프로브로서 나머지 군체에 이용된다. 제2도 b에 sq918 프로브의 뉴클레오티드 시퀀스를 나타내었다.

얻어진 Sq762와 Sq918프로브는 5'위치를 32p로 포스포릴레이션하였다.

2.3 Brevibacterium R12의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 코딩하는 유전자의 클로닝

이 방법은 먼저 프로브의 활성을 증명하고 써던 블로팅에 의해 클론되어진 제놈성 DNA의 성질을 측정한다. 즉 Brevibacterium R312 제놈성 DNA는 가능한 클로닝부위, 바람직하게는 pUC 플라스미드의 다중 클로닝 영역에 존재하는 부위에 해당하는 몇몇의 제한 효소로 소화(digestion)되는데 제한 효소로는 PstI가 사용되었다. 아가로스 젤로 전기영동하고 나일론 멤브레인을 통과시킨후에 프로브 Sq762와 Sq918에 다양한 소화가 혼성되었다. 제3도에 나타낸 결과에서 두개의 프로브는 혼성 조건하에서(많아야 하나의 절편이 각각의 소화에 혼성하는) 특이성을 충분히 나타냄을 보여준다. 또한 두개의 프로브가 혼성에 대한 거의 동일한 프로필을 나타내므로 원하는 유전자의 혼성 시그널이 보다 특이하며 트립신에 의한 소화 후에 얻어진 내부 펩티드가 N-말단에 근접하다는 것을 확신할 수 있다. 특히 혼성의 증가가 두개 프로브로 강력하게 혼성된 5.4kb PstI 절편에서 나타났으므로 이 절편을 클론하기로 결정하였다.

클로닝에 있어서 Brevibacterium R312 DNA의 PstI 소화에 의해 생성되는 4.6 내지 5.5kb와 5.5 내지 6.5kb 사이의 모든 절편은 아가로스로 정제하여 전기 용출하고 PstI으로 절단한 pUC19에 접합되었다. E.coli균주 DH5α를 변형한 후에 이론적으로 재조합 미생물인 X-gal 배지에 500개의 흔 군체를 옮긴다.

각각의 군체를 개별적으로 분리하여 나일론 멤브레인에 옮기고 32p로 표지된 Sq918 프로브로 혼성하여 분석한다. 두개의 클론은 강력히 혼성되어 있으며 이들을 분리하여 다음과 같은 과정을 경유하였다.

두개의 클론에서 분리된 재조합 플라스미드 pXL1650과 pXL1651은 제한효소지도, 시퀀싱 프라이머로서 프로브를 사용한 부분적인 시퀀싱과 써던 블로팅 등의 다양한 방법으로 분석되었다.

제4도는 두개의 플라스미드가 두개 배향내에 동일한 5.4kb PstI가 삽입된 것을 나타낸 것이고 제5도는 이 절편의 제한 효소지도이다. 이들 두개 플라스미드는 N-말단이 결합된 트립신성 절편인 특징화된 펩티드를 코드하는 시퀀스를 함유한다(제8도). 또한 이들결과는 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 코드하는 유전자가 PstI에 BamHI이 배향된 2.3kb BamHI-PstI 절편에 위치함을 나타낸다. 코딩시퀀스가 5'말단에 위치한다는 사실과 효소가 많아야 2kb(추측컨대 57-63KD 모너모)에 의해 코드된다는 사실은 완전한 유전자가 본 발명이 진행한 시퀀스인 BamHI-PstI 절편에 함유된 것이 분명하다.

[실시예 3]

[Brevibacterium R312의 거울상이성질체에 선택적인 아미다제를 코딩하는 유전자를 함유하는 BamHI-PstI 절편의 시퀀스]

BamHI-PstI 절편의 시퀀싱 전략을 제6도에 나타내었다. 다양한 시퀀스들이 작은 절편들을 운반하는 단일가닥 M13 매트릭스에 대해서 또는 PXL1650 플라스미드에 직접적으로 체인반응종결 방법(7-deaza-dGIP와 (35S)-dATP 존재하에 시쿼나제 키트 사용)으로 얻어 그 말단에 몇몇의 특이성 프라이머를 합성하였는데 얻어진 시퀀스의 평균 GC 함량을 61.5%였다. 제7도는 개방판독을 나타낸 것으로 아미다제의 개방판독이 분자량 54671정도의 단백질, 인 521개 아미노산을 코드하는 것을 나타내었다.

상기 판독의 GC량을 첫번째, 두번째, 세 번째 위치에 대해 각각 65.8%, 52.5%와 70%였으며 이것은 GC가 풍부한 미생물의 코딩시퀀스의 전형적인 분포이다.

제8도에 BamHI-PstI 절편의 완전한 시퀀스를 나타내었다.

[실시예 4]

[E. Coli에서 Brevibacterium R312의 거울상이성질체에 선택적인 아미다제를 코딩하는 유전자의 발현]

4.1 플라스미드의 구조

부위(RBS)나 람다의 CII 유전자의 RBS를 함유하는 아미다제의 구조 유전자를 자체 프로모터인 트립토판 오페론 프로모터나 람다의 온도 감지성 프로모터하에 배치하여 수개의 플라스미드를 합성하였다. PXL1650 플라스미드(제4도)는 Brevibacterium R312의 제금성 DNA를 Pst19의 PstI 소화하여 얻어진 5.4kb 절편을 플라스미드 PUC19의 PstI 부위에 삽입하여 만들었다. 상기 플라스미드는 락토오스 오페론 Plac의 프로모터를 운반하며 리보소옴 결합 부위와 Brevibacterium R312의 거울상이성질체에 선택적인 아미다제를 코드하는 구조유전자와 암피실린 내성을 코드하는 마커로 계속된다.

플로스미드 PXL1724(제9도)는 E. Coli의 트립토판 오페론의 프로모터 조절하에서 5.4kb PstI 절편을 함유한다. 이 구조에 있어서, Brevibacterium R312의 아미다제 유전자는 그의 리보소옴 결합부위를 함유하는 ATG 코돈의 상류 58 염기쌍으로 계속된다(제8도).

Brevibacterium R312의 거울상이성질체에 선택적인 아미다제를 코딩하는 구조유전자는 이종 프로모터의 조절하에 이종 리보소옴 결합 부위와 함께 배치하여 두개의 다른 구조를 만들었는데 상기 플라스미드(PXL1751과 PXL1752)는 다음과 같이 얻어졌다.

플라스미드 PXL1724는 NdeI 부위(CATA TG)를 아미다제 구조유전자 상류에 위치하는 ATG 코돈 대신 사용하기 위해 PCR로 변이되었다. 증식을 개시 ATG코돈과 혼성된 NdeI 부위에 해당하는 프라이머와 ATG코돈 하류에 위치하는 XhoI 부위에 해당하는 프라이머를 실시되었는데 증식된 절편을 NdeI과 XhoI으로 절단하였다.

-Ptrp 프로모터의 이용 ECORI과 XHOI으로 소화된 PXL1724 플라스미드에 Ptrp 프로모터와 종료 시퀀스 tR1이 제거된 람다 CII 유전자의 리보소옴 결합부위를 운반하는 EcoRI-NdeI 절편과 아미다제 구조유전자의 5'영역(NdeIO-XhoI 절편)을 삽입하여 PXL1751 플라스미드를 만들었다(제10도).

-PRCITS 프로모터의 이용

PRCITS 프로모터와 종료 시퀀스 tR1이 삭제된 람다 CII 유전자의 리보소옴 결합부위를 함유하는 PXL1029 플라스미드의 EcoRI-NdeI 절편을 사용하여 상기 방법을 적용해서 PXL1752 플라스미드를 만들었다.

4.2 E. coli B와 E. coli KIz E1035에서 Brevibacterium R312의 아미다제 유전자의 발현

플라스미드 PXL1751과 PXL1752가 염화칼슘법으로 E. coli B와 E. coli K12E103S 균주의 변형예 사용되었으며 재조합 미생물의 선택은 암피실린 배지에서 실시되었다.

Brevibacterium R312의 거울상이성질체에 선택적인 아미다제의 발현은 세포를 초음파 분해한 후에 SDS-PAGE에 의해서 측정되거나 원심분리후에 펠렛과 상징액의 SDS-PAGE를 측정하였다. 제12도에 보여진 결과는 총단백질의 20% 이상으로 나타나는 고도의 아미다제 발현을 나타낸다.

[실시예 5]

[아릴-2-프로피온산의 거울상이성질체에 선택적인 합성을 위한 Brevibacterium R312의 거울상이성질체에 선택적인 아미다제의 이용]

E. coli(PXL1751)은 아미다제를 코딩하는 시퀀스를 트립토판오페론의 프로모터 조절하에 배치하여 사용하고 E. coli(PXL1752)는 온도 민감성 억제인자 CIts의 조절하에서 람다 프로모터 PR의 증식기 말엽에 온도를 30℃에서 42℃까지 상승시켜 아미다제를 생산하는데 사용한다.

E. coli(PXL906)를 IL1β 유전자로 대체된 아미다제 유전자를 가진 E. coli(PXL1751)과 동량으로 준비하고 E. coli(PXL1029)를 IL1β유전자로 대체한 아미다제 유전자를 가진 E. coli(PXL1752)와 동량으로 준비하여 대조균주로 사용한다.

이들 미생물의 활성을 다음과 같은 방법으로 시험된다:

적절한 조건에서 배양한 세포 현탁액을 히드록시-4-페녹시-2-프로미온아미드(HPPAm)나 페닐-2-프로피온아미드(PPm), 또는 케토프로펜(KAm)의 아미드를 함유하는 용액에 가하여 아세토니트릴:IN 염산(90:10(V)V)을 함유하는 완충용액으로 희석하고 원심분리로 세포를 제거한다. 반응혼합물을 HPLC로 분석하여 아미다제 활성을 계산한 결과를 표 2에 나타내었는데 표 2는 상기 방법의 효율을 시사한다.

표 2에는 유도된 조건에서 E. coli로 생산되는, 생성된 키릴성을 가지는 산 중의 과량의 거울상 이성질체 뿐만 아니라 라세믹기질 HPPAm, PPAm과 KAm에 대한 Brevibacterium R312 아미다제 활성을 제시하였다.

표 3에는 유도 또는 억제된 조건에서 28℃에서 배양된 E. coli로 생산되는, 생성된 키랄성을 가지는 산 중의 과량의 거울상 이성질체 뿐만아니라 라세믹 기질 KAm에 대한 Brevibacterium R312(발현 플라스미드 pXL1751)의 아미다제 활성을 제시하였다.

그러므로 Brevibacterium R312(유전자형 Amd+)의 아미다제 유전자를 가진 E. coli 균주는 다음 세개의 아미드(병원형 AMD+)를 효율적으로 가수분해할 수 있다.

-히드록시-4-페녹시-2-프로피온아미드(HPPAm)

-페닐-2-프로피온 아미드(PPAm)

-케토프로펜 아미드(KAm)

얻어진 과량의 거울상 이성질체는 항상 93%보다 많았다.

[실시예 6]

[Rhodococus의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 정제]

I 효소활성 분석

활성부분을 완충용액(0.1M 트리스/HCl pH 7.5, 5mM DTT, 18mM 페닐-2-프로피온아미드) 500ml로 30℃에서 30분동안 항온처리한 후 아세토니트릴/1N 염산(90/10) 혼합액 2ml와 50mM H3PO4/CH3CN(75/25)의 혼합액을 가하여 5000rpm에서 10분간 원심분리하여 반응산물을 측정하기 위해 상징액을 HPLC로 분석한다.

-컬럼:뉴클레오심 5-CI8 25cm

-용출액:50mM H3PO4/CH3CN(75/25)

-적재량:10ul

-용출속도:1ml/분

시간당 페닐-2-프로피온 아미드 1umol을 가수분해 하는데 필요한 효소량을 효소활성 1단위로 한다.

II 정제방법

6.1 효소추출물의 제조

세포 7g을 0.1M 트리스/염산 pH 7.55 mMDTT 혼액 15ml 현탁하여 4℃에서 15분동안 초음파 분해하여 초기효소 추출물을 50000rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 모은다.

6.2 1차 이온 교환 크로마토그래피

초기 추출물 20ml에 완충액 A(25mM 트리스/HCL pH 7.5, 5mM DTT) 20ml를 가한다. 이 시료를 완충액 A로 평형시킨 Mono Q HR 10/10 컬럼(pharmacia)에 주사하여, 3ml/분의 속도로 유출시킨다. 컬럼을 세척한 후 KCl을 0.1에서 1M 농도로 연속적으로 변화시키면서 유출속도를 3ml/분으로하여 1시간내에 용출한다. 각 분획의 부피는 6ml였으며 아미다제는 KCl 약 0.3M에서 18ml가 용출되었다.

6.3 2차 이온 교환 크로마토그래피

활성부분을 모아 Centriprep 시스템(Amicon)을 써서 2ml로 농축한다. 완충액 A 6ml로 희석한 후 시료용액 4ml를 완충액 A로 평형한 Mono Q HR 5/5 컬럼에 주사하여 1ml/분의 속도로 유출시킨다. KCL을 0에서 0.5M까지 연속적으로 변화시키면서 유출하여 단백질을 용출한다. 활성부분을 모아 15% 글리세롤(V/V)을 가하고 상기와 같은 방법으로 1ml로 농축한다.

6.4 소수성 크로마토 그래피

완충용액 B(0.1M 트리스/HCl pH, 0.5mM DTT, 1.7M(NH4)2)SO4) 1ml를 시료에 가하여 페닐슈퍼로스 HR 5/5 컬럼(Pharmacia)에 주사하여 0.25ml/분의 속도로 유출한다. (HN4)2SO4를 0에서 1.7M까지 연속적으로 변화시키면서 25ml까지 유출하여 단백질을 용출시킨다. 각 분획의 부피는 0.5ml였고 활성부분을 15% 글리세롤을 가하여 완충액 A 1ml로 희석되었다.

6.5 수산화 인회석 크로마토그래피

상기 시료를 완충액 C(85mM 트리스/HCl pH 7.5, 0.5mM, 10μM CaCl2, 15% 글리세롤)로 평형시킨 Bio-Gel HPHT 컬럼(Bio-Rad)에 주사하여 0.5ml/분의 속도로 유출한다. 아미다제는 0.35M 인산 칼륨 pH 7.5, 0.5mM DTT, 10μM CaCl2, 15% 글리세롤 완충액을 0에서 100%까지 연속적으로 변화시키면서 0.5ml/문의 유출속도로 20분내에 용출하였다. 이 단계에서 효소활성 988μ/mg을 가진 균질의 효소가 정제되었다.

얻어진 효소는 분자량이 53±2KD인 동일한 서브유니트의 다이머 형태로 존재한다.

[실시예 7]

[상기 아미다제를 코드하는 유전자의 클로닝]

TSK-G3000 SW로 추가적인 정제를 한후에 효소를 시퀀스하였다. N-말단이 에드만형(Edman-type chemistry)에 접근하기는 어려우므로 트립신에 의해 가수분해하여 HPLC로 얻어진 가수분해물의 세개분액-123, 124와 162-에서 명백한 시퀀스의 펩티드를 함유하였다. 분액 123에서 얻어진 시퀀스에서 8개 올리고 뉴클레오티드의 혼합체에 해당하고 적어도 3회 축퇴된 위치에서 7개의 이노신을 함유하는 32개 뉴클레오피드 프로브를 합성하였다.

상기 프로브의 효율은 32P로 5'말단을 표지화하여 제한효소중의 하나로 소화한 Rhodococcus에서 제놈성 DNA로 써던 옮김하여 시험하였다. 사용가능한 제한 효소는 SstI, SphI, SmaI, PstI, KpnI, EcoRI, SalI과 BamHZ 등이며, 실험조건은 다음과 같다; 혼성화 완충액, 5×SSC, 5×Denhardt, 0.1% SDS, 50mM NaPO4, pH 6.5, 연어 정충 DNA 250μg/ml, 혼성화온도는 50℃ 또는 55℃(둘다 실험한다)이며 세척조건은 6×SSC로 실온에서 1시간동안과 2×SSC와 0.1% SDS로 50℃에서 5분이다.

이러한 조건에서 프로브 A는 강력하고 명백한 시그널을 가지는데 특히 BamHI, KpnI, SphI, SatI, SmaI, SalI과 PstI 등의 소화에 대해서이며 제놈성단일띠가 프로브 A에 강력하게 혼성되어 있는 것이 발견되었다. PstI 소화에 있어서 프로브 A에 대한 혼성시그널의 크기는 약 3.2kb의 제놈절편에 해당한다.

제놈성 DNA의 3 내지 4kb PstI 소화절편은 아가로스를 이용한 제조용도의 전기영동으로 정제하여 전기용출하고 PstI으로 자른 플라스미드 PUC19에 접합시킨다. Ecoli 균주 DH5α를 변경한 후에 LB Amp-x-gal 상에서 흰색을 띠는 600개의 클론을 다시 채집하여 써던과 유사한 프로브로 조건하에서 군체 혼성에 의해 시험하였다.

특별히 강력한 혼성시그널을 가진 9개의 클론을 플라스미드 DNA를 제한하여 분석하였는데 3.2kb의 동일한 절편이 두개 배향으로 분명히 삽입된 상기 클론 6개 가운데 각각의 배향(pXL1835와 pXL1836)을 나타내는 2개의 클론에 대해서는 더욱 상세히 분석(상세한 지도 및 써던 분석)하여 원하는 절편이 얻어졌음을 확인하였다.

[실시예 8]

[3.2kb PstI 절편의 시퀀스]

3.2kb PstI 절편의 완전한 뉴클레오티드 시퀀스를 두개 가닥에 대해 결정하였다. 상기 절편의 GC량은 62.4%였으며, R312의 GC량도 유사하다(약 62%). 시퀀스의 분석결과 트립신성절편을 시퀀스하여 얻어진 세 개의 펩티드를 함유하는 462개의 아미노산(분자량 48554)의 폴리펩티드는 코드하는 1386개의 뉴플레오티드(210 내지 1595 위치)의 개방 판독이 확인되었는데 이 개방판독은 제13도에 보여진 뉴클레오티드를 가진 반정도 클론된 BamHI 절편에 포함된다.

밑줄친 3개의 펩티드는 정제된 효소(펩티드 123,124와 162)의 트립신성 절편에 대해 직접 결정된 펩티드 절편에 해당하며 밑줄친 뉴클레오티드 시퀀스는 유전자를 증식시키는데 쓰이는 (축토된)프로브에 해당된다.

이탤릭체로 쓰여진 펩티드는 Brevibacterivm R312와 Rhodococcus 균주의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제간에 고도로 보존된 137 내지 193 잔기에 해당한다.

상기 개방 판독은 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 구조유전자이다.

[실시예 9]

[서로다른 아미다제간의 동질성 및 아미다제 활성을 가진 시퀀스의 특성 확인]

R312(제8도)의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 펩티드 시퀀스와 제13도에 나타나 있는 아미다제의 비교에서 R312의 150 내지 300잔기(동일성 50%) 사이에 159와 215의 잔기가 67%의 동종성가진, 시퀀스의 약 2/3에서 높은 동일성을 보였다.

동종성 시퀀스에 대한 GENPRO 유전자 은행의 연구에서 150 내지 200영역에서 비교적 높은 동종성이 나타났고 Aspergillus nidulans의 아세트 아미다제, Pseudomonas syringal와 Bradyrhizobium iaponicum의 인돌 아세트 아미드 하드롤라제(IAH), Agrobacterium tumefaciens의 tms2 단백질과 Flavobacterium 균주 K172와 Pseudomonas 균주 NK87의 6-아미노헥사노에이트-시클릭-디메르히드롤라제(ACDH)에서도 나타났다.

표 4는 상기에서 언급한 효소들의 각 부분이 가진, 아미다제의 펩티드 137-193의 동종성을 나타낸 것이다.

상기와 같은 동종성이 강력하게 보존된 영역은 이들 효소의 활성을 가진다.

[실시예 10]

[E.coli에서 거울상이성질체에 선택적인 아미다제의 발현]

거울상이성질체에 선택적인 아미다제를 코드하는 상태의 동일성을 확인하기 위해서 NdeI 부위(CATATG)가 210위치(제13도)의 가정되는 ATG 코돈에서 PCR법으로 만들어졌으며 아미다제를 코드하는 영역을 함유하는 1683 위치에서 상기 부위와 SalI 부위 사이의 절편을 E.coli에서 시그널 기능 조절하에 전사개시(프로모터 Ptrp 또는 Pr)와 번역(리보소옴 결합 부위 CII)을 위해 배치하였다. 이렇게하여 얻어진 벡터(pXL1893, Ptrp와 pXL1894, PR-CIts)는 언급된 바와같이 pXL1752 벡터와 R312의 아미다제를 발현하는 pXL1751 베터와 유사하다. 프라스미드 pXL1893과 1984의 발현은 E.coli B와 E.coli K12 E103S에서 각각 연구되었다.

정제된 아미다제를 함유하는 단백질은 특별히 플라스미드 pXL1894 존재하에 52℃에서 생산되었다.

[실시예 11]

[corynebacteria에서 거울이성질체에 선택적인 아미다제의 발현]

1. 발현벡터구조

벡터는 corynebacteria에 대한 복제용 벡터에서 유도하였으며, E.coli의 리플리콘, corynbacteria의 리플리콘, 선택성마커, Amd 시퀀스등을 포함한다.

-pSV73벡터(제14도):이 플라스미드는 E.coli 리플리콘과 전이인자 Tn903에 이어진 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 PUC8 플라스미드의 삽입에 의해 C. glutamicum(Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162, 591, 1985)의 pSR1 플라스미드에서 유도하여 제13도에 Amd 시퀀스에 다른 종류의 발현 벡터를 만드는데 사용하였다.

-pYG811 A와 B 벡터(제15도):이들은 제13도의 SalI 절편에 함유된 Amd 시퀀스를 두배향 모두에서 pSV73의 SalI 부위에 클로닝하여 얻었다.

-pYG817 A와 B 벡터(제16도):이들은 제13도의 BamHI 절편이 함유된 Amd 시퀀스를 두배향 모두에서 pSV73의 BglII 부위에 클로닝하여 얻었다.

-pYG822 벡터(제17도):이 발현벡터는 제13도의 Amd 시퀀스를 함유하는 발현카셋트를 SalI과 BalII 사이에 삽입하여 E.coli의 트립토판 오페론의 프로모터 Ptrp 하에서 pSV73으로부터 유도하였다.

-다른 잠복성 Corynebacterium 플라스미드는 corynebacteria에서 작용하는 Amd 시퀀스에 대한 발현벡터의 구성에 사용될 수 있다.

예를들면, B. lactofermentum(Yeh et al., Gene, 47, 301-306, 1986)에서 분리된 플라스미드 pX18은 Brevibacterium R312에서 복제될 수 있는 셔틀벡터 pYG820A와 pYG820B를 구성할 수 있으므로 수개의 corynebacteria에서 클로닝과 발현실험의 수용균으로 사용할 수 있다.

2. Corynebacteria의 변형

변형기술로서 알려진 모든 방법이 사용될 수 있는데 특별히 위에서 인용한 Yoshima et. al이 기술한 프로토플라스트-재생방법을 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 전기이동(electroporation) 방법이 매우 효과적이며 변형빈도를 100배까지 증대시킨다.

초음파 분해된 세포를 SDS-PAGE하여 재조합 숙주에서 세포내 효소발현을 분석한다.

[실시예 12]

[효소의 촉매작용]

이번 실시예는 해당 라세믹 아미드를 가수분해하여 광학적으로 활성인 유기산의 거울상이성질체에 선택적인 합성에 대해 Amd 형의 단백질 또는 이 단백질을 발현하는 재조합 미생물의 용도에 관한 것이다.

1. 세포의 제조

다른 종류의 균주들을 2리터 삼각 플라스크의 600ML 배지에 넣어 적절한 배양조건을 주고 28℃에서 150회전/분으로 진탕하면서 배양한후 세포를 모아 NacI(9g/L)용액으로 세척하여 -18℃에 저장한다.

2. 페닐-2-프로피온아미드기질

페닐-2-프로피온아미드와 세포현탁액을 교반기가 부착된 플라스크에 가하고 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 부피를 5ML로 조절한다. 상기 플라스크를 온도조절장치가 된 결정용기에 담아 25℃에서 1시간동안 저어준 후 반응 혼합물은 아세토니트릴/HCL(9/1(V/V))용액으로 희석한다. 박테리아와 세포잔여물을 원심분리하여 제거하고 산과 아미드의 조성을 HPLC로 정량하였다.

Brevibacterium R312와 Brevibacterium Iactofermentum에서 얻어진 결과는 다음과 같다.

3. 라세믹 케토프로펜 아미드 기질

표 6에서 보이는 바와같이 Rhodococcus에서 아미다제를 발현하는 재조합 Corynebacteria는 pSV73으로 변형된 대조용 세포보다 훨씬 높은 활성을 가진다.

Claims

제8도에 도시된 Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 코딩하는 시퀀스와 제13도에 도시된 Rhodococcus의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제를 코딩하는 시퀀스, 유전자 코드의 축퇴로 발생하는 것이 아닌 동일한 단백질을 코딩하는 상기 시퀀스들의 유사물, 상기 시퀀스중 하나 또는 그들의 단편과 혼성화되고 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 가진 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA로부터 선택되는, 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 시퀀스.
제1항에 있어서, 적어도 DNA 시퀀스는 제13도에 도시된 137 내지 193 아미노산이나 제8도에 도시된 159 내지 215 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 시퀀스.
적어도 제8도에 도시된 시퀀스의 코딩영역을 함유하는 DNA.
적어도 제13도에 도시된 시퀀스의 코딩영역을 함유하는 DNA.
제1항의 DNA 시퀀스를 포함하는 유전자.
제1항의 DNA 시퀀스의 발현으로 생성되며 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제의 활성을 함유하는 신규한 폴리펩타이드.
제6항에 있어서, 상기 시퀀스는 제8도 또는 제13도에 도시된 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 활성을 가지며, 제13도에 도시된 아미노산 137 내지 193에 해당하는 시퀀스, 제8도에 도시된 아미노산 159 내지 125에 해당하는 시퀀스, 중에서 적어도 하나의 선택된 시퀀스를 포함하는 폴리펩타이드.
제6항의 펩타이드는 자연 그대로의 것이 아님을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
적어도 숙주세포에서 그들의 발현을 담당하는 DNA 시퀀스의 조절하에 제1항에 따른 시퀀스를 수반하는 발현카셋트를 함유하는 형질 전환된 미생물.
제10항에 있어서, 제1항에 따른 시퀀스가 발현되는 DNA 시퀀스는 전사 및 번역개시 영역을 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 전사 및 번역 개시 영역이 프로모터 시퀀스와 리보오솜 결합 부위를 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제12항에 있어서, 상기 프로모터 시퀀스와 리보오솜 결합부위는 생성하는 펩타이드에 대해 동종이거나 이종일 수 있음을 특징으로 하는 미생물.
제13항에 있어서, 상기 프로모터 시퀀스는 corynebacterium 파아지의 강력한 프로모터, 트립토판 오페론의 Ptrp 프로모터, 락오페론의 Plac 프로모터, 파아지 람다의 좌측 프로모터 PL 또는 우측 프로모터 PR 중에서 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 미생물.
제14항에 있어서, 상기 프로모터는 트립토판 오페론 Ptrp 프로모터와 파아지 람다의 우측 프로모터 P_RcIts를 사용하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 리보소옴 결합부위는 파아지 람다의 cII 유전자나 corynebacteria의 동종 유전자로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 발현카셋트는 선택방법을 가진 플라스미드에 수반되는 것을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 선택방법은 항생물질에 내성을 주는 선택 가능한 마커임을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 플라스미드는 트립토판 오페론의 Ptrp 프로모터, 전사종료 시퀀스 tR1이 결실된 파아지 람다의 cII 유전자의 리보오솜 결합부위, Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 유전자를 코딩하는 DNA와 암피실린 내성을 주는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 플라스미드는 파아지 람다 P_RcIts의 온도 감지성 우측 프로모터, 전사종료 시퀀스 tR1이 결실된 파아지 람다의 cII 유전자의 리보소옴 결합부위, Brevibacterium R312의 거울상 이성질체에 선택적인 아미다제 유전자를 코딩하는 DNA와 암피실린 내성을 주는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 미생물.
제10항에 있어서, 상기 미생물은 E.coli, Brevibacterium, Corynebacterium Rhodococcus 균주들 중에서 선택되어지는 것임을 특징으로 하는 미생물.
제21항에 있어서, 상기 균주는 E.coli B 또는 E.coli K12 E103S 임을 특징으로 하는 미생물.
거울상 이성질체에 대하여 선택적인 아미다제를 제조함에 있어서, 제10항에 따른 미생물을 상기 아미다제를 코딩하는 시퀀스가 발현될 수 있는 조건에서 배양하고 배양후 미생물을 분리하여 아미다제를 추출되는 것을 특징으로 하는 거울상 이성질체에 대해 선택적인 아미다제의 제조방법.
제23항에 있어서, 상기 배양물을 초음파 분해하고 암모니움 설페이트로 분별하여 페닐세파로스상에서 크로마토그래피하여 더블(double)젤 여과를 실시하는 것을 특징으로 하는 거울상 이성질체에 대해 선택적인 아미다제의 제조방법.
제10항에 언급된 미생물의 존재하에서 또는 제6항 내지 제9항에 따른 폴리펩타이드 존재하에서 대응 라세믹 아미드로부터 유기산의 입체 이성질체를 합성하고 반응 후 입체 이성질체를 회수하는 것을 특징으로 하는 대응 라세믹 아미드로부터 유기산의 입체이성질체 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 아미드는 각각 라세믹2-아릴-프로피온아마이드 및(S)형 산임을 특징으로 하는 대응 라세믹 아미드로부터 유기산의 입체이성질체 제조방법.
제26항에 있어서, 상기 라세믹2-아릴-프로피온아미드는 케토프로펜의 아미드이고 산은 S(+)형 케토프로펜임을 특징으로 하는 대응 라세믹 아미드로부터 유기산의 입체이성질체 제조방법.
제25항에 있어서, 상기 아미드와 산은 각각 라세믹2-아릴옥시-프로피온아미드이고 산은 대응하는 R형 입체 이성질체임을 특징으로 하는 대응 라세믹 아미드로부터 유기산의 입체이성질체 제조방법.