PT95909B

PT95909B - Processo para a preparacao de amidases enentiosselectivas

Info

Publication number: PT95909B
Application number: PT95909A
Authority: PT
Inventors: Jean-Francois Mayaux; Dominique Petre; Edith Cerbelaud; Patrice Yeh
Original assignee: Rhone Poulenc Sante
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-11-15
Publication date: 1998-01-30
Also published as: DE69030615D1; AU631696B2; JPH04218379A; ZA909071B; KR910012245A; PT95909A; FI102971B; HUT56138A; US5766918A; EP0433117A1; AU6661490A; IE904115A1; FR2655660B1; DE69030615T2; GR3024316T3; FR2655660A1; KR0164850B1; CN1052508A; NZ236087A; FI102971B1

Description

RH0NE-POULENC santé

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE AMIDASES ENANTIOSSELECTIVAS

A presente invenção refere-se a polipétidos com ac_ tividade de amidase enantiosselectiva. também se refere ao materi_ al genético necessário para a expressão desses polipéptidos,assim como a um procedimento microbiológico para a sua preparação.Finaj_ mente, a presente invenção refere-se à utilização destes polipéU dos e de microrganismos transformados para a síntese enantiosselectiva de ácidos a partir de amidas racémicas e, em particular de ácidos propiónicos, especialmente os ácidos (S)-2-aril-propi_ó nicos e ácidos(R)-2-ariloxi-propiónicos.

Devido à presença de um átomo de carbono assimétrico diversas moléculas possuem duas formas esteroisoméricas diferentes R e S, sendo uma a imagem no espelho da outra. Este ê o caso dos ácidos 2-ari1-propiónicos. Na maioria das vezes estas moléculas existem sob a forma de misturas racémicas, estando os dois isómeros presentes em proporções mais ou menos iguais. Em determinados casos, apenas é necessário um isómero específico, sendo por esse motivo prático dispor de meios de separação dos dois isómeros ou meios para se efectuar a síntese estereoespecífica do isómero desejado.

A presente invenção refere-se ao domínio dos polipétidos capazes de hidrolisar amidas de um modo enantiosselectivo em particular 2-ariI-propiónamidas racémicas em ácidos (S)-2-aril -propiónicos e 2-ariloxi-propionamidas racémicas em ácidos (R)-2-ariloxi-propiónicos.

Entre os microrganismos nos quais esta actividade enzimática foi demonstrada sobressaem as estirpes do género Brevi bacterium e Corynebacterium (pedido de patente de invenção europeia N2 89 400197.3) e, em particular a estirpe R312 (CBS 717.73) do Brevibacterium. Além disso, estirpes tais como Rhodococ,cus possuem esta actividade enzimática.

A presente invenção engloba a caracterização e purj_ ficação destas actividades de amidase enantiosselectivas, assim co mo a clonagem e a sequenciação do material genético responsável pela sua expressão. Em seguida utiliza-se o termo Amd para se designarem todas as actividades enantiosselectivas da amidase. A designação sequência de Amd refere-se a todas as sequências nucleotídicas que codificam para as referidas actividades da amidase.

Em particular, o objectivo da presente invenção é a obtenção de níveis elevados de expressão destas amidases enantios_ selectivas em diferentes organismos hospedeiros, utilizando técn_£ cas de recombinação de ADN.

Um dos pontos principais da presente invenção refere-se, por isso, às sequências de ADN que codificam para esses p£ lipéptidos com actividade de amidase enantiosselectiva, especialmente no que se refere a 2-ari1-propionamidas racémicas.Num aspe£ to preferido da presente invenção, o objecto consiste na sequência nucleotídica que codifica para a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312 ( representada na Figura 8) ou para a amidase enantiosselectiva de Rhodococcus ( representada na Figura 13 )assim como quaisquer sequências degeneradas que codifiquem para o mesmo polipéptido. A presente invenção também se refere a sequências que se hibridam com estas sequências de ADN com os seus fra£ mentos e que codificam para os polipétidos com actividade de amidase enantiosselectiva. A presente invenção também se refere aos genes que contêm estas sequências de ADN.

Os estudos de homologia entre as sequências peptídicas destas amidases revelaram uma região altamente conservada responsável pela actividade observada. Esta região corresponde aos aminoácidos 137 a 193 da sequência peptídica indicada na Figura 13 (nucleótidos 618 a 788) e aos aminoácidos 159 a 215 da sequência peptídica da amidase de Brevibacterium R312 previamente descrita, os quais partilha uma estreita homologia (67%).

Um dos objectos da presente invenção refere-se, por isso, a uma sequência de ADN tal como anteriormente descrita, caracterizada pelo facto de conter, pelo menos, a sequência que co-4-

difica para os aminoácidos 137 a 193 na Figura 13, ou 159 a 215 na Figura 8, ou uma sequência peptídica com, pelo menos, 50% de homologia para os referidos aminoácidos.

Em particular, um dos objectos da presente invenção refere-se a uma sequência de ADN caracterizada pelo facto de conter total ou parcialmente a sequência de Amd apresentada nas Figuras 8 e 13 ou uma sua variante. No contexto da presente invenção, o termo variante refere-se a todas as sequências que conservam as propriedades da sequência inicial, ainda que contenham alterações resultantes de, por exemplo, mutações, eliminações, inserções ou degenerescência do código genético.

De um modo mais preciso, a sequência de ADN contém a sequência apresentada nas Figuras 8 ou 13.Podem obter-se estas sequências mediante diversos métodos. A estratégia geral consiste em cionar o fragmento de ADN genómico que codifica para o polipéptido desejado, com o auxílio de sondas nucleotídicas derivadas de polipétidos purificados. Po_ de construir-se uma inserção nucleotídica contendo a sequência de ADN desejada utilizando diferentes métodos que incluem o prolong_a mento do precursor, enzimas de restrição, inserção de adaptadores ou ligação de oligonucleótidos de ligação. Pode efectuar-se o seu mapa e a sua sequência, de acordo com técnicas descritas na literatura.

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Podem utilizar-se outras técnicas incluindo a utilização de ADN e/ou síntese química parcial ou total. Estas técnicas são bem conhecidas e as estruturas descritas nas Figuras 8 e 13 permitem o isolamento de uma sequência equivalente, em qualquer nu crorganismo, utilizando técnicas clássicas.

Com efeito, após ter-se demonstrado a homologia entre as diferentes amidases enantiosselectivas, a presente invenção permite a produção de sondas que podem servir para identificar os genes de hibridação ( isto é, os genes com uma homologia suficieii te) em qualquer banco genómico. Deste modo, é fácil verificar que estes genes codificam para uma amidase enantiosselectiva. Deste mo_ do, é possível obter-se elevadas quantidades de amidase em qualquer microrganismo. Também é possível que venham a ser reveladas n£ vas actividades de amidase enantiosselectiva.

A presente invenção também se refere a polipétidos com actividade de amidase enantiosselectiva que contêm, pelo menos, uma das seguintes sequências peptídicas:

- sequências que correspondem aos aminoácidos 137 a 193 na Figura 13;

- sequências que correspondem aos aminoácidos 159 a 215 na Figura 8;

- sequências que compartilham pelo menos 50% de homologia com estas sequências.

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Α

Um outro objecto da presente invenção refere-se a no_ vos polipétidos cuja estrutura é derivada das sequências de ADN previamente descritas e que possuem uma actividade de amidase ena£ tiosselectiva. Estes polipeptidos obtêm-se por extracção e purificação a partir de culturas de microrganismos naturais ou recombinantes. Efectua-se a purificação numa sucessão de passos que consiste na preparação do extracto bruto a partir da cultura, fracci£ namento do extracto com sulfato de amónio e purificação por cromatografia e filtração em gel. Indicam-se os pormenores nos exemplos.

De um modo mais preciso, a presente invenção refere-se a amidases enantiosselectivas de Brevibacterium R312 e de Rhodococcus.

A presente invenção também se refere a microrganismos transformados que contêm, pelo menos, uma sequência (cassette) de expressão para as sequências de ADN anteriormente mencionadas. Estas sequências (cassettes) serão constituídas, de preferência, por uma sequência de ADN de acordo com a presente invenção colocada sob o controlo de sequências de ADN reguladoras que assegura a sua expressão no hospedeiro desejado. A sequência (cassette) pode ser integrada no genoma do hospedeiro ou inserida num plasmídeo de um marcador seleccionável e de uma origem de replicação funcional no hospedeiro.

Um dos pontos de interesse :-da presente invenção é a expressão destes polipétidos sob condições artificiais, isto é a

-Ίexpressão de uma sequência heteróloga em determinadas células cujas condições de cultura sejam particularmente vantajosas e/ou a expressão de uma sequência homóloga sob o controlo de sinais regi£ ladores pelo menos parcialmente heterólogos, com vista a aumentar a produção e/ou melhorar as condições de cultura.

As sequências de ADN que controlam a expressão das sequências de ADN que são o objecto da presente invenção comportam, de preferência, uma região de iniciação de transcrição e de de tradução. Esta região contém um promotor e um sítio de ligação ribossómica que pode ser homólogo ou heterólogo em relação â do produto peptídico.

A escolha da região reguladora depende do hospedeiro utilizado. Nos hospedeiros procarióticos, em particular, o pro motor heterólogo pode ser escolhido entre os promotores bacterianos fortes, tais como os promotores do operão do triptofano Ptrp, o operão da lactose, Plac, os promotores direito ou esquerdo do bacteriofago lambda, P_R e P_L, os promotores fortes dos fagos corynebactéria, ou mesmo os promotores homólogos de corynebactéria.De um modo mais preciso, no caso do promotor direito do bacteriófago lambda, dá-se preferência à forma sensível à temperatura, PRcIts. Para os organismos eucarióticos, tais como as leveduras, podem utilizar-se os promotores dos genes glicolíticos de levedura, tais como os promotores dos genes de fosfogliceratoquinase (PGK), gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GPD), lactase (LAC4) e enolase (ENO).

Quando o microrganismo hospedeiro é procariótico, os sítios de fixação ribosómica serão preferencialmente derivados do gene CII de lambda ou de genes homólogos de corynebactéria.

A região funcional de terminação de transcrição e de tradução no hospedeiro encontrar-se-ão colocadas na extremidade 3' da sequência de código. 0 plasmídeo também será portador de um ou mais marcadores que permitam a selecção do hospedeiro recom binante. Dá-se preferência aos marcadores dominantes, tais como os que conferem resistência a antibióticos semelhantes à ampicilina ou à estreptomicina·. ou a outras toxinas.

Os microrganismos hospedeiros utilizados incluirão, sobretudo enterobactérias, tais como E.coli. e corynebactérias do género CoryneBacteri um, Brevibacterium, ou Rhodococcus .

Ê evidente que se podem utilizar outros tipos de células com base no mesmo princípio.

Um objecto da presente invenção refere-se aos plasmídeos previamente descritos que contêm, pelo menos, uma região de iniciação de transcrição e de tradução, uma sequência de ADN que codifica para 0 polipéptido desejado e um marcador seleccionável.

A presente invenção também se refere aos microrganis. mos transformados anteriormente descritos, tendo em vista a sua

aplicação na preparação de amidases enantiosselectivas, assim como à sua utilização para síntese enantiosselectiva de ácidos a partir de amidas racémicas.

procedimento para a preparação de amidases en^ntiosselectivas envolve o cultivo dos microrganismos anteriormente descritos sob condições oue permitam a expressão da sequência que codifica para amidase enantiosselectiva, seguido da separação dos microrganismos da amidase produzida.

Mais precisamente, a presente invenção refere-se à utilização dos microrganismos ou de polipétidos recombinantes anteriormente descritos para a síntese enantiosselectiva de ácidos 2-ari1-propiónicos a partir das correspondentes 2-aril-propionann das racémicas.

De acordo com um dos aspectos preferidos da presente invenção, descreve-se o procedimento recomendado, que consiste na preparação de um estereoisómero de um ãcido orgânico, a partir da amida racémica correspondente, caracterizado pelo facto de se colocar a amida racémica na presença do microrganismo transformado tal como anteriormente se descreveu ou na presença de um polipéptj_ do obtido tal como anteriormente se descreveu e de se recuperar o esteroisómero resultante.

Entre as amidas que podem ser submetidas a este pro cesso pode mencionar-se a amida racémica de cetoprofeno, a partir da qual pode preparar-se o S(+)-cetoprofeno, útil na indústria far macêutica.

Os exemplos e figuras que se seguem apresentam ojj tras características e vantagens da presente invenção. Devem ser considerados apenas como ilustrações e não devem, de modo algum, limitar o âmbito da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

- Figura 1:

A. Sequências peptídicas (N-terminal e interna) obtida a pa_r tir da amidase purificada a partir de Brevibacterium R312.

B. Sonda oligonucleotídica derivada do fragmento peptídico interno.

- Figura 2:

A. Estratégia para a construção da sonda Sq 918 a partir do fragmento peptídico N-terminal derivado da amidase Brevibacterium R312.

B. Sonda específica Sq 918.

- Figura 3:

A. Características de hibridação da sonda Sq 918 com o ADN genómico total de Brevibacterium R312 digerido com EcoRI, HindIII, Kpnl, PstI, Smal e Sphl.

B. Características de hibridação da sonda Sq 762 com o ADN genómico total de Brevibacterium R312 digerido com BamHI, BglII, EcoRI, Kpnl, PstI, SaLL, Smal, Sphl, SstI e Xhol.

- Figura 4:

Mapas de restrição dos plasmídeos pXL1650 e pXL1651.

- Figura 5:

Mapa de restrição do fragmento PstI de 5,4 Kb que contêm o gene da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312.

- Figura 6:

Estratégia de sequenciação do fragmento BamHI-PstI que contém o gene da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312.

- Figura 7:

Análise das sequências de transcrição abertas do fragmento sequenciado.

- Figura 8:

Sequências nucleotídicas e peptídicas do gene da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312.

- Figura 9:

Mapa de restrição do plasmídeo pXL1724.

- Figura 10:

Mapa de restrição do plasmídeo pXLl751.

- Figura 11:

Mapa de restrição do plasmídeo pXLl752.

- Figura 12:

Gel de poliacrilamida-SDS a 12,5% após coloração com azul de Coomassie, mostrando a expressão da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312 nas estirpes E.coll B. e de E. coli Kl2 E103S. Cada pista corresponde a uma quantidade de proteína equivalente a 60 de uma cultura com uma D.O. de 2,1 (E103S) ou 0,7 (E.coli B) T, fracção tratada com ultra-sons; C, fracção insolúvel. Os plasmídeos testemunhas (pXLlO29 e pXL906) contêm o gene ILI-^sob o controlo do promotor PRcIts ou Ptrp, respectivamente.

- Figura 13:

Sequências nucleotídicas e peptídicas do gene da amidase enantiosselectiva de Rhodococcus (fragmento BamHI do plasmídeo

PXL1836).

- Figuras 14:

Mapa de restrição

- Figura 15:

Mapa de restrição

- Figuras 16:

Mapa de restrição

- Figuras 17:

Mapa de restrição do vector móvel da expressão da expressão da expressão do do do (shuttle) pSV73 plasmídeo pYG811B plasmídeo pYG817B plasmídeo pYG822.

PLASM1DEOSDE PARTIDA plasmídeo pXL1029 descrito por Jung et al., Ann. In st. Pasteur/Microbiol, 139 ( 1986) 129-146 é portador de um frag_ mento EcoRI-Ndel que contém P_Rcits-RBScIlAtRI.

EXEMPLO 1

Identificação e purificação da amidase enantiosselectiva de

Brevibacterium R312.

1.1 Identificação compostos (R,S)-2-(4-hidroxi-fenoxi)-propionamida (HPPAmida), um derivado de 2-ariloxi-propionamida, é um substrato melhor para a amidase enantiosselectiva do que os derivados de 2-ari1-propionamida, especialmente de 2-feni1-propionamida e de 2-14-(3-benzoi1-feni1)-propionamida. Além disso a selectividade da ann dase relativamente ao enantiómero R de HPPAmida é representativa da selectividade em relação ao enantiómero S dos derivados de 2-ari1-propionamida.

Como consequência, detectou-se a actividade enzimáU ca enantiosselectiva utilizando 2-(4-hidroxi-fenoxi)-propionamida como substrato. Efectuou-se a reacção à temperatura de 25°C, com agitação, num tampão de fosfato de sódio 50 mM, a pH 7,0, na presença de Brevibacterium R312; interrompeu-se a reacção mediante adição de uma mistura de ácido fosfórico 0,05 M, acetonitrilo e HCL 1 N numa relação de 55/40/5 (v/v). Após centrifugação da cultura analisou-se o sobrenadante por cromatografia líquida de fase inversa de alta resolução (HPLC) (Hibar-Merck RP-18, 5ju). Efectuou-se aeluição com uma solução de ácido fosfórico 0,005 M e acetonj^ trilo (85/15) (v/v). Mediram-se as respectivas concentrações de HPPAmida e de HPPAcido por comparação dos picos de eluição com um padrão, para este substrato definiu-se o excesso enantiomérico c£ mo (R-S)/(R+S)x100 em que R e S representam as concentrações respectivas dos en -ntiómeros R e S do HPPAcido. Deduziu-se o excesso enantiomérico a partir de medidas polarimétricas (utilizando a absorção de sódio a 589 nm), ou por HPLC utilizando uma coluna qu^ rálica.

As actividades obtidas com, respectivamente, a tota^ lidade das células e um extracto solúvel foram 15U/mg e 24 U/mg

de proteína, (IlUlpmole de HPPAcido formado por hora). 0 excesso enantiomérico de (R)-HPPAcido foi de 95%. Es>tes resultados demons tram que o Brevibacterium R312 possui uma amidase enantiosselectjL. va capaz de hidrolisar 2-ari1-propionamidas racémicas nos ácidos de configuração S correspondentes. Verificou-se este facto por hi_ drólises de 2-feni1-propionamida racémica e de 2-(3-benzoilfeni1)-propionamida racémica nos ácidos de configuração S correspondentes, com um excesso enantiomérico superior a 93%.

1.2 Purificação

Efectuou-se a purificação à temperatura de 4°C. Des_ congelaram-se as células (Brevibacterium R312, 40 g de peso seco) e efectuou-se uma suspensão em 300 ml de Tampão A (fosfato de sódio 50 mM, pH7, ^-mercaptoetanol 5mM). Depois, efectuou-se a rotura das células por tratamento com ultra-sons e eliminaram-se os detritos das membranas por centrifugação a 20000 rpm durante 30 minutos. Adicionou-se, lentamente, com agitação, 25 ml de uma solução de sulfato de estreptomicina a 10%, a 30 ml de sobrenadante. Decorridos 45 minutos, clarificou-se a solução tal como anteriormente se descreveu e tratou-se o sobrenadante resultante com sulfato de amónio. Recolheu-se por centrifugação a fracção proteica que precipitou entre 30,8% e os 56,6% de saturação de sulfato de amónio e dissolveu-se em 35 ml de tampão A e depois dialisou-se lentamente contra o mesmo tampão. Ajustou-se a solução assim obU da até 20% da saturação de sulfato de amónio, centrifugou-se, de16pois aplicou-se a uma coluna feni1-Sefarose CL-4B (Pharmacia), equilibrada com Tampão A a 20% da saturação de sulfato de amónio. Eluiram-se as fracçoes activas com o mesmo tampão e depois concen traram-se por ultrafi1 tração até um volume de 18 ml utilizando uma célula Amicon Diaflo PM10. Depois, adicionou-se glicerol (10%) à solução concentrada e aplicou-se a solução resultante a uma coluna Ultrogel AcA 44 (IBF-Bi'atechnics, França) previamente equilibrada com Tris-HCP 50 mM, pH 7, NaCl 100 mM. Recolheram-se as frac_ ções que continham a actividade específica mais elevada (aproximadamente 32% da actividade total da carga da coluna), concentraram-se e submeteram-se a um passo de filtração suplementar no mesmo gel. Paralelamente analisaram-se por SDS-PAGE as fracçoes que continham a actividade específica mais elevada (aproximadamente 30% da carga total de proteínas na coluna) e armazenaram-se. Também se determinou a enantiosselectividade da proteína purificada.

I

Este método de purificação originou um enzima com uma pureza superior a 80%, com uma actividade específica de 815 U/mg. Neste passo, a banda principal de peso molecular aparente de 59+/-5KD que corresponde a, pelo menos, 80% do total das proteínas, é visível por analise SDS-PAGE. Além disso, a actividade da amidase eluída de uma coluna HPLC TSK 3000 corresponde a um peso molecular de 122 KD, o que indica que o enzima se encontra numa forma dimérica.

No Quadro 1 indicam-se as características das dife-17-

rentes fracções. Este quadro descreve os .diferentes passos· de puri_ ficação da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312:

- a partir de 40 g de células húmidas após precipitação com sulfato de estreptomicina

- uma unidade (U) corresponde a 1 yjmole de HPPAcido formado por hora nas condições anteriormente descritas.

QUADRO 1

1 ÍPasso de 1 'Purificação	Vol. (ml)	Quantidade de Proteína (mg)	I Actividade (U/mg)	Rendimento %	Factor de' Purificação
1/ Extracto bruto	325	1918	26,4	100	1
2/ Precipitado de sulfato de amónio	29,5	613	62,5	75	2,4
3/ Eluido de fenil-sepha rose	77	200	198	78	7,5
4/ AcA44,	6	27	457	24,4	17,3
Primeiro eluido 5/ AcA44,	3	3,9	815	6,3	31
segundo eluido

-18EXEMPLO 2

Clonagem da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312

2.1 Derivação de sequências de proteínas

As sequências peptídicas que correspondem, respectj_ vamente, à extremidade N-terminal (27 resíduos) e a um fragmento trípsico interno (21 resíduos) da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312 foram determinados utilizando o enzima purificado.

Efectuou-se esta operação submetendo 3 nmole de uma preparação de amidase a redução e carboximetilação. Depois dessal£ nizou-se o componente proteico principal e purificou-se até à homo. geneidade por HPLC de fase inversa. Determinou-se a sequência N-terminal de acordo com o método de Edman de degradação sequencial automática, utilizando um dispositivo Applied Biosystems Model 470A. Obteve-se a sequência que se apresenta na Figura 1A de acordo com este procedimento. Para se obter a sequência interna adici£ nal, efectuou-se a digestão de igual quantidade de proteína com tripsina. Depois separam-se os fragmentos reduzidos e carboximetilados por análise HPLC de fase inversa (2,1 χ 10 mm, caudal 0,2 ml/minuto), utilizando o segundo tampão de eluição; um gradiente de 0 a 50% de acetonitrilo em ácido trifluoroacético a 0,07%. Efe£ tuou-se a sequenciação do péptido que eluiu num pico bem distinto (a 40,8% de acetonitrilo) (Figura 1A).

-19tf

2.2. Construção de sondas nucleotídicas

Utilizaram-se duas estratégias.

Na primeira estratégia, construiu-se uma sonda 29-mero (59% de homologia mínima), tendo em mente a utilização de codão no operão triptofano de Brevibacterium lactofermentum (sequência de 7,7 kb contendo 6 cistrões: Matsui e outros_? Mol. Gen. Genet. 209 (1987( 299) e utilizando a sequência IDGALGSYDV do fra£ mento interno ( que apresentava uma menor degenerescência média). Sintetizou-se o cordão não codificante tendo em consideração a neu_ tralidade termodinâmica relativa do par G:T e por introdução de d_i_ versas degenerescências no sentido de maximizar a frequência teórj_ ca média dos codões considerados (88% em relação à utilização dos codões escolhidos). Estas considerações conduziram a um teor de GC na sonda de cerca de 59%. A sequência da sonda (Sq 762) indica-se na Figura 1B.

Na segunda estratégia utilizou-se o método FOR descrito por Girgès et al., Nucleic Acids Res. 16 (1988) 10371, para se obter uma sonda nucleotídica exacta a partir de um péptido que correspondia a codões altamente degenerados. No sentido de se levar a efeito esta operação, sintetizaram-se oligonucleótidos 25-me ro (ver sequências sublinhadas na Figura 2A) que correspondiam a todas as possibilidades de codificação dos primeiros ou dos últimos cinco codões da sequência peptidica N-terminal e que eram por. tadores, respectivamente, dos sítios EcoRI e Hindi 11 nas suas extremidades 5 . Utilizaram-se estes 25-meros para se iniciar

-20(prime) uma amplificação enzimática do ADN genómico de Brevibacterium R312. Após 30 ciclos de amplificação purificou-se o fragmen_ to candidato sobre um gel, depois inseriu-se entre ossítios H i ndlIJ e EcoRI do bacteriofago M13mp19. De facto,uti1izaram-se duas temperaturas de hibridação diferentes do iniciador (45°C e 48°C), o que originou dois fragmentos candidatos. Deste modo, após a clonagem dos fragmentos, efectuou-se a sequenciação de diversos clones para cada uma das temperaturas e compararam-se. Os resultados apre sentam-se na Figura 2A. Pode observar-se que â parte as degenerescências introduzidas pelos iniciadores. 0 fragmento de ADN (único entre os iniciadores) que codifica para a extremidade N-terminal da amidase se encontra bem amplificado. Por esse motivo, utilizou-se um oligonucleótido de síntese de 40-mero (Sq 918) que corresponde a este fragmento interno, para o resto da clonagem como uma sonda exacta para a extremidade N-terminal da amidase. Na Figura 2B indica-se a sequência nucleotídica da sonda específica Sq 918.

Marcaram-se radioactivamente as duas sondas Sq 762 ι 32 e Sq 918 assim obtidas por fosforilação da extremidade 5 com P.

2.3. Clonagem do gene que codifica a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312.

A estratégia consistiu em primeiro lugar na verificação da especificidade das sondas e na determinação da natureza do fragmento de ADN genómico a ser cionado por mancha de Southern.

Resumidamente, efectuou-se a digestão, de um modo alternativo, do ADN genómico de Brevibacterium R312 por diversos enzimas de restrj_ ção que correspondiam aos sítios possíveis de clonagem, e em partj_ cular a sítios presentes na região de clonagem múltipla de plasmídeos pUC. Realça-se a utilização de Psti. Após eletroforese através de gel de agarose e de transferência para uma membrana de nylon, hibridaram-se os diversos produtos de digestão com sondas Sq762 e Sq918. Os resultados apresentados na Figura 3 demonstram que as duas sondas apresentavam uma especificidade suficiente nas condições de hibridação (hibridação no máximo de um fragmento por cada digestão). Além disso, uma vez que as duas sondas proporcionaram quase as mesmas caracteristicas de hibridação, pode admitir-se que os sinais de hibridação do gene pesquisado são bastante específicas e que o péptido interno obtido após digestão trípsica está muj_ to próximo da extremidade N-terminal. Em particular, os vestígios (footprints) da hibridação revelaram a existência de um único fragmento PstI de 5,4 Kb que se hibridou fortemente com as duas sondas. Decidiu-se por isso efectuar a clonagem deste fragmento.

Para se efectuar a clonagem, purificaram-se sobre agarose, electro-eluiram-se e ligaram-se a pUC19 cortado com PstI todos os fragmentos de tamanhos aproximados compreendidos entre

4,6 e 5,5 Kb e entre 3,5 e 6,4 Kb resultantes da digestão por Psti do ADN genómico total de Brevibacterium R312. Após transformação da estirpe DH5 de E. coli, obtiveram-se 500 colónias brancas o_b tidas sobre meios X-gal que teoricamente correspondiam aos micror-22-

ganismos recombinantes. Isolou-se individualmente cada uma das colónias, transferiu-se para uma membrana de nylon, depois analisa32 ram-se por hibridação com uma sonda Sq 918 marcada com P. Dois clones hibridaram-se muito fortemente: isolaram-se esses clones e utilizaram-se nos passos seguintes. Analisaram-se os dois plasmídeos recombinantes pXL1650 e ρΧ11651, isolados a partir destes dois clones de acordo com diversos métodos, incluindo a elaboração de mapas de restrição, a sequenciação parcial utilizando as sondas como iniciadores da sequenciação e mancha de Southern. A Figura 4 mostra que os dois plasmídeos contêm a mesma inserção PstI de 5,4 Kb nos dois sentidos. A Figura 5 indica o mapa de restrição deste fragmento. Estes dois plasmídeos contêm, no entanto, as sequências que codificam os pêptidos caracterizados, o fragmento tríptico adjacente ao N-terminal (Figura 8). Além disso, estes resultados in. dicam que o gene que codifica a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312 se encontra localizado no fragmento BamHI-PstI de

2,3 kb, orientado no sentido BamHI para PstI. Dada a posição da extremidade 5¹ da sequência de código e sabendo que o enzima é codificado por, no máximo, 2Kb (monómero de 57 a 53 KD, de acordo com as nossas estimativas), é evidente que o gene completo está contido no fragmento BamHI-Pstl, pelo que se procedeu à sequenciação.

EXEMPLO 3

Sequenciação do fragmento BamHI-Pstl que contém o gene que codifica a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312

Na Figura 6 indica-se a estratégia de sequênciação para o fragmento BamHI-Psti.Obtiveram-se todas as sequências de acordo com o método de terminação de cadeia C. conjunto (Kit)

M13 de cordão único portadoras de subfragmentos ou directamente sc> bre o plasmídeo pXL1650. Com esta finalidade, sintetizaram-se também diversos iniciadores específicos. 0 teor médio de GC da sequê£ cia obtida foi de 61,5%. A Figura 7 apresenta uma análise das sequências de transcrição abertas; observou-se que a sequência de transcrição aberta que corresponde â amidase codifica para 521 amj_ noácidos, uma proteína de peso molecular calculado de 54671. 0 teor de GC desta sequência de transcrição aberta foi, respectivamente, 65,8%, 52,5% e 70% para a primeira, segunda e terceira posj^ ções do codão que constituem uma, distribuição típica nas sequências que codificam os microrganismos ricos em GC. A Figura 8 indica a sequência completa do fragmento BamHI-PstI.

EXEMPLO 4

Expressão na E. coli do gene que codifica a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312.

4.1 Construção de plasmfdeos

Construiram-se diversos plasmídeos nos quais o gene estrutural da amidase, que continha um sítio de ligação ribossómico (RBS) homólogo ou RBS proveniente do gene cll do bacteriófago lambda, se encontrava colocado sob o controlo do seu proprio promo tor, o promotor do operão do triptofano ou o promotor direito sensível à temperatura do bacteriófago lambda. Obteve-se o plasmídeo pXL1650 (Figura 4) por inserção de um fragmento de 5,4 Kb resultar^ te da digestão com PstI do ADN genómico total de Brevibacterium R312, num.único sítio PstI do plasmídeo pUC19. Por este motivo es_ te plasmídeo transporta o promotor do operão da lactose, Plac, seguido de um sítio de ligação ribossómica e do gene estrutural que codifica a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312, assim como o marcador que codifica a resistência à ampicilina.

plasmídeo pXL1724 (Figura 9) contém o fragmento BamHI-PstI de 2,3 Kb excisado do fragmento PstI de 5,4 Kb sob o controlo do promotor do operão do triptofano de E.col i.. Nesta cons_ trução, o gene de amidase de Brevibacterium R312 encontra-se, por isso, procedido por 58 pares de bases a montante do codão ATG que contém o seu próprio sítio de ligação ribossómica (Figura 8).

Efectuaram-se duas outras construções nas quais o gene estrutural que codifica a amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312 se encontra colocado sob o controlo de promoto res heterólogos, com sítios de ligação ribossómica heterólogos. Es_ tes plasmídeos (pXL1751 e pXL1752) obtiveram-se conforme se segue:

Efectuou-se a mutagénese do plasmídeo pXL1724 por PCR no sentido de se substituir o codão ATG situado a montante do gene estrutural da amidase por. um sítio N de I (CATATG). Efectuou-se a amplificação utilizando um iniciador que correspondia ao sitio Ndel que se hibridava com o codão de iniciação ATG e um pre cursor .que correspondia ao sítio XhoI situado a jusante do codão ATG. De.pois₅ excisaram-se os fragmentos amplificados por digestão com Ndel e XhoI.

- Utilização do promotor Ptrp:

Num plasmídeo pXL1724 digerido por EcoRI e XhoI ijn seriu-se um fragmento EcoRI-Ndel portador do promotor Ptrp e do s_£ tio de ligação ribossómica do gene cll do bacteriófago lambda no qual se tinha eliminado a sequência de terminação tR^ e a região da extremidade 5 do' gene estrutural da amidase ( fragmento Ndei-Xhol). isto originou o plasmídeo pXL1751 ( Figura 10).

- Utilização do promotor P clts:

K

Empregou-se a mesma estratégia, mas desta vez utiH zando o fragmento EcoRI-Ndel do plasmídeo pXL1029 que continha o promotor P^clts e o sítio de ligação ribossómica do gene cll do bacteriófago lambda eliminado da sequência de terminação tRp Isto originou o plasmídeo pXL1752 ( Figura 11 ).

-264.2 Expressão do gene da amidase de Brevibacterium R312 na

E. coli B e na E. coli K12 E103S

Uti1izaram-se os plasmídeos pXL1751 e pXL1752 para transformar estirpes E.coli B e E.coli K12 E103S, respectivamente de acordo com o método de cloreto de cálcio. Efectuou-se a selecção dos microrganismos recombinantes num meio com ampicilina.

Mediu-se a expressão da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium R312 após tratamento das células com ultra-sons por SDS-PAGE das fracções brutas ou após centrifugação do agregado e do sobrenadante. Os resultados na Figura 12 indicam um elevado grau de expressão de amidase representando até 20% da proteína total .

EXEMPLO 5

Utilização da amidase enantiosselectiva de Brevibacterium

R312 para a síntese enantiosselectiva dos ácidos 2-aril-propiónicos

Utilizaram-se as seguintes estirpes:

E. coli (pXL1751) - a sequência que codifica a arni_ dase encontra-se colocada sob o controlo do promotor do operão do triptofano.

E. coli (pXL1752) - a amidase é produzida fazendo subir a temperatura de 30°C para 42°C no fim da fase exponencial

-2/-

(promotor P_D do bacteriófago lambda sob o controlo de CIts, um reK pressor sensível à temperatura).

Utilizaram-se duas estirpes de controlo:

E.col i (pXL906 ) - equivalente a E.coli (pXL1751) com o gene da amidase substituído pelo gene ILI^.

E. coli (pXL1029) - equivalente a E.coli (pXL1752) com o gene da amidase substituido pelo gene IL1J}.

Utilizou-se o seguinte procedimento para se ensaiar a actividade destes microrganismos:

Adicionou-se uma suspensão celular desenvolvida sob condições de indução adequadas a uma solução que continha:

- hidroxi-4-fenoxi-2-propionamida (HPPAm) ou

- fenil-2-propionamida (PPAm) ou

- a amida de cetoprofeno (KAm), por exemplo.

Depois diluiu-se a mistura reaccional num tampão que continha acetonitrilo; ácido clorídrico 1N (90:10) (v/v) e elj_ minaram-se as células por centrifugação. Efectuou-se a resolução da mistura reaccional por HPLC e calculou-se a actividade da amida_ se. Os resultados indicados no Quadro 2 demonstram a eficácia des-28-

te sistema.

Quadro 2 indica a actividade específica da amidase de Brevibacterium R312, tal como se produziu na E.coli em cond_i_ ções indutoras, em função dos substratos racémicos HPPAm, PPAm e KAm, assim como o excesso enantiomérico dos ácidos quirálicos produzidos. Nestes ensaios, as estirpes de E.coli portadoras dos pla_s mídeos pXL1751 (amidase) ou pXL906 (controlo) desenvolveram-se a 37°C.

QUADRO 2

Estirpes de E.coli em condições indutoras	Actividade Específica ^mol/h/g proteína	Excesso Enantiomérico %
HPPAM :	PPAm :	KAm	HPPAR+	PPAS+	Keto S+
pXL1751	1300	50	4	93	96	95
pXL1752	1300	50	5	94	97	95
pXL906	0	nd	nd	nd	nd	nd
pXL1029	14	0	0	nd	nd	nd

Quadro 3 indica a .actividade específica da amidase de Brevibacterium R312 ( plasmídeo de expressão pXL1751 ), tal c£ mo foi produzida na E.coli desenvolvida a 28°C sob condições de

indução ou de repressão, em função dos substratos racémicos KAm, assim como o excesso enantiomérico do ácido quirálico produzido.

QUADRO 3

Estirpe Bacteriana	Plasmídeo	Repressor (D	Actividade específica yjmol/h/g proteína	ee (%) 1
E. coli	PXL1751	-	55	96
11	11	Trp	13	nd

nd = não determinado ee : excesso enantiomérico (%)

Nota (1) Trp : L-triptofano

Deste modo, as estirpes de E.coli que são portadoras do gene da amidase de Brevibacterium R312 (genótipo Amd⁺) po dem hidrolizar de um modo eficiente as seguintes três^amidas (fenótipo AMD⁺):

- 2-(4-hidroxi-fenoxi)-propionamida (HPPAm)

- 2-feni1-propionamida (PPAm)

- amida de cetoprofeno (KAm).

excesso enantiómerico obtido foi sempre superior a 93%.

EXEMPLO 6

Purificação da amidase enantiosselectiva de Rhodococcus

I. Ensaio da actividade enzimática

Incubou-se a fracção activa a 30°C durante 30 minjJ tos em 500 /il de tampão (Tris HC1 0,1 M, pH 7,5, DTT 5 mM, 2-fenil -propionamida 18 mM). Após incubação, adicionou-se à mistura reaccional 2 ml de uma mistura de acetonitrilo/HCl 1 N (90/10) e depois 2 ml de uma mistura de HgPO^ 50 mM/CH₃CN (75/25). Após centrj_ fugação a 5000 rpm durante 10 minutos, submeteu-se uma alíquota de sobrenadante a análise de HPLC para se quantificar os produtos da reacção.

- Coluna: Nucleosil 5-C18 25 cm

- Eluente: H₃P0₄ 50 mM/CH₃CN (75/25)

- Carga: 10 jul

- Caudal: 1 ml/minuto

Definiu-se uma unidade de actividade como a quantidade de enzima necessária para a hidrólise de 1 ^imole de 2-fenil-propionamida por hora.

II. Protocolo de purificação

6.1 Preparação do extracto enzimático

Efectuou-se uma suspensão de 7 g de células em 15 ml de Tris HCl 0,1 M, pH 7,5, DTT 5 mM, e tratou-se com ultra-sons durante 15 minutos a 4°C. Recolheu-se o extracto enzimático bruto por centrifugação a 50000 rpm durante 1 hora.

6.2 Primeira cromatografia de permuta iónica

A 20 ml do extracto bruto adicionou-se 20 ml de tam pão A ( Tris-HCP 25 mM, pH 7,5, DTT 5mM). Injectou-se a amostra n£ ma coluna Mono Q HR 10/10 (Pharmacia) equilibrada em tampão A, a um caudal de 3 ml/minuto. Após lavagem da coluna eluiram-se as pr£ teínas durante 1 hora com um gradiente linear de KCP 0,1 M a 1M, a um caudal de 3 ml/minuto. 0 tamanho da fracção foi de 6 ml. A amidase eluiu em 18 ml aproximadamente 0,3 M de KC1.

6.3 Segunda cromatografia de permuta cónica

Reuniu-se as fracçoes activas e concentrou-se até 2 ml utilizando um sistema de ultra-fi1 tração Centripreo (Amicon). Após diluição com 6 ml de tampão A. Injectaram-se 4 ml de amostra a 1 ml/minuto numa coluna Mono Q HR 5/5 equilibrada com tampão A. Eluíu-se as proteínas com um gradiente linear de KC1 0 a 0,5 M em tampão A. Reuniu-se as fracçoes activas ajustou-se para 15% de

glicerol (v/v) e depois concentrou-se até 1 ml, tal como anterior mente se referiu.

6.4 Cromatografia hidrofóbica

Adicionou-se 1 ml de tampão B (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, DTT 0,5 mM, 1,7 M (NH₄)₂ SO^ a amostra que depois se injectou (mediante duas injecçoes) numa coluna Phenyl-Superose HR 5/5 (Pha£ macia) a um caudal de 0,25 ml/minuto. Eluiu-se as proteínas a 0,5 ml/minuto com um gradiente linear decrescente de (NH^ S0^ (1,7 M a OM ) em 25 ml. 0 tamanho da fracção foi de 0,5 ml. Ajustaram-se as fracções activas para 15% de glicerol e depois diluiu-se até 1 ml com Tampão A

6.5 Cromatografia de hidroxiapatite

Injectou-se a amostra a 0,5 ml/minuto numa coluna Bio-Gel HPHT (Bio-Rad) equilibrada com Tampão C (Tris-HCl 85 mM, ph 7,5, DTT 0,5 mM, CaCl^ 10 jim, 15% de glicerol). Eluiu-se a amidase a um caudal de 0,5 ml/minuto com um gradiente linear de 0 a 100% de tampão fosfato de potássio 0,35 M, pH 7,5, DTT 0,5 mM. CaCl₂ 10 ^iM, 15% de glicerol em Tampão C, durante 20 minutos.

Estes passos permitem a purificação até à homogene^ dade de um enzima com uma actividade específica de 988 U/mg de pr£ teína.

enzima assim obtido encontra-se presente sob a forma de um dímero de subunidades idênticas de peso molecular ap_a rente de 53+/-2KD.

EXEMPLO 7

Clonagem do gene que codifica esta amidase

Após um passo de purificação suplementar sobre TSK-G3000 SW, submeteu-se o enzima a sequenciação. A extremidade N-terminal foi inacessível em procedimentos químicos do tipo Edman, pelo que se efectuou a hidrólise total da tripsina, tendo três fracções de HPLC do hidrolisado - as fracções 123, 124 e 162 - pr£ porcionando pêptidos que permitiram a obtenção de uma sequência não ambigua. A partir da sequência obtida a partir da fracção 123 sintetizou-se uma sonda 32-mero nucleotídica, que correspondia a uma mistura de 8 oligonucleótidos e que continha 7 inosinas em posições de degenerar pelo menos três vezes:

Sonda A ( do peptido 123)

ATVDVPVPDYA

GUI ACIGTIGATGTICCIGTICCIGATTATGC c c c

A eficácia desta sonda, marcada na extremidade 5 com P foi ensaiada por transferência de Southern para ADN genómi

-34co de Rhodococcus previamente digerido por um dos seguintes enzimas de restrição; Sst I, Sph I, Smal, PstI, ΚρηI, EcoRI, Sal I e BamHI. As condições experimentais foram as seguintes; tampão de hibridação, 5χ SSC,5x Denhardt, 0,1% de SDS, NaPO^ 50 mM, a pH 6,5, 250 /ig/ml de ADN de esperma de salmão; as temperaturas de h_i_ bridação foram 50°C ou 55°C (dois ensaios) as condições de lavagem foram: 1 hora em 6χ SSC à temperatura ambiente e 5 minutos em Z*

SSC, 0,1% de SDS a 50°C.

Sob estas condições a sonda A proporcionou sinais fortes não ambíguos; em particular com as digestões por BamHI,Kpnl SphI, SstI, Smal, SalI e PstI descobriu-se uma única banda genómica que se hibridava fortemente com a sonda A. Para a digestão com PstI o tamanho do sinal de hibridação para a sonda A correspondia ao fragmento genómico de aproximadamente 3,4 Kb.

Purificaram-se então os fragmentos de digestão por PstI de 3 a 4 Kb de ADN genómico por electroforese preparatória através de agarose, seguida de electroeluição e depois ligou-se ao plasmídeo pUC19 que tinha sido digerido com PstI, Após transformação de estirpe DH5de E.coli recolheram-se individualmente 600 clones brancos sobre LB Amp-X-gal e sondaram-se com a sonda A por hibridação em colónia, em condições restritas (stringency) semelhantes às da análise de Southern. Depois analisaram-se os 9 clones com sinais de hibridação particularmente fortes por restrição do ADN plasmídico. Entre 6 desses clones que possuíam claramente inserido o mesmo fragmento de 3,2 kb nos dois sentidos, analisaram-35-Vr

-se dois clones que representavam cada um dos sentidos (pXL1835 e pXL1836) mais pormenor izadamente· ( mapa mais pormenorizado e analise de Southern ) confirmando, deste modo, que se tinha obtido o fra£ mento desejado.

EXEMPLO 8

Sequência do fragmento PstI de 3,2 kb

Determinou-se a sequência nucleotídica completa do fragmento PstI de 3,2 kb para os dois cordões. 0 teor de GC para este fragmento era de 62,4%, semelhante ao teor de GC de R312 (aproximadamente 62%). A análise da sequência revelou uma sequência de transcrição aberta de 1386 nucleótidos (da posição 210 até à posição 1595) que codificava para um polipéptido de 462 aminoáci dos (peso molecular calculado de 48554) que continha os três péptidos previamente obtidos por sequenciação dos fragmentos trípsicos. Esta sequência de transcrição aberta encontra-se incluída no fragmento BamHI subclonado cuja sequência nucleotídica se apresen. ta na Figura 13.

As três sequências peptídicas sublinhadas correspon, dem aos fragmentos peptídicos determinados directamente nos fragmentos trípsicos do enzima purificado (péotido 123, 124 e 162). A sequência nucleótidica sublinhada corresponde à sonda (degenerada) utilizada para efectuar a clonagem do gene. A sequência peptídica em itálico corresponde aos resíduos de 137 a 193 que se encontram

-*36-

altamente conservados entre as amidases enantiosselectivas da estirpe R312 de Brevibacterium e da estirpe do gene Rhodococcus (ver adiante).

Esta sequência de transcrição aberta representa o gene estrutural da amidase enantiosselectiva.

EXEMPLO 9

Homologia entre amidases diferentes: identificação de uma sequência característica da actividade da amidase.

Uma comparação das sequências, peptídicas da amidase enantiosselecti va de R312 (Figura 8) e da amidase indicada na Figjj ra 13 indica uma forte homologia em cerca de dois terços da sequên_ cia, entre os resíduos 150 e 300 de R312 (50% de identidade estrita) atingindo a homologia 67% entre os resíduos 159 e 215.

Uma pesquisa no banco genético GENPRO para sequências homólogas revelou algumas fortes homologias entre a região 150 a 200 e as sequências da acetamidase de Aspergillus nidulans entre as indolocetamido-hidrolases (IAH) de Pseudomonas syringae e Bradyrhizobium japonicum, a proteína tms2 de Agrobacterium tumefaciens e 6-amino-hexanoato-ciclico-dimero-hidrolases (ACDH) da estirpe K172 de Flavobacterium e da estirpe NK87 de Pseudomonas .

Quadro 4 indica a homologia do péptido 137-193 da amidase anteriormente descrita com os respectivos sítios destes

Ζ

C **» outros enzimas (expressos como uma % de identidade estrita de aminoácidos) :

QUADRO 4

Amidase	% homologia
R312	65,5
Tms2 A.tumefaciens	64,3
IAH P. syringae	61,8
ACDH (F.K172 or P.NK87	61,4
IAH B. japonicum	54,4
Acetamidase (A. nidulans)	47,4

Esta região fortemente conservada é muito provavelmente responsável pela actividade destes enzimas ( sítio catalítico).

EXEMPLO 10

Expressão da amidase enantiosselectiva na E.coli

No sentido de se confirmar a identificação da fase que codifica para a amidase enantiosselectiva criou-se um sítio Ndel (CATATG) por PCR no presumível codão ATG na posição 210 (Fi-38-

gura 13) e colocou-se o fragmento entre este sítio Sal I na posição 1683 que continha unicamente a região que codifica para a amidase sob o controlo de sinais funcionais na E. coli.para iniciação de transcrição ( promotores Ptrp ou P_R) e iniciação de transferência (sítio cll de ligação ribossómica). Os vectores assim obtidos (pXL1893, Ptrp; e pXL1894, P_D-cits) eram semelhantes aos vectores pXL1752 z pXL1751 que expressavam a amidase de R312, tal como anteriormente se descreveu. Estudou-se a expressão dos plasmídeos pXL1893 e pXL1894 na E.coli B e na E. coli K12 E103S, respectivamente. Uma proteína que migrava em simultâneo com a amidase purificada produziu-se especificamente a 42°C na presença do plasmídeo PXL1894.

EXEMPLO 11

Expressão da amidase enantiosselectiva em corinebacteria

1. Construção de vectores de expressão

Estes vectores foram derivados de vectores de repl£ cação para corinebacteria. Incluem

- um replicão?.: de E. coli

- um replicão de corinebacteria

- um marcador seleccionável

- uma sequência de Amd.

Vector pSV73 (Figura 14): Este plasmídeo é derivado do plasmídeo pSR1 de C. glutamicum ( Yoshínama e outros. J. Bacte-39-

riol., 162,( 1985) 591 ) por inserção do plasmídeo pUC8 que continha um replicão de E. coli e o gene de resistência à canamicina trans_ portado no transposão Tn903.

Utilizou-se este plasmídeo para se construírem diferentes vectores de expressão para as sequências de Amd indicadas na Figura 13, especialmente.

- Vectores pYG811A e B (Figura 15). Estes vectores de expres_ são obtiveram-se por clonagem da sequência de Amd contida no fragmento Sal I representado na Figura 13 no sítio Sal I de pSV73, em ambos os sentidos.

- Vectores pYG817A e B (Figura 16}. Estes vectores de expres_ são obtiveram-se por clonagem da sequência de Amd contida no fragmento BamHI representado na Figura 13 no sítio Bgl 11 de pSV73, em ambos os sentidos.

- vector pyG822 (Figura 17). Este vector de expressão é deri_ vado de pSV73 mediante inserção entre os sítios Sall e BglII de uma sequência de expressão que continha a sequência de Amd indicada na Figura 13 sob controlo do promotor Ptrp do operão triptofano de E. coli.

- Podem utilizar-se outros plasmídeos de corynebacterium crípticos para a construção de vectores de expressão para a sequên_ cia de Amd que são funcionais em corinebacteria. Por exemplo, o plasmídeo pX18, isolado a partir de Β. 1actofermentum [ (Yeh e

-40outros, Gene, 47 (1986) 301-306 ] permitiu a construção dos vect£ res móveis (shuttlé') pYG820A e pYG820B que podem replicar em Brevibacterium R 312 e que por isso podem utilizar como receptores em ensaios de clonagem e de expressão em diversos corinebacteria.

2. Transformação de corinebacteria

Podem utilizar-se todas as técnicas de transformação conhecidas e especialmente a técnica de regeneração do protoplasto descrita por Yoshima e outros, anteriormente referida. No entanto, os inventores demonstraram que a técnica de electroporação é muito eficiente, aumentando a frequência de transformação até cerca de 1000 vezes.

Utilizou-se a análise SDS-PAGE das células tratadas com ultra-sons para se investigar a expressão intracelular do enzj^ ma e dos hospedeiros recombinantes.

EXEMPLO 12

Catálise enzimâtica

Este exemplo ilustra a utilização de proteínas de tipo Amd ou de microrganismos recombinantes que exprimem estas proteínas, para a sintese enantiosselectiva de ácidos orgânicos opticamente activos por hidrólise das amidas racémicas correspondentes.

''WIJ·'·

1. Preparação das células

Efectuou-se uma cultura de estirpes diferentes em balões de Erienmeyer de 2 litros, em 500 ml de meio, a 28°C, em condições de cultura adequadas, com uma agitação de 150 rotações/ /minuto . Após conclusão da cultura, recolheram-se as células, l£ varam-se numa solução de NaCl ( 9g/1) e armazenaram-se a -18°C.

2. 2-feni1-propionamida como substrato protocolo é o seguinte:

Adicionou-se 2-feni1-propionamida e a suspensão ce. lular num balão equipado com um agitador e ajustou-se o volume pa. ra 5 ml com tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,0. Colocou-se o balão num prato de cristalização mantido à temperatura de 25°C, com agitação durante 1 hora. Depois, diluiu-se essa mistura reaccional numa solução de acetonitrilo/HCl (9/1), (v/v) e eliminaram -se as bactérias e os detritos celulares por centrifugação. Deter minou-se a composição em ácido e em amida, por análise de HPLC.

Os resultados obtidos em Brevibacterium R312 e Bre vibacterium 1actofermentum (ATCC 21086) foram os seguintes:

QUADRO 5

Estirpe	Plasmídeo	Actividade Específica jumole/h/mg proteína
Brevibacterium R312	pSV73	0,1
II II	PYG811A	4,3
II II	pYG811B	5,4
B. 1actofermentum	pSV73	0
II II	pYG822	2,8

3. Amida racémica de cetoprofeno como substrato

Como se indica no Quadro 6, verificou-se que a corinebacteria recombinante que exprime a amidase a partir de Rhodococcus proporcionou actividades significativamente mais ele vadas do que células de controlo transformadas com pSV73.

QUADRO 6

Estirpe	Bacteriana	Plasmideo	Indutor (D	Actividade Específica jumol/h/mg proteína	ee m
Brevibact.	R312	pSV73	IBN	0,01	nd
II	II	pYG811A	IBN	0,04	96
II	11	PYG811B	INB	0,04	94
B. lactofermentum	pSV73	IBN + IBNAm	0	nd
H	II	pYG822	IBN + IBNAm	0,02	nd

nd = não determinado ee : excesso enantiomérico (S+cetoprofeno)

Nota (1) = IBN: isobutironitrilo; IBNAm: isobutiramida

Claims

NOVAS REIVINDICAÇÕES

1.- Processo para a preparação de uma amidase enan tiosselectiva, caracterizado pelo facto de se cultivar um microrganismo transformado, que contém pelo menos uma cassete de expressão que suporta uma sequência de ADN que codifica para polipeptidos com actividade de amidase enantiosselectiva, sob o controlo de sequências de ADN que asseguram a expressão desta sequência no organismo hospedeiro, sob condições que permitem a expressão da sequência que codifica para a amidase, e de se separar depois o microrganismo cultivado e se extrair a amidase.

Processo de acordo com a reivindicação 1, carac

-45terizado por a cultura ser tratada com ultra-sons,fraccionada com sulfato de amónio, cromatografada em fenil-Sefarose e submetida a uma filtração dupla com gel.

3.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se escolher a sequência de ADN que co difica para um polipeptido com actividade de amidase enantiosselectiva entre:

- a sequência que codifica a amidase enantiosselecti va de Brevibacterium R312 representada a seguir:

46ÍÍCZZZZ3.ZZZ2.Z2.ZZZZZZZZZZ3.CZZZ3.

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- um análogo dessas sequências que codificam a mesma proteína, mas resultante da degenerescência do código genético;

ADN que hibridiza com uma dessas sequências óu com um seu fragmento e que codifica um polipeptido com actividade de amidase enantiosselectiva.

4.- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN que codifica para um polipeptido incorporar pelo menos a sequência que codifica os aminoácidos 137 a 193 indicados na reivindicação 3, ou os ami-50noácidos 159 a 215 indicados na reivindicação 3, ou uma sequência peptídica com pelo menos 50% de homologia em relação a essas sequências.
5. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN que codifica para um polipeptido ser uma região de codificação da sequência representada na reivindicação 3.
6. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a sequência de ADN que codifica para um polipeptido conter pelo menos a região de codificação da sequência representada na reivindicação 3.
7. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo facto de o polipeptido apresentar pelo menos uma sequência escolhida entre a sequência representada na reivindicação 3.
8.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 7, caracterizado pelo facto de o polipeptido possuir uma actividade de amidase enantiosselectiva e por apresentar pelo menos uma sequência seleccionada entre:

- as sequências correspondentes aos aminoácidos 137 a 193 da reivindicação 3;

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- as sequências correspondentes aos aminoácidos 159 a 215 da reivindicação 3;

- as sequências que partilham pelo menos 50% da homologia com as sequências anteriores.
9.- Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de o polipéptido não ser de origem natural.
10. - Processo de acordo com as reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo facto de as sequências de ADN que garantem a expressão de uma sequência conterem uma região de iniciação de transcrição e de tradução
11. - Processo de acordo com a reivindicarão 10, caracterizado pelo facto de a região de iniciação de transcrição e tradução conter uma sequência promotora e um sítio de ligação ribosómica.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de a sequência promotora e o sítio de li gação ribosómica poderem ser homólogos ou heterõlogos perante o péptido produzido.
13.- Processo de acordo com a reivindicação 12, ca\52

--,**· racterizado pelo facto de as sequências promotoras poderem ser seleccionadas entre promotores fortes de fagos de corynebacterium, o promotor Ptrp do operão triptofano, o promo tor Plac do operão lac, o promotor P_L esquerdo do fago lambda, ou o promotor P_R direito do fago lambda.
14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o promotor ser seleccionado entre o promotor Ptrp do operão triptofano e o promotor P^clts direito do fago lambda.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o sítio de ligação ribosómica derivar do gene cll do fago lambda, ou de genes homólogos de corinebactérias.
16. - Processo de acordo com uma qualquer das reivin dicações 1 a 15, caracterizado pelo facto de a cassete de expressão ser suportada por um plasmídeo que suporta também um meio de selecção.
17. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o meio de selecção ser um marcador se leccionável que confere resistência a um antibiótico.
18. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de o plasmídeo conter o promotor Ptrp do operão triptofano, o sítio de ligação do ribosoma do gene cll do fago lambda suprimido da sequência tRl da terminação de transcrição, o ADN que codifica o gene da amidase enantiosselec tiva de Brevibacterium R312, e um gene que confere resistência â ampicilina.
19. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o plasmídeo conter o promotor sensível à temperatura adequado do fago lambda PRcIts, o sítio de ligação do ribosoma do gene cll do fago lambda suprimido da sequência tRl de terminação de transcrição,-o ADN que codifica o gene da amida se enantiosselectivo de Brevibacterium R312 e um gene que confe re resistência â ampicilina.

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20.- Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser escolhido entre as estirpes E. coli, Brevibacterium,

Corynebacterium, Rhodococcus.
21.- Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o microrganismo ser da estirpe E. coli B ou E. coli D12 E103S.
22.- Processo para a preparação de um estereoisómero de um ãcido orgânico a partir da amida racémica correspondente, caracterizado pelo facto de a amida racémica ser colocada na pre sença de um microrganismo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 21 ou na presença de um polipeptido produzido pelo referido organismo, e por, apõs a reacção, se recuperar o estereoisómero.
23.- Processo de acordo com a reivindicação 22, ca racterizado por a amida ser 2-aril-propionamida racémica e o ácido ser um ãcido (S).
24. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a 2-aril-propionamida racémica ser a amida de cetoprofeno e o ácido ser S(+) cetoprofeno).
25. - Processo de acordo com.a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de a amida ser uma 2-ariloxi-propionamida e o ácido ser o estereoisómero R correspondente,

Lisboa, 23 de Maio de 1991 O Ageite Oficial da Propriedade Industrial