JPH04218380A - チロシンフェノ−ル・リア−ゼをコ−ドする遺伝子とその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、チロシンフェノ−ル・
リア−ゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｅｎｏｌ−ｌｙａｓ
ｅ）［ＥＣ４．１．９９．２］　の生産に有用なチロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子、その遺伝子を含む組換
え体プラスミド、その組換え体プラスミドにより形質転
換された大腸菌およびその大腸菌を用いるチロシンフェ
ノ−ル・リア−ゼの製造法に関するものである。

【０００２】チロシンフェノ−ル・リア−ゼは、いわゆ
る多機能酵素であり、Ｌ−チロシンやＬ−ド−パの合成
など種々の反応を触媒し（Ｙａｍａｄａ，Ｈ．　ａｎｄ
　Ｋｕｍａｇａｉ，Ｈ．（１９７５）　Ａｄｖ．Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２４
９−２８８）、工業的にも重要な酵素である。

【０００３】

【従来の技術】種々のバクテリアがチロシンフェノ−ル
・リア−ゼ活性を有することが知られている。特に、エ
ンテロバクテリアセェ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｃｅａｅ）　に属するエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）属、シトロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ
）属、アエロバクタ−（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、プ
ロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ）属などのバクテリアが高いチロシンフェノ−ル
・リア−ゼ活性を有することが知られている（Ｙａｍａ
ｄａ，Ｈ．　ａｎｄ　Ｋｕｍａｇａｉ，Ｈ．（１９７５
）　Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ
．１９，ｐｐ．２４９−２８８）。

【０００４】また、エルビニア・ヘルビコ−ラ（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＡＴＣＣ−２１４３４
株およびエシェリヒア・フロインディ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）ＡＪ−２６０８株のチロ
シンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片が単
離され、その遺伝子により形質転換された大腸菌がチロ
シンフェノ−ル・リア−ゼ活性を有することが知られて
いる（特開昭６２−２５９５８９および特開昭６３−２
２２６８２）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの微生
物のチロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性は、工業的に用
いるには十分でなく、更に、培養に際しは、誘導物質と
して培地にチロシン（Ｙａｍａｄａ，Ｈ．　ａｎｄ　Ｋ
ｕｍａｇａｉ，Ｈ．（１９７５）　Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１９，ｐｐ．２４９−
２８８、特開昭６２−２５９５８９）、イソプロピル−
β−チオガラクトシド（特開昭６３−２２２６８２）を
添加する必要があった。培地へのチロシン添加は、ド−
パなどの生産においては、製品にチロシンが混入し、イ
ソプロピル−β−チオガラクトシド添加は、イソプロピ
ル−β−チオガラクトシドが、非常に高価であり、工業
的に用いるには問題があった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
微生物により、チロシンフェノ−ル・リア−ゼを生産す
る方法について鋭意研究した結果、エルビニア・ヘルビ
コ−ラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）由来の
チロシンフェノ−ル・リア−ゼを担うＤＮＡ断片を単離
し、その遺伝子の構造を明らかにすると共に、その構造
解析を基に、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ構造遺伝子
を　ｔａｃ　プロモ−タ−の下流に連結した新規な組換
え体プラスミドおよびそれにより形質転換された新規な
大腸菌を創製し、この大腸菌が、培地への誘導物質添加
なしに、著量のチロシンフェノ−ル・リア−ゼを生産す
ることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明によれば、培地へ誘導物
質を添加せずにチロシンフェノ−ル・リア−ゼを生産す
るに有用な遺伝子、その遺伝子を有する組換え体プラス
ミド、その組換え体プラスミドにより形質転換された大
腸菌およびその大腸菌を用いるチロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼの製造法が提供される。

【０００８】本発明において、チロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼの遺伝子を担うＤＮＡを採取する目的に用いられ
る微生物は、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性を有す
るものであり、例えば、エルビニア・ヘルビコ−ラ（Ｅ
ｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＭＴ−１０５０９
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３８５　）　がある。

【０００９】チロシンフェノ−ル・リア−ゼの遺伝子を
担うＤＮＡを採取する方法については、特に限定されな
いが、例えば、次のような方法を用いることが出来る。 チロシンフェノ−ル・リア−ゼ活性を有する微生物を培
養し、この菌体からフェノ−ル法（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．　
ｅｔ　ａｌ．（１９６３）　Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ，　Ｖｏｌ．７２，ｐ．６１９−６２
９　）などにより染色体ＤＮＡを抽出、精製する。この
染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、大腸菌内で増
殖可能なプラスミドベクタ−にＤＮＡリガ−ゼにより酵
素的に接続し、得られた組換えＤＮＡを用いてチロシン
フェノ−ル・リア−ゼ生産能の欠如した大腸菌を形質転
換し、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能を獲得した
菌株を選択し、この菌株よりチロシンフェノ−ル・リア
−ゼの遺伝子を担うプラスミドＤＮＡを分離できる。

【００１０】本発明において、染色体ＤＮＡの切断に用
いる制限酵素は、酵素使用量や反応時間などを調節して
、ＤＮＡの切断の程度を調節すれば、様々な種類のもの
が使用可能である。例えば、ＨｐａＩＩ、ＡｃｃＩ、Ｓ
ａｕ３ＡＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＳｍａＩなどを用いること
ができる。

【００１１】プラスミドベクタ−としては、大腸菌内で
増殖可能なものが用いられ、例えば、ＣｏｌＥ１系の　
ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＫＫ２２３−３　などが
好適に用いられる。

【００１２】プラスミドベクタ−は、染色体ＤＮＡを切
断した際に用いた制限酵素またはその制限酵素と同じ接
着末端を生じさせることの出来る制限酵素で切断したの
ち、染色体ＤＮＡ断片にＤＮＡリガ−ゼにより接続する
ことができる。

【００１３】ＤＮＡリガ−ゼとしては、Ｔ４ファ−ジ由
来のものが好適に用いられる。

【００１４】染色体ＤＮＡは、制限酵素で切断したのち
、ショ糖密度勾配遠心、アガロ−ス電気泳動などにより
特定の大きさのＤＮＡ断片だけを分画、回収してプラス
ミドベクタ−に接続してもよい。

【００１５】このようにして得られた染色体ＤＮＡ断片
とプラスミドベクタ−との組換えＤＮＡを大腸菌に導入
するには、塩化カルシウムで菌体を処理する方法（Ｍａ
ｎｄｅｌ，Ｏ．　ｅｔ　ａｌ．（１９７０）　Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５３，ｐ．１５９−１６２）
などを用いることができる。

【００１６】チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能の欠
如した大腸菌としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ−
１０６１、ＪＭ−８３　などを用いることができる。

【００１７】チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能を獲
得した形質転換株の選択には、例えば、次のような方法
を用いることができる。チロシンを添加したＬ培地の寒
天平板上に形質転換株のコロニ−を形成させる。次いで
、この寒天平板に４−アミノアンチピリンを噴霧し、コ
ロニ−の周囲が赤色になる形質転換株を選べば良い。

【００１８】組換え体プラスミドを有する大腸菌から組
換え体プラスミドを単離するには、アルカリ抽出法（Ｂ
ｒｉｎｂｏｉｍ，Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．（１９７９）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．７，ｐ
１５１３−１５２３）などを用いることが出来る。

【００１９】単離された組換え体プラスミドは、塩化カ
ルシウムで菌体を処理する方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｏ．　
ｅｔ　ａｌ．（１９７０）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
Ｖｏｌ．５３，ｐ．１５９−１６２）などにより、再び
大腸菌に導入することができる。

【００２０】以上のようにして得られたエルビニア・ヘ
ルビコ−ラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）　
由来のチロシンフェノ−ル・リア−ゼの遺伝子を担うＤ
ＮＡをプラスミドベクタ−に連結した組換え体プラスミ
ドの例として、ｐＥＨ２　がある。

【００２１】ｐＥＨ２　上のチロシンフェノ−ル・リア
−ゼ遺伝子の発現効率を高めるには、ｐＥＨ２　からチ
ロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子部分を切り出し、そ
れを強力なプロモ−タ−を有するベクタ−のプロモ−タ
−の下流に接続することが有効である。プロモ−タ−の
例としては、ｔｒｐ、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃ、λＰＬ　
などがある。更に、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝
子の下流にタ−ミネ−タ−を接続するのが有効なことも
ある。このような組換え体プラスミドの例として、ｐＥ
Ｈ２１　及び　ｐＣＥ２６　がある。

【００２２】ｐＥＨ２１　及び　ｐＣＥ２６　を保持す
る大腸菌として次の株が微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

【００２３】エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５１６（ＭＣ１０６１／
ｐＥＨ２１）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３８６　）、エッシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
ＭＴ−１０５１９（ＭＣ１０６１／ｐＣＥ２６）（ＦＥ
ＲＭＢＰ−３２８７　）。

【００２４】本発明において、チロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼを製造するには、エルビニア・ヘルビコ−ラ（Ｅ
ｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）　由来のチロシン
フェノ−ル・リア−ゼの遺伝子を担うＤＮＡをプラスミ
ドベクタ−に連結した組換え体プラスミドで形質転換さ
れた大腸菌を培養し、培養物中にチロシンフェノ−ル・
リア−ゼを生成させればよい。

【００２５】大腸菌の培養は、常法により行うことがで
きる。すなわち、培地として、炭素源、窒素源、無機イ
オン更に必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどを含むも
のを用い、好気的に培養すればよい。

【００２６】このようにして得られた培養物は、そのま
まチロシンフェノ−ル・リア−ゼの酵素源として使用で
きるが、粗酵素抽出液、精製酵素、分離生菌体、分離菌
体の処理物なども酵素源として使用できる。　　チロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼの精製法としては、通常の酵素
精製法を用いることが出来る。

【００２７】

【実施例】以下に実施例で本発明を詳細に説明する。 実施例１ （ａ）エルビニア・ヘルビコ−ラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈ
ｅｒｂｉｃｏｌａ）　の染色体ＤＮＡの分離。

【００２８】エルビニア・ヘルビコ−ラ（Ｅｒｗｉｎｉ
ａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）ＭＴ−１０５０９（ＦＥＲＭ
　Ｐ−１１３８５）　を　１ｌのＬ培地（バクト・トリ
プトン　　１０　ｇ／ｌ、酵母エキス　５　ｇ／ｌ、塩
化ナトリウム　５　ｇ／ｌ、ｐＨ　７．２に調整）に植
菌し、３０　℃で１５　時間振とう培養した後、遠心分
離により集菌した。

【００２９】菌体を　１６０　ｍｌの　０．１５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ−５０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ　８．０）溶液に
懸濁し、１６０　ｍｇ　のリゾチ−ムを加えて　３７　
℃で　２０　分間、ゆるやかにかくはんした。ついで、
２０　％　ＳＤＳ　溶液　４　ｍｌを加え、６５　℃で
２０　分間放置した。 更に、８　ｍｇ　のプロテイナ−ゼＫ（Ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅ　Ｋ，　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ　社製）を加え、３７　℃で　１　時間放置した。

【００３０】０．１５Ｍ　ＮａＣｌ−５０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ　（ｐＨ　８．０）溶液で飽和したフェノ−ル　１６
０　ｍｌを加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分離
（１０，０００　ｒｐｍ，　１５　ｍｉｎ）し、上層を
回収する。

【００３１】この溶液に、２倍量の冷エタノ−ルを加え
、ガラス棒により繊維状の沈澱を巻取り、７０　％，　
８０　％，　９０％　のエタノ−ルに順次、数分づつ浸
漬した後、乾燥し、０．１Ｍ　ＮａＣｌ−０．１５Ｍ　
クエン酸ナトリウム（ｐＨ　７．０）溶液　４０　ｍｌ
に溶解した。

【００３２】この粗ＤＮＡ溶液に、６　ｍｇ／ｍｌのリ
ボヌクレア−ゼＡ（Ｒｉｂｏｉｎｕｌｅａｓｅ　Ａ，　
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　社製）を　
２００　μｌ加え、３７　℃で　１．５　時間放置した
。

【００３３】この溶液に、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ−５０
ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ　８．０）　溶液で飽和したフ
ェノ−ル　４０　ｍｌを加え、ゆるやかにかくはんした
後、遠心分離（１０，０００　ｒｐｍ，　１５　ｍｉｎ
）し、上層を回収した。

【００３４】２倍量の冷エタノ−ルを加え、ガラス棒に
より繊維状の沈澱を巻取り、７０　％，　８０　％，　
９０％　のエタノ−ルに順次、数分づつ浸漬した後、乾
燥し、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１
ｍＭ　ＥＤＴＡ　溶液　（以下、ＴＥ　緩衝液と記す。 ）２０　ｍｌに溶解した。

【００３５】このＤＮＡ溶液を、２　ｌの　ＴＥ　緩衝
液に対して透析し、２　ｍｇ　の染色体ＤＮＡを含む　
ＴＥ　緩衝液を　１０　ｍｌ得た。 （ｂ）染色体ＤＮＡ断片の調製。

【００３６】（ａ）で調製した染色体ＤＮＡを含む　Ｔ
Ｅ　緩衝液の内、４５０　μｌ（ＤＮＡ　９０μｇ　を
含む）に制限酵素　ＨａｅＩＩＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　社製）を　１０　Ｕｎｉｔｓ　
加え、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７
ｍＭ　ＭｇＣｌ２、６０ｍＭ　ＮａＣｌ、７ｍＭ　２−
メルカプトエタノ−ルを含む反応液　５００　μｌ中で
、３７　℃で１　時間放置して、染色体ＤＮＡを部分的
に切断した。

【００３７】この溶液に、ＴＥ　緩衝液で飽和したフェ
ノ−ル・クロロホルム（フェノ−ル：クロロホルム＝１
：１）　を等量加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心
分離（１５，０００　ｒｐｍ，　５　ｍｉｎ）し、上層
を回収した。

【００３８】回収した上層に２倍量の冷エタノ−ルを加
え、生じた沈澱を乾燥後、ＴＥ　緩衝液　１００　μｌ
に溶解した。このＤＮＡ溶液を　１０−４０　％　ショ
糖密度勾配遠心（２０　℃，　２６，０００　ｒｐｍ，
　２４　ｈｒ）にかけ、およそ　２−５　Ｋｂｐ　と　
５−１０　Ｋｂｐ　の２つの画分を回収した。それぞれ
の画分を　ＴＥ　緩衝液に対して透析した後、エタノ−
ル沈澱によりＤＮＡを回収し、　ＴＥ　緩衝液に溶解し
た。 （ｃ）染色体ＤＮＡ断片とプラスミドベクタ−の結合。 　　ｐＵＣ　１９（宝酒造製）１０　μｇ　を、制限酵
素　ＳｍａＩ（ニッポンジ−ン　社製）で完全消化後、
アルカリフォスファタ−ゼ処理した。このプラスミドベ
クタ−　０．２５　μｇ　づつと、（ｂ）　で調製した
染色体ＤＮＡ断片の各画分をそれぞれ混合し、それぞれ
、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ジチオスレイト−ル
、１ｍＭ　ＡＴＰ　、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　緩
衝液（ｐＨ　７．５）の反応液　０．４ｍｌ中で、５　
Ｕｎｉｔｓ　の　Ｔ４　ＤＮＡ　リガ−ゼ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　社製）により、１６　
℃、１６　ｈｒ　反応させた。

【００３９】大腸菌の形質転換には、この反応液をその
まま用いた。 （ｄ）チロシンフェノ−ル・リア−ゼの遺伝子のクロ−
ニング。

【００４０】（ｃ）　で調製した組換え体プラスミドを
含む反応液を用いて大腸菌の形質転換を行った。チロシ
ンフェノ−ル・リア−ゼ生産能のない大腸菌である　Ｅ
．ｃｏｌｉ　ＭＣ−１０６１　を　５ｍｌのＬ培地（バ
クト・トリプトン　　１０　ｇ／ｌ、酵母エキス　５　
ｇ／ｌ、塩化ナトリウム　５　ｇ／ｌ、ｐＨ　７．２に
調整）に植菌し、３７　℃で　３　時間振とう培養した
後、遠心分離により集菌した。

【００４１】菌体を　０．１Ｍ　ＣａＣｌ２　溶液　２
　ｍｌに懸濁し、０　℃で　３０　分間放置した後、遠
心分離し、０．１Ｍ　ＣａＣｌ２　溶液　４　ｍｌに再
び懸濁した。

【００４２】このようにして調製した菌体懸濁液を　２
　ｍｌづつ２本の試験管に分け、それぞれに、（ｃ）　
で調製した反応液を加えて、０　℃で　３　時間放置し
た後、４２　℃で　２　分間保った。

【００４３】遠心分離により集菌し、Ｌ培地を　５　ｍ
ｌづつ加えて３７　℃で　３０　分間培養した後、遠心
分離により集菌した。

【００４４】菌体をそれぞれ　１０　ｍｌの　０．８５
　％　ＮａＣｌ　に懸濁した後、遠心分離により集菌し
、それぞれ　１　ｍｌの　０．８５　％　ＮａＣｌ　に
懸濁した。

【００４５】このようにして調製した菌体懸濁液を、１
００　ｍｇ／ｌのアンピシリン、２０　ｇ／ｌのＬ−チ
ロシン、１５　ｇ／ｌの寒天を添加した　Ｌ培地に塗布
し、３７　℃で１日間培養した。

【００４６】次いで、コロニ−が形成された寒天平板培
地に■１．４％　炭酸水素ナトリウム■０．８５％　４
−アミノアンチピリン　　■５．４％　フェリシアン化
カリウム　　の各水溶液を順次噴霧し、コロニ−の周囲
が赤色に着色した株を選択した。

【００４７】およそ　２−５　Ｋｂｐ　の染色体ＤＮＡ
断片の画分を用いて調製した組換え体プラスミドで形質
転換した大腸菌を塗布した寒天平板培地から、３　株の
チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産株を得た。この内、
代表的なコロニ−から分離した大腸菌をエシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０
５１５　と名付けた。 （ｅ）大腸菌の保持する組換え体プラスミドの分離。

【００４８】エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５１５　より次のような方
法により組換え体プラスミドを分離した。

【００４９】エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５１５　を　１００　ｍｌ
のＬ培地に植菌し、３７　℃で　１５　時間振とう培養
した後、遠心分離により集菌した。

【００５０】菌体を　４　ｍｇ　のリゾチ−ムを含む　
４　ｍｌの　５０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ−２５ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ−１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ　８．０
）溶液に懸濁した。

【００５１】０．２Ｎ　ＮａＯＨ−１　％　ＳＤＳ　溶
液　８　ｍｌを加えて、かくはんした。３Ｍ　ＣＨ３Ｃ
ＯＯＮａ　（ｐＨ　５．２）　溶液を　６　ｍｌ加え、
４　℃で　５　分間時間放置したのち、遠心分離し、上
澄液を回収した。

【００５２】この溶液に、ＴＥ　緩衝液で飽和したフェ
ノ−ル・クロロホルム（フェノ−ル：クロロホルム＝１
：１）を等量加え、ゆるやかにかくはんした後、遠心分
離（１０，０００　ｒｐｍ，　５　ｍｉｎ）し、上層を
回収した。

【００５３】回収した上層に２倍量の冷エタノ−ルを加
え、生じた沈澱を乾燥後、ＴＥ　緩衝液　１　ｍｌに溶
解した。

【００５４】このＤＮＡ溶液に、１　ｍｇ／ｍｌのリボ
ヌクレア−ゼＡ（Ｒｉｂｏｉｎｕｌｅａｓｅ　Ａ，　Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　社製）を　２
０　μｌ加え、３７　℃で　２０　分間放置した。

【００５５】この溶液に、フェノ−ル・クロロホルム（
フェノ−ル：クロロホルム＝１：１）　を等量加え、ゆ
るやかにかくはんした後、遠心分離（１０，０００　ｒ
ｐｍ，　５　ｍｉｎ）し、上層を回収した。

【００５６】このＤＮＡ溶液を　Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　Ａ−
５０ｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によるカラムクロマトグ
ラフィにより精製し、エタノ−ル沈澱によりプラスミド
ＤＮＡを回収した。

【００５７】このようにしてエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５１５　か
ら約　１．２ｍｇ　づつのプラスミドＤＮＡを分離し、
それぞれ　１　ｍｌの　ＴＥ　緩衝液に溶解した。

【００５８】以下の組換え体プラスミドの解析において
は、上記ようにして得たプラスミドを使用した。 （ｆ）組換え体プラスミドの解析。

【００５９】エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５１５　から分離した組換
え体プラスミドを　ｐＥＨ２　と名付けた。この組換え
体プラスミドは約　４．８　Ｋｂｐ　の大きさであり、
制限酵素　ＳａｃＩと　ＰｓｔＩで切断すると、約　２
．１　ＫｂｐのＤＮＡ挿入断片が認められた。

【００６０】ｐＥＨ２　中の挿入ＤＮＡ断片の制限酵素
切断地図を図１に示した。 （ｇ）形質転換の再現性の確認 （ｅ）で分離した組換え体プラスミド　ｐＥＨ２　によ
りチロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能の欠如した大腸
菌である　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ−１０６１　を（ｄ）と
同様に形質転換し、１００　ｍｇ／ｌのアンピシリンと
　２０　ｇ／ｌ　のＬ−チロシンを添加したＬ培地寒天
平板に塗布した。生じたコロニ−について　（ｄ）　と
同様に　４−アミノアンチピリン法によりチロシンフェ
ノ−ル・リア−ゼ生産を調べたところ、全てのコロニ−
の周囲が赤色に着色しており、ｐＥＨ２　上にチロシン
フェノ−ル・リア−ゼの遺伝子を担うＤＮＡが存在する
ことが確認された。 （ｈ）サブクロ−ニングとＤＮＡ断片の解析ｐＥＨ２　
の挿入ＤＮＡ断片からその一部が欠如した種々のＤＮＡ
断片を調製し、それぞれリガ−ゼにより発現ベクタ−　
ｐＫＫ２２３−３　（ファルマシア社製）の　ｔａｃ　
プロモ−タ−の下流のポリリンカ−部に挿入した。これ
らの組換え体プラスミドにより、エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＣ−１０６１　
を（ｄ）と同様に形質転換し、１００　ｍｇ／ｌのアン
ピシリンと　２０　ｇ／ｌ　のＬ−チロシンを添加した
Ｌ培地寒天平板に塗布した。生じたコロニ−について　
（ｄ）　と同様に　４−アミノアンチピリン法によりチ
ロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産を調べることにより、
チロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子のおおよその位置
を決定し図１に示した。ｐＥＨ２　の中で、チロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼ遺伝子が含まれると思われる　Ｂｓ
ｓＩＩ−ＨａｅＩＩＩ挿入ＤＮＡ断片約　１．６ｋｂ　
について、Ｍ１３ｍｐ　系のベクタ−（Ｍｅｓｓｉｎｇ
，Ｊ．（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０１，ｐ．２０−７８）を用
いるジデオキシ法（Ｓａｇｅｒ，Ｆ．　ｅｔａｌ．（１
９７７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃ
ｉ．　ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７４，ｐ．５４６３−５４６７
）でＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、この塩基配
列中には、図２に示したようにオ−プンリ−ディングフ
レ−ムが確認された（配列３）。 （ｉ）チロシンフェノ−ル・リア−ゼ高発現プラスミド
の構築 構築例１ プラスミド　ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
社製）１μｇを、制限酵素　ＳｍａＩ（ニッポンジ−ン
社製）及びＰｓｔＩ（ニッポンジ−ン社製）で完全消化
後、アルカリフォスファタ−ゼ処理し、エタノ−ル沈澱
により回収することにより、ベクタ−ＤＮＡを調製した
。一方、プラスミド　ｐＥＨ２　を、（ｅ）と同様に抽
出しその内の　２　μｇを、制限酵素　ＢｓｓＨＩＩ（
ニッポンジーン社製）で完全消化後、フェノール処理、
エタノール沈澱し、５ｕｎｉｔｓのＫｌｅｎｏｗ　Ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ（宝酒造製）を３７℃、１時間作用させ、
末端を平滑化した。その後フェノール処理、エタノール
沈澱し制限酵素ＰｓｔＩ（ニッポンジーン社製）で完全
消化した。次いで、この反応液中のＤＮＡを　０．８％
アガロ−ス電気泳動し、約　１．６　Ｋｂ　の大きさの
ＤＮＡを含むゲルを切り出し、電気的溶出、エタノ−ル
沈澱により回収し、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝
子を含む挿入ＤＮＡを調製した。

【００６１】ＴＥ　緩衝液に溶解したベクタ−ＤＮＡと
チロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡ
をを混合し、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ジチオス
レイト−ル、１ｍＭ　ＡＴＰ　、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ　緩衝液（ｐＨ　７．５）の反応液　０．１　ｍ
ｌ中で、３００　Ｕｎｉｔｓ　の　Ｔ４　ＤＮＡリガ−
ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　社製）
により、１６　℃、４ｈｒ　反応させた。この反応液を
そのまま用い、チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能の
欠如した大腸菌である　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ−１０６１
　を（ｄ）と同様に形質転換し、１００　ｍｇ／ｌのア
ンピシリンと２０　ｇ／ｌ　のＬ−チロシンを添加した
Ｌ培地寒天平板に塗布した。生じたコロニ−について　
（ｄ）　と同様に　４−アミノアンチピリン法によりチ
ロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産を調べたところ、約　
１０００　株にチロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産が認
められた。このようにして得た形質転換株から４株を選
び、（ｅ）に示した方法に準じてプラスミドを抽出した
。得られたプラスミドは、全て、約　６．２　Ｋｂ　の
大きさで、同一の制限酵素切断地図を有していた。この
プラスミドを　ｐＥＨ２１と名付けた。ｐＥＨ２１の制
限酵素地図を図３に示した。大腸菌　ＭＣ−１０６１　
をｐＥＨ２１により形質転換した株を、エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５
１６　と名付け工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
した（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１３８６）。 構築例２ プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造製）１μｇを制限酵素
ＳｍａＩ（ニッポンジーン社製）及びＰｓｔＩ（ニッポ
ンジーン社製）で完全消化後、アルカリフォスファター
ゼ処理し、エタノール沈澱により回収することにより、
ベクターＤＮＡを調製した。

【００６２】一方、プラスミドｐＥＨ２を（ｅ）と同様
に抽出し、構築例１と同様にして、約１．６ｋｂのチロ
シンフェノール・リアーゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡ断片
を調製し、構築例１と同様な条件でベクターＤＮＡとチ
ロシンフェノール・リアーゼ遺伝子を含む挿入ＤＮＡを
連結し、大腸菌ＪＭ１０１を（ｄ）と同様に形質転換し
た。１００ｍｇ／ｌのアンピシリンの入ったＬ培地寒天
平板で生じたコロニーを（ｅ）に示した方法に準じてプ
ラスミドを抽出し、このプラスミドをｐＣＥ２２と名付
けた。

【００６３】次にプラスミドｐＣＥ２２を保持する大腸
菌ＪＭ１０１からヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を用い
て以下に示す方法により１本鎖ＤＮＡを調製した。ｐＣ
Ｅ２２を保持する大腸菌ＪＭ１０１を２ＹＴ（バクトト
リプトン１．６％，イーストエキストラクト１．０％，
食塩０．５％）に１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンの入
った培地で前培養した。新たに２ＹＴに１５０μｇ／ｍ
ｌのアンピシリンの入った培地５ｍｌに前培養液をＯＤ
６００＝０．０２−０．０５になるように接種して３７
℃で培養し、ＯＤ６００＝０．１−０．２のときＭ１３
ＫＯ７のヘルパーファージ液（宝酒造製）３０μｌを加
え、３７℃で３０分間ゆっくり振とう後７０μｇ／ｍｌ
となるようにカナマイシンを加え、３７℃で１４時間振
とう培養した。その後培養液をミクロ遠心管に移し、遠
心分離（８０００ｇ，５分間）にて菌体を除き、上清を
回収した。上清１ｍｌに対し、ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（
２０％ポリエチレングリコール、２．５ＭＮａＣｌ）を
２００μｌ加え、よく混合し１５分間室温に放置し、遠
心分離（８０００ｇ，５分間）により上清を完全に除去
し、沈澱を１００μｌのＴＥ緩衝溶液で溶解させた。こ
の溶液にＴＥ飽和フェノールを５０μｌ添加し約１０秒
間振とう後、約１０分間放置し、その後クロロホルム：
イソアミルアルコール（２４：１で混合したもの）を５
０μｌ添加し、約１０秒間振とう後５分間遠心して、水
層（上清）を別のミクロ遠心管に移した。１０μｌの酢
酸ナトリウムを添加し、２５０μｌの氷冷エタノールを
加え、エタノール沈澱により回収し、沈澱を５０μｌの
ＴＥ緩衝溶液に溶解しｐＣＥ２２の１本鎖ＤＮＡ１０μ
ｇを回収した。

【００６４】このようにして得られた１本鎖ＤＮＡに対
し、５’−ＧＧＡＴＡＧＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣ
ＴＣＣＡＧ−３’（配列６）のような合成プライマーを
作成し、サイトデレクテッド　　ミュウタジェネシスの
手法を用いてチロシンフェノール・リアーゼの開始コド
ンＡＴＧの直前の塩基−３ー−１（ＡＡＣ）を（ＣＡＴ
）に置換して制限酵素ＮｄｅＩのサイトを作成し、この
プラスミドをｐＣＥ２３と名付けた。サイトデレクテッ
ド　　ミュウタジェネシスは、Ｆｒｉｔｚ　　Ｅｃｋｓ
ｔｅｉｎらの方法（Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ　　ａ
ｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．，
ｐｐ８７４９−８７８５；　　Ｎａｋａｍａｙｅ，Ｋ．
ｅｔ　　ａｌ．（１９８６）　　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
　　Ｒｅｓ．，ｐｐ９６７９−９６９８；　　Ｓａｙｅ
ｒｓ，Ｊ．Ｒ．　　ｅｔ　　ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．，ｐｐ７９１−８０２）を
用いた。次いで合成リンカー５’−ＣＣＣＧＧＧＴＡＴ
ＣＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＡ−３’
（配列４）及び５’−ＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡＧＴＡ
ＡＣＡＧＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＴＡＣ−３’
（配列５）各々約０．０１μｇずつを１０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２，７ｍＭ　　ジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ
，１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０
）の反応液０．１ｍｌ中でＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（ニッポンジーン社製）により３７℃で３０分間反応
させた後、７０℃で１０分間の熱処理を行い調製した。 そして１μｇのｐＣＥ２３を制限酵素ＮｄｅＩ（ニッポ
ンジーン社製）及びＫｐｎＩ（東洋紡社製）で完全に消
化し、フェノール処理後エタノール沈澱により回収し、
調製した合成リンカー５μｌずつを加え、混合し、５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオスレイトール，１ｍ
Ｍ　　ＡＴＰ，６６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液
（ｐＨ７．５）の反応液０．１ｍｌ中で３００ｕｎｉｔ
ｓのＴ４ＤＮＡリカーゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ社製）により４℃　　１６ｈｒ反応させた。 　　この反応液をそのまま用い、構築例１と同様にして
チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産能の欠如した大腸菌
である　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＣ−１０６１　を（ｄ）と同
様に形質転換し、１００　ｍｇ／ｌのアンピシリンと　
２０　ｇ／ｌ　のＬ−チロシンを添加したＬ培地寒天平
板に塗布した。生じたコロニ−について　（ｄ）　と同
様に　４−アミノアンチピリン法によりチロシンフェノ
−ル・リア−ゼ生産を調べたところ、約　１００　株に
チロシンフェノ−ル・リア−ゼ生産が認められた。この
ようにして得た形質転換株から４株を選び、（ｅ）に示
した方法に準じてプラスミドを抽出した。得られたプラ
スミドは、全て、約　１．４ｋｂの挿入断片を含む約４
．６　Ｋｂ　の大きさで、同一の制限酵素切断地図を有
していた。このプラスミドを　ｐＣＥ２６と名付けた。 ｐＣＥ２６の制限酵素地図を図４に示した。大腸菌　Ｍ
Ｃ−１０６１　をｐＣＥ２６により形質転換した株を、
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）ＭＴ−１０５１９　と名付け工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３２８７　）
。 （ｊ）チロシンフェノ−ル・リア−ゼの製造エシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−
１０５１６及びＭＴ−１０５１９を、０　または２０　
ｇ／ｌ　のＬ−チロシンを添加したＬ培地（バクト・ト
リプトン　　１０　ｇ／ｌ、酵母エキス　５　ｇ／ｌ、
塩化ナトリウム　５　ｇ／ｌ、ｐＨ　７．２に調整）１
００　ｍｌに植菌し、３７℃で　２０　時間振とう培養
した後、遠心分離により集菌した。

【００６５】これら菌体のチロシンフェノ−ル・リア−
ゼ活性を次のように測定した。菌体を洗浄後、０．１ｍ
Ｍ　のピリドキサ−ル　　リン酸を含む１０ｍＭ　ピロ
リン酸緩衝液（ｐＨ　８．５）　１０　ｍｌに懸濁した
。超音波処理により無細胞抽出液を調製し、この酵素液
を、Ｌ−セリン　７０　ｇ／ｌ、フェノ−ル　１７ｇ／
ｌ、酢酸アンモニウム　１７　ｇ／ｌを含みｐＨ　８．
５　にアンモニアで調整した反応液　９０　ｍｌに加え
、３７℃で　１　時間ゆるやかに振とうしながら反応し
た。生成したＬ−チロシン量を　Ｋｏｎｄｏ　らの方法
（Ｋｏｎｄｏ，Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）　Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．４８，ｐｐ１
５９５−１６０１）により高速液体クロマトグラフィ−
で定量した。

【００６６】各菌株のチロシンフェノ−ル・リア−ゼ活
性を第１表に示した。なお、チロシンフェノ−ル・リア
−ゼ活性の　１　ｕｎｉｔ　は、３７℃で　１　分間当
り　１　μｍｏｌ　のチロシンを生成する酵素量である
。

【００６７】表１に示したように　ＭＴ−１０５１６株
及びＭＴ−１０５１９株においては、培地へのチロシン
添加なしで高い酵素活性が認められた。 比較例１ 宿主として用いたエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＣ−１０６１および染色体ＤＮ
Ａ源として用いたエルビニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉ
ｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｒａ）ＭＴ−１０５０９および
　ｐＥＨ２　を有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＭＴ−１０５１５　を実施例
１（ｊ）に示したのと同様に培養して、そのチロシンフ
ェノ−ル・リア−ゼ活性を実施例１（ｊ）に示したのと
同様に測定し、その値を表２に示した。

【００６８】ＭＴ−１０５０９株では、培地にチロシン
を添加しない場合は、ほとんど酵素活性が認められず、
培地にチロシンを添加した場合に酵素活性が認められた
。ＭＴ−１０５１５株では、チロシン無添加でも酵素活
性が認められたが、その値は、チロシンを添加した場合
の約１／２であった。

【００６９】表１、表２から、ＭＴ−１０５１６株，及
びＭＴ−１０５１９株の酵素活性はＭＣ−１０６１株、
ＭＴ−１０５０９株、ＭＴ−１０５１５株の酵素活性よ
りも著しく高いものであり、さらにＭＴ−１０５１６株
，及びＭＴ−１０５１９株については培地中にチロシン
を添加しなくても高い酵素活性が認められたが、ＭＴ−
１０５０９株、ＭＴ−１０５１５株については培地中に
チロシンを添加しない場合は添加した場合に比べ著しく
低いものであった。 比較例２ エルビニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂ
ｉｃｏｌａ）　ＡＴＣＣ２１４３４より染色体ＤＮＡを
調製し、特開昭６２−２５９５８９記載の方法により、
β−チロシナーゼ活性を有し、その塩基対が、１．７ｋ
ｂであり、そのＤＮＡ鎖中に制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
される箇所を含むＳａｕ３ＡＩ−ＰｓｔＩ　１．７ｋｂ
のＤＮＡ断片を調製し、プラスミドベクターｐＵＣ１８
のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ制限酵素サイトに導入し、これ
をｐＳＰ１７と名付けた。ｐＳＰ１７から、β−チロシ
ナーゼ活性を有する　　ＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｄ
ＮＡ断片　１．７ｋｂ　を調製し、Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒ
ａｇｍｅｎｔ　により、ＨｉｎｄＩＩＩ末端を平滑化し
てプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３のＳｍａＩサイ
トに導入し、ｔａｃ　プロモーターに対し、向きの異な
る２つのプラスミドベクターｐＳＰ１８，ｐＳＰ１９を
得た。ｐＳＰ１８，ｐＳＰ１９をそれぞれエッシェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＭＣ
−１０６１株に導入し、それらを実施例１（ｊ）と同様
に培養してそのチロシンフェノールリアーゼ活性を測定
し、その値を表３に示した。

【００７０】ＭＣ１０６１／ｐＳＰ１８株、及びＭＣ１
０６１／ｐＳＰ１９株は、表１のＭＴ−１０５１６株，
及びＭＴ−１０５１９株に比べて、その酵素活性は著し
く低いものであった。

【００７１】

【発明の効果】本発明によればチロシンフェノ−ル・リ
ア−ゼの効率的生産に有用な遺伝子、その遺伝子を有す
る組換え体プラスミド、それにより形質転換された大腸
菌およびこの大腸菌を用いるチロシンフェノ−ル・リア
−ゼの製造法が提供される。

【００７２】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：　１３６８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡハイポセチィカ
ル：　ＹＥＳ アンチセンス：ＮＯ 起源： 生物名：　Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ直接の
起源 クローン名：　ｐＥＨ２１，　ｐＣＥ２６配列の特徴： ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤＳ 存在位置：　１．．１３６８ 配列 ＡＴＧ　ＡＡＣ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　Ｃ
ＣＴ　ＴＴＣ　ＣＧＣ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＴ
Ｔ　ＧＡＡ　ＡＣＣ　ＧＴＡ　　　　　　４８Ｍｅｔ　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐ
ｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　　　１　　　　　　　　　　　
　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　　　　
　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＣＧＣ　ＧＡＴ　
ＧＡＧ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　Ｃ
ＡＡ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＧＧＣ　　　　　　９６Ｓｅｒ
　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　
Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｇ
ｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　
２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　　　　　　
　　ＴＡＴ　ＡＡＣ　ＡＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＧ
　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　
ＡＴＣ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　　　　　１４４Ｔｙ
ｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ
　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　
Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　３５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　
　　　　　　　　　　　　４５　　　　　　　　　　　
　　　ＡＣＡ　ＧＡＣ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＡＡ
Ｔ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣ　ＡＡＧ　ＣＡＧ
　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　　　　　１９２Ｔ
ｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌ
ａ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ
　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　　　　　　　５０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　
　　　　　　　　　６０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　Ｇ
ＣＣ　ＴＡＣ　ＧＣＡ　ＧＧＣ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡ
Ｃ　ＴＴＣ　ＴＡＣ　ＣＡＴ　ＣＴＣ　　　　　２４０
Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔ
ｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈ
ｅ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　　　６５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　８０　　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　
ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　Ｃ
ＡＣ　ＡＴＣ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＡＣＣ　　　　　２８
８Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｉ
ｌｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５
　　　　　　ＣＡＣ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＣＧＣ　ＧＧＧ
　ＧＣＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＣＴＧ　ＣＴＣ　ＴＣＧ　
ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　　　　　３
３６Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ
　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　
　　　　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０５　　　　　　　　　　　　　　　　　１１０　　　
　　　　　　　ＣＣＣ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＴ
Ｃ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＴＡＣ　ＴＴＴ
　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＣＣ　ＣＧＣ　ＴＴＣ　　　　　
３８４Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ
　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　
　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０　
　　　　　　　　　　　　　　　　１２５　　　　　　
　　　　　　　　ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＣ　ＧＣＡ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＧＡ
Ｔ　ＡＴＴ　ＧＴＣ　ＣＧＣ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　　　　
　４３２Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌ
ｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　　　　　　１３
０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５　　　　
　　　　　　　　　　　　　１４０　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＧＣＣ　
ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＣＴＣ　ＣＣＣ　ＴＴＴ　Ａ
ＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　　　
　　４８０Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　
Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　　１４５　　
　　　　　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　
　　　　　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　
　　　　　１６０　　ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＧＣＧ
　ＡＣＧ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　
ＧＧＣ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＧＣＣ　　
　　　５２８Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ
　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　
Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１６５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　
　　１７５　　　　　　ＴＡＴ　ＡＴＣ　ＴＧＣ　ＣＴ
Ｔ　ＧＣＧ　ＧＴＣ　ＡＣＣ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＣＴＧ
　ＧＣＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　
　　　　５７６Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　　　　
　　　　　　　　　１８０　　　　　　　　　　　　　
　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１
９０　　　　　　　　　　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＧＣＧ　Ａ
ＡＴ　ＡＴＧ　ＣＧＴ　ＧＣＣ　ＧＴＡ　ＣＡＴ　ＧＡ
Ａ　ＡＴＧ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＧＧＣ
　　　　　６２４Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｍ
ｅｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅ
ｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　　　　
　　　　　　１９５　　　　　　　　　　　　　　　　
　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０５　
　　　　　　　　　　　　　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＡＴＣ　
ＴＡＴ　ＴＡＣ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＣＧＴ　Ｔ
ＧＣ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＣＣ　ＴＡＴ　ＴＴ
Ｔ　　　　　６７２Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　
Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　　　
　　　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　２１
５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＡＧ
　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣ　ＴＡＣ　ＧＡＧ　
ＡＡＣ　ＧＴＣ　ＡＧＴ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　Ａ
ＴＣ　　　　　７２０Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ
　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　
Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　　
２２５　　　　　　　　　　　　　　　　　２３０　　
　　　　　　　　　　　　　　　２３５　　　　　　　
　　　　　　　　　　２４０　　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＧＡ
Ａ　ＡＴＧ　ＴＴＣ　ＡＧＣ　ＴＡＴ　ＧＣＣ　ＧＡＴ
　ＧＧＧ　ＴＧＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　
ＡＡＡ　　　　　７６８Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅ
ｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ
　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２４５　　　　　
　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　　
　　　　　　　２５５　　　　　　ＡＡＡ　ＧＡＴ　Ｔ
ＧＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＡＴＣ　ＧＧＣ　ＧＧ
Ｃ　ＴＴＣ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＣ　ＧＡＴ
　ＧＡＧ　　　　　８１６Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ
　　　　　　　　　　　　　　２６０　　　　　　　　
　　　　　　　　　２６５　　　　　　　　　　　　　
　　　　２７０　　　　　　　　　　ＧＡＧ　ＡＴＧ　
ＴＴＣ　ＴＣＡ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　Ｔ
ＴＧ　ＧＴＴ　ＧＴＣ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＧ
Ｔ　ＡＴＧ　　　　　８６４Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　
Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖ
ａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅ
ｔ　　　　　　　　　　２７５　　　　　　　　　　　
　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　　
　２８５　　　　　　　　　　　　　　ＣＣＧ　ＴＣＡ
　ＴＡＣ　ＧＧＣ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＧＧＴ　
ＣＧＧ　ＧＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　Ｇ
ＣＴ　ＡＴＴ　　　　　９１２Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　
Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｉ
ｌｅ　　　　　　２９０　　　　　　　　　　　　　　
　　　２９５　　　　　　　　　　　　　　　　　３０
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＧ　ＣＴ
Ａ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ
　ＧＡＡ　ＴＡＴ　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＣＧＧ　
ＧＴＣ　ＡＡＡ　　　　　９６０Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒ
ｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ
　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　
Ｌｙｓ　　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　
３１０　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　
　　　　　　　　　　　　　　　３２０　　ＣＡＧ　Ｇ
ＴＧ　ＣＧＣ　ＴＡＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣ　ＧＡＴ　ＡＡ
Ａ　ＣＴＣ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＧＧＣ　ＧＴＡ
　ＣＣＣ　ＡＴＴ　　　　１００８Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａ
ｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅ
ｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ
　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３２５
　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　
　　　　　　　　　　　　３３５　　　　　　ＧＴＴ　
ＧＡＡ　ＣＣＧ　ＡＣＧ　ＧＧＣ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　Ｇ
ＣＧ　ＧＴＡ　ＴＴＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＣＧ
Ｔ　ＣＧＴ　ＴＴＣ　　　　１０５６Ｖａｌ　Ｇｌｕ　
Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｖ
ａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒ
ｇ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　３４０　　　
　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　
　　　　　　　　　３５０　　　　　　　　　　ＴＧＴ
　ＣＣＡ　ＣＡＣ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＧＡＴ　
ＣＡＧ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣ　Ｃ
ＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣ　　　　１１０４Ｃｙｓ　Ｐｒｏ
　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　
Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ａｌａ　　　　　　　　　　３５５　　　　　　
　　　　　　　　　　　３６０　　　　　　　　　　　
　　　　　　３６５　　　　　　　　　　　　　　ＡＧ
Ｃ　ＡＴＣ　ＴＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ　ＧＧＣ
　ＧＴＧ　ＣＧＡ　ＡＧＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＧＴ　
ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　　　　１１５２Ｓｅｒ　Ｉｌ
ｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ
　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
Ｉｌｅ　Ｖａｌ　　　　　　３７０　　　　　　　　　
　　　　　　　　３７５　　　　　　　　　　　　　　
　　　３８０　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔ
ＣＣ　ＧＣＣ　ＧＧＴ　ＣＧＴ　ＡＧＣ　ＡＡＧ　ＧＡ
Ａ　ＡＣＧ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＡＡＣ　ＣＡＴ　ＡＧＣ
　ＣＣＣ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　　　　１２００Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　　３８５　　　　　　　　　　　　
　　　　　３９０　　　　　　　　　　　　　　　　　
３９５　　　　　　　　　　　　　　　　　４００　　
ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＣ　ＡＣＴ　Ａ
ＴＴ　ＣＣＡ　ＣＧＣ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣ　ＡＣ
Ｔ　ＴＡＣ　ＧＣＧ　ＣＡＣ　　　　１２４８Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐ
ｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙ
ｒ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　４０５　　　　　　　　　　　　　　　　　４１０
　　　　　　　　　　　　　　　　　４１５　　　　　
　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＧＣＣ　ＧＡＴ　
ＧＧＣ　ＡＴＣ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　Ｃ
ＡＧ　ＣＡＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　　　　１２９６Ｍｅｔ
　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　
Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｈ
ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　４
２０　　　　　　　　　　　　　　　　　４２５　　　
　　　　　　　　　　　　　　４３０　　　　　　　　
　　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＡＣＧ
　ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　
ＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＧＣ　ＴＴＣ　　　　１３４４Ａｓ
ｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ
　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　
Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　　４３５　
　　　　　　　　　　　　　　　　４４０　　　　　　
　　　　　　　　　　　４４５　　　　　　　　　　　
　　　ＴＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣＧ　ＣＧＴ　ＴＴＴ　ＧＡ
Ｃ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３６８Ｐ
ｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｈ
ｅ　Ｉｌｅ　　　　　４５０　　　　　　　　　　　　
　　　　　４５５　　　　　配列番号：２ 配列の長さ：　４５６残基 配列の型：アミノ酸 トポロジー：　直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐ
ｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａ
ｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　　　１　　　　　　　　
　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　　
　　　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ
　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　
　　　　　２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　
２５　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０　　　
　　　　　　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ
　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　
Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　　　　　　
　　　　３５　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　４５　　　　
　　　　　　　　　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　
Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　　　
　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ
　　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　８０　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈ
ｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ
　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　８５　　
　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　９５　　　　　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ
　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　
Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　１００　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　
　　　　　　　　　１１０　　　　　　　　　Ｐｒｏ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｎ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈ
ｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　　　　　　　　　１１５　　　　
　　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　
　　　　　　　　１２５　　　　　　　　　　　　　Ｈ
ｉｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌ
ａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ
　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　　　　　１３０　　　　　
　　　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１４０　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ
　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　
Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　１４５　　　　　　
　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　
　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　
　１６０　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　
Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　　　　　　　
　　　　　　　　　　１６５　　　　　　　　　　　　
　　　　　１７０　　　　　　　　　　　　　　　　　
１７５　　　　　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　　　
　　　　　　　　　１８０　　　　　　　　　　　　　
　　　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　　　１
９０　　　　　　　　　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓ
ｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ
　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　
　　　　　　　　１９５　　　　　　　　　　　　　　
　　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　２０
５　　　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ
　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　
Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐ
ｈｅ　　　　　２１０　　　　　　　　　　　　　　　
　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　
Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇ
ｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓ
ｐ　Ｉｌｅ　２２５　　　　　　　　　　　　　　　　
　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４０　Ｖａｌ　Ｈ
ｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌ
ａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　
２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０　　
　　　　　　　　　　　　　　　２５５　　　　　Ｌｙ
ｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　
Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　２
６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５　　　
　　　　　　　　　　　　　　２７０　　　　　　　　
　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔ
ｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　　　　　　　　　２７
５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０　　　　
　　　　　　　　　　　　　２８５　　　　　　　　　
　　　　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　　　　　２９０
　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　
　　　　　　　　　　　　３００　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌ
ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　３０５　
　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　
　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　
　　　　　　３２０　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　
Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　　
　　　　　　　　　　　　　　　３２５　　　　　　　
　　　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　
　　　　　３３５　　　　　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐ
ｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｈ
ｅ　　　　　　　　　　　　　３４０　　　　　　　　
　　　　　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　
　　　　３５０　　　　　　　　　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈ
ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｈ
ｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ
　Ａｌａ　　　　　　　　　３５５　　　　　　　　　
　　　　　　　　３６０　　　　　　　　　　　　　　
　　　３６５　　　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ　Ｉｌ
ｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ
　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
Ｉｌｅ　Ｖａｌ　　　　　３７０　　　　　　　　　　
　　　　　　　３７５　　　　　　　　　　　　　　　
　　３８０　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ
　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　３８５　　　　　　　　　　　
　　　　　　３９０　　　　　　　　　　　　　　　　
　３９５　　　　　　　　　　　　　　　　　４００　
Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉ
ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈ
ｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　
　　　　　４０５　　　　　　　　　　　　　　　　　
４１０　　　　　　　　　　　　　　　　　４１５　　
　　　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓ
ｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ
　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　
　　　　４２０　　　　　　　　　　　　　　　　　４
２５　　　　　　　　　　　　　　　　　４３０　　　
　　　　　　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ
　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　　　　　　
　　　４３５　　　　　　　　　　　　　　　　　４４
０　　　　　　　　　　　　　　　　　４４５　　　　
　　　　　　　　　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　
Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　　　　　４５０　　
　　　　　　　　　　　　　　　４５５　　　　　配列
番号：３ 配列の長さ：　１５７１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡ配列の特徴： ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：　ＣＤＳ 存在位置：　１７６．．１５４３ 配列 ＧＣＧＣＧＣＡＴＡＧ　ＴＧＡＣＧＣＧＣＴＡ　ＴＴＴ
ＴＣＡＣＧＣＡ　ＴＧＡＴＡＡＡＴＣＣ　ＣＧＣＡＴＧ
ＡＴＧＧ　ＴＧＴＣＧＴＡＴＴＡ　　　　６０ＴＴＴＣ
ＣＡＣＣＴＣ　ＡＡＴＴＣＴＧＡＧＧ　ＴＴＡＴＴＧＴ
ＴＡＴ　ＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴ　ＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣ
　ＴＡＴＧＣＡＣＣＡＧ　　　１２０ＡＣＴＴＡＴＴＣ
ＧＡ　ＣＧＣＧＣＡＴＴＴＴ　ＴＣＴＧＣＧＴＡＴＧ　
ＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡ　ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡ　ＴＡＡ
ＡＣ　ＡＴＧ　　　　１７８　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｍ
ｅｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　ＡＡＣ　Ｔ
ＡＴ　ＣＣＴ　ＧＣＣ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＴＣ　ＣＧ
Ｃ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣ
　ＧＴＡ　ＴＣＡ　　　　　２２６Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｐ
ｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌ
ｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ
　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１５　　　　　　　　　　ＡＴＧ　
ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＣＧＣ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＣＧＴ　Ｇ
ＴＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＣ
Ｇ　ＧＧＣ　ＴＡＴ　　　　　２７４Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　
Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　２０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　３０　　　　　　　　　　　　　　ＡＡＣ
　ＡＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　
ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＴＡＣ　ＡＴＣ　ＧＡＴ　Ｃ
ＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＡ　　　　　３２２Ａｓｎ　Ｔｈｒ
　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　
Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈｒ　　　　　　　３５　　　　　　　　　　
　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４５　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＡ
Ｃ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＧＣＣ　ＡＴＧ
　ＡＧＴ　ＧＡＣ　ＡＡＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　
ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　　　　　３７０Ａｓｐ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ
　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　
Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　　　５０　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
６０　　　　　　　　　　　　　　　　　　６５　　Ａ
ＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＴＡＣ　ＧＣ
Ａ　ＧＧＣ　ＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＴＡＣ
　ＣＡＴ　ＣＴＣ　ＧＡＡ　　　　　４１８Ｉｌｅ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ
　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８０　　　　　　
ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　Ｔ
ＴＴ　ＧＧＴ　ＴＴＣ　ＡＡＡ　ＣＡＣ　ＡＴＣ　ＧＴ
Ｔ　ＣＣＡ　ＡＣＣ　ＣＡＣ　　　　　４６６Ｌｙｓ　
Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇ
ｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｐｒ
ｏ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　　　　　　　　　　　　　　　８
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　９０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　９５　　　　　　　　　
　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＣＧＣ　ＧＧＧ　ＧＣＧ　ＧＡＡ　
ＡＡＣ　ＣＴＧ　ＣＴＣ　ＴＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　Ｇ
ＣＣ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＣＣＣ　　　　　５１４Ｇｌｎ
　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　
Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　　１００　　
　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　　　　　
　　　　　　　　　　１１０　　　　　　　　　　　　
　　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＴＡＴ　ＧＴＣ　ＧＣＡ　ＧＧＡ
　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＴＡＣ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　
ＡＣＣ　ＣＧＣ　ＴＴＣ　ＣＡＴ　　　　　５６２Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ
　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　
Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　　　　　　１１５　　　　　
　　　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　
　　　　　　　１２５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＧＧＣ　ＧＣ
Ａ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＧＴＣ
　ＣＧＣ　ＧＡＴ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　　　　　６１０Ｇ
ｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｈ
ｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｒｇ
　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　　１３０　　　　　　　　
　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　
　　　　１４０　　　　　　　　　　　　　　　　　１
４５　　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＧＣＣ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　Ａ
ＡＴ　ＣＴＣ　ＣＣＣ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＡ
Ｔ　ＡＴＴ　ＧＡＣ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　　　　　６５８
Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｉｌ
ｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　　
　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　１６０　
　　　　　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＧＣＧ　ＡＣＧ　ＣＴＣ　
ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＡ　ＧＧＣ　ＧＣＣ　Ｇ
ＡＧ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＧＣＣ　ＴＡＴ　　　　　７０
６Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａ
ｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　
　　　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７
０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５　　　　
　　　　　　ＡＴＣ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　ＧＴＣ
　ＡＣＣ　ＧＴＧ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＧＧＴ　
ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＴＣＡ　　　　　７
５４Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ
　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　　　　　　　　　　
１８０　　　　　　　　　　　　　　　　　１８５　　
　　　　　　　　　　　　　　　１９０　　　　　　　
　　　　　　　ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＡＡＴ　ＡＴＧ　ＣＧ
Ｔ　ＧＣＣ　ＧＴＡ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＣＣ
　ＡＧＣ　ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＧＧＣ　ＡＴＴ　　　　　
８０２Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｌ
ａ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ
　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　　　　　　１９５
　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　　　　
　　　　　　　　　　　　２０５　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＡＡＧ　ＡＴＣ　ＴＡＴ　ＴＡＣ　Ｇ
ＡＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣ　ＣＧＴ　ＴＧＣ　ＧＴＴ　ＧＡ
Ａ　ＡＡＴ　ＧＣＣ　ＴＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＣ　　　　
　８５０Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａ
ｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓ
ｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　　２１０　　　
　　　　　　　　　　　　　　２１５　　　　　　　　
　　　　　　　　　２２０　　　　　　　　　　　　　
　　　　２２５　　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　
ＧＣＧ　ＧＧＣ　ＴＡＣ　ＧＡＧ　ＡＡＣ　ＧＴＣ　Ａ
ＧＴ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＴＣ　ＧＴＧ　　　
　　８９８Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｉ
ｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２３０　　　　　　　　　　　
　　　　　　２３５　　　　　　　　　　　　　　　　
　２４０　　　　　　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＴＴＣ
　ＡＧＣ　ＴＡＴ　ＧＣＣ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＴＧＣ　
ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　ＡＡＡ　ＡＡＡ　　
　　　９４６Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ
　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　
Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　　　　　　
　　　　　　　　２４５　　　　　　　　　　　　　　
　　　２５０　　　　　　　　　　　　　　　　　２５
５　　　　　　　　　　ＧＡＴ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＧＴ
Ｇ　ＡＡＴ　ＡＴＣ　ＧＧＣ　ＧＧＣ　ＴＴＣ　ＴＴＧ
　ＴＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＣ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　
　　　　９９４Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓ
ｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ
　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　　　　　
　　　　　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　
２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０　　
　　　　　　　　　　　　ＡＴＧ　ＴＴＣ　ＴＣＡ　Ｇ
ＣＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＧＴ
Ｃ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＣＣＧ
　　　　１０４２Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａ
ｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　　　　
　　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０
　　　　　　　　　　　　　　　　　２８５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＴＣＡ　ＴＡＣ　ＧＧＣ　
ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＧＧＴ　ＣＧＧ　ＧＡＴ　Ａ
ＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＧＧ
Ｇ　　　　１０９０Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇ
ｌｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　　２
９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　
　　　　　　　　　　　　　　３００　　　　　　　　
　　　　　　　　　３０５　　ＣＴＡ　ＣＧＴ　ＧＡＡ
　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＴＡＴ　
ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＣＡＴ　ＣＧＧ　ＧＴＣ　ＡＡＡ　Ｃ
ＡＧ　　　　１１３８Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ
　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　
Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　　
　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　　
　　　　　　３２０　　　　　　ＧＴＧ　ＣＧＣ　ＴＡ
Ｔ　ＣＴＧ　ＧＧＣ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＣＴＣ　ＣＧＴ
　ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＧＧＣ　ＧＴＡ　ＣＣＣ　ＡＴＴ　
ＧＴＴ　　　　１１８６Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ
　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　
　　　　　　　　　　　　　３２５　　　　　　　　　
　　　　　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　
　　　３３５　　　　　　　　　　ＧＡＡ　ＣＣＧ　Ａ
ＣＧ　ＧＧＣ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧＣＧ　ＧＴＡ　ＴＴ
Ｔ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＴＣ
　ＴＧＴ　　　　１２３４Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅ
ｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ
　　　　　　　　　　３４０　　　　　　　　　　　　
　　　　　３４５　　　　　　　　　　　　　　　　　
３５０　　　　　　　　　　　　　　ＣＣＡ　ＣＡＣ　
ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧ　ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＴＴＣ　Ｃ
ＣＴ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣ　ＣＴＧ　ＧＣＡ　ＧＣ
Ｃ　ＡＧＣ　　　　１２８２Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅ
ｒ　　　　　　３５５　　　　　　　　　　　　　　　
　　３６０　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ　ＴＡＴ
　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＡＣＣ　ＧＧＣ　ＧＴＧ　ＣＧＡ　
ＡＧＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＣＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　Ｇ
ＴＴ　ＴＣＣ　　　　１３３０Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ
　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｓ
ｅｒ　　３７０　　　　　　　　　　　　　　　　　３
７５　　　　　　　　　　　　　　　　　３８０　　　
　　　　　　　　　　　　　　３８５　　ＧＣＣ　ＧＧ
Ｔ　ＣＧＴ　ＡＧＣ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＧＧＧ
　ＧＡＧ　ＡＡＣ　ＣＡＴ　ＡＧＣ　ＣＣＣ　ＡＡＡ　
ＣＴＧ　ＧＡＧ　　　　１３７８Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒ
ｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ
　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３９０　
　　　　　　　　　　　　　　　　３９５　　　　　　
　　　　　　　　　　　４００　　　　　　ＡＣＧ　Ｇ
ＴＡ　ＣＧＴ　ＣＴＣ　ＡＣＴ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＣＧ
Ｃ　ＣＧＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣ　ＡＣＴ　ＴＡＣ　ＧＣＧ
　ＣＡＣ　ＡＴＧ　　　　１４２６Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａ
ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒ
ｇ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｈｉｓ
　Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　　　　４０５　　　　
　　　　　　　　　　　　　４１０　　　　　　　　　
　　　　　　　　４１５　　　　　　　　　　ＧＡＴ　
ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＧＣＣ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＡＴＣ　Ａ
ＴＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＡＡ
Ａ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　　　　１４７４Ａｓｐ　Ｖａｌ　
Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌ
ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌ
ｕ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　４２０　　　　　　　
　　　　　　　　　　４２５　　　　　　　　　　　　
　　　　　４３０　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＴ
　ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＡＣＧ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　
ＴＡＣ　ＧＡＡ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＣＴＴ　Ｃ
ＧＣ　ＴＴＣ　ＴＴＴ　　　　１５２２Ｉｌｅ　Ａｒｇ
　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　
Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｈｅ　　　　　　４３５　　　　　　　　　　
　　　　　　　４４０　　　　　　　　　　　　　　　
　　４４５　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＣ
Ｔ　ＧＣＧ　ＣＧＴ　ＴＴＴ　ＧＡＣ　ＴＴＴ　ＡＴＴ
　ＴＡＡＴＡＣＡＡＣＣ　ＣＴＧＧＣＣＣＣＧＣ　ＡＧ
ＧＧＧＧＣＣ　　　　　　　　　１５７１Ｔｈｒ　Ａｌ
ａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４５０　　　　　　　　　　　　　　　　　４５
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　配列番号：４ 配列の長さ：　３１塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：　直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡ配列 ＣＣＣＧＧＧＴＡＴＣ　ＡＡＣＡＣＴＧＴＴＡ　ＣＴＧ
ＧＡＧＡＡＡＣ　Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３１配列番号
：５ 配列の長さ：　３７塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：　直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡ配列 ＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣ　ＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴ　ＧＴＴ
ＧＡＴＡＣＣＣ　ＧＧＧＧＴＡＣ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３７配列番号
：６ 配列の長さ：　２５塩基 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：　直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡ配列 ＧＧＡＴＡＧＴＴＣＡ　ＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣ　ＴＣＣ
ＡＧ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５

【図面の簡単な説明】

【図１】組換え体プラスミド　　ｐＥＨ２　　の中のエ
ルビニア・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　　ｈｅｒｂ
ｉｃｏｌａｄｉｉ）由来の挿入ＤＮＡ部分の制限酵素切
断地図とチロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子のおおよ
その位置を示した図である。

【図２】チロシンフェノ−ル・リア−ゼ遺伝子のＤＮＡ
塩基配列とチロシンフェノ−ル・リア−ゼのアミノ酸配
列を示した図である。

【図３】組換え体プラスミド　　ｐＥＨ２１の制限酵素
切断地図を示した図である。

【図４】組換え体プラスミド　　ｐＣＥ２６の制限酵素
切断地図を示した図である。