KR100338372B1 - 5'-이노신산 생산 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 5'-이노신산(5'-inosinic acid)을 생산하는 미생물에 관한 것으로, 고농도의 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 중에서 생육이 가능하고, 삼투압에 대해 내성을 가짐으로써 5'-이노신산을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시키는 코리네박테리움 암모니아게네스에 관한 것이다.

Description

5'-이노신산 생산 미생물{5'-Inosinic acid-producing microorganism}

본 발명은 5'-이노신산을 생산하는 미생물, 좀 더 구체적으로는 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes,종전 브레비박테리움 암모니아게네스라고도 함) 균주(ATCC 6872)의 변이주에 관한 것이다.

본 발명의 미생물은 종래의 5'-이노신산을 생산하는 아데닌(Adenine) 누출형 변이주(Leaky Mutant) [Agr. Bio. Chem., Vol; 47(5), p.1035-1041, 1983, (KY13102, KY13171, KY13184 등)] 또는 아데닌과 크산틴(Xanthine) 또는 구아닌(Guanine) 동시 요구성 균주와는 달리, 아데닌을 요구하는 반면 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 이들을 첨가함으로서 생육이 촉진되고, 우레아(Urea)를 자화할 수 있는 우레아제(Urease)가 결손되어 있으며, 세포벽 합성 능력이 부분적으로 결손되어 세포벽 분해효소인 라이소자임(Lysozyme)에 높은 감수성을 가짐으로써 세포내에 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있을 뿐만아니라, 삼투압 내성 형질이 부여됨으로써 배양 과정에서 첨가된 고농도의 포도당 및 여러 탄소원에 의하거나 또는 배양 후반에서의 5'-이노신산이 배양액 중에 축적되어 균체 외부의 삼투압이 증가하더라도 5'-이노신산 생산 세포의 정상적인 생리활성의 저해에 따른 균체성장의 둔화 및 5'-이노신산 생성의 저하를 방지할 수 있는 미생물 균주(KFCC-10814)(대한민국특허 제127853호)로 부터 개발된 것으로서, 삼투압 조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)에 대한 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주를 선별할 목적으로 여러 가지 변이원으로 처리하여 균체 외부에 축적된 고농도 용질에 대하여 세포 내부에서 농도가 증가되어 기존 균주에 비하여 효율적으로 삼투압에 의한 영향을 배제함으로서 5'-이노신산을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시킬 수 있다.

5'-이노신산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 이용 등 다방면에 이용되고 있으며, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승 효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고있는 핵산계 조미료중의 하나이다.

현재 직접 발효법을 사용하여 5'-이노신산을 생산하는 여러 가지 방법들이 공지되어 있는데, 가장 중요한 사항은 경제적으로 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하는데 있다.

본 발명자들은 여러 가지 프롤린 유사체(L-proline analogue)에 대한 내성주를 선별하여 예의 연구한 결과, 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성을 부여한 균주가 직접 발효법에 의해 5-이노신산을 기존의 것에 비해서 고농도, 고수율로 생산할수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 당사에서 개발한 공지의 균주(KFCC-10814)로부터 선별되어 공지의 기술보다 직접 발효법에 의해 5'-이노신산을 고수율 및 고농도로 생산하는, 프롤린 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주인 미생물 균주를 제공하는데 있다.

대부분의 세균은 균체외부의 삼투압하에서 삼투적 탈수 현상을 막기위해 균체 내부의 삼투압을 증가시키는 방법으로 칼륨 이온과 오스모라이트(osmolytes)라고 하는 유기성 용질을 축적시킨다. 이러한 오스모라이트에는 프롤린(L-proline), 글루타민산(Glutamate), 당(Sugar), N-메틸화 아미노산 유도체(N-methylated amino acid derivatives) 등이 알려져 있으며 그 중에서 프롤린(L-proline)은 삼투압 조절의 중요한 인자로 균체 외부의 증가된 5'-이노신산에 의한 삼투압 조건에서 프롤린 생합성 경로의 중요한 효소인 피롤리딘-5-카르복실레이트 리덕타아제(Pyrroline-5-carboxylate reductase)의 활성이 증가되면서 균체 내부에 프롤린(L-proline)을 축적시키는 것이 브레비박테리움 락토퍼맨텀(Brevibacterium lactofermentum)을 통해 보고된 바 있다[참조,Agr, Bio, Chem., Vol; 53(9), p.2475-2479, 1989]. 이외에 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium),세라티아 마르센스(Serratia marcescens)등에서도 균체 내부에 프롤린(L-proline)이 축적되며 이는 외부 삼투압에 의하여 조절됨을 보고하였다[J, Bacteriol., Vol. 163, p296, 1985]. 따라서, 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하는 균주를 개발하기 위해서는 프롤린(L-proline) 합성 능력을 증가시킴으로써 삼투압 내성형질을 강화하고 또한 균체내부의 프롤린(L-proline) 합성 증가에 따른 생육과 생화학적 대사과정의 저해를 방지하기 위해 프롤린 유사체 저항성 균주를 획득하는 것이 중요하다고 사료된다.

다음에 본 발명에 대해 좀더 구체적으로 설명한다.

먼저, 본 발명에서 사용된 미생물은 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenesATCC6872)의 변이주로서, 본 발명의 미생물은 아데닌을 요구하는 반면 크산틴 또는 구아닌을 요구하지 않으나 이들을 첨가함으로서 생육이 촉진되고, 우레아(Urea)를 자화할 수 있는 우레아제(Urease)가 결손되어 있으며, 세포벽 합성 능력이 부분적으로 결손되어 세포벽 분해효소인 라이소자임(Lysozyme)에 높은 감수성을 가짐으로써 세포내에 생성된 다량의 5'-이노신산을 세포밖으로 잘 분비할 수 있을 뿐만아니라, 삽투압 내성 형질이 부여됨으로써 배양 과정에서 첨가된 고농도의 포도당 및 여러 탄소원에 의하거나 또는 배양 후반에서의 5'-이노신산이 배양액 중에 축적되어 균체 외부의 삼투압이 증가하더라도 5'-이노신산 생산 세포의 정상적인 생리활성의 저해에 따른 균체성장의 둔화 및 5'-이노신산 생성의 저하를 방지할 수 있는 미생물 균주(KFCC-10814)(대한민국특허 제127853호)로 부터 개발된 것으로서, 삼투압 조절에 중요한 역할을 하는 프롤린(L-proline)에 대한 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주를 선별하고자 하였다.

본 발명의 최소배지(주 1)에서 아제티딘 카르복실산에 대한 균주의 내성 정도를 측정(아제티딘 카르복실산 첨가배지, 주 3)한 결과, 기존 CS1019753(KFCC-10814)은 아제티딘 카르복실산 5mg/ml 까지 내성이 있으며 10mg/ml이상에서는 전혀 성장이 일어나지 않았다.

본 발명의 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스CS1019753(KFCC-10814)를 친주로 하여 X-선, 자외선 또는 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌, 디에틸 설페이트, 에틸아민 등 화학변이 유기제로 처리한 후 아제티딘 카르복실산을 각각 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml함유한 아제티딘 카르복실산 첨가배지(주3)에 적절히 희석한 후 도말하여 콜로니(colony)를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양하고 종배지(주 4)에서 24 시간 배양후, 발효배지(주 5)에서 3-4일씩 배양한 결과 발효배양액에 축적되는 5'-이노신산 생성량이 가장우수한 CIAC101(KFCC-11134)를 선별하였다.

본 발명에서 사용된 배지들은 다음의 성분들을 갖는다:

(주 1) 영양배지: 펩톤 1%, 육즙 1%, 염화나트륨 0.25%, 효모엑기스 1%, 한천 2% pH 7.2.

(주 2) 최소배지: 포도당 2%, 황산나트륨 0.3%, 인산제1칼륨 0.1%, 인산제2칼륨 0.3%, 황산마그네슘 0.3%, 염화칼슘 10mg/l, 황산철 10mg/l, 황산아연 1mg/l, 황산망간 1mg/l, L-시스테인 20mg/l, 칼슘판토테네이트 10mg/l, 티아민염산염 5mg/l, 비오틴 30 ㎍/l, 아데닌 20mg/l, 구아닌 20mg/l, pH 7.3.

(주 3) 아제티딘 카르복실산 첨가배지: Agar를 1.7%함유한 배지(주 2)에 아제티딘 카아복시산을 농도별로 5, 10, 20, 30g/l 첨가한 배지.

(주 4) 종배지: 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%,아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH 7.6.

(주 5) 발효배지: 인산제1칼륨 1.5%, 인산제2칼륨 2.5%, 암모늄크로라이드 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산아연 10mg/l, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30 ㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, 과당, 포도당및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6%되게 첨가하여 사용.

본 발명에서 분리한 신규한 변이주 CIAC101는 2000년 1월 29일자로 국제기탁기관인 사단법인 한국종균협회에 수탁번호 KFCC-11134로 기탁되었으며, 이것의 생화학적 특성은 표 1의 기재와 같다.

표 1

특 성	CS1019753(KFCC-10814)	CIAC101(KFCC-11135)
아데닌	요구성	요구성
구아닌(크산틴)	누출형	누출형
비오틴	요구성	요구성
라이소자임 감수성육억제농도)	8㎍ /ml	8 ㎍/ml
3,4-디하이드로프롤린내성	3500 ㎍/ml	3500 ㎍/ml
아제티딘 카아복실산	5mg/ml	30mg/ml

본 발명에서 사용되는 5'-이노신산생산 배양 방법은 하기와 같다:

즉, 코리네박테리움속에 속하며, 5'-이노신산을 생산할 수 있는 미생물들을 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민등을 함유한 통상의 배지내에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양한다.

탄소원으로서는 글루코오스, 프락토오스, 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기 화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에서 예를 들면, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양에 의해, 바람직하게는 20-40℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH는 배양하는 동안 중성근처에서 유지하는 것이 바람직하며, 배양은 3-4 일간 하였으며 직접발효법에 의해서 축적된 5'-이노신산을 상법에 따라 분석하였다.

<실시예>

실시예 1: 아제티딘 카르복실산 내성주 CIAC101의 분리

본 발명의 변이주는 코리네박테리움 암모니아게네스CS1019753(KFCC-10814)을 친주로 하여 포스페이트 완충액(pH 7.0) 혹은 시트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷-10⁸cells/ml로 현탁시키고 N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아닌을 최종농도가 10-50 ㎍/ml가 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 20-40 분간 처리하여 돌연변이를 유발시킨후, 2회에 걸처서 0.85% 식염수로 세척하고 아제티딘 카르복실산을 각각 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml 함유한 아제티딘 카르복실산 첨가배지(주 3)에 적절히희석후, 도말하여 콜로니(colony)를 얻었다. 각각의 콜로니를 영양배지(주 1)에서 배양하고 종배지(주 4)에서 24시간 배양후, 발효배지(주 5)에서 3-4일씩 배양한 결과 발효 배양액 중에 축적되는 5'-이노신산 생성량이 가장 우수한 균주를 CIAC101(KFCC-11134)로 선별하였으며, 표 2는 기존 균주 및 본 발명 균주의 아제티딘 카르복실산 내성 농도를 표시하였다.

표 2.

특 성	CS1019753(KFCC-10814)	CIAC101(KFCC-11134)
아제티딘 카르복실산 내성 농도	5 mg/ml	30 mg/ml

실시예 2: : 삼각플라스크 발효역가 실험

사용 균주 : CIAC101

종배지 : 포도당 5%, 펩톤 0.5%, 육즙 0.5%, 효모엑기스 1%, 염화나트륨 0.25%, 아데닌100mg/l, 구아닌 100mg/l, pH 7.6.

발효배지 : 인산제1칼륨1.5%, 인산제2칼륨 2.5%, 암모늄크로라이드 1%, 황산마그네슘 1%, 염화칼슘 0.01%, 황산철 10mg/l, 황산망간 10mg/l, 황산아연 10mg/l, 옥수수침 지여액 20%, 비오틴 30 ㎍/l, 티아민염산 5mg/l, 아데닌 100mg/l, 구아닌 100mg/l, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 환원당으로 6%되게 첨가하여 사용.

발효방법 : 상기 종배지 3 ml을 지름 18 mm 시험관에 분주하고 상법에 따라가압살균후 사용균주를 접종하고 30℃ 온도에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 40 ml를 500 ml 진탕용 삼각 플라스크에 분주하고 120℃ 온도에서 10 분간 가압살균하여 종배양액 3ml을 접종 한 다음 3-4일간 배양하였다. 회전수는 분당 200회, 온도30℃, pH7.0으로 조절하였다. 배지내 5'-이노신산 축적량은 18.1 g/l 이었다.

실시예 3: 5-L 발효조에서의 발효역가 실험

사용균주 : CIAC101

종배지 : 실시예1과 동일

발효배지 : 인산2%, 수산화칼륨2%, 황산마그네슘1%, 염화칼슘0.01%, 황산철10mg/ml, 황산망간 10mg/ml, 황산아연 10mg/ml, 옥수수침지여액 20%, 비오틴 30 ㎍/ml, 티아민염산염 5mg/l, 아데닌 200mg/l, 구아닌 100mg/l, 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 총환원당으로 18% 되게 첨가하여 사용.

발효방법 : 상기 종배지 40ml를 500ml 진탕용 삼각플라스크에 분주하고 상법에 따라 가압살균후 사용 균주를 접종하고 30℃에서 24시간 진탕배양하여 종배양액으로 사용하였다. 발효배지 1600ml를 5L-시험 발효조에 넣고 온도120℃에서 15분간 가압살균하여 종배양액 200ml를 접종한 다음 3-4일간 배양하였다. 회전수는 분당 900회, 온도 28-34 ℃, pH 7.0 으로 조절하였다. 또한, 발효시 배양액 중에 환원당이 2%가 되었을때 1차 및 2차, 3차 추가당을 과당, 포도당 및 당밀을 혼합하여 최종 환원당으로 각각 8% 되도록 첨가했다. 배지내 5'-이노신산 축적량은 67.3 g/l 이었다.

본 발명에 따른 미생물은 당사에서 개발한 공지의 균주 코리네박테리움 암모니아게네스(KFCC-10814)로부터 프롤린 유사체인 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2-carboxylic acid) 내성주 CIAC101(KFCC-11134)을 선별한 것으로 직접 발효법으로 고농도, 고수율의 5'-이노신산을 생산하여 보다 더 경제적으로 5'-이노신산을 생산하는 것이 가능하다.

Claims (4)

1. 코리네박테리움 속에 속하고, 30 mg/ml의 아제티딘 카르복실산(L-azetidine-2- carboxylic acid)의 농도하에서 생육이 가능하고, 삼투압 내성을 가지며, 직접 발효법으로 배양시 발효 배양액 중에 5'-이노신산을 고농도, 고수율로 축적시킬수 있음을 특징으로 하는 브레비박테리움 암모네아게네스 CIAC101 (KFCC-11134)인 미생물.
2. 제1항에 있어서, 생육에 아데닌과 비오틴을 요구하며 구아닌 또는 크산틴 누출형 변이주(Leaky Mutant)인 미생물.
3. 제1항에 있어서, 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 의한 최저 생육억제농도가 8 ㎍/ml인 미생물.
4. 제1항에 있어서, 3,4-디하이드로 프롤린의 농도가 3500 ㎍/ml에서 생육 가능한 내성을 가지는 미생물.