KR20170005350A - Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 L-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포벽 가수분해 관련 단백질이 내재적 활성에 비해 불활성되도록 변이된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 제조 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-라이신 생산 방법 {A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same}

본 발명은 L-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법에 관한 것이다.

동물사료나 사람의 의약품, 또는 화장품 산업에 이용되고 있는 L-아미노산, 특히 L-라이신은 주로 코리네박테리움 속 균주나 에세케리키아 속 균주를 이용한 발효에 의해 생산되고 있다. 이에 따라 L-라이신을 생산하기 위한 고효율 생산 균주 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있지만, 아직까지 발효 후반 생산능 감소의 원인이 될 수 있는 세포 용해 제어에 대한 연구는 미흡한 실정이다.

한편, 세포벽 가수분해효소 (cell wall hydrolases)는 박테리아의 세포벽을 분해하는 효소로 알려져 있으며, 펩티도글리칸 (peptidoglycan)을 갖는 모든 미생물에 존재한다 (Rice KC & Bayles KW. Microbiol Mol Biol Rev. 2008. 72:85-109). 이와 같은 세포벽 가수분해효소에 대한 연구가 다양한 박테리아에서 진행되고 있지만, 이의 정확한 활성 조절 기작에 대해서는 알려져 있지 않다.

최근 미생물의 배양 시 발생되는 세포 용해 기작에 대한 모델이 폐렴 쌍구균 (Pneumococcal)에서 제시된 바 있다 (Mellroth P et al. J Biol Chem. 2012. 287:11018-29). 구체적으로, 먼저 세포가 다양한 스트레스에 노출되면, 세포 외부 벽에 존재하는 세포벽 가수분해효소의 활성이 증가하여 세포벽 분해가 시작된다. 이와 같은 세포벽 가수분해효소의 지속적인 작용으로 세포가 용해되면, 세포질에 존재하는 세포벽 가수분해효소가 세포 외부에 노출된다. 일련의 과정이 지속적으로 일어나 세포벽 가수분해효소의 양이 세포 외부의 역치 (threshold)를 넘게 되면 주변 세포들이 용해되는 기작이 보고된 바 있다. 그러나 발효 배양 과정 중 발생되는 세포 용해와 아미노산 생산과의 연관성에 대하여 공지된 바 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 대표적인 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 속 미생물에서 L-라이신 생산능을 증가시킬 수 있는 유효 형질을 지속적으로 탐색하기 위해 예의 노력한 결과, 세포벽 가수분해에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 결손 될 경우 L-라이신 생산능이 증가한다는 사실을 확인하였다. 또한, 추가로 유사한 기능을 하는 단백질을 코딩하는 유전자 결손 시 라이신 생산능 증가에 영향이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 L-라이신을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 세포벽 가수분해 관련 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "세포벽 가수분해 관련 단백질"은 코리네박테리움 속 미생물에서 세포벽을 가수분해시킬 수 있는 관련 단백질을 의미한다. 상기 세포벽 가수분해 관련 단백질은 세포벽-관련 가수분해 효소 (cell wall-associated hydrolase 또는 N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다제 (N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase) 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에 기술된 바와 같이 미생물에서 세포벽을 가수분해시킬 수 있는 관련 단백질 활성을 가진다면, 당해 단백질 및 유전자 서열은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포벽-관련 가수분해 효소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코리네박테리움 속 미생물, 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 NCgl1480 유전자 코딩 단백질, NCgl2107 유전자 코딩 단백질 또는 NCgl2108 유전자 코딩 단백질일 수 있다. 구체적인 예로 세포벽-관련 가수분해 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 활성을 갖는 단백질 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 세포벽-관련 가수분해 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 염기서열이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적인 예로 서열번호 5의 염기서열, 서열번호 6의 염기서열 또는 서열번호 7의 염기서열에 의해 코딩되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다제 (N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)는 코리네박테리움 속 미생물, 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 NCgl2986 유전자 코딩 단백질일 수 있다. 구체적은 예로 상기 N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다제는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 상기 활성을 가지는 단백질이라면 이의 아미노산 서열은 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 상기 N-아세틸뮤라모일-L-알라닌 아미다제 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 염기서열이라면 제한없이 포함될 수 있으며, 구체적인 예로 서열번호 8의 염기서열에 의해 코딩되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 각 단백질은 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

아울러, 본 발명의 상기 각 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 유전자 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 즉, 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등 일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 본래 미생물이 변형되기 전 상태 또는 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성 상태를 의미한다.

상기 "효소의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된"은 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다.

이와 같이 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되는 것은 본래 미생물이 천연의 상태 또는 변형 전의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 상기 감소는 상기 효소를 코딩하는 유전자의 변이 등으로 효소 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 효소의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.

상기 "활성이 없는 경우"는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및/또는 발현이 되더라도 그 활성이 제거된 경우를 의미한다.

이러한 효소 활성의 불활성화되도록 변이시키는 방법은, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 효소의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 효소를 코딩하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 효소로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 효소를 코딩하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜 (ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF (open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE (Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 효소를 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다.

상기에서 "일부"란, 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 구체적으로는 1 내지 100개, 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 "상동 재조합(homologous recombination)"이란, 서로 상동성을 지닌 유전자 사슬의 좌위에서 연결 교환을 통해 일어나는 유전자 재조합을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상동재조합에 의해 상기 단백질들을 불활성화시켰다.

구체적으로, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 핵산 서열에 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 프로모터로 교체하는 등의 방법으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성이 더욱 감소되도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어, "L-라이신 생산능을 갖는 미생물"은 발효에 의해 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물 균주를 의미한다. 그 예로, , 본 발명에 따른 조작에 의해 세포벽 가수분해 관련된 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이시켜, 라이신 생산을 위한 발효 중 발생하는 세포 용해를 제어하여, L-라이신 생산능을 증가시킬 수 있는 균주를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서, 상기 L-라이신 생산능을 갖는 미생물은 본 발명의 세포벽 가수분해 관련 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이될 수 있는 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 그 예로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes ), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum), 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium fermentum) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그 한 예로, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 사용할 수 있다. 상기 변이된 코리네박테리움 속 미생물은 세포벽 가수분해 관련 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이되지 않은 미생물에 비하여 L-라이신 생산능이 증대된 특징을 갖는다.

본 발명은 또 하나의 양태로서 (i) 본 발명의 상기 세포벽 가수분해 관련 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 배양에 따른 배양물 또는 상기 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 제조 방법을 제공한다.

상기 L-라이신 생산능이 증가된 코리네박테리움 속 미생물은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 코리네박테리아 속 미생물을 이용하여 L-라이신을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 글루콘산, 아세트산, 피루브산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌 ("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양 배지의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나, 조건에 따라 변경이 가능하다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속할 수 있다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성될 수 있다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법은, 상기 미생물 또는 배지로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 미생물 또는 배양물로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 알려진 방법, 예컨대 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 미생물은 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들의 내재적 활성에 비해 감소 또는 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물은 발효 후반 생산능의 증가를 이끄는 새로운 균주로, L-라이신 생산능을 갖고 있는 코리네박테리움 속 미생물에 새로운 패러다임으로 적용되어, 높은 수율로 L-라이신을 생산할 수 있는 미생물을 제공할 수 있다. 이에 따라, 제조된 L-라이신을 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 제작

라이신 생산능을 증가시키는 유전자를 획득하기 위한 목적으로 아래의 방법으로 벡터 라이브러리를 제작하였다. 먼저 EZ-Tn5™<R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kit(Epicentre)를 사용하여 얻은 플라스미드를 KCCM11016P (상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어 KCCM11016P로 기탁번호를 부여받음, 대한민국 특허 등록번호 제10-0159812호) 균주를 모균주로 하여 형질전환하고 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 복합 평판배지에 도말하여 약 20,000 개의 콜로니를 확보하였다.

<복합평판배지 (pH 7.0)>

포도당 10 g, 펩톤 10 g, Beef extract 5 g, 효모추출물 5 g, Brain Heart Infusion 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, Sorbitol 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)

실시예 2: 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 스크리닝

상기 실시예 1에서 확보된 약 20,000개의 콜로니를 각각 300 ㎕의 선별 배지에 접종하여 96 deep well plate 에서 32℃, 1000 rpm으로 약 24시간 동안 배양하였다. 배양액에 생산된 L-라이신의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다 (Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388). 배양이 완료된 후 배양 상층액 10 ㎕와 닌하드린 반응용액 190 ㎕를 65℃에서 30분간 반응시킨 후, 파장 570 nm에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하고 대조구인 KCCM11016P와 비교해 높은 흡광도를 보이는 변이 균주들로서 약 60여 종의 콜로니를 선별하였다. 그 외 콜로니들은 대조구로 이용된 KCCM11016P 균주와 유사하거나 감소한 흡광도를 보였다.

상기 선별된 60여 종의 균주들은 상기와 동일한 방법으로 배양 후 닌하이드린 반응을 반복 수행하여 결과적으로 KCCM11016P 균주 대비 L-라이신 생산능이 향상된 상위 10 종의 균주를 선발하였다.

<선별배지 (pH 8.0)>

포도당 10 g, 5.5 g ammonium sulfate, MgSO4·7H2O 1.2 g, KH2PO4 0.8 g, K2HPO4 16.4 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

실시예 3: 선별된 무작위적 돌연변이주들의 L- 라이신 생산능 분석

상기 실시예 2에서 선발된 10 종의 균주들을 대상으로 L-라이신 생산능이 증가된 균주들을 최종 선별하기 위하여 하기의 배지를 이용해 플라스크에서 재현성 테스트를 실시하였다. 상기 10종의 균주들과 대조군을 하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 1 ㎖의 종배양액을 하기의 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 37℃에서 96시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양이 완료된 후 HPLC를 이용하여 배양액 내 L-라이신 농도를 분석하였고, 각 돌연변이주들의 L-라이신 생산 농도를 하기 표 1에 나타내었다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).

선별된 돌연변이주 10종의 L-라이신 생산 농도

	균주	L-라이신(g/l)
		배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM11016P	42.5	42.8	42.7	42.7
1	KCCM11016P/mt-1	48.8	48.9	48.5	48.7
2	KCCM11016P/mt-2	43.0	43.1	43.4	43.2
3	KCCM11016P/mt-3	42.7	43.1	42.9	42.9
4	KCCM11016P/mt-4	44.9	45.1	45.3	45.1
5	KCCM11016P/mt-5	44.3	44.1	44.0	44.1
6	KCCM11016P/mt-6	42.4	42.9	42.8	42.7
7	KCCM11016P/mt-7	43.8	43.2	43.7	43.6
8	KCCM11016P/mt-8	47.2	46.9	47.1	47.1
9	KCCM11016P/mt-9	44.1	44.4	44.2	44.2
10	KCCM11016P/mt-10	43.1	43.7	43.2	43.3

상기 선발된 10 종의 변이주들 중 L-라이신 생산능이 의미있게 향상된 균주로서 KCCM11016P/mt-1 및 KCCM11016P/mt-8 이 최종 선별되었다.

실시예 4: 최종 선별주들에서의 L- 라이신 생산능 관련 유전자 확인 및 추가 후보 유전자 선별

본 실시예에서는 상기 실시예 3에서 최종 선별된 균주를 대상으로 트랜스포존의 무작위적인 삽입에 의해 결손 된 유전자를 동정하고자 하였다. KCCM11016P/mt-1과 KCCM11016P/mt-8의 Genomic DNA를 추출하여 digest한 후 ligation하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신 (25 mg/l)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질 전환된 콜로니 20종을 각각 선별한 후 미지의 유전자 일부가 포함된 플라스미드를 획득하였고, EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kit에 있는 서열번호 9 및 서열번호 10의 서열을 사용하여 염기서열을 분석한 결과 (표 2), 돌연변이주에서 각각 NCgl2108, NCgl2986 유전자가 불활성화되어 있음을 알게 되었다.

	서열	서열번호
Kit 프라이머	ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC	9
Kit 프라이머	CTACCCTGTGGAACACCTACATCT	10

상기 실시예 3에서 선별된 변이주에 결손된 것으로 동정된 NCgl2108, NCgl2986 유전자는 코리네박테리움에 내재적으로 존재하는 유전자로, 세포벽 가수분해에 관련된 단백질로 동정되었다.

이와 같은, 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이주들에서 2 종의 세포벽 가수분해에 관련된 단백질이 선별된 결과를 바탕으로, 세포벽 가수분해에 관련된 유전자의 결손은 L-라이신 생산능 증가에 효과적일 것이라 판단하였다. 따라서 NCgl2108 과 NCgl2986 이외의 세포벽 가수분해에 관련된 유전자를 미국국립생물정보센터(NCBI)에서 탐색하였다.

탐색 결과, 코리네박테리움에 내재적으로 존재하는 NCgl1480 과 NCgl2107 유전자가 추가적으로 세포벽 가수분해에 관련된 단백질로서 선별되었다. 이에 따라, NCgl1480 과 NCgl2107 유전자 결손 시에도, L-라이신 생산능에 영향이 있는지 확인하기 위하여, 상기 두 유전자를 추가 결손 후보 유전자로 선별하였다.

실시예 5: NCgl1480 , NCgl2107 , NCgl2108 , NCgl2986 유전자의 불활성화를 위한 재조합 플라스미드 제작

본 실시예에서는 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986 유전자의 불활성화와 L-라이신 생산의 영향을 확인하기 위해서, 상기 실시예 4에서 선별된 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986 유전자를 코리네박테리움 L-라이신 생산균주 염색체 상에서 결손시키기 위한 재조합 플라스미드를 제작하였다.

미국 국립보건원의 유전자은행(NIH Genbank)에 보고된 염기서열에 근거하여 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, 및 NCgl2986의 서열번호 1, 2, 3, 및 4의 아미노산 및 이를 각각 코딩하는 서열번호 5, 6, 7 및 8의 뉴클레오티드의 서열을 확보하였다. 각 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 내부적으로 소실된 유전자 단편을 만들기 위해, 상기 서열번호 5, 6, 7, 및 8를 바탕으로, 각각 서열번호 11 내지 14, 15 내지 18, 19 내지 22, 및 23 내지 26의 프라이머를 제작하였다. 이의 서열을 하기 표 3에 표시하였다.

프라이머	서열	서열번호
NCgl1480 프라이머	CCGGGGATCCTCTAGAACCTTGAAACTTCCACTC	11
NCgl1480 프라이머	CTCCTGACGAACTATTTCAAATCCCCTATCAACCTC	12
NCgl1480 프라이머	CACCGAGGTAAATTGCCATGCAAGCGCAATCAACGC	13
NCgl1480 프라이머	GCAGGTCGACTCTAGAAACCACACATTATCGATC	14
NCgl2107 프라이머	CCGGGGATCCTCTAGAGCACAGGGCACCCCTGTTG	15
NCgl2107 프라이머	CTCCTGACGAACTATTTCAAATCCCCTATCAACCTC	16
NCgl2107 프라이머	GAGGTTGATAGGGGATTTGAAATAGTTCGTCAGGAG	17
NCgl2107 프라이머	GCAGGTCGACTCTAGAAACCACACATTATCGATC	18
NCgl2108 프라이머	CCGGGGATCCTCTAGAGAACCCTTAGTAGTTGGG	19
NCgl2108 프라이머	GTAATCCAAGGAGTGCTCACCCACTGATGAAACTCC	20
NCgl2108 프라이머	GGAGTTTCATCAGTGGGTGAGCACTCCTTGGATTAC	21
NCgl2108 프라이머	GCAGGTCGACTCTAGACGAGCCTCAATATCAATC	22
NCgl2986 프라이머	CCGGGGATCCTCTAGATTAGGAGAAACCATGAGC	23
NCgl2986 프라이머	ATCAGTCAGAACTGCCAGGACTGCAGTAAGAATACC	24
NCgl2986 프라이머	GGTATTCTTACTGCAGTCCTGGCAGTTCTGACTGAT	25
NCgl2986 프라이머	GCAGGTCGACTCTAGAGTTGAGGCGTTTGGATAC	26

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 게놈 DNA를 주형으로 하여 서열번호 11 및 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18, 서열번호 19 및 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22, 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26 을 프라이머로 이용하여 PCR[Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]을 수행하였다. PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 1분을 30회 반복하였다.

그 결과, 319bp와 410bp 의 NCgl1480 유전자 앞부분과 뒤부분이 포함된 두 쌍의 DNA 단편 (NCgl1480-A 및 NCgl1480-B), 324bp와 300bp의 NCgl2107 유전자 앞부분과 뒤부분이 포함된 두 쌍의 DNA 단편 (NCgl2107-A 및 NCgl2107-B), 381bp와 377bp의 NCgl2108 유전자 앞부분과 뒤부분이 포함된 두 쌍의 DNA 단편 (NCgl2108-A 및 NCgl2108-B), 그리고 356bp와 374bp의 NCgl2986 유전자 앞부분과 뒤부분이 포함된 두 쌍의 DNA 단편 (NCgl2986-A 및 NCgl2986-B)을 얻었다. PCR로 증폭된 상기 DNA 단편은 Infusion 클로닝 키트 (Invitrogen)를 사용하여 pDZ플라스미드(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 접합한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 25 mg/L의 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질 전환된 콜로니를 선별한 후, 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 상기 플라스미드를 각각 pDZ-ΔNCgl1480, pDZ-ΔNCgl2107, pDZ-ΔNCgl2108, pDZ-ΔNCgl2986 라 명명하였다. pDZ-ΔNCgl1480는 NCgl1480의 유전자 1672bp가, pDZ-ΔNCgl2107은 NCgl2107의 유전자 1026bp가, pDZ-ΔNCgl2108은 NCgl2108의 유전자 576bp가, pDZ-ΔNCgl2986는 NCgl2986의 유전자 1092bp가 소실되었다.

실시예 6: 라이신 생산 균주 KCCM11016P 유래 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 유전자 불활성화 균주 제작 및 평가

대표적인 L-라이신 생산 코리네박테리움 속 균주인 KCCM11016P 균주를 기반으로 상기에서 선별한 세포벽 가수분해 관련 단백질 유전자 불활성화 균주를 제작하고 이의 라이신 생산능을 평가하고자 하였다.

상기 실시예 5에서 제작한 4 종의 재조합 플라스미드(pDZ-ΔNCgl1480, pDZ-ΔNCgl2107, pDZ-ΔNCgl2108, pDZ-ΔNCgl2986)들을 전기펄스법을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 각각 형질전환시키고, 상동 재조합에 의해 염색체 상에서 목적 유전자가 불활성화된 균주들을 PCR 방법으로 제조하였다. 제조된 불활성화 균주들을 각각 KCCM11016P:: ΔNCgl1480, KCCM11016P:: ΔNCgl2107, KCCM11016P:: ΔNCgl2108, KCCM11016P:: ΔNCgl2986 라 명명하였다.

상기 4 종의 균주들과 대조군을 하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 1 ㎖의 종배양액을 하기의 생산배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 접종하고, 37℃에서 96시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, (NH4)2SO4 10 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍(증류수 1리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (cornsteep solid) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준)

배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도를 하기 표 4에 나타내었다. 표 4의 결과는 3회 반복 실험 결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.

	라이신 g/L
	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM11016P	42.7	42.6	43.0	42.8
KCCM11016P-ΔNCgl1480	44.3	44.1	44.0	44.1
KCCM11016P-ΔNCgl2107	45.1	44.9	45.2	45.1
KCCM11016P-ΔNCgl2108	48.1	48.3	48.0	48.1
KCCM11016P-ΔNCgl2986	49.3	49.1	49.2	49.2

그 결과, 상기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986 유전자가 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 각각 3.2%, 5.4%, 13%, 15% 증가하였다.

이와 같은 결과들은, 코리네박테리움 속 미생물에서 세포 융해를 일으킬 수 있는 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들을 불활성화시킴으로써 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 시사하는 것이다.

이에, 추가적인 다양한 코리네박테리움 속 미생물에서 상기 세포벽 가수분해 관련 단백질들을 불활성화시킬 경우에도 유사한 효과가 있는지를 하기에서 실험하였다.

실시예 7: L- 라이신 생산균주 KCCM10770P 유래 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 불활성화 균주들의 제작 및 평가

라이신 생합성 경로가 강화된 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P (한국 등록특허 제10-0924065호)에서 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 불활성화 효과가 상기 실시예 6의 실험결과와 유사한지 비교하기 위하여, 4종의 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들이 불활성화된 균주들을 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 제조하여 KCCM10770P::ΔNCgl1480, KCM10770P::ΔNCgl2107, KCCM10770P::ΔNCgl2108, KCM10770P::ΔNCgl2986 명명하였고, L-라이신 생산능을 비교하였다.

상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조군과 함께 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 5에 나타내었다. 표 5의 결과는 3회 반복 실험 결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.

	라이신 g/L
	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM10770P	46.0	46.3	46.1	46.1
KCCM10770P-ΔNCgl1480	47.3	47.1	47.0	47.1
KCCM10770P-ΔNCgl2107	48.0	48.2	48.1	48.1
KCCM10770P-ΔNCgl2108	51.7	51.9	51.6	51.7
KCCM10770P-ΔNCgl2986	53.1	52.9	52.1	52.7

그 결과, 상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM10770P로부터 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986 유전자가 각각 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 각각 2.2%, 4.3%, 12.1%, 14.2% 증가하였다.

따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P (대한민국 등록특허 제10-0924065호)에서도 상기 실시예 6과 유사하게 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들을 불활성화 시킴으로써 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 8: L- 라이신 생산균주 KCCM11347P 유래 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 불활성화 균주들의 제작 및 평가

인공변이법에 의하여 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 L-라이신 생산균주 KCCM11347P (상기 미생물은 KFCC10750으로 공개되었다가 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11347P를 부여받았음. 한국 등록특허 제10-0073610호)에서도 세포벽 가수분해에 관련된 단백질의 불활성화의 효과를 확인하기 위하여, 4 종의 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들이 불활성화된 균주들을 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 제조하여 KCCM11347P::ΔNCgl1480, KCCM11347P:ΔNCgl2107, KCCM11347P::ΔNCgl2108, KCCM11347P:ΔNCgl2986라 명명하였고, L-라이신 생산능을 비교하였다.

상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조군과 함께 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 6에 나타내었다. 표 6의 결과는 3회 반복 실험 결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.

	라이신 g/L
	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM11347P	38.2	38.6	38.3	38.4
KCCM11347P-ΔNCgl1480	39.0	39.4	39.1	39.2
KCCM11347P-ΔNCgl2107	39.1	39.5	39.3	39.3
KCCM11347P-ΔNCgl2108	39.8	40.2	39.9	42.9
KCCM11347P-ΔNCgl2986	39.9	40.3	40.1	43.9

그 결과, 상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11347P로부터 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986 유전자가 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 각각 2%, 2.4%, 11.7%, 14.4% 증가하였다.

따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11347P (대한민국 등록특허 제10-0073610호)에서도 상기 실시예 6 및 7과 유사하게 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들을 불활성화 시킴으로써 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 9: L- 라이신 생산균주 CJ3P 유래 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 불활성화 균주들의 제작 및 평가

코리네박테리움 글루타미쿰 야생주에 3종의 변이[pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P (Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에서도 상기 실시예 6, 7, 8과 마찬가지로 세포벽 가수분해에 관련된 단백질의 불활성화의 효과를 알아보기 위하여 4 종의 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들이 불활성화된 균주들을 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 제조하여 CJ3P::ΔNCgl1480, CJ3P::ΔNCgl2107, CJ3P::ΔNCgl2108, CJ3P::ΔNCgl2986 라 명명하였고, L-라이신 생산능을 비교하였다.

상기 균주들의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 각 대조군과 함께 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 7에 나타내었다. 표 7의 결과는 3회 반복 실험 결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.

	라이신 g/L
	배치 1	배치 2	배치 3	평균
CJ3P	7.8	8.0	7.9	7.9
CJ3P-ΔNCgl1480	8.3	8.0	8.1	8.1
CJ3P-ΔNCgl2107	8.0	7.9	8.1	8.0
CJ3P-ΔNCgl2108	8.8	8.9	9.0	8.9
CJ3P-ΔNCgl2986	9.1	9.2	9.2	9.2

그 결과, 상기 표 8에서 나타낸 바와 같이, 모균주 CJ3P로부터 NCgl1480, NCgl2107, NCgl2108, NCgl2986 유전자가 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 각각 3%, 1.3%, 12.7% 16% 증가하였다.

따라서, 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P에서도 상기 실시예 6, 7, 8의 실험 결과와 유사하게 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들을 불활성화시킴으로써 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 10: L- 라이신 생산균주 KCCM11016P 유래 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 동시 불활성화 균주의 제작 및 평가

상기 실시예들로부터 L-라이신 생산 균주인 코리네박테리움 속에서 세포벽 가수분해 관련 단백질을 각각 불활성화시킬 경우 L-라이신 생산능이 증가됨을 확인한 후, 관련 단백질들을 2종 이상 동시 불활성화시킬 경우에도 L-라이신 생산능이 증가되는지를 확인하고자 하였다.

이에, L-라이신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에서 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들의 동시 불활성화에 따른 효과를 확인하기 위하여 다음의 실험을 진행하였다. 단독 결손 시 L-라이신 생산능 향상에 효과가 높은 2 종의 세포벽 가수분해에 관련된 단백질 유전자 (NCgl2108과 NCgl2986)들이 동시에 불활성화된 균주를 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 제조하여 얻은 균주를 KCCM11016P::ΔNCgl2108/ΔNCgl2986라 명명하였고, L-라이신 생산능을 비교하였다.

상기 균주의 라이신 생산능을 비교하기 위하여 대조군과 함께 실시예 6과 동일한 방법으로 배양하고, 배양을 종료한 후, HPLC를 이용하여 분석한 L-라이신 농도는 하기 표 8에 나타내었다. 표 8의 결과는 3회 반복 실험 결과값이며, 평균치로 생산능을 평가하였다.

	라이신 g/L
	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM11016P	43.4	43.1	43.2	43.2
KCCM11016P-ΔNCgl2108/ ΔNCgl2986	52.6	52.4	52.7	52.6

그 결과, 상기 표 8에서 나타낸 바와 같이, 모균주 KCCM11016P로부터 NCgl2108 및 NCgl2986 유전자가 동시 불활성화된 균주에서 라이신 생산능이 약 21.6% 증가하였다.

이와 같은 결과는 세포벽 가수분해에 관련된 단백질을 1종 뿐 아니라, 2종 이상 동시에 코리네박테리움 속 미생물에서 불활성화시키는 경우에도 L-라이신 생산능을 향상시킬 수 있음을 시사하는 것이다.

이에, 상기 균주, KCCM11016P-ΔNCgl2986를 CA01-2292로 명명하고, CA01-2292는 2014년 12월 5일자로 부다페스트 조약 하에 국제기탁 기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM11627P로 기탁번호를 부여받았다.

상기의 결과들로부터, L-라이신 생산균주에서 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들의 내재적 활성에 비해 불활성화는 발효 중 발생하는 세포 용해를 제어함으로써 L-라이신 생산능을 증가시키는데 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 이와 같은 세포벽 가수분해에 관련된 단백질들은 1종 뿐 아니라 2종 이상의 동시 활성 불활성화 역시 L-라이신 생산능을 증가시킬 수 있음을 확인하여, 신규한 L-라이신 생산 균주를 제공할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외) KCCM11627P 20141205

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism having enhanced L-lysine productivity and a method of producing L-lysine using the same <130> KPA141341-KR <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 604 <212> PRT <213> Corynebacterium <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(604) <223> NCgl1480 <400> 1 Met Thr Arg Ala Leu Ile Ala Leu Ala Val Ser Gly Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ser Met Thr Pro Ala Val Ala Gln Pro Gln Asn Pro Asp Asp Ala Ala 20 25 30 Ile Ala Gln Ala Glu Glu Asn Val Ser Ala Gly Asp Gly Glu Val Ala 35 40 45 Arg Leu Ala Gly Ser Leu Ser Ser Thr Asp Ala Glu Ile Asn Arg Val 50 55 60 Glu Leu Glu Met Gly Ala Leu Arg Glu Glu Val Asn Lys Ser Leu Val 65 70 75 80 Asp Leu His Asp Ala Gln Ala Ile Ala Glu Gln Ala Arg Gln Asp Ala 85 90 95 Leu Ala Ala Lys Lys Asp Leu Asp Asp Ser Gln Ala Gln Ile Glu Ala 100 105 110 Ala Gln Glu Arg Leu Asp Glu Ile Ser Arg Ala Ala Tyr Arg Gln Asn 115 120 125 Gly Thr Ser Lys Gly Leu Ser Gly Ile Ser Gly Asn Gly Asn Ser Glu 130 135 140 Asp Ala Leu Asp Arg Gln Thr Tyr Leu Arg Thr Ser Ala Glu Lys Gln 145 150 155 160 Gln Ala Ala Val Glu Glu Leu Asp Arg Leu Arg Thr Glu Asn Ala Asn 165 170 175 Lys Glu Ser Val Leu Arg Gln Ala Arg Ile Val Ala Glu Gln Arg Glu 180 185 190 Ala Glu Ala Val Glu Lys Gln Val Gln Thr Glu Ala Ala Ile Ala Ala 195 200 205 Asn Ser Glu Gln Leu Asn Val Leu Thr Asn Asn Arg Ser Thr Leu Val 210 215 220 Ala Gln Arg Asp Gly Ala Glu Arg Asn Leu Ala Ile Ala Arg Ala Gln 225 230 235 240 Ala Asp Asn Leu Gln Gly Gln Arg Ala Glu Tyr Glu Glu Phe Gln Gln 245 250 255 Ala Glu Gln Ala Arg Ile Gln Ala Glu Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala 260 265 270 Glu Glu Lys Arg Arg Ala Asp Glu Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Glu 275 280 285 Ala Gln Glu Ala Ala Gln Gln Ala Gln Ala Ala Glu Glu Ala Gln Ala 290 295 300 Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Ala Ala Glu 305 310 315 320 Thr Gln Ala Ala Gln Ala Ala Gln Ala Gln Ala Glu Ala Asn Asp Arg 325 330 335 Ala Ala Ala Gln Gln Arg Ala Ala Glu Ala Gln Ala Ala Ala Glu Gln 340 345 350 Ala Gln Arg Glu Ala Asp Ala Gln Ala Ala Asn Asp Ala Gln Ala Gln 355 360 365 Ala Leu Arg Glu Gln Ala Leu Thr Ala Ala Ser Ile Ala Ala Ala Ala 370 375 380 Leu Ile Ala Ala Ser Gln Ser Ser His Ala Thr Thr Gln Asn Pro Tyr 385 390 395 400 Pro Thr Asp Glu Asp Ala Asp Pro Thr Asp Ile Ala Asp Ile Gln Gly 405 410 415 Pro Thr Gln Pro Gly Thr Gly Glu Ser Gly Asp Ser Gln Ser Asn Ser 420 425 430 Ser Asp Asn Asp Ser Thr Gly Asn Asp Ser Thr Gly Ser Asp Ser Ser 435 440 445 Asp Ser Asp Ser Ser Gly Asn Asp Ser Ser Glu Val Ile Ser Gly Asp 450 455 460 Arg Ser Ala Gln Ile Glu Thr Val Ile Ala Arg Ala Met Ser Gln Leu 465 470 475 480 Gly Val Gln Tyr Ala Trp Gly Gly Gly Asn Ala Asn Gly Pro Thr Leu 485 490 495 Gly Ile Arg Asp Gly Gly Val Ala Asp Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Lys 500 505 510 Val Gly Phe Asp Cys Ser Gly Leu Thr Leu Tyr Ala Phe Ala Gly Val 515 520 525 Gly Ile Ser Leu Pro His Tyr Thr Gly Tyr Gln Tyr Gln His Gly Thr 530 535 540 Lys Val Ser Pro Ser Glu Met Gln Arg Gly Asp Leu Ile Phe Tyr Gly 545 550 555 560 Pro Gly Ala Ser Gln His Val Ala Ile Tyr Leu Gly Asp Gly Gln Met 565 570 575 Ile Glu Ala Pro Asn Ser Gly Ser Val Val Lys Ile Ser Pro Val Arg 580 585 590 Trp Ser Gly Met Thr Glu Ser Val Val Arg Leu Ile 595 600 <210> 2 <211> 349 <212> PRT <213> Corynebacterium <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(349) <223> NCgl2107 <400> 2 Met Asn Glu Val Asp Arg Gly Phe Leu Lys Met Phe Gly Arg Arg Trp 1 5 10 15 Val Ser Val Val Ala Ser Cys Val Ile Ala Ser Thr Leu Ile Leu Val 20 25 30 Pro Ser His Ser Gly Ala Glu Glu Val Asp Gln Leu Ile Ala Asp Ile 35 40 45 Glu His Val Ser Gln Glu Thr Ser Ala Gln Asn Glu Glu Val Lys Gln 50 55 60 Leu Glu Ile Asp Ile Glu Ala Arg Glu Val Thr Ile Lys Glu Val Gln 65 70 75 80 Glu Gln Ser Val Ser Tyr Arg Glu Ala Ala Asp Gln Ala Ser Glu Asn 85 90 95 Val Glu Ala Tyr Arg Ser Glu Ile Asn Arg Ile Ala Gln Ala Lys Tyr 100 105 110 Arg Gly Thr Val Thr Asp Pro Leu Ser Ile Ala Val Ser Ala Glu Asp 115 120 125 Pro Gln Asn Val Ile Asp Arg Met Ser Tyr Leu Ser Thr Leu Thr Lys 130 135 140 Ser Thr Ser Asp Val Val Glu Ser Leu Asn Ala Glu Thr Glu Lys Ser 145 150 155 160 Ala Glu Ala Val Tyr Gln Ala Asn Arg Thr Lys Ala Glu Ala Glu Phe 165 170 175 Gln Leu Gly Gln Leu Lys Val Arg Gln Ala Glu Leu Glu Ser Glu Lys 180 185 190 Glu Ala Leu Asp Gly Arg Lys Ser Glu Ile Arg Asp Arg Val Asp Ala 195 200 205 Leu Thr Pro Gln Glu Arg Glu Met Trp Val Ala Lys Asn Gly Pro Leu 210 215 220 Asp Ile Asp Leu Thr Asp Leu Leu Gly Leu Ser Ala Ala Thr Ser Gly 225 230 235 240 Ala Val Asp Ala Ala Leu Ser Lys Leu Gly Ser Pro Tyr Gly Trp Gly 245 250 255 Gly Ile Gly Pro Asn Glu Phe Asp Cys Ser Gly Leu Ile Tyr Trp Ala 260 265 270 Tyr Gln Gln Met Gly Lys Thr Leu Pro Arg Thr Ser Gln Ala Gln Met 275 280 285 Ala Gly Gly Thr Pro Val Ser Arg Asp Glu Leu Gln Pro Gly Asp Val 290 295 300 Ile Gly Tyr Tyr Pro Gly Ala Thr His Val Gly Leu Tyr Ile Gly Asp 305 310 315 320 Gly Lys Ile Val His Ala Ser Asp Tyr Gly Ile Pro Val Gln Val Val 325 330 335 Ser Val Asp Ser Ala Pro Phe Tyr Gly Ala Arg Arg Tyr 340 345 <210> 3 <211> 209 <212> PRT <213> Corynebacterium <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(209) <223> NCgl2108 <400> 3 Met Gly Lys His Arg Arg Asn Asn Ser Asn Ala Thr Arg Lys Ala Val 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Val Ala Leu Gly Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Pro 20 25 30 Ala Gln Ala Ala Glu Val Val Val Pro Gly Thr Gly Ile Ser Val Asp 35 40 45 Ile Ala Gly Ile Glu Thr Thr Pro Gly Leu Asn Asn Val Pro Gly Ile 50 55 60 Asp Gln Trp Ile Pro Ser Leu Ser Ser Gln Ala Ala Pro Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ala Ala Val Ile Asp Ala Pro Ala Ala Gln Ala Ala Pro Ala Ala Ser 85 90 95 Thr Gly Gln Ala Ile Val Asp Ala Ala Arg Thr Lys Ile Gly Ser Pro 100 105 110 Tyr Gly Trp Gly Ala Thr Gly Pro Asn Ala Phe Asp Cys Ser Gly Leu 115 120 125 Thr Ser Trp Ala Tyr Ser Gln Val Gly Lys Ser Ile Pro Arg Thr Ser 130 135 140 Gln Ala Gln Ala Ala Gln Gly Thr Pro Val Ala Tyr Ser Asp Leu Gln 145 150 155 160 Ala Gly Asp Ile Val Ala Phe Tyr Ser Gly Ala Thr His Val Gly Ile 165 170 175 Tyr Ser Gly His Gly Thr Val Ile His Ala Leu Asn Ser Ser Thr Pro 180 185 190 Leu Ser Glu His Ser Leu Asp Tyr Met Pro Phe His Ser Ala Val Arg 195 200 205 Phe <210> 4 <211> 414 <212> PRT <213> Corynebacterium <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(414) <223> NCgl2986 <400> 4 Met Asp Glu Leu Tyr Pro Leu Ile Ile Leu Asn Met Asn Asp Gly Arg 1 5 10 15 Ser Arg Val Ser Lys Val Leu Arg Val Gly Asp Arg Ser Pro Arg Val 20 25 30 Ala Glu Val Arg Thr Thr Leu Ala Arg Leu Gly Val Ile Glu Gly Tyr 35 40 45 Ser Arg Glu Met Ser Ala Lys Thr Glu Ser Gln Lys Phe His Glu Glu 50 55 60 Glu Thr Leu Phe Asp Glu Glu Leu Ser Leu Ser Ile Lys Ser Phe Gln 65 70 75 80 Gln Ala Arg Gly Val Val Pro Ser Gly Leu Ile Asp Asp Pro Thr Leu 85 90 95 Arg Ala Ile Arg Glu Ala Ser Tyr Thr Leu Gly Thr Arg Val Leu Ala 100 105 110 Tyr Gln Pro Gly Asn Gln Leu Val Gly Asp Asp Val Val Glu Ile Gln 115 120 125 Ser His Leu Gln Glu Leu Gly Phe Tyr Ala Asp Arg Val Asp Gly His 130 135 140 Phe Gly Glu Leu Thr His Lys Ala Val Met Asn Tyr Gln Leu Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Met Gln Val Asp Gly Ile Cys Gly Pro Asp Thr Ile Arg Ala Leu 165 170 175 Ser Arg Leu Gly Leu Arg Ile Lys Gly Gly Ser Ala Gln Ala Ile Arg 180 185 190 Glu Arg Glu Arg Met Arg Asn Ala Gly Pro Arg Leu Ala Gly Lys Arg 195 200 205 Val Val Ile Asp Pro Ala Leu Gly Gly Ser Asn Lys Gly Gln Ile Val 210 215 220 Lys Gly Pro Tyr Gly Glu Ile Ser Glu Glu Glu Ile Leu Trp Asp Leu 225 230 235 240 Ala Thr Arg Leu Glu Gly Arg Met Ile Ala Thr Gly Met Glu Thr Ile 245 250 255 Leu Ser Arg Pro His Met Asp Asp Pro Ser Ser Arg Asp Arg Ala Ser 260 265 270 Ile Ala Asn Ala Phe Gly Ala Asp Leu Met Leu Ser Leu His Cys Asp 275 280 285 Ser Tyr Pro Asn Glu Lys Ala Asn Gly Val Ala Ser Phe Tyr Phe Gly 290 295 300 Ser Glu Asn Gly Thr Asn Ser Leu Thr Gly Glu Thr Leu Ser Ala Tyr 305 310 315 320 Ile Gln Lys Glu Ile Val Ala Arg Thr Pro Leu Asn Asn Cys Gly Ser 325 330 335 His Ala Arg Thr Trp Asp Leu Leu Arg Leu Thr Arg Met Pro Met Val 340 345 350 Glu Val Val Thr Gly Tyr Leu Thr Asn Pro Asp Asp Leu Ala Val Leu 355 360 365 Thr Asp Pro Gln Met Arg Asp His Ile Ala Glu Ala Ile Val Val Ala 370 375 380 Val Lys Arg Leu Tyr Leu Leu Asp Glu Glu Ala Gln Pro Lys Thr Gly 385 390 395 400 Thr Phe Lys Phe Ser Glu Leu Leu Gln Ser Glu Gln Ala Gly 405 410 <210> 5 <211> 1815 <212> DNA <213> Corynebacterium <220> <221> gene <222> (1)..(1815) <223> NCgl1480 <400> 5 ttgaccaggg cgttgattgc gcttgcagta agcggagctt tgcttagttc catgactccg 60 gcggtggcgc agccacagaa tccggatgac gcagccattg cacaggcaga ggaaaatgtt 120 tcggcgggcg atggggaagt cgcccgcctg gcaggatctt tgtccagcac tgacgcggaa 180 attaaccgcg tcgagctgga aatgggtgct ctgcgtgaag aagtgaacaa gtccctcgtg 240 gatttgcatg atgcgcaggc aatcgccgag caggcccgcc aagatgcact tgcagccaag 300 aaggatctcg atgattctca agcgcagatc gaagcagccc aagagcgcct tgatgagatt 360 tcacgtgcag cgtatcgcca aaacggaacc tccaaggggc tttcaggcat ctcgggcaat 420 ggaaattctg aagatgcgct agatcgtcag acttacctgc gaaccagtgc ggaaaagcag 480 caggcagctg ttgaagagct tgatcgcctc cgtacggaaa acgccaacaa ggaatcggtg 540 ttgcgccagg cccgcatcgt tgctgagcag cgtgaggcgg aagccgtcga aaagcaagtc 600 cagaccgagg ctgcaattgc cgcaaacagc gagcagctca atgtcttgac taacaatcgc 660 agtaccttgg ttgcccagcg tgatggggct gagcgcaact tggccatcgc tcgtgcgcag 720 gcggataatc tgcaaggtca gcgtgctgag tacgaggaat tccagcaggc agagcaggct 780 cgcatccagg cggaagcgga agctcaggct gctgcggagg agaagcgtcg tgccgatgag 840 gctgctgcac aggcagccgc tgaagctcaa gaagctgccc agcaagctca ggcggcggag 900 gaagcccaag ccgcgcaagc agctgagaca gcacaagccc aagccgcgca agctgcggaa 960 acccaagctg cacaagccgc gcaagctcag gcagaagcga atgatcgtgc cgccgcgcaa 1020 cagcgtgctg cagaggctca agcagcagcg gaacaggcgc aacgtgaggc tgacgctcag 1080 gcggccaacg atgcccaagc tcaggcactg cgtgaacagg cgctcaccgc agcctccatc 1140 gctgcggctg ctctaattgc ggcgagccag tccagccatg ccactactca aaatccttac 1200 ccaactgatg aagacgcgga tccgaccgat attgcggaca tccaaggccc aacgcagcca 1260 ggtacgggtg agtctggaga ttcccagagc aactccagcg acaacgattc cacaggcaac 1320 gattccacag gctctgactc ttcagattca gattcctccg gcaacgattc ttcagaggtt 1380 atttccggcg atcgttccgc tcagattgag actgtgattg cgcgcgccat gagccagttg 1440 ggtgtgcagt acgcatgggg tggcggtaac gctaatggcc caactctggg tatccgtgac 1500 ggtggcgtgg cggactctta cggcgattac aacaaggttg gcttcgactg ctctggactg 1560 accttgtatg cgtttgcggg tgtgggaatt tcacttcctc actacacggg ctaccagtac 1620 cagcacggca ccaaggtgtc gccttctgag atgcaacgtg gcgatctgat cttctatggt 1680 ccgggagcgt ctcagcacgt ggcaatttac ctcggtgatg gtcagatgat tgaggctccg 1740 aattcgggtt ctgtcgtgaa gatttctcct gttcgctgga gcggaatgac cgagagcgtg 1800 gtacgcctca tttag 1815 <210> 6 <211> 1050 <212> DNA <213> Corynebacterium <220> <221> gene <222> (1)..(1050) <223> NCgl2107 <400> 6 ttgaatgagg ttgatagggg atttttgaag atgtttggtc gccgttgggt gagcgttgtg 60 gcgtcatgtg ttatcgcaag cacgctgatt ctggtgcctt cgcattccgg tgcggaggaa 120 gtcgatcaac tgattgctga tatcgagcat gtctctcagg aaacgtctgc ccagaatgag 180 gaagtcaaac agcttgagat tgatattgag gctcgtgagg tcacgatcaa ggaagttcag 240 gagcagtcgg taagctaccg tgaggcggct gatcaagcat cggagaatgt cgaagcttat 300 cgttcggaga tcaatcggat cgctcaggcg aagtatcgtg gcacagtcac ggatcctttg 360 agcattgcgg tgtctgcaga agatccacaa aacgtgattg atcggatgag ctacctttca 420 acgttgacta agtccactag tgatgtggtt gaatccctca acgcggagac tgagaagtcc 480 gcagaagctg tgtatcaagc aaaccgtact aaggcggaag cggagttcca gttggggcag 540 ctgaaggtac gccaggcgga gcttgaatct gaaaaggaag cattggatgg tcgaaaatcg 600 gagatccgag accgggtgga tgccctgacg ccacaggagc gggaaatgtg ggttgctaag 660 aatggtccat tggacattga tctgactgat ttgcttggtc tttccgctgc gacttcgggt 720 gcggtggatg ctgccttgtc taagttggga agcccttatg gttggggtgg cattggccca 780 aatgagtttg attgctcagg tttgatctat tgggcgtatc agcagatggg taagactttg 840 ccacgtacgt ctcaagctca gatggctggc ggaacgccgg tgagcagaga tgagctgcag 900 cctggcgatg tcattggata ttacccaggt gctactcacg tgggactgta tattggggac 960 ggaaagattg tgcacgcctc agactacgga atccctgtgc aggtggtatc tgttgattca 1020 gcaccgtttt atggtgcgcg tcgctactaa 1050 <210> 7 <211> 630 <212> DNA <213> Corynebacterium <220> <221> gene <222> (1)..(630) <223> NCgl2108 <400> 7 gtgggtaagc accgtcgcaa caattcaaac gcaactcgca aggctgtagc agcatctgca 60 gttgcgcttg gagcaaccgc agctatcgcc tccccagcac aggcagctga ggttgttgtt 120 cctggcaccg gaatcagcgt tgacatcgct ggcatcgaga ccactccagg tcttaacaac 180 gttccaggaa tcgatcagtg gatcccttcc cttagcagcc aggcagctcc tactgcttac 240 gcagccgtca ttgatgcacc tgcagcacag gctgcacctg cagcaagcac cggtcaggca 300 atcgttgatg cagcgcgcac caagattggt tccccatacg gttggggtgc taccggtcct 360 aacgctttcg actgctccgg ccttacctca tgggcataca gccaggttgg caagtccatc 420 ccacgtacct cccaggctca ggctgcacag ggcacccctg ttgcttactc tgaccttcag 480 gctggcgaca tcgttgcgtt ctactccggc gctacccacg ttggtatcta ctccggccac 540 ggcaccgtta tccacgcact gaacagcagc acccctctgt ctgagcactc cttggattac 600 atgccattcc actctgcagt tcgtttctaa 630 <210> 8 <211> 1245 <212> DNA <213> Corynebacterium <220> <221> gene <222> (1)..(1245) <223> NCgl2986 <400> 8 gtggatgaac tatatccatt gataattttg aacatgaatg atggaaggag cagggtgtct 60 aaagtcctga gagttggcga tcgcagcccg cgcgtggcag aagtgcgcac tacgctcgct 120 cgcctcggtg tgattgaagg ctattccagg gagatgtctg caaagacaga atcccagaag 180 ttccacgaag aagagacgct tttcgacgaa gaactcagcc tcagcatcaa gtcattccag 240 caagctcgag gagtcgttcc ctccgggctt attgacgacc ccaccctgcg cgcaatccgc 300 gaagcctcct acaccctggg aacccgcgtg ctggcctacc agcccggcaa ccagcttgtt 360 ggtgacgacg ttgtagaaat ccaatcccat ctccaagagc tcggcttcta cgccgaccgt 420 gtggatggac attttggcga gctcacacac aaagctgtga tgaactacca actcaactac 480 ggcatgcagg tagacggcat ctgtggccct gacaccatcc gtgcgctgtc ccgacttggt 540 ctgcgcatca agggtggctc tgctcaagct atccgtgaac gcgaacgcat gcgcaatgca 600 ggcccacgtc ttgctggcaa gcgtgtggtc attgatcctg cgcttggggg ctccaacaag 660 ggtcagatcg tgaaaggccc ctacggtgag atctctgagg aagaaatcct ctgggatttg 720 gccacccgcc tggaaggtcg catgatcgca acaggcatgg aaaccattct gtcgcgcccg 780 cacatggatg atcccagcag ccgtgatcgc gcgtcgatcg cgaatgcttt cggcgctgac 840 ctcatgctga gcctgcactg cgattcctac ccgaatgaaa aagctaacgg cgtggccagc 900 ttctacttcg gttcggaaaa cggcaccaac tccttgaccg gtgaaacgct ctccgcgtac 960 atccaaaaag agatcgttgc ccgcacccca ctgaacaact gtggcagcca tgcccgtacc 1020 tgggatctgc tgcgcctcac gcgcatgccc atggtggaag ttgtcaccgg ttacctcacc 1080 aaccccgatg acctggcagt tctgactgat ccacaaatgc gtgatcacat tgccgaagcc 1140 atcgttgtcg ccgtcaagcg cctgtacctc cttgatgagg aagcacagcc caagaccgga 1200 accttcaagt tctctgagct gttgcaatca gagcaggctg gctaa 1245 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kit primer <400> 9 acctacaaca aagctctcat caacc 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kit primer <400> 10 ctaccctgtg gaacacctac atct 24 <210> 11 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1480 primer <400> 11 ccggggatcc tctagaacct tgaaacttcc actc 34 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1480 primer <400> 12 ctcctgacga actatttcaa atcccctatc aacctc 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1480 primer <400> 13 caccgaggta aattgccatg caagcgcaat caacgc 36 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl1480 primer <400> 14 gcaggtcgac tctagaaacc acacattatc gatc 34 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2107 primer <400> 15 ccggggatcc tctagagcac agggcacccc tgttg 35 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2107 primer <400> 16 ctcctgacga actatttcaa atcccctatc aacctc 36 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2107 primer <400> 17 gaggttgata ggggatttga aatagttcgt caggag 36 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2107 primer <400> 18 gcaggtcgac tctagaaacc acacattatc gatc 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2108 primer <400> 19 ccggggatcc tctagagaac ccttagtagt tggg 34 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2108 primer <400> 20 gtaatccaag gagtgctcac ccactgatga aactcc 36 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2108 primer <400> 21 ggagtttcat cagtgggtga gcactccttg gattac 36 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2108 primer <400> 22 gcaggtcgac tctagacgag cctcaatatc aatc 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2986 primer <400> 23 ccggggatcc tctagattag gagaaaccat gagc 34 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2986 primer <400> 24 atcagtcaga actgccagga ctgcagtaag aatacc 36 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2986 primer <400> 25 ggtattctta ctgcagtcct ggcagttctg actgat 36 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2986 primer <400> 26 gcaggtcgac tctagagttg aggcgtttgg atac 34

Claims (4)

1. 세포벽 가수분해 관련 단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 불활성화되도록 변이된, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 세포벽 가수분해 관련 단백질은 서열번호 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질인 것인, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)인, L-라이신 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물.
   
4. (i) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
   (ii) 상기 배양에 따른 배지 또는 상기 미생물로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신의 제조 방법.