JP6526058B2 - Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用したｌ−リジンの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物、及びそれを利用して、Ｌ−リジンを生産する方法に関する。

Ｌ−リジンは、オキサロ酢酸（oxaloacetate）を前駆物質にし、リジン生合成経路を介して生合成され、オキサロ酢酸は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ｏｄｘ：oxaloacetate decarboxylase）によって、ピルベート（pyruvate）と二酸化炭素とに分解される。

従来、Simon KlafflとBernhard J. Eikmannsは、コリネバクテリウムグルタミクムにおいて、内在的遺伝子ｃｇ１４５８を過発現させる場合、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの活性が増大すると共に、Ｌ−リジン生産は減少し、不活性化させる場合には、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの活性がなくなるということを確認することにより、遺伝子ｃｇ１４５８がオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを暗号化するということを単純証明したが、ｃｇ１４５８の不活性化によるＬ−リジン生産の変化は確認されていない（Klaffl S, Eikmanns BJ, et al., J. Bacteriol., May 2010, 192(10), p. 2604-12）。しかし、本発明者らは、Ｌ−リジン生産用コリネバクテリウム菌株において、内在的オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの活性を抑制する場合、オキサロ酢酸が他の経路に消耗されず、Ｌ−リジン生合成経路に流入する量が増加すると予想し、多様な系列のＬ−リジン生産菌株を対象に、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を不活性化させた結果、Ｌ−リジン生成能上昇効果があるということを確認し、本発明を完成した。

従って、本発明の目的は、Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。

本発明の他の目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を利用して、Ｌ−リジンを生産する方法を提供することである。

前記のような目的を果たすため、本発明の一様態において、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの活性が不活性化され、Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。

本発明の他の様態において、また前記コリネバクテリウム属微生物を培養し、Ｌ−リジンを生産する方法を提供する。

本発明は、Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム菌株において、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を不活性化させ、Ｌ−リジン生産能が向上した組換えコリネバクテリウム属微生物を提供し、前記組換えコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−リジンを高収率で生産することができるので、産業上有用に利用可能である。

コリネバクテリウム染色体内ｏｄｘ遺伝子欠損用ベクターｐＤＺ−Δｏｄｘを示す図面である。

以下、本発明について詳細に説明する。

１つの様態として、本発明は、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ｏｄｘ：oxaloacetate decarboxylase）の活性が不活性化され、Ｌ−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供する。

オキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、オキサロ酢酸を、ピルベートと二酸化炭素とに分解する反応を触媒する酵素であり、前記活性を有する酵素であるならば、いかなる微生物由来の酵素も、係わりなく活用することができる。具体的には、コリネ型微生物由来の酵素、さらに具体的には、コリネバクテリウムグルタミクム由来の酵素を活用することができるが、それに限定されるものではない。

さらに具体的には、本発明のオキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号２の塩基配列を有するｏｄｘ遺伝子によって暗号化される。しかし、前記アミノ酸配列及び塩基配列に限定されるものではない。具体的には、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質である限り、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上、具体的には９０％以上、９５％以上、さらに具体的には９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列も本発明に含まれ、かような相同性を有する配列として、実質的に、配列番号１のタンパク質と同一であるか、あるいは相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が、欠失、変形、置換または付加がなされたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範疇に含まれるということは自明である。また、遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因し、同一アミノ酸配列をコーディングする前記塩基配列の変異体も本発明に含まれる。

本発明で使用された用語「相同性」は、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、百分率で表示される。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一であるか、あるいは類似した活性を有するその相同性配列が、「％相同性」と表示される。例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)］やPearsonによるＦＡＳＴＡ［参照：Methods Enzymol., 183, 63 (1990)］を使用して決定することができる。かようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている［参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov］。または、定義された厳格な条件下で、サザン混成化実験によって、配列を比較することによって確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術範囲内であり（例えば、 Sambrook et al., 1989, infra参照）、当業者に周知の方法で決定されるのである。

本発明で使用された用語「不活性化」は、本来、微生物の天然状態または非変形状態で示すタンパク質活性と比較するとき、活性がさらに弱化されたり除去されたりすることを意味し、当業界に公知の任意の不活性化方法によってなされる。本発明において、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼの不活性化とは、前記内在的ｏｄｘ遺伝子の発現が、親菌株または非変形菌株に比べて低レベルに減少するか、あるいは全然発現しない遺伝子、及び発現されるにしても、その活性がないか、あるいは減少している遺伝子が生成されるということを意味する。

具体的には、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコーディングする遺伝子の一部を含む組換えベクターを微生物に導入し、内在的オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を欠損させたり突然変異させたりすることにより、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ内在的活性を不活性化させるか、遺伝子のプローモーター（promoter）部位及び５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変形させることにより、タンパク質の発現を弱化させるか、あるいは当該遺伝子のＯＲＦ部位に突然変異を導入することにより、タンパク質の活性を弱化させることができる。また、前記遺伝子の染色体内への挿入は、当業界に知られた任意の方法によって行われる。

本発明で使用された用語「内在的活性」は、本来、微生物が天然または非変形状態で有しているタンパク質の活性状態を意味する。

さらに具体的には、前記不活性化は、部位特異的遺伝子欠失（site specific gene disruption）にもよるもんであるが、それに制限されるものではない。

本発明で使用された用語「組換えベクター」は、適する宿主内で、目的タンパク質を発現させることができるように、適する調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプローモーター、かような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適するｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、並びに転写及び解読の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムと係わりなく複製されたり機能したりすることができ、ゲノムそれ自体に統合される。本発明で使われるベクターは、宿主において、複製可能なものであるならば、特別に限定されるものではなく、当業界に公知の任意のベクターを利用することができる。

本発明で使用された用語「形質転換」は、遺伝子を宿主細胞内に導入し、宿主細胞内において発現させることを意味する。形質転換された遺伝子は、宿主細胞内で発現されるものであるならば、宿主細胞の染色体内挿入であっても、または染色体外に位置していても、制限なしに含まれる。また、前記遺伝子は、宿主細胞内に導入されて発現されるものであるならば、いかなる形態で導入されてもよい。

前記組換えベクターを導入する親菌株としては、Ｌ−リジンを生産することができる微生物であるならば、制限なしに使用することができるが、具体的には、コリネバクテリウム属微生物またはブレビバクテリウム属微生物、さらに具体的には、コリネバクテリウムグルタミクムを使用することができるが、それに限定されるものではない。

本発明の具体的な一実施例においては、コリネバクテリウムグルタミクム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（韓国登録特許第０９２４０６５号）に、ｏｄｘ遺伝子の一部分が挿入された組換えベクターを作製した後、当業界に公知の任意の方法で、前記組換えベクターを、微生物に形質転換させ、かつ染色体内相同組換えすることにより、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼが不活性化された、Ｌ−リジン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物を作製することができたが、本発明は、それに限定されるものではない。

本発明の一実施例で製造されたコリネバクテリウムグルタミクム菌株は、いずれもＬ−リジン生産量が、親菌株対比で増加し、ｏｄｘ遺伝子の不活性化によって、Ｌ−リジンを高収率で生産することができるということを確認した。

本発明の他の１つの様態として、前記コリネバクテリウム属微生物を培養し、Ｌ−リジンを生産する方法を提供する。さらに詳細には、本発明の微生物を培養し、培養物内または細胞内でＬ−リジンを生産する段階と、培養物から、Ｌ−リジンを回収する段階と、を含んでなる、Ｌ−リジンを生産する方法を提供する。

本発明の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当業界に公知の任意の培養条件及び培養方法が使用され、次の例に限定されるものではない。

コリネバクテリウム属微生物の培養のために使用される培地としては、例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)に開示された培地が使用される。

培地において使用される糖源としては、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような糖；炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸が含まれる。それら物質は、個別的にまたは混合物として使用される。

使用される窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的にまたは混合物として使用することができる。

使用されるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、または相応するナトリウムを含む塩が含まれ、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含み、前記物質に加え、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が使用されてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が使用される。前述の原料は、培養過程において、培養物に適切な方式によって、回分式でまたは連続式で添加される。

前記微生物の培養中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物、またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方式で使用し、培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用し、気泡生成を抑制することができる。好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入する。培養物の温度は、普通２０℃ないし４５℃、具体的には、２５℃ないし４０℃でもある。培養時間は、所望Ｌ−アミノ酸の生成量が得られるまで続けられるが、望ましくは、１０ないし１６０時間である。

本発明の方法において、培養は、バッチ工程、注入バッチ工程及び反復注入バッチ工程のような連続式または回分式によって行われる。かような培養は、方法は当業界に周知であり、任意の方法が使用される。

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって限定されるものではない。

実施例１：コリネバクテリウム由来ｏｄｘ遺伝子不活性化用組換えベクターの作製
コリネバクテリウムグルタミクムのオキサロ酢酸デカルボキシラーゼは、配列番号１と記載されるアミノ酸配列を有し、それを暗号化するｏｄｘ遺伝子（配列番号２）を、部位特異的遺伝子欠失（site specific gene disruption）によって不活性化させるために、下記の方法でプラスミドベクターを作製した。まず、アメリカ国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Genbank）を根にして、ｏｄｘ遺伝子の塩基配列を確保し、それを基に、ｏｄｘ遺伝子の不活性化断片を作製するためのプライマーを合成した。

野生型コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体をテンプレートにし、配列番号３及び配列番号４、配列番号５及び配列番号６をプライマーとして利用し、ＰＣＲ［Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories］を行った。ＰＣＲ条件は、９５℃での５分間変性後、９５℃ ３０秒変性、５５℃ ３０秒アニーリング、７２℃ ３０秒重合を３０回反復した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｏｄｘ遺伝子５’末端と３’末端をそれぞれ含む５３６ｂｐの配列番号７と、５３４ｂｐの配列番号８とを得た。

配列番号３：５’−ＴＣＴＡＧＡＡＣＧＡＴＧＡＡＡＴＣＧＣＣＧＣＧＧＧＴ−３’
配列番号４：５’−ＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＡＴＣＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＡＧＧＴＴＡＧＣＴ−３’
配列番号５：５’−ＡＧＣＴＡＡＣＣＴＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＣ−３’
配列番号６：５’−ＴＣＴＡＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＴＴ−３’

増幅された配列番号７と配列番号８とをテンプレートにし、配列番号３及び配列番号６にＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃ ３０秒変性、５５℃ ３０秒アニーリング、７２℃ ６０秒重合を３０回反復した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ｏｄｘ遺伝子の５’末端と３’末端とが連結された１０３０ｂｐの配列番号９（以下、Δｏｄｘ）が増幅された。

コリネバクテリウムグルタミクム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（韓国登録特許第０９２４０６５号）と、増幅されたＤＮＡ断片Δｏｄｘとを制限酵素ＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を利用して連結した後、クローニングすることによってプラスミドを獲得し、それをｐＤＺ−Δｏｄｘ（図１）と命名した。

実施例２：Ｌ−リジン生産コリネバクテリウムでのｏｄｘ不活性化及びＬ−リジン生成能の分析
実施例１で作製したｐＤＺ−Δｏｄｘを、Ｌ−リジン生産菌株であるコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１０１６ＰとコリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１１３４７Ｐとに、電気パルス法（Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52: 541-545)にそれぞれ形質転換した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含んだ選別培地で形質転換菌株を獲得した。二次組換え過程（cross-over）でゲノム上に挿入されたＤＮＡ断片Δｏｄｘによって、ｏｄｘ遺伝子が不活性化された菌株を獲得し、それぞれＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Δｏｄｘ、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ／Δｏｄｘと命名した。

遺伝子ｏｄｘの不活性化が、実際にリジン生成能上昇に効果を示すか否かということを確認するために、ｏｄｘ不活性化菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Δｏｄｘ及びＫＣＣＭ１１３４７Ｐ／Δｏｄｘを、それぞれ下のような方法で培養し、生成能を確認した。

下記の種培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに各菌株を接種し、３７℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。下記の生産培地２４ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに、１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。

＊種培地（ｐＨ７．０）の組成：
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物１０ｇ、尿素５ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ４ｇ、Ｋ₂ＨＰＯ₄ ８ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １，０００ｕｇ（工程水１リットル基準）
＊生産培地（ｐＨ７．０）の組成：
ブドウ糖８０ｇ、糖蜜または前処理糖蜜（還元糖として）２０ｇ、とうもろこし浸漬液（corn steep liquor）５ｇ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ４０ｇ、尿素４ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ｇ、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ １０ｍｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩２００μｇ、ＣａＣＯ₃ ４０ｇ、必要時にＬ−ロイシン０．４ｇ、必要時にＬ−スレオニン０．１ｇ、必要時にＬ−メチオニン０．１ｇ（工程水１リットル基準）

培養を終了した後、ＨＰＬＣによって、Ｌ−リジンの生産量を測定した。その結果、各菌株に対する培養物中のＬ−リジン含量は、下表１の通りであった。

前記の表１でのように、ｏｄｘ不活性化菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／Δｏｄｘ及びｏｄｘ不活性化菌株ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ／Δｏｄｘは、それぞれの親菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ及びＫＣＣＭ１１３４７Ｐ対比で、Ｌ−リジン生産能が約４．２％ほど増加したということを確認した。

このうち、前記菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ΔｏｄｘをＣＡ０１−２２７６と命名し、２０１３年１１月２２日付けで、大韓民国ソウル特別市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在する国際寄託機関である韓国種菌協会付設韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１４７８Ｐを受けた。

実施例３：Ｌ−リジン生合成経路が強化されたＬ−リジン生産コリネバクテリウムでのｏｄｘ不活性化及びリジン生成能の確認
実施例１で作製したｐＤＺ−Δｏｄｘを、Ｌ−リジン生合成経路が強化された特徴を有するＬ−リジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（韓国登録特許第１０−０９２４０６５号）に、実施例２と同一方法で形質転換し、形質転換株を作製し、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ／Δｏｄｘと命名した。

遺伝子ｏｄｘの不活性化が、実際にＬ−リジン生成能増加に効果を示すか否かということを確認するために、ｏｄｘ不活性化菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ／Δｏｄｘを、実施例２と同一方法で培養し、生成能を分析した。各菌株に対する培養物中のＬ−リジン含量は、下表２の通りであった。

前記の表２でのように、親菌株であるＫＣＣＭ１０７７０Ｐ対比で、ｏｄｘ不活性化菌株ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ／ΔｏｄｘのＬ−リジン生産能が、約６．４％ほど増加するということを確認した。

実施例４：野生株由来Ｌ−リジン生産コリネバクテリウムでのｏｄｘ不活性化及びリジン生成能の確認
実施例１で作製したｐＤＺ−Δｏｄｘを、野生株由来のＬ−リジン生産菌株コリネバクテリウムグルタミクムＣＪ３Ｐ（Binder et al. Genome Biology 2012, 13: R40, pyc (P458S), hom (V59A), lysC (T311I)）に、実施例２と同一方法で形質転換し、形質転換株を作製し、ＣＪ３Ｐ／Δｏｄｘと命名した。

遺伝子ｏｄｘの不活性化が、実際にリジン生成能増加に効果を示すか否かということを確認するために、ｏｄｘ不活性化菌株ＣＪ３Ｐ／Δｏｄｘを、実施例２と同一方法で培養し、生成能を分析した。各菌株に対する培養物中のＬ−リジン含量は、下表３の通りであった。

前記の表３でのように、野生型由来Ｌ−リジン生産菌株である親菌株ＣＪ３Ｐにおいても、ｏｄｘ不活性化時に、リジン生産が約３．８％ほど増加するという結果を確認した。

従って、本出願人は、前記実施例２ないし４を介して、多様な系列のコリネバクテリウムソック微生物において、共通的して、ｏｄｘ遺伝子の不活性化時、リジン生産能が増加するということを確認することにより、ｏｄｘ遺伝子の不活性化が、Ｌ−リジンの生産にあって有効な形質であるということを確認した。

寄託機関人：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４７８Ｐ
受託日付け：２０１３１１２２

Claims (4)

1. Ｌ−リジン生合成経路が強化され、且つ配列番号１のアミノ酸配列を有するオキサロ酢酸デカルボキシラーゼが不活性化された、Ｌ−リジンを生産するコリネバクテリウム属微生物であって、前記経路の強化がaspB遺伝子、lysC遺伝子、asd遺伝子、dapA遺伝子、dapB遺伝子及びlysA遺伝子の導入であり、未改変の微生物と比較してＬ−リジンの生産能が増加された、前記コリネバクテリウム属微生物。
2. 前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウムグルタミクムであることを特徴とする、請求項１記載のコリネバクテリウム属微生物。
3. オキサロ酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の欠損又は欠失突然変異を含む、請求項１記載のコリネバクテリウム属微生物。
4. 請求項１〜３のいずれか１項記載の微生物を培養して培養物を修得する段階と、
   前記培養物又は微生物からＬ−リジンを回収する段階と、
   を含む、Ｌ−リジンの生産方法。

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