ES2552342T3

ES2552342T3 - Procedimiento de producción de L-lisina usando Corynebacterium sp. que ha obtenido la actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa a partir de una especie foránea

Info

Publication number: ES2552342T3
Application number: ES10797237.4T
Authority: ES
Inventors: So-Yeon Rah; Sangjo Lim
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2009-07-08
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2015-11-27
Anticipated expiration: 2030-05-28
Also published as: CN102471758A; KR20110004733A; CN102471758B; MY170242A; JP5618164B2; WO2011004962A2; US20120208245A1; JP2012532603A; EP2453006B1; PL2453006T3; KR101182033B1; WO2011004962A3; EP2453006A2; BR112012000475A2; EP2453006A4

Abstract

La cepa de Corynebacterium sp. que tiene una actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una productividad de L-lisina, en la que un gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA) endógeno está inactivado y se introduce un gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAPD (gapN) exógeno.

Description

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DESCRIPCIÓN

Procedimiento de producción de L-lisina usando Corynebacterium sp. que ha obtenido la actividad de gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa a partir de una especie foránea

Antecedentes

5 1. Campo

La presente divulgación se refiere a una cepa de Corynebacterium sp. que tiene una actividad de gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una mayor productividad de L-lisina y un procedimiento para producir L-lisina usando el mismo.

2. Descripción de la técnica relacionada

10 Tradicionalmente, las bacterias corineformes son los microorganismos industriales más ampliamente utilizados para la producción de una variedad de materiales químicos útiles en las industrias de alimentación animal, farmacéutica y alimentaria, incluyendo aminoácidos, tales como L-lisina, L-treonina, L-arginina y ácido glutámico y materiales relacionados con ácidos nucleicos. Estos microorganismos son bacterias gram-positivas y requieren biotina para su crecimiento. Los ejemplos representativos de bacterias corineformes son las del género Corynebacterium,

15 incluyendo Corynebacterium glutamicum, el género Brevibacterium, incluyendo Brevibacterium flavum, las especies de Arthrobacter, las especies de Microbacterium, etc.

La L-lisina es un L-aminoácido que se utiliza comercialmente como un aditivo para piensos en la alimentación animal debido a su capacidad para ayudar al cuerpo a absorber otros aminoácidos mejorando así la calidad del pienso. En el cuerpo humano, la L-lisina se usa como un ingrediente de una solución de inyección, y también se aplica en el

20 campo farmacéutico. Por lo tanto, la producción industrial de lisina es un proceso industrial económicamente importante.

Para mejorar el rendimiento de producción de lisina, la actividad de la enzima en la vía biosintética de la lisina ha sido generalmente mejorada mediante la amplificación de genes en la vía de biosíntesis de la lisina o mediante la modificación del promotor de los genes. Además, se puede introducir un gen exógeno obtenido de otras bacterias y,

25 por ejemplo, la introducción de un gen que codifica la citrato sintasa obtenida de Escherichia coli se describe en la Publicación de Patente Japonesa Nº Hei 7-121228.

Mientras tanto, la ruta metabólica central del carbono puede modificarse con el fin de mejorar la productividad de lisina implicada en la ruta metabólica central del carbono. En Corynebacteria, existe en una forma de gapA que convierte la gliceraldehído-3-fosfato en glicerato-1,3-bisfosfato utilizando NAD como coenzima, en la que el glicerato30 1,3-bisfosfato se convierte en 3-fosfoglicerato por el gen pgk que codifica la enzima. Por el contrario, en Streptococcus y Bacillus, existe como GAPDH dependiente de NADP no fosforilante (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP no fosforilante, en lo sucesivo referida como gapN) que convierte el gliceraldehído-3-fosfato en 3-fosfoglicerato utilizando NADP como coenzima y produce NADPH. Este proceso es un proceso de un solo paso que juega un papel importante en la glucólisis y que está afectado por una relación

35 NADPH/NADP (Iddar, A et al., Protein Expr Purif. 25(3):519-26 (2002)).

El documento WO 2006/071086 describe microorganismos de las especies de Escherichia y microorganismos de las especies de Corynebacterium que se transforman con un gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa exógeno y que tienen la capacidad de producir L-lisina y un procedimiento para producir L-lisina utilizando los microorganismos.

40 Se ha descrito que la enzima gapN no existe inherentemente en Corynebacterium. Además, no se ha descrito el uso del gen gapN en el cultivo de Corynebacterium. Sin embargo, hay patentes anteriores que se refieren al aumento de la productividad de aminoácidos mediante la introducción del gen gapN. Por ejemplo, la solicitud de patente coreana Nº 10-2004-0116999 y la patente US-11/722.820 describen que el gapN se expresa en E. coli para aumentar la productividad de lisina, pero no se describe su aplicación a Corynebacterium. Por lo tanto, con el fin de lograr el

45 efecto de gen gapN, se propuso el gapN derivado de Clostridium acetobutyricum para ser expresado en la cepa de Corynebacterium productora de lisina, pero no se pudo obtener un resultado satisfactorio. Por lo tanto, los presentes autores han explorado tres tipos de genes gapN presentes en otras bacterias mediante búsqueda en papel (Abdelaziz Soukri et al. INTERNATIONAL MICROBIOLOGY (2005) 8:251-258).

Los presentes autores encontraron que el gapN se expresa con el fin de utilizar NADP, en lugar de NAD, como una

50 coenzima y el incremento resultante en los niveles de NADPH se utiliza como la fuente de poder reductor para la biosíntesis de lisina, y por tanto la productividad de L-lisina de la cepa de Corynebacterium sp. se puede mejorar, completando de esta manera la presente divulgación.

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Sumario

Un objeto es proporcionar una cepa de Corynebacterium sp. que tenga una actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una mayor productividad de L-lisina y un procedimiento para producir Llisina usando la misma.

5 Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra un mapa de escisión de pECCG122-Pcj7-gapN, que es un plásmido de expresión para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapN) de Streptococcus mutans, Streptococcus agalactiae o Bacillus cereus y La FIG. 2 muestra un mapa de escisión de un vector de inserción cromosómica PDZ-gapA para la alteración del

10 gen gapA.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

En una realización, la presente divulgación proporciona una cepa de Corynebacterium sp. que tiene una actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una mayor productividad de L-lisina.

La cepa de Corynebacterium sp. que tiene una mayor productividad de L-lisina de la presente divulgación puede

15 obtenerse mediante la inactivación del gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA) endógeno e introduciendo el gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP (gapN) exógeno.

En la presente divulgación, el gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP exógeno incluye cualquier nucleótido que codifica un polipéptido, siempre que el polipéptido tenga una actividad de

20 conversión en 3-fosfoglicerato mediante el uso de gliceraldehído-3-fosfato como sustrato y NADP como coenzima.

Ejemplos de gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP exógeno incluyen genes que codifican para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP obtenidos de animales, plantas y bacterias, preferiblemente genes que codifican para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP obtenidos de bacterias y, más preferiblemente, un gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato

25 deshidrogenasa dependiente de NADP originado a partir de Streptococcus mutans, Streptococcus agalactiae o Bacillus cereus. Más específicamente, los genes de Streptococcus mutans, Streptococcus agalactiae y Bacillus cereus pueden tener las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nº 11 (GenBank Nº de acceso NC_004350), 12 (GenBank Nº de acceso NC_004116) y 13 (GenBank Nº de acceso NC_004722.1), respectivamente.

El gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa dependiente de NADP exógeno se puede introducir

30 en un vector recombinante de expresión e introducir el vector recombinante en una bacteria corineiforme que tiene un gen endógeno inactivado de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa con el fin de producir una bacteria corineiforme transformada.

El vector recombinante que expresa la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP se puede preparar por un procedimiento común, por ejemplo, ligando la secuencia del gen de la gliceraldehído-3-fosfato

35 deshidrogenasa dependiente de NADP exógeno con un vector adecuado usando una enzima de restricción. En la presente divulgación, el vector puede ser un vector que tiene el mapa de escisión de la Figura 1. En la realización específica de la presente divulgación, los vectores para la introducción de los genes de Streptococcus mutans, Streptococcus agalactiae y Bacillus cereus son pECCG122-Prj7-gapN1, pECCG122-Pcj7-gapN2 y pECCG122-Pcj7gapN3, respectivamente.

40 El gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa endógeno se refiere a un gen que codifica la enzima que tiene una actividad de convertir en glicerato-1,3-bisfosfato mediante el uso de gliceraldehído-3-fosfato como sustrato y NAD como coenzima en la cepa de Corynebacterium sp. y preferiblemente se refiere a un gen que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 14 (NCBI Nº de Acceso NC_003450, NCgl1526).

Además, con el fin de inactivar el gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa endógeno, se puede

45 aplicar la manipulación genética de deleción, sustitución o inserción del gen nativo gapA de la cepa de Corynebacterium sp. Preferiblemente, se puede transformar una bacteria corineiforme con un vector recombinante que incluye una parte del gen gapA y se puede preparar, por ejemplo, una cepa que tiene la actividad gapA inactivada por introducción de un vector que tiene el mapa de escisión de la Figura 2. En la realización específica de la presente divulgación, se utilizó un vector recombinante pDZ-gapA que tiene dos fragmentos de una parte del gen

50 que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa endógeno consecutivamente clonado como un vector para la inserción cromosómica. Preferiblemente, una bacteria corineiforme a ser transformada con este vector para la inserción cromosómica es, pero no se limita a, Corynebacterium glutamicum KFCC-10 881. De acuerdo con la realización específica de la presente divulgación, la bacteria corineiforme que tiene la alteración del gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa endógeno puede ser Corynebacterium glutamicum CA01-0096 (Nº de

55 Acceso KCCM 11012P).

imagen3

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “transformación” significa que el ADN se introduce en un hospedador en el que el ADN se mantiene como un elemento extracromosómico o integrado en el cromosoma e invención, la bacteria corineiforme que tiene la alteración del gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa endógeno puede ser Corynebacterium glutamicum CA01-0096 (Nº de Acceso KCCM 11012P).

5

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “transformación” significa que el ADN se introduce en un hospedador en el que el ADN se mantiene como un elemento extracromosómico o integrado en el cromosoma y se hace que sea replicable. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “transfección” significa que un vector de expresión que tiene una secuencia de codificación arbitraria que se puede expresar o no es recibida por 10 una célula hospedadora. Tal como se usa en el presente documento, los términos “hospedador transfectado” y “hospedador transformado” significan una célula en la que se introduce el ADN. La célula se denomina “célula hospedadora” y puede ser una célula procariota o eucariota. La célula procariota típica incluye una variedad de cepas tales como E. coli. El término “vector” se refiere a un producto de ADN que tiene una secuencia de ADN unida operativamente a una secuencia reguladora que puede expresar el ADN en un hospedador adecuado. Los ejemplos 15 de la secuencia reguladora incluyen un promotor para la transcripción, una secuencia operadora arbitraria para la regulación de la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma del ARNm apropiado y secuencias para la regulación de la terminación de la transcripción y la traducción. Ejemplos del vector pueden incluir plásmidos, partículas de fagos o simplemente posibles insertos genómicos. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma hospedador, o 20 puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. Como se usa en el presente documento, “plásmido” y “vector” se utilizan a veces indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector en la actualidad. El término “secuencia reguladora” se refiere a una secuencia de ADN necesaria para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Por ejemplo, secuencias reguladoras necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia

25 operadora, y un sitio de unión al ribosoma. Los eucariotas son conocidos por utilizar un promotor, una señal de poliadenilación y un potenciador.

Cuando un ácido nucleico está dispuesto en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico, está “unido operativamente” a la secuencia de ácido nucleico. Esto significa que los genes están unidos de una manera tal que permiten la expresión del gen cuando la secuencia reguladora(s) se acopla con una molécula adecuada (por 30 ejemplo, una proteína activadora de la transcripción). Por ejemplo, se pueden utilizar de acuerdo con un procedimiento ordinario el ADN de una pre-secuencia o un líder secretor está unido operativamente al ADN de un polipéptido cuando se expresa como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante cuando afecta a la transcripción de la secuencia codificante; un sitio de unión al ribosoma es un sitio para unión a una enzima de restricción, un adaptador de

35 oligonucleótido sintético o enlazador.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “vector” se refiere a un vehículo recombinante en el que se insertan fragmentos de ADN heterólogo, en el que el fragmento de ADN es generalmente un fragmento de ADN de doble cadena. Aquí, el ADN heterólogo significa ADN de tipo heterólogo que no se encuentra de forma natural en una célula hospedadora. Una vez que el vector de expresión se incorpora en una célula hospedadora, este se puede

40 replicar independientemente del ADN genómico hospedador para generar varias copias y sus insertos (ADN heterólogos).

Como es conocido por un experto en la materia, a fin de elevar un nivel de expresión de un gen transfectado en una célula hospedadora, el gen correspondiente debe estar unido operativamente a una secuencia de control de la expresión que realiza funciones de transcripción y traducción en un hospedador de expresión seleccionado.

45 Preferiblemente, la secuencia de control de la expresión y el gen se incluyen en un único vector de expresión que comprende tanto un marcador seleccionable bacteriano como un origen de replicación. Cuando un hospedador de expresión es una célula eucariota, el vector de expresión debe incluir además un marcador de expresión útil en el hospedador de expresión eucariótico.

El vector útil para la preparación del vector recombinante de la presente divulgación se puede obtener de vectores

50 autónomamente replicables en las bacterias corineformes, y por ejemplo, un vector de fago o un vector plásmido. Ejemplos de vector de fago o el vector cósmido incluyen pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A y Charon21A y los ejemplos de vector plasmídico incluyen un plásmido pBR, un plásmido pUC, un plásmido pBluescriptII, un plásmido pGEM, un plásmido PTZ, un plásmido pET, un plásmido pMal, un plásmido pQE, etc.

55 Además, el Corynebacterium sp. utilizado en la presente divulgación incluye cualquier Corynebacterium sp., con tal de que tenga productividad de L-lisina. Los ejemplos del Corynebacterium sp. incluyen Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes, Brevibacterium flavum y Brevibacterium fermentum.

Los Corynebacterium sp. de la presente divulgación incluyen una cepa mutante que tiene una mayor productividad de L-lisina, así como una cepa de tipo silvestre. Ejemplos de los mismos incluyen cepas que requieren nutricionalmente metionina o son resistentes a los análogos de treonina (AHV: ácido α-amino-β-hidroxi valérico), análogos de lisina (AEC: S-(2-aminoetil)-L-cisteína), análogos de isoleucina (ácido α-aminobutírico), análogos de metionina (etionina), etc. Además, con el fin de aumentar la productividad de L-lisina, la cepa puede ser un mutante asociado a una mayor productividad de L-lisina que se prepara aumentando el número de copias del gen introducido

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5 o manipulando una secuencia reguladora del gen. Preferiblemente, puede incluir Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 y un mutante o cepa productora de L-aminoácido preparados a partir de, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum KFCC11001 y lo más preferiblemente, Corynebacterium glutamicum KFCC10881, pero sin limitarse a estos.

10 La realización específica de la presente divulgación proporciona cepas de Corynebacterium sp. de Corynebacterium glutamicum CA01-0565 (Nº de Acceso KCCM 11013P), Corynebacterium glutamicum CA01-0566 (Nº de Acceso KCCM 11014P) y Corynebacterium glutamicum CA01-0567 (Nº de Acceso KCCM 11015P), las cuales se preparan introduciendo el gen de Streptococcus mutans, el gen de Streptococcus agalactiae y el gen de Bacillus cereus en Corynebacterium glutamicum KFCC10881 que tiene el gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa

15 endógeno inactivado, respectivamente. Estas cepas fueron depositadas en la KCCM (Colección Coreana de Cultivos de Microorganismos, ubicada en 361-221 Yurim Bild., Hongje 1-dong, Seodaemun-gu, Seúl, Corea) el 2 de julio de 2009.

El aumento de la productividad de L-lisina se atribuye al aumento del poder reductor por la activación de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP. En lugar de la gliceraldehído-3-fosfato

20 deshidrogenasa endógena, se introduce una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP exógena en la cepa de Corynebacterium productora de L-lisina, de manera que la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP se activa para hacer que la cepa utilice NADP en lugar de NAD como coenzima y, por lo tanto, el incremento de los niveles de NADPH resultantes puede ser utilizado como la fuente de poder reductor para la biosíntesis de L-lisina.

25 Otra realización de la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir L-lisina, que comprende las etapas de cultivar la cepa de Corynebacterium sp. que tiene una actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una mayor productividad de L-lisina y recuperar la lisina de las células cultivadas o del caldo de cultivo.

La cepa de Corynebacterium sp. utilizada de acuerdo con la presente invención puede cultivarse mediante el

30 procedimiento de tipo continuo o discontinuo, como cultivos por lotes, por lotes alimentados y cultivos por lotes alimentados repetidos. Un resumen de los procedimientos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto [Chmiel, (Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1991); y Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]. de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una mayor productividad de L-lisina y recuperar la

35 lisina de las células cultivadas o del caldo de cultivo.

La cepa de Corynebacterium sp. utilizada de acuerdo con la presente invención puede cultivarse mediante el procedimiento de tipo continuo o discontinuo, como cultivos por lotes, por lotes alimentados y cultivos por lotes alimentados repetidos. Un resumen de los procedimientos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto [Chmiel, (Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1991); y

40 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)].

El medio de cultivo a utilizar debe cumplir los requisitos de las cepas particulares de una manera adecuada. Descripciones de medios de cultivo para la cepa de Corynebacterium sp. se encuentran en el manual [“Manual of Methods for General Bacteriology” de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington DC, EE.UU., 1981)]. La fuente de carbono útil puede incluir azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, 45 maltosa, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Se pueden usar vitaminas además de las sustancias anteriormente mencionadas. También pueden añadirse precursores adecuados al medio de cultivo. Las sustancias mencionadas se pueden añadir al cultivo mediante un tipo continuo o por lotes de una manera adecuada durante el

50 cultivo.

Con el fin de controlar el valor del pH del cultivo, los compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y amoníaco o los compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, se utilizan convenientemente. Con el fin de controlar el desarrollo de espuma, se puede usar un agente anti-espumante tales como los ésteres de poliglicol de ácidos grasos. Con el fin de mantener las condiciones aerobias, se puede introducir

55 en el cultivo oxígeno o gas que contiene oxígeno. La temperatura del cultivo es normalmente de 20 °C a 45 °C, y preferiblemente de 25 °C a 40 °C. El cultivo se continúa hasta que se ha formado la cantidad máxima de los Laminoácidos deseados. Este objetivo se logra normalmente en un plazo de entre 10 horas y 160 horas.

El análisis de los L-aminoácidos se puede llevar a cabo por cromatografía de intercambio aniónico con posterior derivatización de ninhidrina (Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).

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La presente divulgación se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Sin embargo, la divulgación no se pretende que esté limitada por estos ejemplos.

Ejemplo 1. Exploración y clonación del gen gapN de Streptococcus mutans

La secuencia del gen gapN obtenido de Streptococcus ha sido claramente revelada. La información genética de

5 gapN de Streptococcus mutans (nº de acceso NC_004350) fue adquirida de GenBank de los NIH. Basándose en la secuencia descrita, se sintetizó un par de cebadores descritos en la siguiente Tabla 1 y se amplificaron 1428 pares de bases del gen gapN por reacción de polimerización en cadena (PCR) [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] (Condiciones de la PCR: Desnaturalización = 94 °C, 30 seg/hibridación = 50 °C, 30 seg/polimerización = 72 °C, 1 min 30 seg, 30 ciclos) usando un ADN cromosómico de la

10 cepa de Streptococcus mutans ATCC25175 como molde, y se clonó en un plásmido pCR2.1 de E. coli usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener un plásmido pCR-gapN1.

[Tabla 1] Cebador

Cebador: secuencia SEC ID Nº

gapN_F1: 5'-GCG CAT ATG ACA AAA CAA TAT AA AAA-3' 1

La reacción de polimerización en cadena (PCR) [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989),

15 Cold Spring Harbor Laboratories] (Condiciones de la PCR: Desnaturalización = 94 °C, 30 seg/hibridación = 50 °C, 30 seg/polimerización = 72 °C, 1 min 30 seg, 30 ciclos) usando un ADN cromosómico de la cepa ATCC25175 de Streptococcus mutans como molde y se clonó en un plásmido pCR2.1 de E. coli usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener un plásmido pCR-gapN1.

[Tabla 1] Cebador

Cebador: secuencia SEC ID Nº

gapN_F1: 5'-GCG CAT ATG ACA AAA CAA TAT AA AAA-3' 1

gapN_R1: imagen6 2

20

Ejemplo 2. Construcción del vector de expresión gapN

El vector pCR-gapN1 que contiene el gen gapN obtenido en el Ejemplo 1 se escindió utilizando las enzimas de restricción Nde I y Xba-I y el fragmento de gen que codifica gapN se separó solo y se ligó un promotor de expresión Pcj7 (referencia; Publicación de Patente Nº 2006-0068505) con un vector lanzadera pECCG122 de E. coli y

25 Corynebacterium (referencia; Publicación de Patente Nº 1992-0000933), a fin de construir pECCG122-Pcj7-gapN1 (Fig. 1).

Ejemplo 3. Exploración y clonación del gen gapN de Streptococcus agalactiae

La secuencia del gen gapN obtenido de Streptococcus ha sido claramente revelada. La información genética de gapN de Streptococcus agalactiae (nº de acceso NC_004116) fue adquirida de GenBank de los NIH. Basándose en 30 la secuencia descrita, se sintetizaron un par de cebadores descritos en la siguiente Tabla 2 y se amplificaron 1428 pares de bases del gen gapN por reacción de polimerización en cadena (PCR) [Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories] (condiciones de la PCR: Desnaturalización = 94 °C, 30 seg/hibridación = 50 °C, 30 seg/polimerización = 72 °C, 1 min 30 seg, 30 ciclos) usando un ADN cromosómico de la cepa ATCC BAA-611 de Streptococcus agalactiae como molde, y se clonó en un plásmido pCR2.1 de E. coli

35 usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener un plásmido pCR-gapN2.

[Tabla 2] Cebador 5

Cebador: secuencia SEC ID Nº

gapN_F2: 5'-GCG CAT ATG ACA AAA GAA TAT CAA-3' 3

gapN_R2: imagen7 4

10

15

20

25

30

35

40

Ejemplo 4. Construcción del vector de expresión gapN

El vector pCR-gapN que contiene el gen gapN obtenido en el Ejemplo 3 se escindió utilizando las enzimas de restricción Nde I y Xba-I y sólo se separó el fragmento de gen que codifica gapN y se ligó un promotor de expresión Pcj7 (referencia; Publicación de Patente Nº 2006-0068505) con un vector lanzadera pECCG122 de E. coli y Corynebacterium (referencia; Publicación de Patente Nº 1992-0000933), a fin de construir pECCG122-Pcj7-gapN2 (Fig. 1).

Ejemplo 5. Exploración y clonación del gen gapN de Bacillus cereus

La secuencia del gen gapN obtenida de Bacillus ha sido claramente revelada La información genética de gapN de Bacillus cereus (nº de acceso NC_004722.1) fue adquirida de GenBank de los NIH. Basándose en la secuencia descrita, se sintetizaron un par de cebadores descritos en la siguiente Tabla 3 y se amplificaron 1428 pares de bases del gen gapN por reacción de polimerización en cadena (PCR) [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratorios] (Condiciones de la PCR: Desnaturalización = 94 °C, 30 seg/hibridación = 50 °C, 30 seg/polimerización = 72 °C, 1 min 30 seg, 30 ciclos) usando un ADN cromosómico de la cepa ATCC 14579 de Bacillus cereus como molde, y se clonó en un plásmido pCR2.1 de E. coli usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen) para obtener un plásmido pCR-gapN3.

[Tabla 3] Cebador

Cebador: secuencia SEC ID Nº

gapN_F3: 5'-GCG CAT ATG ACA ACT AGC AAT ACG-3' 5

gapN_R3: 5'-GCG TCT AGA TTA AAC TAA GTT TAA-3' 6

Ejemplo 6. Construcción del vector de expresión gapN

El vector pCR-gapN3 que contiene gapN obtenido en el Ejemplo 5 se escindió utilizando las enzimas de restricción Nde I y Xba-I y sólo se separó el fragmento de gen que codifica gapN y se ligó un promotor de expresión Pcj7 con un vector lanzadera pECCG122 de E. coli y Corynebacterium, con el fin de construir pECCG122-Pcj7-gapN3 (Fig. 1).

Ejemplo 7. Preparación de Corynebacterium glutamicum (KFCC-10881) productora de lisina por mutación artificial

Se usó Corynebacterium glutamicum (KFCC-10881) preparada por mutación artificial, que es resistente a S-(2aminoetil) cisteína (en lo sucesivo denominada como “AEC”) y produce cantidades pequeñas de homoserina, como una cepa en la que se insertó una pluralidad de genes responsables de la vía biosintética de la lisina.

La cepa mutante KFCC-10881 se preparó a partir de Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) de tipo silvestre como una cepa madre. La cepa madre de 107 ~108 células/ml se trató con el mutágeno N-metil-N'-nitro-Nnitrosoguanidina (en lo sucesivo denominada “NTG”) en una concentración final de 500 µg/ml a 30 °C durante 30 min, seguido de la selección de colonias crecidas en una placa compleja que contiene 5 g/l de AEC. Después de analizada la cepa mutante primaria en cuanto a la resistencia a AEC y la productividad de lisina, se indujo la mutación secundaria con NTG. Una pluralidad de las colonias formadas de este modo fueron recogidas con palillo en medio mínimo, las cuales fueron o no fueron suplementados con homoserina (100 mg/l), a fin de separar los auxótrofos de homoserina (mutantes secundarios), los cuales no pueden crecer en un medio mínimo que carece de homoserina. Se indujo una mutación terciaria en el auxótrofo de homoserina a fin de crear una cepa que produce cantidades pequeñas de homoserina que se identificó por incubación en un medio mínimo que contenía 10 mg/l de homoserina. La cepa crecida en el medio fue examinada para determinar la productividad de lisina (Tabla 4). La cepa productora de lisina resultante, que es resistente a la AEC y que produce cantidades pequeñas de homoserina, se depositó en la Colección Coreana de Cultivos de Microorganismos, número de acceso KFCC-10881.

[Tabla 4] Productividad de lisina de KFCC-10881

Cepa: Lisina (g/l)

Lote 1: Lote 2 Lote 3

Tipo silvestre (ATCC13032): 0 0 0

KFCC-10881: 45 43 42,5

imagen8

Medio mínimo (pH 7,0)

Glucosa 10 g, (NH4)2SO4 5 g, urea 2 g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 2 g, MgSO47H2O 0,4 g, biotina 200 µg, tiamina HCl 3000 µg, pantotenato de calcio 1000 µg, nicotinamida 5000 µg, NaCl 0,5 g (por 1 litro de agua destilada)

Medio de siembra (pH 7,0)

5 Glucosa 20 g, peptona 10 g, extracto de levadura 10 g, urea 5 g, KH2PO 44 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7 H2O 0,5 g, biotina 100 µg, tiamina HCl 1000 µg (por 1 litro de agua de proceso)

Medio de Producción (pH 7,0)

Glucosa 100 g, (NH4)2SO4 40 g, proteína de soja 2,5 g, maíz fermentado sólido 5 g, urea 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0,5 g, biotina 100 µg, tiamina HCl 1000 µg, CaCO3 30 g (por 1 litro de agua destilada)

10 Ejemplo 8. Clonación del gen gapA obtenido de Corynebacterium glutamicum KFCC-10881, construcción del vector recombinante (pDZ-gapA) y preparación de la cepa con gen gapA alterado

En este Ejemplo, el gen gapA de la ruta biosintética de la lisina fue obtenido por PCR usando un ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 productor de lisina preparado en el Ejemplo 7 como molde. Se adquirió de GenBank de los NIH, la información de la secuencia del gen gapN (NCBI nº de acceso NC_003450,

15 NCg11526) y se sintetizaron dos pares de cebadores (Tabla 5, SEC ID Nos 7 a 10).

Se realizó la PCR utilizando el ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 como molde y un conjunto de cebadores de oligonucleótidos de las SEC ID Nos 7 y 10 en presencia de PfuUltra™ High-Fidelity DNA Polymerase (Stratagene), con 30 ciclos de desnaturalización a 96 °C durante 30 s; hibridación a 53 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 30 seg. Se observó que los productos de PCR obtenidos de este modo eran dos

20 tipos de fragmentos de gen gapA (gapA-A, gapA-B) de 600 pb. El gapA-A se amplificó usando los cebadores de SEC ID Nos 7 y 8 y el gapA-B fue amplificado utilizando los cebadores de la SEC ID Nos 9 y 10. Los productos amplificados fueron clonados en un vector pCR2.1 de E. coli usando un kit de clonación TOPO (Invitrogen), a fin de obtener los vectores pCR-gapA-A y pCR-gapA-B.

[Tabla 5] Cebador

Cebador: secuencia SEC ID Nº

F-gapA -SalI_P1: CAC GTC GAC GAA TGT GTC TGT ATG 7

R-gapA-XbaI_P2: TGA TCT AGA AGA TGA TGA CCT TCT 8

F-gapA -XbaI_P3: CCA TCT AGA GCT CTG GTT CTC CCA GAG 9

R-gapA -XbaI_P4: GCT TCT AGA GGT CTT AAC AGC CAT GCC 10

25

Estos vectores de PCR fueron tratados respectivamente con las enzimas de restricción incluidas en cada extremo de gapA-A y gapA-B (gapA-A: SalI, XbaI, gapA-B: XbaI) para separar los genes gapA partir de los vectores de pCR. A continuación, estos fragmentos se clonaron a través de la ligación de 3 piezas en un vector pDZ (referencia: Publicación de Patente Nº 10-2008-0025355) tratado con enzimas de restricción SalI y XbaI, para producir un vector

30 recombinante pDZ-gapA, en el que dos copias de gapA se clonaron de forma consecutiva. La figura 2 muestra un vector pDZ-gapA para la inserción cromosómica de Corynebacterium.

El vector pDZ-gapA construido se transformó en Corynebacterium glutamicum KFCC-10 881 productor de lisina preparado en el Ejemplo 7, seguido por la inserción de un vector que tiene una deleción de 300 pares de bases en el gen gapA en el gen gapA del cromosoma por entrecruzamiento secundario, a fin de producir un Corynebacterium

35 glutamicum CA01-0096 productor de lisina que tiene el gen gapA inactivado (Nº de Acceso KCCM 11012P). La PCR se realizó usando los cebadores de SEC ID Nos 7 y 10 para confirmar que el gen gapA alterado tiene una deleción de 300 pares de bases del gen gapA de tipo silvestre.

Ejemplo 9. Inducción de la expresión del gen gapN en CA01-0096

Los vectores pECCG122-Pcj7-gapN1 ~ 3 obtenidos en los Ejemplos 2, 4 y 6 se introdujeron en CA01-0096. La cepa

40 con gapA alterado no crece en un medio mínimo donde suele crecer Corynebacterium glutamicum (documento de referencia; Hideaki Yukawa et al., J. Mol Microbiol Biotechnol., 2004; 8:91-103).

Los vectores pECCG122-Pcj7-gapN1 ~ 3 se transformaron en CA01-0096 mediante un procedimiento de pulso eléctrico a fin de preparar cepas transformadas (cepa Nº CA01-0565, CA01-0566, CA01-0567). La expresión de gapN se indujo en Corynebacterium glutamicum mediante la utilización de la característica de crecimiento en un 45 medio mínimo mediante la expresión de gapN. Las cepas CA01-0565, CA01-0566, CA 02-0567 fueron depositadas en KCCM (Colección Coreana de Cultivos de Microorganismos, ubicada en 361-221 Yurim Bild., Hongje 1-dong,

imagen9

Seodaemun-gu, Seúl, Corea) el 2 de julio de 2009 con los Nos de acceso KCCM 11013P, KCCM 11014P y KCCM 11015P, respectivamente.

Ejemplo 10. Examen de la actividad gapN en la cepa productora de lisina

Se examinó el crecimiento en un medio mínimo utilizando glucosa como fuente de carbono. Como resultado, la cepa con gapA alterado no creció y la cepa que expresa gapN se recuperó y creció.

[Tabla 6] Crecimiento

Cepa: Crecimiento Sin crecimiento

KFCC10881: Crecimiento

CA01-0096: Sin crecimiento

CA01-0565: Crecimiento

CA01-0566: Crecimiento

CA01-0567: Crecimiento

Ejemplo 11. Examen de la actividad gapN en la cepa productora de lisina

Se midieron los niveles de expresión de gapN para confirmar si el gen gapN del vector de expresión de gapN se

10 expresaba en una célula con el fin de exhibir su actividad. Las cepas CA01-0565, CA01-0566 y CA01-0567 se prepararon mediante la introducción de cada uno de los vectores pECCG122-Pcj7-gapN1,2,3 en la cepa con gapA alterado, la cepa CA01-0096 con gapA alterado y la cepa KFCC 10881 con gapA se cultivaron en medios de siembra durante un día y después se diluyó a una D.O. 600 = 0,2 y se recuperaron 25 ml de cada célula a una D.O. 600 = 10. La actividad gapN se determinó por un procedimiento descrito en A. Soukri et al., Protein Expression and

15 Purification; 25; (2002) 519-529. Como resultado, se encontró gapN1 a 30 °C durante 20 horas con agitación (220 rpm). Después de esto, se inoculó 1 ml de cada uno de los cultivos de siembra en un matraz con deflector en ángulo de 250 ml que contiene 25 ml del medio de producción y se cultivó a 35 °C durante 96 horas con agitación (200 rpm). Después de la terminación del cultivo, se realizó el análisis por HPLC para determinar las cantidades de Llisina producida por las cepas. Las concentraciones de L-lisina en los cultivos de Corynebacterium glutamicum

20 KFCC-10 881, CA01-0096, CA01-0565, CA01-0566 y CA01-0567 se resumen en la siguiente Tabla 8. Como resultado, la cepa con gapA alterado no produjo lisina. Se observó que la lisina era producida por el gen gapN introducido en la cepa con gapA alterado y las cantidades de producción también se incrementaron en un 16 ~ 17%, en comparación con las de la cepa madre KFCC-10 881 (Tabla 8).

[Tabla 8] Resultado del cultivo en matraz

Nombre de cepa: Lisina (g/l)

KFCC-10881: 42

CA01-0096: 0

CA01-0565: 50

CA01-0566: 48,8

CA01-0567: 46

25

Efecto

De acuerdo con la presente divulgación, la cepa de Corynebacterium que tiene una productividad de L-lisina y una actividad gapN se prepara mediante la introducción de genes que codifican gapN obtenidos de Streptococcus y Bacillus y, por lo tanto, el poder reductor se incrementa para suministrar la energía necesaria para la producción de

30 lisina, lo que conduce al aumento de la producción de L-lisina. se incrementa para suministrar la energía necesaria para la producción de lisina, lo que conduce al aumento de la producción de L-lisina.

<110> CJ CHEILJEDANG Corporation

35 <120> Procedimiento para la producción de L-lisina en Corynebacterium sp. amplificando el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa obtenido de otra

<130> OPA10051/PCT

40 <150> KR10-2009-0062322

<151>

<160> 14

5 <170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 26

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapN_F1 de Streptococcus mutans

15 <400> 1 gcgcatatga caaaacaata taaaaa 26

<210> 2

<211> 27 20 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de gapN_R1 de Streptococcus mutans 25

<400> 2 gcgtctagat tatttgatat caaatac 27

<210> 3 30 <211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Cebador de gapN_F2 de Streptococcus agalactiae

<400> 3 gcgcatatga caaaagaata tcaa 24

40 <210> 4

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Cebador gapN_R2 de Streptococcus agalactiae

<400> 4

gcgtctagac tatttcatat caaaaac 27 50

<210> 5

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 55

<220>

<223> Cebador gapN_F3 de Bacillus cereus

<400> 5 60 gcgcatatga caactagcaa tacg 24

<210> 6

<211> 24

<212> ADN 65 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador gapN_R3 de Bacillus cereus

<400> 6 5 gcgtctagat taaactaagt ttaa 24

<210> 7

<211> 24

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador F-gapA -SalI_P1 de Corynebacterium glutamicum KFCC10881

<400> 7 15 cacgtcgacg aatgtgtctg tatg 24

<210> 8

<211> 24

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador R-gapA-XbaI_P2 de Corynebacterium glutamicum KFCC10881

25 <400> 8 tgatctagaa gatgatgacc ttct 24

<210> 9

<211> 27 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador F-gapA -XbaI_P3 de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 35

<400> 9 ccatctagag ctctggttct cccagag 27

<210> 10 40 <211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> Cebador R-gapA -XbaI_P4 de Corynebacterium glutamicum KFCC10881

<400> 10 gcttctagag gtcttaacag ccatgcc 27

50 <210> 11

<211> 1428

<212> ADN

<213> Streptococcus mutans

55 <400> 11

imagen10

<210> 12

<211> 1428

<212> ADN

<213> Streptococcus agalactiae

<400> 12

imagen11

<210> 13

<211> 1440

<212> ADN

<213> Bacillus cereus

<400> 13

imagen12

<210> 14

<211> 1005

<212> ADN

<213> Corynebacterium sp.

<400> 14

imagen13

Claims

imagen1

REIVINDICACIONES

1. La cepa de Corynebacterium sp. que tiene una actividad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP y una productividad de L-lisina, en la que un gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gapA) endógeno está inactivado y se introduce un gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa

5 dependiente de NAPD (gapN) exógeno.
2. La cepa de Corynebacterium sp. de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP exógeno es un gen que codifica la gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP de Streptococcus mutans, (ATCC 25175), Streptococcus agalactiae (ATCC BAA-611) o Bacillus cereus (ATCC 14579).

10 3. La cepa de Corynebacterium sp. de acuerdo con la reivindicación 2, en la que el gen de Streptococcus mutans, el gen de Streptococcus agalactiae y el gen de Bacillus cereus tienen las secuencias de nucleótidos de SEC ID Nos 11, 12, y 13, respectivamente.
4. La cepa de Corynebacterium sp. de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el gen que codifica la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa endógeno tiene la secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº 14.

15 5. La cepa de Corynebacterium sp. de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la cepa de Corynebacterium sp. es Corynebacterium glutamicum CA01-0565 (Nº de Acceso KCCM 11013P), Corynebacterium glutamicum CA01-0566 (Nº de Acceso KCCM 11014P) o Corynebacterium glutamicum CA01-0567 (Nº de Acceso KCCM 11015P).
6. La cepa de Corynebacterium sp. de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el aumento de la productividad de

L-lisina se obtiene del poder reductor aumentado por la activación de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa 20 dependiente de NADP.
7. Un procedimiento de producción de L-lisina, que comprende las etapas de cultivar la cepa de Corynebacterium sp. de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y recuperar la lisina a partir de las células cultivadas o del caldo de cultivo.

16