CN102471758A - 利用具有来源于外源物种的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的棒状杆菌属生产l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株，以及使用所述菌株生产L-赖氨酸的方法。根据本发明所述的棒状杆菌属菌株和使用所述菌株生产L-赖氨酸的方法，可以高产地生产L-赖氨酸。

Description

利用具有来源于外源物种的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性的棒状杆菌属生产L-赖氨酸的方法
发明背景
1.技术领域
本发明涉及具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量(productivity)提高的棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)菌株，以及利用所述菌株生产L-赖氨酸的方法。
2.背景技术
一直以来，棒状杆菌是各种化学物质的生产中应用最为广泛的工业微生物，这些化学物质在动物饲料、医药和食品工业中很有用，包括氨基酸，如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸和谷氨酸，以及核酸相关物质。这些微生物是革兰氏阳性的，并且其生长需要生物素。棒状杆菌代表性的例子是棒状杆菌属(包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum))、短杆菌属(包括黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、节杆菌属物种、细杆菌属物种等。
L-赖氨酸是一种L-氨基酸，由于其具有帮助身体吸收其他氨基酸从而提高饲料质量的能力，因此商业上被用作动物营养中的饲料添加剂。对于人体来讲，L-赖氨酸作为注射液的组分使用，在制药领域也有应用。因此，赖氨酸的工业生产在经济上是一个重要的工业工艺。
为了提高赖氨酸的产量，通常通过扩增赖氨酸生物合成途径上的基因或对这些基因的启动子进行修饰，来提高赖氨酸生物合成途径上的酶活性。此外，可以导入来源于其他细菌的外源基因，比如，在公开号为平7-121228的日本专利文献中，描述了导入来源于大肠杆菌的编码柠檬酸合成酶的基因。
同时，为了提高赖氨酸的产量，可以对体内的中心碳代谢途径进行修饰。3-磷酸甘油醛脱氢酶是中心碳代谢途径中涉及的一个酶。在棒状杆菌中，它以gapA的形式存在，以NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为1，3-二磷酸甘油酸，其中，pgk基因编码的酶将1，3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸。与之相反，在链球菌和芽孢杆菌中，它以非磷酸化的NADP依赖型GADPH(非磷酸化的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，下文中称为gapN)形式存在，其以NADP作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸，并产生NADPH。该过程是个单步的过程，在糖酵解中扮演重要角色，并受到NADPH/NADP比例的影响(Iddar，A等人，Protein Expr Purif.25(3)：519-26(2002))。
有报道指出，gapN酶在棒状杆菌中并不天生存在。目前也没有在培养棒状杆菌中使用gapN基因的报道。但是，已有通过导入gapN基因提高氨基酸产率的在先专利。例如，申请号为10-2004-0116999的韩国专利申请和US11/722,820的美国专利文献中描述了在大肠杆菌中表达gapN，以提高赖氨酸的产量，但是目前没有将其应用于棒状杆菌的报导。因此，为了达到gapN基因的效果，曾试图将源于醋酪酸梭状芽胞杆菌(Clostridium acetobutyricum)的gapN在生产赖氨酸的棒状杆菌中表达，但是没有获得满意的结果。因此，本发明人通过文献搜索(Abdelaziz Soukri等人，INTERNATIONAL MICROBIOLOGY(2005)8：251-258)，探索研究了存在于异源细菌中的三种类型的gapN基因。
本发明人发现，不使用NAD作为辅酶，而使用NADP作为辅酶，并为此对gapN进行表达，结果更高水平的NADPH可被用作赖氨酸生物合成的还原力来源。这样，棒状杆菌属菌株的L-赖氨酸的产量可以得到提高，由此完成了本发明。
发明概述
本发明的一个目的就是提供具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株，以及利用所述菌生产L-赖氨酸的方法。
附图简述
图1显示了变异链球菌(Streptococcus mutans)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)或蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapN)的表达质粒pECCG122-Pcj7-gapN的切割图谱；和
图2显示了用于破坏gapA基因的染色体插入载体PDZ-gapA的切割图谱。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明提供了一种具有NADP依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株。
本发明所述的L-赖氨酸产量提高的棒状杆菌属菌株，可以通过失活内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapA)和导入外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapN)而获得。
在本发明中，外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因包括编码多肽的任何核苷酸，只要所述多肽具有以NADP作为辅酶，将3-磷酸甘油醛作为底物转化为3-磷酸甘油酸的活性。
外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因例子包括：来源于动物、植物和细菌的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因，优选地为来源于细菌的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因，最优选地为来源于变异链球菌、无乳链球菌或蜡样芽孢杆菌的NADP依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因。更具体地，变异链球菌、无乳链球菌和蜡样芽孢杆菌的基因可以分别具有如SEQ ID NO.11(GenBank登录号NC_004350)、12(GenBank登录号NC_004116)和13(GenBank登录号NC_004722.1)所示的核苷酸序列。
可以使用本领域广泛知晓的通用方法将外源NADP依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因导入棒状杆菌中。
具体来说，可以用以下方式实现：通过将外源NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因导入载体，从而获得NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达重组载体；以及将该重组载体导入内源3-磷酸甘油醛脱氢酶基因失活的棒状杆菌，以产生转化的棒状杆菌。
可以使用通用的方法制备NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达重组载体，例如，用限制性内切酶将外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶与合适的载体连接。在本发明中，载体可以是具有如图1所示切割图谱的载体。在本发明的一个具体实施例中，用于导入变异链球菌、无乳链球菌和蜡样芽孢杆菌基因的载体分别是pECCG122-Pcj7-gapN1、pECCG122-Pcj7-gapN2和pECCG122-Pcj7-gapN3。
所述内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因是指编码下述酶的基因：在棒状杆菌中，所述酶具有将NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛作为底物转化为1，3-二磷酸甘油酸的活性，优选地，是指具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列(NCBI登录号NC_003450、NCgl1526)的基因。
进一步，为了失活内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶的编码基因，可以进行遗传操作，如棒状杆菌gapA基因的敲除、替代或插入。优选地，棒状杆菌可以用包括部分gapA基因的重组载体进行转化，例如，具有失活的gapA活性的菌株可以通过导入具有图2所示切割图谱的载体进行制备。在本发明的一个具体实施例中，使用pDZ-gapA重组载体作为染色体插入载体，所述载体具有连续克隆出的一部分内源3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因的两个片段。优选地，用该染色体插入载体进行转化的棒状杆菌可以是(但不限于)：谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881。根据本发明的一个具体实施例，其内源3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因被破坏的棒状杆菌可以是谷氨酸棒状杆菌CA01-0096(保藏号KCCM 11012P)。
如本文所用，术语“转化”是指将DNA导入宿主，其中该DNA仍保持为染色体外的元件或整合入染色体中，并可进行复制。如本文所用，术语“转染”是指具有任意编码序列的表达载体被宿主细胞所接受，所述表达载体可以表达也可以不表达。如本文所用，术语“转染的宿主”和“转化的宿主”是指被导入DNA的细胞。该细胞称为“宿主细胞”，其可以是原核的或真核的细胞。典型的原核细胞包括各种菌株如“大肠杆菌”。术语“载体”是指具有一段DNA序列的DNA产物，所述DNA序列可操作地相连于一个调控序列，所述DNA产物可以在合适的宿主中表达DNA。所述调控序列的例子包括：转录启动子，调控转录的任意操纵子序列；一段编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和调控转录终止翻译终止的序列。载体的例子可以包括质粒、噬菌体颗粒或简单的潜在基因组插入体。一旦转入合适的宿主，所述载体可以独立于宿主基因组进行复制并行使功能，或者在某些情况下，自身可以整合入基因组中。如本文所用，术语“质粒”和“载体”有时可以互换使用，因为质粒是目前最广泛使用的载体形式。术语“调控序列”是指一段DNA序列，所述的DNA序列对于在一个特定宿主生物体中可操作连接的编码序列的表达是必需的。例如，在原核生物中表达所必需的调控序列包括启动子、任选的操纵(子)序列和核糖体结合位点。已知真核生物使用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当一个核酸被设置在与另一核酸序列具有功能性关系时，它就“可操作地连接”于该核酸序列。这意味着基因以这样的方式连接：当调节序列与合适的分子(如转录激活蛋白)结合，使基因表达。例如，当作为前导蛋白表达，参与多肽的分泌时，前导序列或分泌序列的DNA是可操作地连接于多肽的DNA；当影响到编码序列的转录时，启动子或增强子是可操作地连接于编码序列；当影响编码序列的转录时，核糖体结合位点是可操作地连接于编码序列；或当促进翻译时，核糖体结合位点是可操作地连接于编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA是连续的，并且在分泌肽的例子中，是连续的并处于同一阅读框。但是，增强子并不需要与编码序列直接相连。序列之间的连接可以通过便利的限制性内切酶位点的连接来实现。但是，当没有限制性内切酶位点时，可以根据常用方法使用合成的寡核苷酸接头。
如本文所用，术语“载体”是指插入了异源DNA片段的重组载体，所述的DNA片段通常是双链的DNA片段。在这里，异源DNA是指在宿主细胞中并不天然存在的异种DNA。一旦导入宿主细胞，表达载体可以不依赖于宿主基因组DNA进行复制，产生若干拷贝及其所插入的(异源)DNA。
为了提高宿主细胞中转入基因的表达水平，相应的基因必须与在所选的表达宿主中执行转录和翻译功能的表达控制序列可操作地连接，这是本领域的普通技术人员所知晓的。优选地，表达控制序列和基因部包含在单个表达载体中，所述表达载体包括细菌选择标记和复制起点。当表达宿主为真核细胞时，表达载体必须还包括真核表达宿主中有用的表达标记。
可用于制备本发明重组载体的载体，可以来源于在棒状杆菌中可自主复制的载体，例如噬菌体载体或质粒载体。噬菌体载体或粘粒载体的例子包括：pWE15、M13、λEMBL3、λEMBL4、λFIXII、λDASHII、λZAPII、λgt10、λgt11、Charon4A和Charon21A，质粒载体的例子包括：pBR质粒、pUC质粒、pBluescriptII质粒、pGEM质粒、pTZ质粒、pET质粒、pMal质粒、pQE质粒等等。
进一步地，可用于本发明的棒状杆菌包括任何棒状杆菌，只要它能生产L-赖氨酸。棒状杆菌的例子包括：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜热棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、和发酵短杆菌(Brevibacterium fermentum)。
本发明的棒状杆菌包括具有L-赖氨酸产量提高的突变型菌株，也包括野生型菌株。例子包括：需要蛋氨酸营养的菌株或对苏氨酸类似物(AHV：α-氨基-β-羟基 戊酸)、赖氨酸类似物(AEC：S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸)、异亮氨酸类似物(α-氨基丁酸)、蛋氨酸类似物(乙基硫氨酸)等具有抵抗性的菌株。另外，为了提高L-赖氨酸的产量，所述菌株可以是L-赖氨酸产量提高的突变株，所述突变株是通过提高导入基因的拷贝数或对基因的调节序列进行操作而制备的。优选地，它可以包括(但并不限于)：谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、嗜热棒状杆菌FERM BP-1539、黄色短杆菌ATCC14067、乳糖发酵短杆菌ATCC13869和由此制备的生产L-氨基酸的突变株或菌株，例如，谷氨酸棒状杆菌KFCC11001，最优选地，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。
本发明的一个具体实施例中，提供了棒状杆菌属的菌株，谷氨酸棒状杆菌CA01-0565(保藏号KCCM 11013P)，谷氨酸棒状杆菌CA01-0566(保藏号、KCCM11014P)和谷氨酸棒状杆菌CA01-0567(保藏号KCCM 11015P)，所述菌株是通过分别将变形链球菌的基因、无乳链球菌的基因和蜡样芽孢杆菌的基因导入内源3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因失活的谷氨酸棒状杆菌KFCC10881而制备的。这些菌株于2009年7月2日保藏在KCCM(韩国微生物保藏中心，地址：361-221育民大厦，洪济-1-洞，西大门区，首尔，韩国)。
L-赖氨酸产量的提高是由于通过激活NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，使得还原力得到提高。将外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶而不是内源NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶导入产生L-赖氨酸的棒状杆菌中，使得NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶被激活，从而使菌株利用NADP而非NAD作为辅酶，这样，NADPH水平的提高可以用作L-赖氨酸生物合成中还原力的来源。
本发明的另一个实施例提供了生产L-赖氨酸的方法，包括步骤：培养具有NADP依赖的3-磷酸甘油醛脱氢酶活性和L-赖氨酸声量提高的棒状杆菌，和从培养细胞或培养液(culture broth)中回收L-赖氨酸。
根据本发明，使用的棒状杆菌属菌株可以是连续或批次法培养，如分批处理、分批补料培养和重复的分批补料培养。在教科书[Chmiel，(Bioprozesstechnik1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)；和Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)]中概括描述了已知的培养方法。
使用的培养基必须以合适的方式满足特定菌株的需求。在手册[“Manual ofMethods for General Bacteriology”，美国细菌学学会(华盛顿，美国，1981年)]中可以找到棒状杆菌培养基的描述。有用的碳源可以包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类，如甘油和乙醇，以及有机酸，如乙酸。这些物质可以单独或以混合物的形式使用。有用的氮源可以包括含有机氮的化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或无机化合物，如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独或以混合物的形式使用。有用的磷源可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或其相应的含钠盐。培养基还必须包括生长必需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述提到的物质外，还可以使用基本生长物质，如氨基酸和维生素。合适的前体也可以添加到培养体系中。在培养中，所提到的物质可以以合适的形式连续地或分批地添加到培养体系中。
为了控制培养体系的pH值，宜使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾和氨，或者酸类化合物如磷酸或硫酸。为了控制发泡，可以使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持有氧的状态，可将氧气或含氧的气体如空气通入培养体系中。培养温度一般为20℃-45℃，优选为25℃-40℃。连续培养直至所需的L-氨基酸形成最高产量。该目标通常在10小时-160小时的期间内达到。
可以通过离子交换色谱法及其随后的茚三酮衍生作用对L-氨基酸进行分析(Spackman等人，(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)。
将根据下述实施例进行更详细地描述本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。
实施例1.变形链球菌gapN基因的研究和克隆
来源于链球菌的gapN基因序列已被清晰地揭示。变形链球菌gapN基因的信息(登录号NC_004350)获自NIH基因银行。根据已报道的序列，合成了下面表1中描述的一对引物，使用变形链球菌ATCC25175菌株的染色体DNA作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)[Sambrook等人，分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室]扩增1428bp的gapN基因(PCR条件：变性＝94℃、30秒/复性＝50℃、30秒/聚合＝72℃、1分钟30秒，30个循环)，使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆入大肠杆菌质粒pCR2.1中，获得质粒pCR-gapN1。
[表1]引物
  引物   序列   SEQ ID NO.
  gapN_F1   5’-GCG CAT ATG ACA AAA CAA TAT AA AAA-3’   1
  gapN_R1   5’-GCG TCT AGA TTA TTT GAT ATC AAA TAC-3’   2
实施例2.构建gapN表达载体
使用限制性内切酶Nde-I和Xba-I，对实施例1获得的含有gapN基因的载体pCR-gapN1进行切割，只分离编码gapN的基因片段，将表达启动子Pcj7(参考公开号为2006-0068505的专利文献)与大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭载体pECCG122连接(参考公开号为1992-0000933的专利文献)，从而构建形成pECCG122-Pcj7-gapN1(图1)。
实施例3无乳链球菌gapN基因的研究和克隆
来源于链球菌的gapN基因序列已被清晰地揭示。无乳链霉菌gapN基因信息(登录号NC_004116)获自NIH基因银行。根据已报道的序列，合成了下面表2中描述的一对引物，使用无乳链球菌ATCC BAA-611菌株的染色体DNA作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)[Sambrook等人，分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室]扩增了1428bp的gapN基因的(PCR条件：变性＝94℃、30秒/复性＝50℃、30秒/聚合＝72℃、1分钟30秒，30个循环)，使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆入大肠杆菌质粒pCR2.1中，获得质粒pCR-gapN2。
[表2]引物
  引物   序列   SEQ ID NO.
  gapN_F2   5’-GCG CAT ATG ACA AAA GAA TAT CAA-3’   3
  gapN_R2   5’-GCG TCT AGA CTA TTT CAT ATC AAA AAC-3’   4
实施例4.gapN表达载体的构建
使用限制性内切酶Nde-I和Xba-I，对实施例3获得的含有gapN基因的载体pCR-gapN2进行切割，只分离编码gapN的基因片段，将表达启动子Pcj7(参考公开号为2006-0068505的专利文献)与大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭载体pECCG122连接(参考公开号为1992-0000933的专利文献)，从而构建形成pECCG122-Pcj7-gapN2(图1)。
实施例5.蜡样芽孢杆菌gapN基因的研究和克隆
来源于芽孢杆菌的gapN基因序列已被清晰地揭示。蜡样芽孢杆菌gapN基因信息(登录号NC_004722.1)获自NIH基因银行。根据已报道的序列，合成了下面表3中描述的一对引物，使用蜡样芽孢杆菌ATCC14579菌株的染色体DNA作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)[Sambrook等人，分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室]扩增了gapN基因的1428个碱基对(PCR条件：变性＝94℃、30秒/复性＝50℃、30秒/聚合＝72℃、1分钟30秒，30个循环)，使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)将其克隆入大肠杆菌质粒pCR2.1中，获得质粒pCR-gapN3。
[表3]引物
  引物   序列   SEQ ID NO.
  gapN_F3   5’-GCG CAT ATG ACA ACT AGC AAT ACG-3’   5
  gapN_R3   5’-GCG TCT AGA TTA AAC TAA GTT TAA-3’   6
实施例6.gapN表达载体的构建
使用限制性内切酶Nde-I和Xba-I，对实施例5获得的含有gapN基因的载体pCR-gapN3进行切割，只分离编码gapN的基因片段，将表达启动子Pcj7与大肠杆菌和棒状杆菌的穿梭载体pECCG122连接，从而构建形成pECCG122-Pcj7-gapN3(图1)。
实施例7.通过人工突变制备生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)
人工突变制备的具有S-(2-氨乙基)半胱氨酸抵抗性(以下称为“AEC”)和高丝氨酸渗漏型的谷氨酸棒状杆菌(KFCC-10881)，被用作菌株，并将负责赖氨酸生物合成途径的多个基因插入该菌株内。
以野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)作为亲本菌株，来制备突变菌株KFCC-10881。用终浓度为500μg/ml的诱变剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(下文称作“NTG”)对107～108个细胞/ml的亲本菌株在30℃处理30分钟，接着在含有5g/L的AEC的复合平板上选择生长的菌落。对初始突变菌株的AEC抗性和赖氨酸产率进行分析后，用NTG进行二次突变。用牙签将如此形成的多个菌落挑入补充或不补充高丝氨酸(100mg/L)的基本培养基中，以便分离不能在缺乏高丝氨酸的基本培养基中生长的高丝氨酸营养缺陷体(二次突变体)。高丝氨酸营养缺陷体允许进行第三次突变，以便产生高丝氨酸渗漏菌株，所述菌株是通过在含有10mg/L高丝氨酸的基本培养基中培养后鉴别出的。对培养基中生长的菌株进行赖氨酸产量检测(表4)。获得的具有AEC抵抗和高丝氨酸渗漏型的赖氨酸产生菌保藏于韩国培养物保藏联合会(KFCC)，保藏号为KFCC-10881。
[表4]KFCC-10881的赖氨酸产量
Figure BDA0000129633510000101
基本培养基(pH 7.0)
葡萄糖10g，(NH4)2SO45g，尿素2g，KH2PO41g，K2HPO42g，MgSO47H2O0.4g，生物素200μg，盐酸硫胺素3000μg，泛酸钙1000μg，烟酰胺5000μg，NaCl 0.5g(每1L蒸馏水)
种子培养基(pH 7.0)
葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物10g，尿素5g，KH2PO44g，K2HPO48g，MgSO47H2O 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺素1000μg(每1L蒸馏水)
生产培养基(pH 7.0)
葡萄糖100g，(NH4)2SO4 40g，大豆蛋白2.5g，玉米浆(固态)5g，尿素3g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺素1000μg，CaCO3 30g(每1L蒸馏水)
实施例8.克隆来源于生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的gapA 基因，构建重组载体(pDZ-gapA)，以及制备gapA被破坏的菌株
在本实施例中，使用实施例7中制备的生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的染色体DNA作为模板，通过PCR获得赖氨酸生物合成途径的gapA基因。根据NIH基因银行，获得gapA基因(NCBI登录号NC_003450，NCgl1526)的序列信息，合成两对引物(表5，SEQ ID NO.7-10)。
使用谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881的染色体DNA作为模板，用一对如SEQID NO.7和10所示的寡核苷酸引物，在PfuUltraTM高保真DNA聚合酶(Stratagene)存在的下，进行PCR，96℃变性30秒；53℃退火30秒；72℃聚合30秒，30个循环。发现获得的PCR产物有两种600bp的gapA基因片段(gapA-A、gapA-B)。使用SEQ ID NO.7和8的引物对gapA-A进行扩增，使用SEQ ID NO.9和10的引物对gapA-B进行扩增。扩增产物使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)克隆入大肠杆菌载体pCR2.1中，从而获得载体pCR-gapA-A和pCR-gapA-B。
[表5]引物
  引物   序列   SEQ ID NO.
  F-gapA-SalI_P1   CAC GTC GAC GAA TGT GTC TGT ATG   7
  R-gapA-XbaI_P2   TGA TCT AGA AGA TGA TGA CCT TCT   8
  F-gapA-XbaI_P3   CCA TCT AGA GCT CTG GTT CTC CCA GAG   9
  R-gapA-XbaI_P4   GCT TCT AGA GGT CTT AAC AGC CAT GCC   10
为了从pCR载体中分离gapA基因，分别用gapA-A和gapA-B的各末端(gapA-A：SalI，XbaI，gapA-B：XbaI)所含的限制性酶处理这些pCR载体。接着，将这些片段通过3-片段连接法克隆入用限制性酶SalI和XbaI处理的pDZ载体(参考公开号为10-2008-0025355的专利文献)，以产生gapA的两个拷贝被连续克隆的pDZ-gapA重组载体。图2显示了用于棒状杆菌染色体插入的pDZ-gapA载体。
将构建的pDZ-gapA载体转入实施例7制备的生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881中，接着通过二次交换将gapA基因缺失300个碱基对的载体插入染色体的gapA基因，产生gapA基因失活的生产赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌CA01-0096(保藏号：KCCM 11012P)。使用SEQ ID NO.7和10的引物进行PCR，以确认被破坏的gapA基因缺失了野生型gapA基因的300个碱基对。
实施例9.诱导CA01-0096中gapN基因的表达
将实施例2、4和6中获得的载体pECCG122-Pcj7-gapN1、pECCG122-Pcj7-gapN2、和pECCG122-Pcj7-gapN3转入CA01-0096。已知，在谷氨酸棒状杆菌通常生长的基本培养基中，gapA被破坏的菌株是不能生长的(参考文献：Hideaki Yukawa等人，J Mol Microbiol Biotechnol 2004；8：91-103)。
通过电子脉冲的方法将载体pECCG122-Pcj7-gapN1、pECCG122-Pcj7-gapN2、和pECCG122-Pcj7-gapN3转入CA01-0096中，从而制备转化菌株(菌株号CA01-0565、CA01-0566、CA01-0567)。通过利用gapN表达在基本培养基中生长的特性，对谷氨酸棒状杆菌的gapN表达进行诱导。菌株CA01-0565、CA01-0566、CA01-0567于2009年7月2日保藏在KCCM(韩国微生物保藏中心，地址：361-221育民大厦，洪济-1-洞，西大门区，首尔，韩国)，保藏号分别为：KCCM 11013P、KCCM 11014P和KCCM 11015P。
实施例10.检测赖氨酸生产菌中gapN的活性
检测在以葡萄糖作为碳源的基本培养基中的生长情况。结果，gapA破坏的菌株没有生长，表达gapN的菌株恢复生长。
[表6]生长
  菌株   生长   不生长
  KFCC10881   生长
  CA01-0096   不生长
  CA01-0565   生长
  CA01-0566   生长
  CA01-0567   生长
实施例11.检测赖氨酸生产菌中gapN的活性
检测gapN的表达水平，以确认来自gapN表达载体的gapN基因在细胞中是否表达并具有活性。将pECCG122-Pcj7-gapN1、2、3的每个载体导入gapA被破坏的菌株从而制备的CA01-0565、CA01-0566和CA01-0567菌株、gapA被破坏的CA01-0096菌株和存在gapA的KFCC-10881菌株，在种子培养基中培养1天，然后稀释至O.D 600＝0.2，每种细胞取25ml，使其恢复至O.D 600＝10。使用A.Soukri等人在Protein Expression and Purification；25；(2002)519-529中所描述的方法测定gapN的活性。结果发现，gapN1的活性是1个单位(unit)，gapN2的活性是0.64个单位，gapN3的活性是0.09个单位(表7)。
[表7]分析结果
单位：nmol/mg.min＝单位
实施例12.gapN表达菌株的赖氨酸产率
用下述方法对菌株CA01-0565、CA01-0566和CA01-0567的L-赖氨酸产率进行分析。将谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、CA01-0096、CA01-0565、CA01-0566和CA01-0567接种入含有25ml种子培养基的250ml三角挡板摇瓶中，30℃震动(220rpm)培养20小时。随后，每个种子培养基取1ml，接种入含有25ml生产培养基的250ml三角挡板摇瓶中，35℃震动(220rpm)培养96小时。培养完成后进行HPLC分析，以确定菌株产生的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒状杆菌KFCC-10881、CA01-0096、CA01-0565、CA01-0566和CA01-0567培养物中L-赖氨酸的浓度总结于下面的表8中。结果，gapA被破坏的菌株不产赖氨酸。发现赖氨酸是由导入gapA被破坏的菌株的gapN基因产生的，且与亲本菌株(KFCC-10881)相比，其产量也提高了16～17％(表8)。
[表8]摇瓶培养结果
  菌株名称   赖氨酸(g/l)
  KFCC-10881   42
  CA01-0096   0
  CA01-0565   50
  CA01-0566   48.8
  CA01-0567   46
发明的效果
根据本发明，通过导入来源于链球菌和芽孢杆菌的gapN编码基因，制备具有L-赖氨酸生产力和gapN活性的棒状杆菌，结果提高了还原力，为赖氨酸的生产提供所需的能量，导致L-赖氨酸的产量提高。
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Figure IDA0000129633580000021
Figure IDA0000129633580000041
Figure IDA0000129633580000051
Figure IDA0000129633580000061

Claims (8)

1.一种棒状杆菌属菌株，其特征在于，所述菌株具有NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性并且具有提高的L-赖氨酸产量。
2.如权利要求1所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，所述内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapA)是失活的，且导入了外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gapN)。
3.如权利要求2所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，所述外源的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因来自于变形链球菌(ATCC 25175)、无乳链球菌(ATCC BAA-611)或蜡样芽孢杆菌(ATCC 14579)。
4.如权利要求3所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，变形链球菌的基因、无乳链球菌的基因和蜡样芽孢杆菌的基因分别具有SEQ ID NO.11、12和13所示的核苷酸序列。
5.如权利要求2所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，内源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因具有如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，棒状杆菌属菌株是谷氨酸棒状杆菌CA01-0565(保藏号KCCM 11013P)、谷氨酸棒状杆菌CA01-0566(保藏号KCCM 11014P)或谷氨酸棒状杆菌CA01-0567(保藏号KCCM11015P。
7.如权利要求1所述的棒状杆菌属菌株，其特征在于，L-赖氨酸产量的提高是通过激活NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，使还原力提高获得的。
8.一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求1-7之任一所述的棒状杆菌属菌株；和从培养的细胞或培养液中回收L-赖氨酸。
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