KR20110004733A - 외래종 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 획득한 코리네박테리움 속의 l-라이신 생산방법 - Google Patents
외래종 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 획득한 코리네박테리움 속의 l-라이신 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 갖고, L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 생산방법에 관한 것으로 본 발명의 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 생산방법에 따르면 높은 수율로 L-라이신을 생산할 수 있다.
코리네박테리움, 글리세르알데하이드-3-포스페이트, NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제, 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제, 스트렙토코쿠스, 바실러스, L-라이신, L-아미노산
Description
본 발명은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 갖고, L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 생산방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 전통적으로 아미노산과 핵산관련물질의 생산에 가장 널리 이용되는 산업용 미생물로서, 주로 L-라이신(lysine), L- 쓰레오닌(threonine), L-아르기닌(arginine) 및 글루탐산 등의 아미노산 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는데 이용되는 그람양성세균이며, 생육에 비오틴을 요구한다. 대표적인 균종으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 포함한 코리네박테리움 속, 브레비박테 리움 플라붐(Brevibacterium flavum)을 포함한 브레비박테리움 속, 아쓰로박터 종 (Athrobacter sp.), 및 마이크로박테리움 종 (Microbacterium sp.) 등이 있다.
L-라이신은 L-아미노산의 하나로서, 기타 아미노산의 흡수를 증가시킴으로써 사료의 질을 향상시킬 수 있는 능력으로 인해 동물 사료보충물로서 상업적으로 사용되고 있고, 인체 의학에서는 특히 주입용 용액제의 성분으로서 사용되며, 제약산업에도 사용되고 있다. 그러므로 라이신을 산업적으로 생산하는 것은 경제적으로 중요한 산업공정이다.
라이신의 생산효율을 개선시키기 위한 방법으로 라이신 생합성 경로상의 유전자를 증폭시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜, 생합성 경로 상의 효소 활성을 증대시키는 방법이 이용되어 왔다. 또한, 외부의 다른 박테리아 유래의 유전자를 도입하는 경우도 있어, [일본 특허공보 제(평)7-121228호]에는 에스케리키아 콜리 유래의 시트르산 신타제를 암호화하는 유전자를 도입하는 방법이 기술되어 있다.
한편, 라이신 생산성을 향상시키기 위하여 생체 내 중앙탄소대사 과정에 변형을 가할 수 있다. 중앙탄소대사 과정에 관여하는 효소인 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는, 코리네박테리아에서는 NAD를 조효소로 이용하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (glyceraldehyde-3-phosphate)를 글리세레이트-1,3-비스포스페이트 (glycerate- 1,3-bisphosphate)로 전환시켜주는 효소인 gapA의 형태로 존재하고 글리세레이트-1,3-비스포스페이트 (glycerate-1,3-bisphosphate)는 pgk 유전자에 의해 3-포스포글리세레이트 (3-phasphateglycerate)로 전환이 되는 두 단계의 과정을 거치는 반면에, 스트렙토코쿠스 및 바실러스에서는 글리세르알데하이드-3-포스페이트(glyceraldehyde-3-phosphate)의 조효소인 NADP를 이용하여 3-포스포글리세레이트 (3-phasphateglycerate)로 전환시켜주는 비인산화 NADP 의존적 GAPDH (nonphosphorylation NADP-dependent glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 이하,gapN)효소로 존재하고, NADPH를 생산하면서 해당과정에서 중요한 역할을 하며 NADPH/NADP 비율에 의해 영향을 받으며 한 단계의 과정으로 이루어진다. (Iddar, A 등, Protein Expr Purif. 25(3):519-26(2002)).
코리네박테리움에는 gapN 유전자가 없다고 보고되어 있으며, gapN을 암호화하는 유전자를 코리네박테리움 세균의 육종에 이용하는 것도 공지되어 있지 않다. 그러나, gapN 유전자를 도입하여 아미노산 생산을 증가한 선행문헌으로, 특허 출원KR10-2004-011699 및 US11/722,820에서는 대장균에서 gapN을 발현시켜 라이신 생산량을 증가시킨 예가 있지만, 코리네박테리움에 대하여는 그 실시예가 없었다. 이에, gapN의 효과를 보기 위하여 코리네박테리움의 라이신 생산균주에서 클로스트리디움 아세토부틸리쿰의 gapN 발현실험을 수행해 보았더니 그 효과가 미미하였다. 이에, 논문 탐색을 통하여 (Abdelaziz Soukri et al. INTERNATIONAL MICROBIOLOGY (2005) 8:251-258) 외래종의 세균에 존재하는 3종의 gapN 유전자를 찾았다.
본 발명자들은 상기 검색한 gapN 유전자를 클로닝 한 후, L-라이신 생산균주에 도입하여 L-라이신 생산에 미치는 영향을 확인한 결과, NAD을 조효소로 이용하는 대신에 NADP를 이용하도록 gapN을 발현시켜서 NADPH의 양을 늘려 라이신 생합성과정에서 에너지원인 환원력으로 사용하여 상기 균주의 L-라이신 생산력이 향상될 수 있다는 것을 발견하고 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 갖고, L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주 및 이를 이용한 L-라이신의 생산방법을 제공하기 위한 것이다.
일 태양으로 본 발명은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 갖고, L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주를 제공한다.
본 발명의 L-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 균주는 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(gapA)를 코딩하는 유전자를 불활성화시키고, 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자(gapN)를 도입하여 얻어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (glyceraldehyde-3-phosphate)를 기질로 하고 조효소인 NADP를 이용하여 3-포스포 글리세레이트(3-phasphateglycerate)로 전환하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드이면 어느 것이든 포함된다.
상기 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자의 예에는 동물, 식물, 및 박테리아로부터 유래한 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자가 포함된다. 바람직하게는 박테리아로부터 유래한 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자이고, 가장 바람직하게는, 스트렙토코크스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코크스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터 유래하는 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자이다. 보다 구체적으로 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래 유전자, 스트렙토코크스 아갈락티에 유래 유전자 및 바실러스 세레우스 유래 유전자는 각각 서열번호 11(진뱅크 등록번호:NC_004350), 12(진뱅크 등록번호:NC_004116),및 13(진뱅크 등록번호:NC_004722.1)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 코리네형 세균 내에 도입될 수 있다.
구체적으로, 상기 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자를 벡터 내에 도입하여 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포 스페이트 디하이드로지나제 발현용 재조합 벡터를 제조하고, 상기 벡터를 내재된 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자가 불활성화된 코리네형 세균 내에 도입하여 형질전환된 코리네형 세균을 생산함으로써 이루어질 수 있다.
상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 발현용 재조합 벡터는 통상적인 방법 즉, 적절한 벡터에 제한효소를 사용하여 외래 NADP 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 유전자 염기서열을 라이게이션시킴으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 벡터일 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에서 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래 유전자, 스트렙토코크스 아갈락티에 유래 유전자 및 바실러스 세레우스 유래 유전자를 도입하기 위한 벡터는 각각 pECCG122-Pcj7-gapN1, pECCG122-Pcj7-gapN2, 및 pECCG122-Pcj7-gapN3이다.
상기 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 코리네박테리아움 종 균주에서 NAD를 조효소로 이용하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트 (glyceraldehyde-3-phosphate)를 기질로 하여 글리세레이트-1,3-비스포스페이트 (glycerate-1,3-bisphosphate)로 전환시키는 효소를 코딩하는 유전자를 말하고, 바람직하게는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열(NCBI 등록번호 NC_003450, NCgl1526)을 갖는 유전자이다.
또한, 상기 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자를 불활성화 하기 위하여 코리네박테리움 속 균주가 천연의 상태로 가지고 있는 gapA 유전자를 결실, 치환 또는 삽입시키는 유전자 조작을 가할 수가 있고, 바람직하게는 gapA 유전자의 일부를 포함하는 재조합 벡터로 코리네형 박테리아를 형질전환할 수 있으며, 일 예로 도 2의 개열지도를 갖는 벡터를 도입시킴으로써 gapA 활성이 불활성화된 균주를 제작할 수 있다. 본 발명의 구체적인 예에서 염색체 삽입용 벡터는 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자 단편 두 조각이 연속적으로 클로닝된 pDZ-gap A 재조합 벡터를 사용하였다. 이러한 염색체 삽입용 벡터를 형질전환할 코리네형 박테리아는 바람직하게는, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881가 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자가 파괴된 코리네형 박테리아는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0096일 수 있다.
본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염된 숙주" 및 "형질전환된 숙주"는 DNA의 세포로의 도입을 의미한다. 그 세포는 "숙주 세포"로 불리우며 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 전형적인 원핵 숙주 세포는 이. 콜라이의 각종 균주를 포함한다. 용어 "벡터'는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위 한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 용어 "조절 서열"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 이종 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA로서 정의된다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 오리진을 더 포함하는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
본 발명의 재조합 벡터 제조시 사용가능한 벡터로는 코리네형 박테리아에서 자율적으로 증식할 수 있는 벡터로부터 유래한 것일 수 있다. 예를 들면, 파지벡터 또는 플라스미드 벡터로부터 유래할 수 있다. 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λ gt10, λgt11, Charon4A, Charon21A 등을 들 수 있고, 플라스미드 벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계, pMal계, pQE계 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.)은 코리네박테리움 속에 속하고, L-라이신 생산능을 갖는 것이면 어느 것이 포함된다. 상기 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.)의 예에는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 브리비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 및 브리비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium fermentum)가 있다.
본 발명의 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.)에는 야생형 균주뿐만 아니라, L-라이신 생산능이 개선된 변이주도 포함된다. 예를 들면, 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체 (AHV: α-아미노-β-히드록시 발레릭산)에 대한 내성, 라이신 유사체 (AEC: S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)에 대한 내성, 이소루이신 유사체(α-아미노부티릭에시드)에 대한 내성, 메티오닌의 유사체(에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 지닌 균주들이 될 수 있다. 또한, L-라이신 생산능을 향상시키기 위하여, 도입된 유전자의 카피수의 증가시키거나 유전자 조절서열을 조작함으로써 L-라이신 생산능이 개선된 균주로 변이될 수도 있다. 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토 페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001이 포함될 수 있다. 가장 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 예에서는 각각 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래 유전자, 스트렙토코크스 아갈락티에 유래 유전자, 및 바실러스 세레우스 유래 유전자를 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 도입하여 생산된 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0565 (수탁번호KCCM-), 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0566 (수탁번호KCCM-),및 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0567 (수탁번호KCCM-)인 코리네박테리움 속 균주를 제공한다.
L-라이신 생산능력의 향상은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성화 의해 증가된 환원력에 기인한다. 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제 대신에 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코리네박테리움 L-라이신 생산 균주에 도입하여, NAD을 조효소로 이용하는 대신에 NADP를 이용하도록 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 활성화시키고, 이를 통해 NADPH의 양을 늘려 L-라이신 생합성과정에서 에너지원인 환원력으로 사용할 수 있다.
다른 태양으로 본 발명은 상기 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 갖고, L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주를 배양하는 단계, 및 상기 배양된 세포 또는 세포 배양물로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 사용되는 코리네박테리움 속 균주는 배치 공정(batch process) 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식 또는 회분식으로 배양할 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.
사용되는 배양 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포 함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.
L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의해 분석할 수 있다(Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).
본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명된다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되어서는 아니된다.
본 발명은 스트렙토코쿠스속 및 바실러스속 유래의 gapN을 암호화하는 유전자를 도입함으로써 L-라이신 생산능력을 가지며 gapN 활성을 가지는 코리네박테리움 균주를 이용해 환원력을 증가시켜 라이신 생산에 필요한 에너지를 공급받아 라이신 생산 능력이 향상된 L-라이신 제조법을 제공하였다.
실시예
1.
스트렙토코쿠스
뮤탄스
유래
gapN
유전자 검색 및
클로닝
스트렙토코쿠스 유래의 gapN 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어있다. 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 gapN 유전자정보(등록번호 NC_004350)를 확보하였다. 보고된 염기서열에 근거하여 아래 표 1에서 기재된 한쌍의 프라이머를 합성하고 스트렙토코쿠스 뮤탄스 ATCC25175 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=94℃, 30초/Annealing=50℃,30초/Polymerization=72℃,1분 30초, 30회)에 의해 1428 염기쌍의 gapN 유전자 를 증폭한 뒤 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-gapN1 플라스미드를 얻었다.
표 1. 프라이머
프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
gapN_F1 | 5'-GCG CAT ATG ACA AAA CAA TAT AA AAA-3 | 1 |
gapN_R1 | 5'-GCG TCT AGA TTA TTT GAT ATC AAA TAC-3 | 2 |
실시예
2.
gapN
유전자 발현벡터 제조
실시예 1에서 얻은 gapN 유전자가 포함된 벡터 pCR-gapN1를 각각, 제한효소 Nde I 과 Xba I으로 절단하여 gapN을 암호화하는 유전자 단편만을 분리한 뒤 대장균과 코리네박테리움 셔틀벡터인 pECCG122 (참고; 특허공개번호 1992-0000933 에 공지됨) 에 발현 프로모터인 Pcj7(참고; 특허공개번호 2006-0068505 에 공지됨) 을 접합하여 pECCG122-Pcj7-gapN1를 제작하였다 (도.1).
실시예
3.
스트렙토코쿠스
아갈락티에
유래
gapN
유전자 검색 및
클로닝
스트렙토코쿠스 유래의 gapN 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어있다. 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)의 gapN 유전자정보(등록번호 NC_004116)를 확보하였다. 보고된 염기서열에 근거하여 아래 표 2에서 기재된 한쌍의 프라이머를 합성하고 스트렙토코쿠스 아갈락티에 ATCC BAA-611 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=94℃, 30초/Annealing=50℃,30초/Polymerization=72℃,1분 30초, 30회)에 의해 1428 염기쌍의 gapN 유전자를 증폭한 뒤 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-gapN2 플라스미드를 얻었다.
표 2. 프라이머
프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
gapN_F2 | 5'-GCG CAT ATG ACA AAA GAA TAT CAA-3' | 3 |
gapN_R2 | 5'-GCG TCT AGA CTA TTT CAT ATC AAA AAC-3 | 4 |
실시예
4.
gapN
유전자 발현벡터 제조
실시예 3에서 얻은 gapN 유전자가 포함된 벡터 pCR-gapN 2를 각각 제한효소 Nde I 과 Xba I으로 절단하여 gapN을 암호화하는 유전자 단편만을 분리한 뒤 대장균과 코리네박테리움 셔틀벡터인 pECCG122 (참고; 특허공개번호1992-0000933 에 공지됨) 에 발현 프로모터인 Pcj7(참고; 특허공개번호 2006-0068505 에 공지됨) 을 접합하여 pECCG122-Pcj7-gapN2를 제작하였다. (도.1)
실시예
5.
바실러스
세레우스
유래
gapN
유전자 검색 및
클로닝
바실러스 유래의 gapN 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어있다. 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)로부터 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 gapN 유전자정보(등록번호 NC_004722.1)를 확보하였다. 보고 된 염기서열에 근거하여 아래 표 3에서 기재된 한쌍의 프라이머를 합성하고 바실러스 세레우스 ATCC 14579 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 연쇄중합법(PCR법) [Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories](PCR 조건: Denaturing=94℃, 30초/Annealing=50℃,30초/Polymerization=72℃,1분 30초, 30회)에 의해 1428 염기쌍의 gapN 유전자를 증폭한 뒤 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-gapN3 플라스미드를 얻었다.
표 3. 프라이머
프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
gapN_F3 | 5'-GCG CAT ATG ACA ACT AGC AAT ACG-3 | 5 |
gapN_R3 | 5'-GCG TCT AGA TTA AAC TAA GTT TAA-3' | 6 |
실시예
6.
gapN
유전자 발현벡터 제조
실시예 5에서 얻은 gapN 유전자가 포함된 벡터 pCR-gapN3를 각각 제한효소 Nde I 과 Xba I으로 절단하여 gapN을 암호화하는 유전자 단편만을 분리한 뒤 대장균과 코리네박테리움 셔틀벡터인 pECCG122 에 발현 프로모터인 Pcj7을 접합하여 pECCG122-Pcj7-gapN3를 제작하였다.(도.1)
실시예
7.
인공변이법에
의한
코리네박테리움
글루타미쿰
라이신
생산균주
(KFCC-10881) 제조
라이신 생합성 경로의 복수 개의 유전자를 삽입할 균주는 인공변이법에 의하 여 제작된 S- (2-아미노에틸) 시스테인 (S-(2-aminoethyl) cysteine, 이하 AEC)에 대한 내성 및 호모세린 유출 (homoserine leaky)의 특징을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 (KFCC-10881)을 이용하였다.
상기의 변이주 KFCC-10881은 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주 (ATCC13032)를 모균주로 하여 돌연변이 유발원인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine: 이하 NTG)을 세포 107 내지 108/ml에 대하여 30 ℃에서 최종농도 500 ㎍/ml로 30 분간 처리하고, AEC를 5 g/l의 농도로 함유한 복합평판 배지에서 성장하는 균주를 분리함으로써 얻을 수 있었다. 상기의 1차 변이주에 대한 AEC 내성도와 라이신 생산능을 확인한 후, NTG에 의한 2차 인공변이를 유도한 후 획득한 다수의 콜로니를 호모세린 (100 mg/L)을 함유한 최소 배지와 호모세린이 첨가되지 않은 최소배지에 접종 (tooth picking)하여 호모세린이 첨가되지 않은 최소배지에서 성장하지 못하는 호모세린 요구성 균주 (2차 변이주)를 분리하였다. 이로부터 다시 호모세린 유출형 균주를 분리하고자 3차 인공변이를 유도한 후, 호모세린 10 mg/L가 함유된 최소배지에서 성장하는 균주를 분리하여 라이신 생산능을 확인하였다 (표 4). 최종적으로 AEC 내성 및 호모세린 유출형 특징을 갖는 라이신 생산주를 획득하였고 이를 사단법인 한국종균협회에 기탁하고, 기탁번호 제 KFCC-10881호를 부여받았다.
표 4. KFCC-10881의 라이신 생산능
균주 |
라이신 (g/l) |
||
뱃치1 | 뱃치2 | 뱃치3 | |
야생주 (ATCC13032) | 0 | 0 | 0 |
KFCC-10881 | 45 | 43 | 42.5 |
최소배지
(
pH
7.0)
포도당 10 g, (NH4)2SO4 5 g, 요소 2 g, KH2PO4 1 g, K2HPO4 2 g, MgSO4 7H2O 0.4 g, 바이오틴 200 ㎍, 티아민 염산염 3000 ㎍, 칼슘-판토텐산 1000 ㎍, 니코틴아미드 5000 ㎍, NaCl 0.5g (증류수 1리터 기준)
종배지
(
pH
7.0)
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 10 g, 요소 5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7 H2O 0.5 g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍ (공정수 1 리터 기준)
생산배지
(
pH
7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 (Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
실시예
8. 라이신
생산균주
코리네박테리움
글루타미쿰
KFCC
-10881 유래
gapA
유전자
클로닝
및 재조합벡터 (
pDZ
-
gapA
) 제작,
gapA
파괴균주
개발
본 실시예에서는 실시예 7에서 제작된 라이신 생산균주 코리넥박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, 라이신 생합성 경로 의 gapA 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 gapA 유전자의 염기서열 정보 (NCBI 등록번호 NC_003450, NCgl1526)를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머 (표 5, 서열번호 7 내지 10)를 합성하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 7 내지 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초을 30회 반복하였다. 그 결과, 600bp의 gapA 유전자 단편 두 쌍 (gapA -A, gapA -B)을 얻었다. gapA -A는 서열번호 5과 6를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, gapA -B는 서열번호 7과 8를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 TOPO Cloning Kit (Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR- gapA -A와 pCR- gapA -B 벡터를 얻었다.
표 5. 프라이머
프라이머 | 염기서열 | 서열번호 |
F- gapA -SalI_P1 | CAC GTC GAC GAA TGT GTC TGT ATG | 7 |
R- gapA- XbaI_P2 | TGA TCT AGA AGA TGA TGA CCT TCT | 8 |
F- gapA -XbaI_P3 | CCA TCT AGA GCT CTG GTT CTC CCA GAG | 9 |
R- gapA -XbaI_P4 | GCT TCT AGA GGT CTT AAC AGC CAT GCC | 10 |
상기 pCR 벡터에 gapA-A와 gapA-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (gapA-A: SalI,XbaI, gapA-B: XbaI)를 처리하여, 상기 pCR 벡터로부터 각각의 gapA 유전자를 분리하였다. 다음으로, 제한효소 SalI 와 XbaI 가 처리된 pDZ 벡터(참고: 특허공개번호 10-2008-0025355에 공지됨)에 3 조각 접합 (3-piece ligation)을 통하여 클로닝하여, 최종적으로 gapA 단편 두 조각이 연속적으로 클로닝된 pDZ-gapA 재조합 벡터를 제작하였다. 도 2는 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ-gapA를 나타내는 도면이다.
제작된 pDZ-gapA 벡터를 실시예 5에서 제작된 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 gapA 유전자에 gapA 유전자 중간부위 300 염기쌍 제거된 벡터를 삽입하여 gapA 유전자가 불활성화된 라이신 생산주 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0096(수탁번호KCCM 11015P)을 얻었다. 파괴된 gapA 유전자는 야생형 gapA 보다 300 염기쌍이 줄어든 것을 서열번호 7과 10의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 최종 확인하였다.
실시예
9.
CA01
-0096에서
gapN
유전자 발현 유도
실시예 2, 4, 6 에서 얻은 pECCG122-Pcj7-gapN1~3 벡터를 CA01-0096에 도입하였다. gapA 유전자가 파괴되면, 일반적인 코리네박테리움 글루타미쿰이 자라는 배지인 최소 배지에서는 성장하지 못하는 특징이 있는 것으로 알려져 있다 (참고 논문; Hideaki Yukawa 등 J Mol Microbiol Biotechnol 2004; 8:91-103 )
pECCG122-Pcj7-gapN1~3 벡터를 CA01-0096 내로 전기펄스법을 이용하여 형질전환한 균주 (균주번호CA01-0565, CA01-0566, CA01-0567)를 제작하여 gapN이 발현되면 최소 배지에서 자랄 수 있는 특성을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰에서 gapN의 발현을 유도하였다.
실시예
10. 라이신 생산 균주에서
gapN
활성 확인
탄소원을 포도당을 이용하여 제작한 최소배지에서 성장여부를 측정한 결과 gapA가 파괴된 균주는 성장하지 않았고 gapN이 발현된 균주에서는 성장이 회복되었다.
표.6 성장여부
균주 | 성장 | 성장안함 |
KFCC10881 | 성장 | |
CA01-0096 | 성장안함 | |
CA01-0565 | 성장 | |
CA01-0566 | 성장 | |
CA01-0567 | 성장 |
실시예
11. 라이신 생산 균주에서
gapN
활성 확인
gapN 발현벡터로부터 세포 내로 gapN이 발현되어 활성이 있는지를 gapN 발현량을 측정하여 확인하였다. gapA가 파괴된 균주 속에 pECCG122-Pcj7-gapN1,2,3 벡터를 도입한 균주 CA01-0565, CA01-0566, CA01-0567과 gapA가 파괴된 균주 CA01-0096, gapA가 존재하는 균주 KFCC-10881를 각각 종배지에서 하루정도 배양한 후, O.D 600=0.2으로 동일하게 희석하여 O.D 600=10에서 25ml 세포를 회수하였다. A. Soukri 등 Protein Expression and Purification;25; (2002) 519-529에 기재되어 있는 방법을 이용하여 gapN의 활성을 측정한 결과 gapN1 이 1 unit , gapN2가 0.64 unit, gapN3 이 0.09 unit 의 활성을 가지고 있었다. (표.7)
표7. ASSAY 결과
균주 | control | ΔgapA | 스트렙토코쿠스 뮤탄스 gapN |
스트렙토코쿠스 아갈락티에 gapN |
바실러스 세레우스 gapN |
KFCC10881 | CA01-0096 | CA01-0565 | CA01-0566 | CA01-0567 | |
gapN activity ( unit ) | 0 | 0 | 1 | 0.64 | 0.09 |
단위 ;nmol/mg.min=unit
실시예
12.
gapN
유전자 발현 균주의 라이신
생산능
균주 CA01-0565, CA01-0566, CA01-0567를 L-라이신 생산능 확인을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881, CA01-0096, CA01-0565, CA01-0566, CA01-0567를 접종하고 35℃에서 20 시간 동안 진탕 배양(220 rmp) 하였다. 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 35℃에서 96시간 동안 진탕배양(220 rpm)한다. 배양 종료 후 HPLC에 의해 L-라이신의 생산량을 측정한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC-10881,CA01-0096, CA01-0565, CA01-0566, CA01-0567에 대한 배양물 중의 L-라이신은 아래 표 8와 같다. 그 결과 gapA가 파괴된 균주에서는 라이신 생산이 전혀 되지 않았으며 gapA가 파괴괸 균주에 도입한 gapN에 의하여 라이신이 생산되었으며 그 생산량 또한 모균주인 KFCC-10881에 비하여 16~17% 상승한 결과를 보였다. (표.8)
표.8 플라스크 배양 결과
균주명 | 라이신 (g/l) |
KFCC-10881 | 42 |
CA01-0096 | 0 |
CA01-0565 | 50 |
CA01-0566 | 48.8 |
CA01-0567 | 46 |
도 1은 스트렙토코쿠스 뮤탄스, 스트렙토코크스 아갈라티에, 바실러스 세레우스 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제(gapN) 발현 플라스미드 pECCG122-Pcj7-gapN의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 염색체 삽입용 벡터로 gapA 유전자를 파괴하기 위한 벡터 PDZ-gapA의 개열지도를 나타낸 것이다.
<110> CJ CHEILJEDANG Corporation
<120> The Method of L-lysine production in corynebacteirum sp. by
amplifying glyceraldehyde-3-phophate dehydrogenase gene derived
from other
<130> PA090237/KR
<160> 14
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus mutans gapN_F1 primer
<400> 1
gcgcatatga caaaacaata taaaaa 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus mutans gapN_R1 primer
<400> 2
gcgtctagat tatttgatat caaatac 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus agalactiae gapN_F2 primer
<400> 3
gcgcatatga caaaagaata tcaa 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Streptococcus agalactiae gapN_R2 primer
<400> 4
gcgtctagac tatttcatat caaaaac 27
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacillus cereus gapN_F3 primer
<400> 5
gcgcatatga caactagcaa tacg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bacillus cereus gapN_R3 primer
<400> 6
gcgtctagat taaactaagt ttaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Corynebacterium glutamicum KFCC10881 F- gapA -SalI_P1 primer
<400> 7
cacgtcgacg aatgtgtctg tatg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Corynebacterium glutamicum KFCC10881 R- gapA- XbaI_P2 primer
<400> 8
tgatctagaa gatgatgacc ttct 24
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Corynebacterium glutamicum KFCC10881 F- gapA -XbaI_P3 primer
<400> 9
ccatctagag ctctggttct cccagag 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Corynebacterium glutamicum KFCC10881 R- gapA -XbaI_P4 primer
<400> 10
gcttctagag gtcttaacag ccatgcc 27
<210> 11
<211> 1428
<212> DNA
<213> Streptococcus mutans
<400> 11
ttgacaaaac aatataaaaa ttatgtcaat ggcgagtgga agctttcaga aaatgaaatt 60
aaaatctacg aaccggccag tggagctgaa ttgggttcag ttccagcaat gagtactgaa 120
gaagtagatt atgtttatgc ttcagccaag aaagctcaac cagcttggcg atcactttca 180
tacatagaac gtgctgccta ccttcataag gtagcagata ttttgatgcg tgataaagaa 240
aaaataggtg ctgttctttc caaagaggtt gctaaaggtt ataaatcagc agtcagcgaa 300
gttgttcgta ctgcagaaat cattaattat gcagctgaag aaggccttcg tatggaaggt 360
gaagtccttg aaggcggcag ttttgaagca gccagcaaga aaaaaattgc cgttgttcgt 420
cgtgaaccag taggtcttgt attagctatt tcaccattta actaccctgt taacttggca 480
ggttcgaaaa ttgcaccggc tcttattgcg ggaaatgtta ttgcttttaa accaccgacg 540
caaggatcaa tctcagggct cttacttgct gaagcatttg ctgaagctgg acttcctgca 600
ggtgtcttta ataccattac aggtcgtggt tctgaaattg gagactatat tgtagaacat 660
caagccgtta actttatcaa tttcactggt tcaacaggaa ttggggaacg tattggcaaa 720
atggctggta tgcgtccgat tatgcttgaa ctcggtggaa aagattcagc catcgttctt 780
gaagatgcag accttgaatt gactgctaaa aatattattg caggtgcttt tggttattca 840
ggtcaacgct gtacagcagt taaacgtgtt cttgtgatgg aaagtgttgc tgatgaactg 900
gtcgaaaaaa tccgtgaaaa agttcttgca ttaacaattg gtaatccaga agacgatgca 960
gatattacac cgttgattga tacaaaatca gctgattatg tagaaggtct tattaatgat 1020
gccaatgata aaggagccgc tgcccttact gaaatcaaac gtgaaggtaa tcttatctgt 1080
ccaatcctct ttgataaggt aacgacagat atgcgtcttg cttgggaaga accatttggt 1140
cctgttcttc cgatcattcg tgtgacatct gtagaagaag ccattgaaat ttctaacaaa 1200
tcggaatatg gacttcaggc ttctatcttt acaaatgatt tcccacgcgc ttttggtatt 1260
gctgagcagc ttgaagttgg tacagttcat atcaataata agacacagcg cggtacggac 1320
aacttcccat tcttaggggc taaaaaatca ggtgcaggta ttcaaggggt aaaatattct 1380
attgaagcta tgacaactgt taaatccgtc gtatttgata tcaaataa 1428
<210> 12
<211> 1428
<212> DNA
<213> Streptococcus agalactiae
<400> 12
ttgacaaaag aatatcaaaa ttatgtcaat ggcgaatgga aatcatctgt taatcagatt 60
gagattttgt caccaattga tgattcttca ttgggattcg tgccagcgat gactcgagaa 120
gaagttgatc atgctatgaa agcgggtcgt gaggctttac cagcctgggc tgctttgaca 180
gtatatgaac gtgcacaata ccttcataaa gccgcagaca ttattgaacg tgataaagaa 240
gaaattgcta ctgttttagc aaaagaaatt tctaaagctt acaatgcttc agtaactgag 300
gttgtaagga cagctgatct tattcgttat gcagcagaag aaggaattcg tttatcaact 360
tcagctgacg aaggtggaaa aatggatgct tcaacaggtc ataagttggc tgttattcgt 420
cgtcaaccag taggtatcgt tttagcaatc gcaccttata attaccctgt taacctctca 480
ggatcaaaaa ttgcgccagc tctaattggt ggaaacgttg tgatgtttaa accaccaaca 540
caaggttcag tctcaggact tgttttagca aaagcttttg cagaagcagg tcttccagca 600
ggtgtcttta atactattac aggacgcggt tctgagattg gagattacat tgttgagcat 660
gaagaagtta attttattaa ctttacagga tcaacgccag ttggaaaacg tattggtaag 720
ttagcaggaa tgcgtccaat tatgcttgag ttgggtggta aggatgcagg tgtcgtctta 780
gctgatgctg accttgacaa cgctgctaaa caaatcgttg caggtgctta tgattactcc 840
ggacaacgct gtacggcaat taagcgtgta cttgtcgttg aagaagttgc agatgaattg 900
gcagaaaaaa tatctgaaaa tgtagcaaaa ttatcagtag gtgatccatt tgataatgca 960
acggtgacac cggttattga tgataattca gccgacttta ttgaaagctt agtagtagat 1020
gcacgtcaaa aaggtgcgaa agaattgaat gaatttaaac gtgatggtcg tctattaact 1080
ccaggattgt ttgatcatgt tactttagat atgaaactag cttgggaaga gccttttgga 1140
ccaattctcc caattattcg tgtcaaggat gcagaagaag ctgttgctat tgccaacaaa 1200
tctgattttg gattacaatc atcagtcttt acacgtgatt tccaaaaagc atttgatata 1260
gcaaataaac ttgaagttgg tacagttcac attaacaata agactggacg tggtcctgat 1320
aatttcccat tcttaggact caaaggatct ggtgcaggtg ttcaaggtat cagatattca 1380
attgaagcaa tgacaaatgt aaaatcgata gtttttgata tgaaatag 1428
<210> 13
<211> 1440
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 13
atgacaacta gcaatacgta caaattttat ttaaacggag aatggagaga aagctcttca 60
ggagaaacaa tcgaaattcc atctccatac ttacacgaag taattggaca agtacaagca 120
attactcgcg gagaagtaga tgaagcaatt gcatctgcaa aagaagctca aaaatcatgg 180
gctgaagctt ccctacaaga tcgcgcaaaa tacttatata aatgggctga tgagctcgta 240
aatatgcagg atgaaattgc cgatatcatt atgaaagaag tcggtaaagg atataaagat 300
gcgaagaaag aagttgttcg tacagctgac ttcattcgtt acacgatcga agaagcttta 360
catatgcacg gagaaagcat gatgggcgat agcttcccgg gcggtacaaa atctaagctt 420
gcgattatcc aacgcgcacc acttggtgtt gtattagcaa tcgcaccatt taactaccca 480
gtaaacttat ctgctgcaaa acttgcacca gcattaatta tgggtaacgc tgttattttc 540
aaaccagcaa ctcaaggtgc aattagtggt attaaaatgg ttgaagcact tcataaagct 600
ggccttccaa aaggtcttgt aaacgtagct acaggacgcg gttctgtaat tggtgactac 660
ttagtagaac acgaaggcat caatatggta tcgttcacag gtggtacaaa cacaggtaaa 720
catttagcga aaaaagcttc aatgattcca cttgtattag aacttggtgg taaagatcct 780
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ttctcttact ctggtcaacg ttgtacagct attaaacgtg tacttgtaca cgaaaacgta 900
gcggacgagc ttgttagctt attaaaagcg caagtagctg aactatcagt tggatctcca 960
gaacaagata gcacaatcgt tccattaatc gacgacaagt ctgctgactt cgttcaaggt 1020
ttagttgacg acgctgtaga aaaaggtgct acaatcgtta tcggtaacaa acgtgagcgt 1080
aacttaattt acccaacatt aatcgatcac gtaacagaag agatgaaagt tgcttgggaa 1140
gagccattcg gcccaatcct tccaatcatc cgtgtttctt cagatgaaca agcaattgaa 1200
attgctaaca aatcagagtt cggtctgcaa gcaagtgtct tcactaaaga cattaacaaa 1260
gcatttgcaa ttgctaacaa aatcgaaact ggttctgttc aaattaacgg acgcacagag 1320
cgcggccctg accacttccc attcatcggt gtaaaaggtt caggtatggg cgcacaaggt 1380
attcgtaaga gccttgagtc tatgacacgt gaaaaagtaa ctgtattaaa cttagtttaa 1440
1440
<210> 14
<211> 1005
<212> DNA
<213> Corynebacterium sp.
<400> 14
atgaccattc gtgttggtat taacggattt ggccgtatcg gacgtaactt cttccgcgca 60
gttctggagc gcagcgacga tctcgaggta gttgcagtca acgacctcac cgacaacaag 120
accctttcca cccttctcaa gttcgactcc atcatgggcc gccttggcca ggaagttgaa 180
tacgacgatg actccatcac cgttggtggc aagcgcatcg ctgtttacgc agagcgcgat 240
ccaaagaacc tggactgggc tgcacacaac gttgacatcg tgatcgagtc caccggcttc 300
ttcaccgatg caaacgcggc taaggctcac atcgaagcag gtgccaagaa ggtcatcatc 360
tccgcaccag caagcaacga agacgcaacc ttcgtttacg gtgtgaacca cgagtcctac 420
gatcctgaga accacaacgt gatctccggc gcatcttgca ccaccaactg cctcgcacca 480
atggcaaagg tcctaaacga caagttcggc atcgagaacg gcctcatgac caccgttcac 540
gcatacactg gcgaccagcg cctgcacgat gcacctcacc gcgacctgcg tcgtgcacgt 600
gcagcagcag tcaacatcgt tcctacctcc accggtgcag ctaaggctgt tgctctggtt 660
ctcccagagc tcaagggcaa gcttgacggc tacgcacttc gcgttccagt tatcaccggt 720
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ctggtttcca ccgacatcgt ccacgattcc cacggctcca tcttcgacgc tggcctgacc 900
aaggtctccg gcaacaccgt caaggttgtt tcctggtacg acaacgagtg gggctacacc 960
tgccagctcc tgcgtctgac cgagctcgta gcttccaagc tctaa 1005
Claims (8)
- NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 갖고 L-라이신 생산능력이 향상된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자(gapA)가 불활성화되고, 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자(gapN)가 도입된 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주.
- 제2항에 있어서, 상기 외래 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 스트렙토코쿠스 뮤탄스 (Streptococcus mutans: ATCC 25175), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactie : ATCC BAA-611), 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus : ATCC 14579) 유래인 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium sp.) 균주.
- 제3항에 있어서, 상기 스트렙토코쿠스 뮤탄스 유래 유전자, 스트렙토코쿠스 아갈락티에 유래 유전자 및 바실러스 세레우스 유래 유전자는 각각 서열번호 11, 12, 및 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 코리네박테리움 속 균주.
- 제2항에 있어서, 상기 내재적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열인 코리네박테리움 속 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0565 (수탁번호KCCM 11013P), 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0566 (수탁번호KCCM 11014P), 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-0567 (수탁번호KCCM 11015P)인 코리네박테리움 속 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 L-라이신 생산능은 NADP 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성화에 의해 증가된 환원력으로 얻어지는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 균주.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 코리네박테리움 속 균주를 배양하는 단계; 및상기 배양된 세포 또는 세포 배양물로부터 라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.
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