CN105670982A - 重组菌株及其构建方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其构建方法、应用。本发明保护将目标基因以重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得到的工程菌株。摇瓶发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC？1.299的L-缬氨酸产量为3.2g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高103％，具有极显著差异(P＜0.01)。50L罐发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为7.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高152％，具有极显著差异(P＜0.01)。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及重组菌株及其构建方法、应用。
背景技术
L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315℃。
L-缬氨酸(L-Val)是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。
医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱。如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。
食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味。L-缬氨酸也可用作氨基酸能量饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。
饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用。将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免疫能力。而且L-缬氨酸是动物饲料中的一种限制性氨基酸，所以L-缬氨酸可作为饲料添加剂改善动物日粮中氨基酸含量的不足。
L-缬氨酸的生产方法有三种:提取法、化学合成法、微生物发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制、生产成本高、污染环境，难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和、容易实现大规模生产等优点，是目前生产L-缬氨酸最主要的方法。通过菌株的选育，以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到过量积累L-缬氨酸的目的，是微生物发酵法工业应用最为广泛的手段。
棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)和黄色短杆菌(Breviabacteriumflavum)。为了改善这些微生物的L-缬氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。
传统诱变育种，是指通过对特定出发菌株进行物理、化学或二者合并地诱变处理，再选育出营养缺陷型和/或氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制或阻遏作用，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。
代谢工程育种，就是在对代谢网络系统分析的基础上采用基因工程技术改造细胞代谢系统以提高产物得率或改进细胞性能。主要包括如下手段：对原有代谢途径的改造、新代谢途径的构建、组学规模的代谢关键途径或靶点的识别。通过理性的代谢工程构建氨基酸生产菌株，正逐渐成为氨基酸育种的主要策略。
3-磷酸甘油醛脱氢酶是中心碳代谢途径中涉及的一个酶。在棒状杆菌中，它以gapA的形式存在，以NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油酸，而pgk基因编码的酶再将1,3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸。与之相反，在链球菌和芽孢杆菌中，它以非磷酸化的NADP依赖型GADPH(非磷酸化的NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶，下文中称为gapN)形式存在，其以NADP作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸，并产生NADPH。该过程是个单步的过程，在糖酵解中扮演重要角色，并受到NADPH/NADP比例的影响。
甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，EC1.2.1.9)是一种NADP+依赖型的氧化还原酶，它可逆地催化甘油醛3-磷酸反应生成1,3二磷酸甘油酸，如下所示：
glyceraldehyde3-phosphate+phosphate+NADP+＝3-phospho-glyceroylphosphate+NADPH+H+
来源于变形链球菌(streptococcusmutans)ATCC25175的甘油醛3-磷酸脱氢酶具有良好的热稳定性、化学稳定性和操作稳定性。NADH和NADPH是细胞内重要的辅酶，参与糖、脂、蛋白质三类物质代谢的绝大部分氧化还原反应，NAD/NADH和NADP/NADPH分别是其对应的氧化还原对。
将来源于变形链球菌的亮甘油醛3-磷酸脱氢酶编码基因gapN导入到棒杆菌或黄杆菌中，其编码产物可以将NADP转化为NADPH，从而增加NADPH的供应，达到调节胞内NADH/NADPH平衡的效果，转化并表达的结果是使胞内氧化还原平衡也相应得到改变。
此类相似的应用，其他专利就是利用NADP依赖型3-磷酸甘油醛脱氢酶活性来达到提高L-赖氨酸产量棒状杆菌属菌株的方法。
工程菌CGMCC1.299自身的3-磷酸甘油醛脱氢酶以gapA的形式存在，以NAD作为辅酶，将3-磷酸甘油醛转化为1,3-二磷酸甘油酸，而pgk基因编码的酶再将1,3-二磷酸甘油酸转化为3-磷酸甘油酸。此过程中产生的是NADH，而不能在缬氨酸末端合成的四步反应中应用，从而一方面造成NADH的大量积累，另一方面合成需要的NADPH又不足。
发明内容
有鉴于此，本发明提供重组菌株及其构建方法、应用。本发明涉及分子改造棒杆菌或短杆菌，并发酵生产L-缬氨酸的方法。具体地说，是将辅助因子为NADPH的甘油醛3-磷酸脱氢酶gapN转化导入棒杆菌或短杆菌中，从而获得胞内氧化还原平衡改变的基因工程菌。该基因编码的甘油醛3-磷酸脱氢酶可以将甘油醛3-磷酸转化为1,3二磷酸甘油酸。该基因工程菌可用于发酵生产L-缬氨酸。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了重组菌株，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株制得；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株的所述原始菌株选自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.flavum)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述生产L-缬氨酸的原始菌株为保藏编号为CGMCC1.299的谷氨酸棒杆菌。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述编码gapN蛋白质的gapN基因以重组质粒或插入染色体的方式导入所述原始菌株。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述编码gapN蛋白质的gapN基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端第1至1428位核苷酸所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株中所述重组质粒的制备方法为将所述gapN基因的核苷酸序列插入出发载体pXMJ19的多克隆位点。
在本发明的一些具体实施方案中，所述重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.11938。
本发明还提供了所述重组菌株发酵生产缬氨酸中的应用。
本发明还提供了所述重组菌株的构建方法，将编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
本发明还提供了一种发酵生产L-缬氨酸的方法，发酵菌株为所述重组菌株或所述构建方法构建的重组菌株。
本发明保护将目标基因以重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得到的工程菌株；所述重组质粒为将gapN的基因序列插入出发载体pXMJ19的多克隆位点得到的质粒。所述棒杆菌的编号为CGMCC1.299。所述甘油醛3-磷酸脱氢酶编码的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端第1至1428位核苷酸所示。
用gapN，其以NADP为辅本科，将3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸，并产生NADPH。而NADPH是缬氨酸末端合成必须的辅助因子，每合成一分子缬氨酸需要二分子的NADPH。从而同时解决NADH的过剩与NADPH的不足，达到两者的平衡。
摇瓶发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为3.2g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高103％，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.11938的重组菌株具有极显著差异(P＜0.01)。
50L罐发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为7.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高152％，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.11938的重组菌株具有极显著差异(P＜0.01)。
生物保藏说明
生物材料MHZ-1011分类命名：谷氨酸棒杆菌，Corynebacteriumglutamicum于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11938。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示pXMJ19-gapN质粒图谱。
具体实施方式
本发明公开了重组菌株及其构建方法、应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的目的是提供一种生产L-缬氨酸的工程菌株。
本发明的另一目的是提供利用该工程菌株生产L-缬氨酸的方法。
本发明保护将目标基因以重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得到的工程菌株；所述重组质粒为将gapN的基因序列插入出发载体pXMJ19的多克隆位点得到的质粒。所述棒杆菌的编号为CGMCC1.299。所述甘油醛3-磷酸脱氢酶编码的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端第1至1428位核苷酸所示。
L-缬氨酸生产菌主要有:谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.flavum)。
本发明保护将目标基因以重组质粒或插入染色体等方式导入棒杆菌或短杆菌得到的工程菌株；所述重组质粒为将gapN的基因序列插入出发载体pXMJ19的多克隆位点得到的质粒。所述棒杆菌的编号为CGMCC1.299。所述甘油醛3-磷酸脱氢酶编码的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端第1至1428位核苷酸所示。
用gapN，其以NADP为辅本科，将3-磷酸甘油醛转化为3-磷酸甘油酸，并产生NADPH。而NADPH是缬氨酸末端合成必须的辅助因子，每合成一分子缬氨酸需要二分子的NADPH。从而同时解决NADH的过剩与NADPH的不足，达到两者的平衡。
摇瓶发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为3.2g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高103％，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.11938的重组菌株具有极显著差异(P＜0.01)。
50L罐发酵生产L-缬氨酸实验结果表明：出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为7.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高152％，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.11938的重组菌株具有极显著差异(P＜0.01)。
本发明提供的重组菌株及其构建方法、应用中所涉及的菌株、原料及制剂均可由市场购得。
术语解释
本发明中涉及的专业名称解释如下：
gapA：甘油醛3-磷酸脱氢酶基因
gapN：甘油醛3-磷酸脱氢酶基因
NADPH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
pgk：磷酸甘油酸激酶
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1表达质粒pXMJ19-gapN的构建
1.以变形链球菌(streptococcusmutans)ATCC25175的基因组DNA为模板，用gapNF和gapNR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物：
gapNF：5-’TGGATCCATGACAAAACAATATAAAAATTA-3’(下划线为BamHI酶切识别位点)，如SEQIDNo.2所示；
gapNR：5-’CGAATTCTTATTTGATATCAAATACGACGG-3’(下划线为EcoRI酶切识别位点)，如SEQIDNo.3所示；
2.回收步骤1的PCR产物并连到载体pEASYTM-T5(购自北京全式金生物技术有限公司)，得到重组质粒pT5-gapN，测序得到gapN基因序列，如SEQIDNo.1所示，其蛋白质序列如SEQIDNo.4所示；
3.用两种限制性内切酶(BamHI和EcoRI)双酶切质粒pT5-gapN和载体pXMJ19，切胶回收后分别得到gapN片段(约1400bp)与pXMJ19载体骨架(约6600bp)；
4.将步骤3所得的两条双酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，经含有17μg/mL氯霉素的LB培养基平板筛选得到阳性克隆子，扩增培养后提取重组质粒pXMJ19-gapN，其结构示意图如图1所示。
实施例2工程菌CGMCC1.299/pXMJ19-gapN的构建
1.制备棒杆菌的电击转化感受态细胞；
2.电击转化：将3-8μL的pXMJ19-gapN质粒加入到感受态细胞中，冰上放置10min；转入1mm电击杯，1.8或2.1kV电击5-7ms；
3.加入LB培养基1mL，31℃、150rpm培养1h；浓缩后涂布于含25μg/mL卡那霉素的脑心培养基平板上，31℃恒温培养36-48h；
4.筛选阳性克隆子，通过用gapNF/gapNR组成的引物对进行PCR鉴定(有约1.4kb的特异条带的为阳性)，得到重组菌。
实施例3工程菌CGMCC1.299/pXMJ19-gapN(MHZ-1011)发酵生产L-缬氨酸
1.培养基
种子活化培养基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH7.2；
种子培养基：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，pH7.2；
发酵培养基：玉米浆0.5％，葡萄糖12.0％，硫酸铵4.0％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO34％，VH50ug/L，VB1·HCl100μg/L,pH7.2；
2.摇瓶发酵生产L-缬氨酸
(1)种子培养：挑取工程菌株MHZ-1011斜面种子1环接至装有20mL种子培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养16-22h；
(2)发酵培养：将2mL种子液接种至装有20mL发酵培养基的500mL三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养72h；24h时加入IPTG(终浓度为10μmol/L)诱导；
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-缬氨酸含量，其浓度如表1所示：
表1L-缬氨酸浓度
如表1所示，出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为3.2g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为6.5g/L，比出发菌株产量提高103％，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.11938的重组菌株具有极显著差异(P＜0.01)。
3.50L罐发酵生产L-缬氨酸
(1)二级种子培养：挑取工程菌株MHZ-1011斜面种子2-3环接至装有100mL种子培养基的2L三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养约12-16h；再将其转入含1L培养液的5L三角瓶中，33℃、220r/min继续培养16-20h；
(2)50L发酵：将3L种子液接种至装有22L发酵培养基的50L发酵罐中，31℃培养72h；过程中用氨水来调节pH7.0，用80％(m/v)的葡萄糖维持残糖浓度为2-3％，相对溶氧控制在10-20％之间，24h时加入IPTG(终浓度为10μmol/L)诱导；
(3)取1mL发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，HPLC检测工程菌与对照菌发酵液中的L-缬氨酸含量，其浓度如表2所示：
表2L-缬氨酸含量
如表2所示，出发菌株CGMCC1.299的L-缬氨酸产量为7.3g/L，而本发明的工程菌MHZ-1011的L-缬氨酸产量为18.4g/L，比出发菌株产量提高152％，与出发菌株相比，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.11938的重组菌株具有极显著差异(P＜0.01)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.重组菌株，其特征在于，由编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株制得；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述原始菌株选自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)、北京棒杆菌(C.pekinense)和黄色短杆菌(B.flavum)。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述生产L-缬氨酸的原始菌株为保藏编号为CGMCC1.299的谷氨酸棒杆菌。
4.根据权利要求1至3任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述编码gapN蛋白质的gapN基因以重组质粒或插入染色体的方式导入所述原始菌株。
5.根据权利要求1至4任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述编码gapN蛋白质的gapN基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1中自5’末端第1至1428位核苷酸所示。
6.根据权利要求4或5所述的重组菌株，其特征在于，所述重组质粒的制备方法为将所述gapN基因的核苷酸序列插入出发载体pXMJ19的多克隆位点。
7.根据权利要求1至6任一项所述的重组菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.11938。
8.根据权利要求1至7任一项所述的重组菌株发酵生产缬氨酸中的应用。
9.一种如权利要求1至7任一项所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，将编码gapN蛋白质的gapN基因导入生产L-缬氨酸的原始菌株；所述原始菌株为棒杆菌或短杆菌。
10.一种发酵生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，发酵菌株为根据权利要求1至7任一项所述的重组菌株或如权利要求9所述构建方法构建的重组菌株。
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| HASEGAWA SATOSHI等: "Improvement of the redox balance increases L-valine production by Corynebacterium glutamicum under oxygen deprivation conditions", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| SPAANS S.K.等: "NAPDH-generating systems in bacteria and archaea", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 * |
| TAKENO SEIKI等: "Engineering of Corynebacterium with an NADPH-generating glycolytic pathway for L-lysine production", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106086099A (zh) * | 2016-08-27 | 2016-11-09 | 河北圣雪大成制药有限责任公司 | L‑缬氨酸发酵培养基及用其生产l‑缬氨酸的发酵方法 |
| CN106086099B (zh) * | 2016-08-27 | 2019-12-13 | 河北圣雪大成制药有限责任公司 | L-缬氨酸发酵培养基及用其生产l-缬氨酸的发酵方法 |
| CN106520655A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-03-22 | 廊坊梅花生物技术开发有限公司 | 重组菌株及其制备方法和生产l‑缬氨酸的方法 |
| CN112195204A (zh) * | 2020-10-21 | 2021-01-08 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法 |
| CN112195204B (zh) * | 2020-10-21 | 2022-04-15 | 通辽梅花生物科技有限公司 | 一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |