CN112195204A - 一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法 - Google Patents

一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，选择异亮氨酸生产菌、亮氨酸生产菌或缬氨酸生产菌中的至少2株不同的生产菌株，采用混菌联合发酵方法，制备得到亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2：0.8‑1.2：0.8‑1.2的发酵液。本发明通过选择合适的菌株，利用混菌发酵，通过控制合适的种子液接种比和分两阶段控制发酵温度，来调整产物的比例，使亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的表达量比例达到2：0.8‑1.2：0.8‑1.2，直接达到常规BCAA产品的要求；一次性同时生产三种支链氨基酸，简化了发酵、提取工艺，降低了生产成本，同时大大减少了生产污水的排放量。

Description

一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法
技术领域：
本发明属于氨基酸生产技术领域，具体涉及一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法。
背景技术：
支链氨基酸(BCAA：Branched ChainAminoAcids)指的是结构上含有支链的一群氨基酸，包括了亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸。这三种氨基酸属于必须氨基酸，与合成蛋白质有着密不可分的关系，不用经过身体代谢，便可以直接提供能量给人体使用。人体中约33％的肌肉蛋白质是由BCAA组成，BCAA对任何运动项目来说都是最重要和最有效的营养品，它可以帮助生物体自然地、没有任何副作用地增强肌肉获得更多能量。科学家已经发现这种氨基酸混合物在延长单细胞酵母寿命上的巨大作用，运动前或运动中补充支链氨基酸可以提高运动能力。运动后立即或运动后随餐食用BCAA可以降低皮质醇和快速恢复肌肉中支链氨基酸的水平。支链氨基酸之间在吸收能力上具有相互竞争性，因此必须同时补充，以保证较大程度的吸收。目前常规BCAA产品中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的比例一般是2:1:1。
在现有氨基酸发酵工艺中，一般以某一种氨基酸作为主要产物，其他氨基酸作为杂酸，经后续提取工序予以除去，即提取精制过程，提取步骤往往需要消耗大量的蒸汽、水源、能源，是主要的成本来源，且会带来大量的污水。如果按照现有发酵工艺进行生产，从3种支链氨基酸的生产到BCAA产品的制备，就要经过3次发酵、3次提取，生产工序复杂，成本高，污染大。
发明内容：
基于现有工艺存在的工序复杂、成本高、污染大问题，本发明通过改进支链氨基酸的发酵技术工艺，提供一种工艺简单、生产成本低、污染小的，经1步发酵、1步提取、混菌发酵生产支链氨基酸的方法。
本发明的目的由如下技术方案实施：一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，选择异亮氨酸生产菌、亮氨酸生产菌或缬氨酸生产菌中的至少2株不同的生产菌株，采用混菌联合发酵方法，制备得到亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2：0.8-1.2：0.8-1.2的发酵液。
进一步，选择2株不同的生产菌株，分别为谷氨酸棒杆菌株SML001(保藏编号为CGMCC NO.13408)和谷氨酸棒杆菌株SMV001(保藏编号为CGMCC NO.11938)。所述谷氨酸棒杆菌株SML001是一种亮氨酸生产菌，所述谷氨酸棒杆菌株SML001发酵过程中积累的杂酸主要是异亮氨酸；所述谷氨酸棒杆菌株SMV001是一种缬氨酸生产菌，所述谷氨酸棒杆菌株SMV001发酵过程中主要积累杂酸也为异亮氨酸。
进一步，所述混菌联合发酵方法具体包括如下步骤：
(1)分别将所述谷氨酸棒杆菌株SML001和所述谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，依次得到种子液1和种子液2；
(2)按照5-12％的接种比将种子液1接入发酵罐中，再按照12-20％的接种比将种子液2接入所述发酵罐中，进行联合培养发酵，制备得到发酵液。
进一步，所述步骤(2)联合培养发酵过程中，发酵的前0-30h温度控制在28-31℃；发酵的后30-50h温度控制在31-34℃。谷氨酸棒杆菌株SML001在28-31℃条件下，菌体量增长快、亮氨酸产酸高；谷氨酸棒杆菌株SMV001在31-34℃条件下，缬氨酸积累最多。从而在前中期积累较多的亮氨酸、异亮氨酸，后期积累较多的缬氨酸，使得最终发酵液中亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的比例达到2：0.8-1.2：0.8-1.2。
进一步，所述步骤(2)联合培养发酵过程中，发酵条件为：罐压为0.04-0.1Mpa，通气量为5-25L/min，搅拌速度为200-800rpm，pH为6.6-7.2；通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌速度，将溶氧维持在15-35％。
进一步，所述谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基组成包括：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L。
进一步，所述谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基组成包括：葡萄糖20g/L、玉米浆40g/L、硫酸铵10g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.4mg/L、VB1 2mg/L。
进一步，所述步骤(2)联合培养发酵过程中，发酵所用培养基组成包括：葡萄糖40g/L、玉米浆45g/L、硫酸铵15g/L、甜菜碱1.5g/L、氯化胆碱0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.1mg/L。
本发明的优点：
本发明利用混菌发酵，通过控制合适的种子液接种比(菌株SML001接种比5-12％、菌株SMV001接种比12-20％)，来调整不同菌株合适的菌体量，进而影响产物的比例；通过温度两阶段控制(0-30h温度28-31℃、30-50h温度31-34℃)，来调整不同菌株的代谢活力，同样影响产物的比例；经过上述措施，使亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的表达量比例达到2：0.8-1.2：0.8-1.2，直接达到常规BCAA产品的要求；一次性同时生产三种支链氨基酸，简化了发酵、提取工艺，降低了生产成本，同时大大减少了生产污水的排放量。
具体实施方式：
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数也视为在本专利的范围内。
一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其包括如下步骤：
(1)分别将谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，依次得到种子液1和种子液2；
其中，谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基组成包括：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB12mg/L。
谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基组成包括：葡萄糖20g/L、玉米浆40g/L、硫酸铵10g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.4mg/L、VB1 2mg/L。
(2)按照5-12％的接种比将种子液1接入发酵罐中，再按照12-20％的接种比将种子液2接入所述发酵罐中，进行联合培养发酵，制备得到发酵液。发酵液中亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2：0.8-1.2：0.8-1.2。
发酵条件为：罐压为0.04-0.1Mpa，通气量为5-25L/min，搅拌速度为200-800rpm，pH为6.6-7.2；通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌速度，将溶氧维持在15-35％；发酵的前0-30h温度控制在28-31℃；发酵的后30-50h温度控制在31-34℃。发酵所用培养基组成包括：葡萄糖40g/L、玉米浆45g/L、硫酸铵15g/L、甜菜碱1.5g/L、氯化胆碱0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.1mg/L。
对比实验例1：谷氨酸棒杆菌株SML001单独发酵
将谷氨酸棒杆菌株SML001用发酵罐进行培养，得到谷氨酸棒杆菌株SML001种子液。种子所用培养基组成为：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
将培养好的谷氨酸棒杆菌株SML001种子液按15％的接种量接入50L发酵罐中，初定容20L。发酵所用培养基组成为：葡萄糖40g/L、玉米浆45g/L、硫酸铵15g/L、甜菜碱1.5g/L、氯化胆碱0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB10.1mg/L，其余为水。发酵条件为：罐压0.04-0.1Mpa，通气量5-25L/min，搅拌速度200-800rpm，pH6.6-7.2，温度30℃。通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌速度，将溶氧维持在15-35％。
发酵40h结束，利用HPLC测定发酵液中的亮氨酸含量为46.2g/L、缬氨酸含量为1.5g/L、异亮氨酸含量为14.0g/L。
对比实验例2：谷氨酸棒杆菌株SMV001单独发酵
将谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，得到谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液；种子所用培养基组成为：葡萄糖20g/L、玉米浆40g/L、硫酸铵10g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.4mg/L、VB1 2mg/L，其余为水。
将培养好的谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液按20％的接种量接入50L发酵罐中，初定容20L。发酵所用培养基组成为：葡萄糖40g/L、玉米浆45g/L、硫酸铵15g/L、甜菜碱1.5g/L、氯化胆碱0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB10.1mg/L，其余为水。发酵条件为：罐压0.04-0.1Mpa，通气量5-25L/min，搅拌200-800rpm，pH6.6-7.2，温度32.5℃。通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌速度，溶氧维持15-35％。
发酵40h结束，利用HPLC测定发酵液中的亮氨酸含量为2.2g/L、缬氨酸含量为33.5g/L、异亮氨酸含量为8.5g/L。
实施例1：谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001混合培养，接种比依次为5％、12％，发酵的前0-30h温度控制在30℃、发酵的后30-50h温度控制在32.5℃。
具体的，一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其包括如下步骤：
(1)分别将谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，依次得到谷氨酸棒杆菌株SML001种子液和谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液；
谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基与对比实验例1中谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基相同；
谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基与对比实验例2中谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基相同；
(2)先将培养好的谷氨酸棒杆菌株SML001种子液按5％的接种量接入50L发酵罐中；再将培养好的谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液按12％的接种量接入同一50L发酵罐中。发酵所用培养基组成与对比实验例1发酵所用培养基组成相同，初定容20L。发酵的前0-30h温度控制在30℃，发酵的后30-50h温度控制在32.5℃，其他发酵培养条件均与对比实验例1相同。
发酵50h结束，利用HPLC测定发酵液中的亮氨酸含量为35.0g/L、缬氨酸含量为16.5g/L、异亮氨酸含量为17.8g/L；亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2:0.94:1.02，接近目前常规BCAA产品中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的比例2:1:1。
实施例2：谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001混合培养，接种比依次为12％、20％，发酵的前0-30h温度控制在30℃、发酵的后30-50h温度控制在32.5℃。
具体的，一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其包括如下步骤：
(1)分别将谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，依次得到谷氨酸棒杆菌株SML001种子液和谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液；
谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基与对比实验例1中谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基相同；
谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基与对比实验例2中谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基相同；
(2)先将培养好的谷氨酸棒杆菌株SML001种子液按12％的接种量接入50L发酵罐中；再将培养好的谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液按20％的接种量接入同一50L发酵罐中。发酵所用培养基组成与对比实验例1发酵所用培养基组成相同，初定容20L。发酵的前0-30h温度控制在30℃，发酵的后30-50h温度控制在32.5℃，其他发酵培养条件均与对比实验例1相同。
发酵50h结束，利用HPLC测定发酵液中的亮氨酸含量为40.5g/L、缬氨酸含量为19.2g/L、异亮氨酸含量为20.7g/L；亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2:0.95:1.02，接近目前常规BCAA产品中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的比例2:1:1。
实施例3：谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆SMV001混合培养，接种比依次为12％、20％，发酵的前0-30h温度控制在31℃，发酵的后30-50h温度控制在34℃。
具体的，一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其包括如下步骤：
(1)分别将谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，依次得到谷氨酸棒杆菌株SML001种子液和谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液；
谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基与对比实验例1中谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基相同；
谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基与对比实验例2中谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基相同；
(2)先将培养好的谷氨酸棒杆菌株SML001种子液按12％的接种量接入50L发酵罐中；再将培养好的谷氨酸棒杆菌株SMV001种子液按20％的接种量接入同一50L发酵罐中。发酵所用培养基组成与对比实验例1发酵所用培养基组成相同，初定容20L。发酵的前0-30h温度控制在31℃，发酵的后30-50h温度控制在34℃，其他发酵培养条件均与对比实验例1相同。
发酵50h结束，利用HPLC测定发酵液中的亮氨酸含量为37.2g/L、缬氨酸含量为19.5g/L、异亮氨酸含量为21.0g/L；亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2:1.05:1.13，接近目前常规BCAA产品中亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的比例2:1:1。
综上，通过选择合适的菌株，利用混菌发酵，再控制合适的种子液接种比和两阶段控制发酵温度，可以实现亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的表达量比例达到2：0.8-1.2：0.8-1.2，直接达到常规BCAA产品的要求。其中，实施例2效果最佳，总产酸水平最高，且不同产物间比例最接近2:1:1。
术语解释：
1.发酵工艺：指利用微生物菌种来积累目标产物的全过程，包括培养基配方和配制，菌种复壮、扩培、培养过程的控制，含温度、pH、溶氧等关键参数控制，以及营养补充，培养结束控制等。
2.现有发酵工艺：指公开报道或广泛公知的发酵工艺。
3.液相色谱测定异亮氨酸及杂酸的方法(HPLC测定法)：高效液相色谱检测方法，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
本发明采用安捷伦公司的高效液相色谱仪(Agilent Technologies1200)进行发酵液中积累的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸含量检测，具体方法如下：
3.1色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA柱(3.5μm，4.6×75mm)
3.2流动相A：称取6.24g NaH2PO4·2H2O，转移到1000mL玻璃烧杯中。加入1000mL超纯水，搅拌，直到所有晶体完全溶解。用NaOH调节溶液pH值至7.80。
3.3流动相B：乙腈:甲醇:水＝45:45:10(V/V/V)。
3.4流速：2ml/min。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，选择异亮氨酸生产菌、亮氨酸生产菌或缬氨酸生产菌中的至少2株不同的生产菌株，采用混菌联合发酵方法，制备得到亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸的质量比为2：0.8-1.2：0.8-1.2的发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，选择2株不同的生产菌株，分别为谷氨酸棒杆菌株SML001和谷氨酸棒杆菌株SMV001。
3.根据权利要求2所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，所述混菌联合发酵方法具体包括如下步骤：
(1)分别将所述谷氨酸棒杆菌株SML001和所述谷氨酸棒杆菌株SMV001用发酵罐进行培养，依次得到种子液1和种子液2；
(2)按照5-12％的接种比将种子液1接入发酵罐中，再按照12-20％的接种比将种子液2接入所述发酵罐中，进行联合培养发酵，制备得到发酵液。
4.根据权利要求3所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)联合培养发酵过程中，发酵的前0-30h温度控制在28-31℃；发酵的后30-50h温度控制在31-34℃。
5.根据权利要求3所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)联合培养发酵过程中，发酵条件为：罐压为0.04-0.1Mpa，通气量为5-25L/min，搅拌速度为200-800rpm，pH为6.6-7.2；通过依次循环调节罐压、通气量、搅拌速度，将溶氧维持在15-35％。
6.根据权利要求3-5任一所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌株SML001种子所用培养基组成包括：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.2mg/L、VB1 2mg/L。
7.根据权利要求3-5任一所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌株SMV001种子所用培养基组成包括：葡萄糖20g/L、玉米浆40g/L、硫酸铵10g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁0.6g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.4mg/L、VB1 2mg/L。
8.根据权利要求3-5任一所述的一种混菌发酵生产支链氨基酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)联合培养发酵过程中，发酵所用培养基组成包括：葡萄糖40g/L、玉米浆45g/L、硫酸铵15g/L、甜菜碱1.5g/L、氯化胆碱0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L、消泡剂0.3mL/L、生物素0.1mg/L、VB1 0.1mg/L。
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