BR112016008952B1 - Microrganismos para a produção de o-succinil homoserina e método para produção de o-succinil homoserina usando os mesmos - Google Patents
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Abstract
MICRORGANISMOS PARA A PRODUÇÃO DE O-SUCCINIL HOMOSERINA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE O-SUCCINIL HOMOSERINA USANDO OS MESMOS. A presente invenção se refere a um polipeptídeo tendo resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase, um microrganismo que produz O-succinil homoserina que expressa o polipeptídeo e um método para produção de O-succinil homoserina usando o mesmo.
Description
[001] A presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado o qual tem uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase, um microrganismo que expressa o polipeptídeo e um método para produzir O-succinil homoserina usando o mesmo.
[002] A maioria dos microrganismos presentes na natureza são conhecidos para usar O-succinil homoserina ou O-acetil homoserina como um intermediário para a biossíntese de metionina. Em geral, a O-succinil homoserina é produzida pela homoserina O-succiniltransferase (MetA), a qual conjuga o grupo succinila de succinil-coA à homoserina, e a O-acetil homoserina é produzida pela homoserina O-acetiltransferase (MetX), a qual conjuga grupo acetila de acetil-coA à homoserina. Isto é, na produção de O- succinil homoserina dentre intermediários, metAé um dos genes mais importantes no desenvolvimento de microrganismos que produzem a mesma. Entretanto, ao contrário de MetA, MetX é conhecida por não ter o feedback inibido e ter elevada estabilidade de enzima.
[003] A O-succinil homoserina se acumula quando a cistationina gama sintase na via de biossíntese de metionina é bloqueada e, assim, a cepa que produz O-succinil homoserina requer L-metionina. Consequentemente, a metionina é adicionada a um meio e a atividade de O-homoserina succiniltransferase é inibida pela metionina adicionada ao meio e, eventualmente, O-succinil homoserina não pode ser obtida em uma concentração elevada.
[004] Consequentemente, muitas patentes anteriores têm focado seus estudos sobre a liberação de inibição de feedback de metA a partir de um sistema de controle de feedback. No entanto, a homoserina O- succiniltransferase codificada por metA tem problemas pelo fato de que ela tem baixa estabilidade por sua proteína de tipo selvagem em si e a introdução de uma mutação para a liberação de inibição de feedback piora a instabilidade. Consequentemente, para o desenvolvimento de uma cepa que produz O- succinil homoserina com alta produtividade, é necessário que a inibição de feedback do gene metA seja removida e a estabilidade enzimática seja assegurada.
[005] De modo a resolver o fenômeno de inibição de feedback de metA e o problema de instabilidade enzimática descritos acima, os presentes inventores se esforçaram para desenvolver uma homoserina O- succiniltransferase, a qual tem estabilidade enzimática assegurada, ao mesmo tempo em que não tem o feedback inibido pela metionina e, a este respeito, rastrearam novas enzimas tendo a atividade. Como um resultado da seleção dos genes candidatos assim rastreados e cultura em um frasco após introdução das mesmas em Escherichia sp., os presentes inventores descobriram a produção de O-succinil homoserina e que os genes assim selecionados têm uma atividade de homoserina O-succiniltransferase e uma resistência à inibição de feedback pela metionina, deste modo, concluindo a presente invenção.
[006] Um objetivo da presente invenção é fornecer um novo polipeptídeo isolado tendo uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase.
[007] Outro objetivo da presente invenção é fornecer um polinucleotídeo que codifica o novo polipeptídeo isolado.
[008] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um microrganismo para a produção de O-succinil homoserina o qual expressa o novo polipeptídeo isolado.
[009] Um outro objetivo da presente invenção é fornecer um método para produção de O-succinil homoserina usando o microrganismo acima.
[010] O microrganismo para a produção de O-succinil homoserina que inclui um novo polipeptídeo isolado, o qual tem uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase, pode ter uma resistência à inibição de feedback pela metionina e produzir O- succinil homoserina com elevado rendimento e, assim, pode ser usado eficazmente para a produção de L-metionina, a qual usa a mesma como precursor, com um rendimento elevado.
[011] De modo a atingir os objetivos acima, em um aspecto, a presente invenção fornece um novo polipeptídeo isolado o qual tem uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O- succiniltransferase.
[012] Conforme usado aqui, o termo "atividade de homoserina O- succiniltransferase" se refere à atividade de conversão de homoserina em O- succinil homoserina.
[013] Conforme usado aqui, o termo "inibição de feedback" se refere à inibição da atividade de homoserina O-succiniltransferase pela metionina.
[014] O polipeptídeo da presente invenção é caracterizado pelo fato de que ele tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 tendo a atividade de homoserina O-succiniltransferase e uma resistência à inibição de feedback pela metionina. Qualquer polipeptídeo que compartilha uma homologia de sequência de 80% ou maior para o polipeptídeo acima, especificamente 90% ou maior, mais especificamente 95% ou maior e, ainda mais especificamente, 97% ou maior, também está dentro do âmbito da presente invenção, contanto que o polipeptídeo tenha a atividade de homoserina O-succiniltransferase e a resistência à inibição de feedback pela metionina sugeridas na presente invenção. A homologia % pode ser determinada usando o BLAST 2.0, o qual é um algoritmo de referência, ou FASTA por Pearson [Methods Enzymol., 183, 63 (1990), infra]. Com base no algoritmo BLAST, programas denominados BLASTN e BLASTX foram desenvolvidos [www.ncbi.nlm.nih.gov, infra].
[015] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo acima. Especificamente, o polipeptídeo pode ser codificado pela sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, em virtude de degenerância de códon, aqueles polinucleotídeos os quais têm uma homologia de sequência de pelo menos 80% com a sequência acima, especificamente 90% ou maior, mais especificamente 95% ou maior e, ainda mais especificamente, 97% ou maior, também estão dentro do âmbito da presente invenção, embora não limitado aos mesmos.
[016] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um vetor o qual inclui o polinucleotídeo de uma forma operacional.
[017] Conforme usado aqui, o termo "vetor" se refere a um construto de ADN que inclui a sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse, no qual a proteína de interesse está operacionalmente ligada a uma sequência reguladora adequada, de modo que a proteína de interesse possa ser expressa em um hospedeiro apropriado. A sequência reguladora pode incluir um promotor capaz de iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para a regulação de transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação a ribossomo de ARNm adequado e uma sequência de regulação de término de transcrição e tradução. O vetor, após ser transformado em um hospedeiro apropriado, pode ser replicado ou funcionar independentemente do genoma do hospedeiro ou pode ser integrado no genoma do hospedeiro em si.
[018] O vetor usado na presente invenção não está particularmente limitado, contanto que o vetor seja replicável no hospedeiro, e pode ser usado qualquer vetor conhecido na técnica.
[019] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um microrganismo que produz O-succinil homoserina que expressa um polipeptídeo, o qual tem uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase.
[020] Conforme usado aqui, o termo "um microrganismo que produz O- succinil homoserina" pode se referir a um microrganismo o qual pode produzir O-succinil homoserina e armazená-la intracelular e extracelularmente.
[021] O microrganismo para a produção de O-succinil homoserina inclui cepas de microrganismos procariotas e eucariotas, por exemplo, as cepas de microrganismos pertencentes ao gênero Escherichia, ao gênero Erwinia, ao gênero Serratia, ao gênero Providencia, ao gênero Corynebacterium e ao gênero Brevibacterium, porém sem limitação aos mesmos. Especificamente, o microrganismo pode ser um microrganismo pertencente ao gênero Escherichia, por exemplo, Escherichia coli.
[022] O microrganismo que produz O-succinil homoserina pode ser preparado usando cepas de microrganismos as quais produzem L-lisina, L- treonina ou L-isoleucina e, especificamente, usando uma cepa que produz L- treonina. Uma vez que a cepa que produz L-treonina é uma cepa capaz de sintetizar L-treonina e homoserina como um precursor de O-succinil homoserina, uma grande quantidade de precursores de metionina, isto é, O- succinil homoserina, pode ser sintetizada usando a cepa.
[023] Na presente invenção, a expressão do polipeptídeo pode ser obtida por meio de transformação com um vetor recombinante o qual inclui um gene que codifica o polipeptídeo de uma forma operacional ou ao inserir um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo no cromossomo, mas os métodos não são limitados aos mesmos.
[024] Conforme usado aqui, o termo "transformação"se refere a um processo de introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína alvo em uma célula hospedeira, deste modo, permitindo a expressão do polinucleotídeo codificado pela proteína na célula hospedeira. Para o polinucleotídeo transformado, não importa se ele é inserido no cromossomo de uma célula hospedeira e localizado no mesmo ou localizado fora do cromossomo, contanto que ele possa ser expresso na célula hospedeira. O polinucleotídeo pode ser inserido de qualquer forma, contanto que ele possa ser introduzido em uma célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula hospedeira na forma de um cassete de expressão, o qual é um construto de polinucleotídeo que inclui todos os elementos essenciais necessários para autoexpressão. O cassete de expressão pode, convencionalmente, incluir um promotor operacionalmente ligado ao quadro de leitura aberta (daqui em diante "ORF") do gene, um sinal de término de transcrição, um domínio de ligação a ribossomo e um sinal de término de tradução. O promotor usado na presente invenção não está particularmente limitado, contanto que ele possa iniciar a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína alvo em uma célula hospedeira com alta frequência, e pode ser usado qualquer promotor conhecido na técnica. Especificamente, o promotor T7, o promotor trc, promotor tac e o promotor cysK (Patente Coreana N° 10-0966324) podem ser usados, embora não limitado aos mesmos.
[025] Em uma concretização exemplificativa da presente invenção, o gene metB que codifica a cistationina gama sintase no microrganismo pode ainda ser eliminado ou enfraquecido.
[026] Em uma concretização exemplificativa da presente invenção, o gene thrB que codifica homoserina quinase e o gene metA que codifica a homoserina O-succiniltransferase no microrganismo podem ainda ser eliminados ou enfraquecidos.
[027] Na presente invenção, as sequências dos genes podem ser obtidas a partir de bancos de dados, tal como o The National Center for Biotechnology Information (NCBI).
[028] Conforme usado aqui, o termo "eliminação"se refere a um tipo de remoção, dentro do cromossomo, de uma parte ou a totalidade de uma região da sequência de nucleotídeos de um gene alvo da sequência de nucleotídeos que corresponde ao códon inicial até o códon terminal, ou uma parte ou a totalidade da região de sequência de nucleotídeos de uma região reguladora do mesmo.
[029] Conforme usado aqui, o termo "enfraquecimento" se refere à eliminação ou redução de atividade intracelular de pelo menos uma enzima que é codificada pelo ADN correspondente de uma cepa de microrganismo. Por exemplo, a expressão de uma proteína pode ser enfraquecida ao modificar a região promotora ou a sequência de nucleotídeos da 5'-UTR de um gene ou a atividade de uma proteína pode ser enfraquecida ao introduzir uma mutação na região de ORF do gene correspondente.
[030] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir O-succinil homoserina que inclui cultura do microrganismo acima em um meio para produzir O-succinil homoserina e obtenção de O-succinil homoserina a partir do microrganismo ou do meio.
[031] A cultura da cepa de microrganismo para produção da O-succinil homoserina preparada acima pode ser realizada de acordo com o meio e as condições apropriadas para cultura conhecidos na técnica. O processo de cultura pode ser facilmente ajustado para uso por aqueles versados na técnica de acordo com a cepa a ser selecionada. Especificamente, a cultura pode ser uma cultura descontínua, uma cultura contínua e uma cultura em batelada, porém sem limitação às mesmas. Estes vários processos de cultura são descritos, por exemplo, na referência ("Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138-176).
[032] Os meios usados para cultura devem satisfazer adequadamente os requisitos de cepas particulares. Exemplos de meios para os vários microrganismos são descritos, por exemplo, na referência ("Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bacteriology, Washington D.C., EUA, 1981). Os meios podem incluir várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio e oligoelementos. Exemplos da fonte de carbono a estar contida nos meios podem incluir carboidratos, tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; gorduras, tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico; álcoois, tais como glicerol e etanol; e ácidos orgânicos, tal como ácido acético. Estas fontes de carbono podem ser usadas individualmente ou em combinação. Exemplos da fonte de nitrogênio a estar contida nos meios podem incluir fontes de nitrogênio orgânicas, tais como peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, licor de infusão de milho (CSL) e farinha de feijão; e fontes de nitrogênio inorgânicas, tais como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Estas fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou em combinação. Como uma fonte de fósforo, os meios podem incluir di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio e sais correspondentes contendo sódio. Além disso, os meios de cultura podem incluir metais, tais como sulfato de magnésio e sulfato de ferro. Além disso, aminoácidos, vitaminas e precursores adequados, etc., podem ser incluídos. Estes meios de cultura ou precursores podem ser adicionados à cultura na forma de uma cultura descontínua ou cultura contínua.
[033] Adicionalmente, o pH da cultura pode ser ajustado mediante adição de um composto, tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico durante cultura de uma maneira apropriada. Além disso, a formação de bolhas pode ser evitada durante a cultura usando um agente antiespuma, tal como poliglicol éster de ácido graxo. Além disso, um gás oxigênio ou um gás que contém um gás oxigênio (por exemplo, ar) pode ser adicionado a uma cultura para manter condições aeróbicas na cultura. A temperatura de cultura pode estar na faixa de 20 °C a 45 °C e especificamente de 25 °C a 40 °C. O cultivo pode ser continuado até que seja obtida a quantidade desejada de produto O-succinil homoserina e, especificamente, de 10 horas a 160 horas.
[034] A O-succinil homoserina produzida por meio do método da presente invenção pode ser convertida em metionina pela cistationina gama sintase ou O-succinil homoserina sulfidrilase. Adicionalmente, ácido succínico pode ser obtido como um subproduto, além de L-metionina, ao reagir a O-succinil homoserina produzida por meio do método da presente invenção com CH3SH.
[035] Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo tendo uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase, no qual o polipeptídeo tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Foi confirmado que o novo polipeptídeo isolado da presente invenção tem uma resistência à inibição de feedback pela metionina e é capaz de produzir O-succinil homoserina com um rendimento elevado e, assim, o polipeptídeo pode ser usado para a produção de O-succinil homoserina.
[036] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos Exemplos a seguir. No entanto, estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e a invenção não se destina a estar limitada por estes Exemplos.
[037] Como um método de liberar do controle de feedback do gene metA e para assegurar a estabilidade da mesma, metX derivado de Chromobacterium violaceum foi desenvolvido com base no fato de que o gene metX (homoserina O-acetiltransferase) não tem o feedback inibido pela L-methonine, embora o gene metX tenha uma estrutura similar àquela do gene metA.
[038] A este respeito, para o desenvolvimento de uma nova homoserina O-acetiltransferase, os presentes inventores realizaram uma análise de homologia em relação às sequências de aminoácidos do metX já desenvolvido derivado de Chromobacterium violaceum e, por fim, selecionaram o polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, liberado da inibição de feedback pela metionina. Os presentes inventores confirmaram que o polipeptídeo recém selecionado, embora seja um metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, tem uma nova atividade que nunca foi reportada anteriormente.
[039] Exemplo 2: Construção do plasmídeo
[040] 2-1. Síntese de gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1
[041] O gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1 (sli) (SEQ ID NO: 3) foi sintetizado com base na sequência do gene metX (SEQ ID NO: 2) do banco de dados NCBI (sequência de referência: YP_003522665.1) através de um processo de otimização de códons, de modo que o gene possa ser expresso em E. coli.
[042] 2-2. Construção de um plasmídeo que expressa o gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1
[043] O gene metX foi amplificado por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 4 e 5 com base na sequência de nucleotídeos sintetizada de SEQ ID NO: 3. O iniciador de SEQ ID NO: 5 tem o sítio de restrição HindIII. a. SEQ ID NO: 4) 5'-ATCTTGAGTATTTCGGTTGGTATTG-3'
[044] SEQ ID NO: 5) 5'-CCC AAGCTTttaagcagctgattcccaagc-3'
[045] A PCR foi realizada durante 30 ciclos que consistiam em desnaturação a 95 °C durante 30 s, recozimento a 55 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 1 m. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 1,0% e uma banda de 1,14 kb foi eluída, purificada e tratada com HindIII. O vetor pLC1920 que inclui o promotor cysK foi tratado com EcoRV e HindIII e os fragmentos de restrição resultantes foram clonados. O plasmídeo que expressa o gene metX obtido como um resultado da clonagem foi nomeado como "pCL-PcysK-metX(sli)".
[046] Exemplo 3: Construção de cepas experimentais
[047] 3-1. Eliminação do gene metB
[048] O gene metB que codifica a cistationina gama sintase em uma cepa W3110 de E. coli (K12) de tipo selvagem foi eliminado. Para a eliminação do gene metB, o método de eliminação por FRT-uma-etapa-PCR foi realizado (PNAS (2000) vol. 97: páginas 6640-6645). Para a eliminação do gene metB, um cassete de eliminação foi construído por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7 e o vetor pKD3 (PNAS (2000) vol. 97: páginas 6640-6645) como um modelo.
[049] SEQ ID NO: 6)
[050] 5'- TTACTCTGGTGCCTGACATTTCACCGACAAAGCCCAGGGAACTTCATCACG TGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[051] SEQ ID NO: 7)
[052] 5'- CGCTGCGCCAGCTCCATACGCGGCACCAGCGTTCGCAACCCACGTAGCA GCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
[053] A PCR foi realizada durante 30 ciclos que consistiam em desnaturação a 95 °C durante 30 s, recozimento a 55 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 1 m. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 1,0% e uma banda de 1,1 kb foi eluída e purificada. O fragmento de ADN recuperado foi eletroporado na cepa W3110 de E. coli (K12), a qual já tinha sido transformada com o vetor pKD46 (PNAS (2000) vol. 97: páginas 6640-6645). Para a eletroporação, a cepa W3110, a qual foi transformada com o pKD46, foi cultivada em meio LB contendo 200 μg/L de ampicilina e L-arabinose a 5 mM a 30 °C até que a OD600 atingisse 0,5 e lavada 3 vezes com glicerol a 10% para uso. A eletroporação foi realizada a 2500V. A cepa recuperada foi colocada sobre um meio para placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, cultivada a 37 °C durante 1 a 2 dias e a cepa que mostra resistência ao cloranfenicol foi selecionada. A cepa selecionada foi submetida à PCR sob as mesmas condições descritas acima usando os iniciadores de SEQ ID NOs: 8 e 9 e a eliminação do gene metB foi confirmada observando a presença de uma banda de 1,5 kb do gene em um gel de agarose a 1,0%.
[054] SEQ ID NO: 8) 5'-TATTCGCCGCTCCATTCAGC-3'
[055] SEQ ID NO: 9) 5'-TACCCCTTGTTTGCAGCCCG-3'
[056] A cepa assim confirmada foi transformada com o vetor pCP20 (PNAS (2000) vol. 97: páginas 6640-6645) e cultivada em meio LB contendo 100 μg/L de ampicilina. A cepa final com uma eliminação do gene metBtendo um tamanho reduzido, o que foi confirmado em um gel de agarose a 1,0%, foi construída realizando PCR sob as mesmas condições e confirmado que o marcador cloranfenicol tinha sido removido da cepa. A cepa assim construída, a qual requer metionina, foi nomeada como "CC03-0131".
[057] 3-2. Eliminação do gene thrB
[058] Foi tentado aumentar a quantidade de síntese de O-succinil homoserina a partir de homoserina ao eliminar o gene thrB o qual codifica homoserina quinase. Em particular, é essencial eliminar o gene thrB para usar uma cepa que produz treonina, porque a atividade de utilização de homoserina é muito alta. A eliminação do gene thrB na cepa CC03-0131 construída acima foi realizada por meio do método de eliminação por FRT-uma-etapa-PCR. Um cassete de eliminação de thrB foi construído através de PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 10 e 11 e o vetor pKD3 como um modelo.
[059] SEQ ID NO: 10)
[060] 5'- CATGGTTAAAGTTTATGCCCCGGCTTCCAGTGCCAATATGAGCGTCGGGT GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[061] SEQ ID NO: 11)
[062] 5'- GGAGATACCGCTCGCTACCGCGCCGATTTCCGCGACCGCCTGCCGCGCC TCATATGAATATCCTCCTTAG-3'
[063] A PCR foi realizada durante 30 ciclos que consistiam em desnaturação a 95 °C durante 30 s, recozimento a 55 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 1 m. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 1,0% e uma banda de 1,1 kb foi eluída e purificada. O fragmento de ADN recuperado foi eletroporado na cepa CC03- 0131, a qual já tinha sido transformada com o vetor pKD46. Para a eletroporação, a cepa CC03-0131, a qual foi transformada com o pKD46, foi cultivada em meio LB contendo 200 μg/L de ampicilina e arabinose a 5 mM a 30 °C até que a OD600 atingisse 0,5 e lavada 3 vezes com glicerol a 10% para uso. A eletroporação foi realizada a 2500V. A cepa recuperada foi colocada em meio para placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, cultivada a 37 °C durante 1 a 2 dias e uma cepa que mostra a resistência ao cloranfenicol foi selecionada.
[064] A cepa selecionada foi submetida à PCR sob as mesmas condições descritas acima usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 12 e 13 e a eliminação do gene thrB confirmada observando a presença de uma banda de 1,5 kb do gene em um gel de agarose a 1,0%.
[065] SEQ ID NO: 12) 5'-ACTCGACGATCTCTTTGCC-3'
[066] SEQ ID NO: 13) 5'-ACGCCGAGAGGATCTTCGCAG-3'
[067] A cepa assim confirmada foi transformada com o vetor pCP20 e cultivada em meio LB contendo 100 μg/L de ampicilina. A cepa final com uma eliminação do gene thrB tendo um tamanho reduzido, o que foi confirmado em um gel de agarose a 1,0%, foi construída realizando PCR sob as mesmas condições e confirmado que o marcador cloranfenicol tinha sido removido da cepa. A cepa assim construída foi nomeada como "CC03-0131-2".
[068] 3-3. Eliminação do gene metA
[069] Para a caracterização de especificidade de substrato e atividade do gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1 em uma cepa de E. coli, o gene metA original no cromossomo foi eliminado com base na cepa CC03-0131-2, a qual é uma cepa W3110 de E. coli (K12) com eliminações dos genes metB e thrB. O gene metA foi eliminado por meio do método de eliminação FRT-uma-etapa-PCR. Um cassete de eliminação de metA foi construído por PCR usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 14 e 15 e o vetor pKD3 como um modelo.
[070] SEQ ID NO: 14)
[071] 5'- TCAGCTGTTGCGCATCGATTCCCGTGAATCGCGCAACACGCCCGCAGAGC GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3'
[072] SEQ ID NO: 15)
[073] 5'- CCGTCACAAAGGCAATGCGCTTATCTTTACTGGCAAACAGATATGCATCCC ATATGAATATCCTCCTTAG-3'
[074] A PCR foi realizada durante 30 ciclos que consistiam em desnaturação a 95 °C durante 30 s, recozimento a 55 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 1 m. Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em um gel de agarose a 1,0% e uma banda de 1,1 kb foi eluída e purificada. O fragmento de ADN recuperado foi eletroporado na cepa CC03- 0131-2, a qual já foi transformada com o vetor pKD46. Para eletroporação, a cepa CC03-0131-2, a qual foi transformada com o pKD46, foi cultivada em meio LB contendo 200 μg/L de ampicilina e arabinose a 5 mM a 30 °C até que a OD600 atingisse 0,5 e lavada 3 vezes com glicerol a 10 % para uso. A eletroporação foi realizada a 2500V. A cepa recuperada foi colocada em meio para placa LB contendo 30 μg/L de cloranfenicol, cultivada a 37 °C durante 1 a 2 dias e uma cepa que mostra resistência ao cloranfenicol foi selecionada.
[075] A cepa selecionada foi submetida à PCR sob as mesmas condições descritas acima usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 16 e 17 e a eliminação do gene metA confirmada observando a presença de uma banda de 1,5 kb do gene em um gel de agarose a 1,0%.
[076] SEQ ID NO: 16) 5'-CTCATTAACGTTGGTTGTCA-3'
[077] SEQ ID NO: 17) 5'-TATCTTGCTGCTGCTGAATG-3'
[078] A cepa assim confirmada foi transformada com o vetor pCP20 e cultivada em meio LB contendo 100 μg/L de ampicilina. A cepa final com uma eliminação do gene metA tendo um tamanho reduzido, o que foi confirmado em um gel de agarose a 1,0%, foi construída realizando PCR sob as mesmas condições acima e confirmado que o marcador cloranfenicol foi removido da cepa. A cepa assim construída foi nomeada como "CC03-0132".
[079] 3-4. Construção de uma cepa na qual foi introduzido um plasmídeo que expressa o gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1
[080] Para a caracterização de especificidade de substrato e atividade do gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, o plasmídeo pCL- PcysK-metX (sli)) construído no Exemplo 2a foi introduzido na cepa CC030132, a qual é uma cepa W3110 de E. coli (K12) com eliminações dos genes metB, thrB e metA.
[081] A cepa CC03-0132 com o pCL-PcysK-metX (sli) introduzido foi nomeada como "CC03-0136" e depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) localizado em 361-221, Hongje-1-dong, Seodaemun- gu, Seoul, Coreia do Sul, o qual é uma subsidiária da Korean Federation of Culture Collections (KFCC), reconhecida como uma autoridade internacional de depósito sob o Tratado de Budapeste, em 10 de Junho de 2013, sob o Número de Adesão KCCM11424P.
[082] Foi construída uma cepa através da introdução de um plasmídeo pCL-PcysK-metA, o qual tinha sido construído da mesma maneira conforme no Exemplo 2, exceto quanto ao uso de metA de tipo selvagem na cepa CC030132 como o grupo de controle. A cepa assim construída foi nomeada como "CC03-0132/pCL-PcysK-metA".
[083] Adicionalmente, foi construída uma cepa usando uma cepa CJM002 que produz treonina, a qual foi liberada do requisito de metionina (Número de Adesão: CCCM-10568), através de mutação artificial usando NTG com base na cepa TF4076 que produz L-treonina (Número de Acesso: KFCC-10718), a qual é uma cepa que requer metionina descrita na Patente Coreana N° 10-0905381, da mesma maneira conforme nos Exemplos 3-1 a 3-3, e a cepa assim construída foi nomeada como "CJM-BTA".
[084] Os plasmídeos pCL-PcysK-metX (sli) e pCL-PcysK-metA, conforme descrito acima, foram introduzidos com base na cepa CJM-BTA e as cepas assim construídas foram nomeadas como "CJM-BTA/ pCL-PcysK-metX (sli)" e "CJM-BTA/pCL-PcysK-metA", respectivamente.
[085] Exemplo 4: Produção de O-succinil homoserina usando uma cepa
[086] 4-1. Experimento de cultura em frasco
[087] Para caracterização de especificidade de substrato e atividade do gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, introduzido na cepa construída no Exemplo 3, foi realizada uma cultura em frasco de Erlenmeyer. A composição da cultura em frasco é mostrada na Tabela 1 abaixo. [Tabela 1]
[088] A cepa CC03-0132 e a cepa CJM-BTA foram inoculadas em meio para placa LB como grupos de controle. A cepa CC03-0136 (transformada com um vetor de expressão de metX), a cepa CC03-0132/pCL-PcysK-metA (transformada com o vetor de expressão de metX preparado usando o mesmo vetor) e duas outras cepas, CJM-BTA/pCL-PcysK-metX (sli) e CJM-BTA/pCL- PcysK-metA (transformadas com o vetor de expressão de metX ou o vetor de expressão de metA com base na cepa CJM-BTA, respectivamente) foram inoculadas em meios para placa LB contendo espectinomicina, cultivadas a 33 °C de um dia para o outro. Então, as colônias individuais foram inoculadas em 2 ml de meio LB contendo espectinomicina, cultivadas a 33 °C durante 2 horas, inoculadas de novo em um frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 25 mL de meio para frasco para uma absorbância de 0,07 a OD600, cultivadas a 33 °C em uma velocidade de 200 rpm durante 48 horas e a quantidade de produção de O-succinil homoserina foi comparada através de análise por HPLC. Os resultados são mostrados na Tabela 2 abaixo. [Tabela 2]
[089] Como um resultado, foi confirmado que o gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1, conforme é o caso com o gene metA de E. coli, produz O-succinil homoserina usando succinil-coA como um substrato, mas não produz O-acetil homoserina. Quando o gene metX derivado de Sideroxydans lithotrophicus ES-1 foi introduzido, nenhuma inibição de feedback pela metionina adicionado ao meio apareceu, mesmo com o tipo selvagem em 51, sem a introdução de qualquer modificação.
[090] Aqueles versados na técnica reconhecerão que a presente invenção pode ser concretizada em outras formas específicas sem se afastar de seu espírito ou características essenciais. As concretizações descritas devem ser consideradas, em todos os aspectos, apenas como ilustrativas e não restritivas. O âmbito da presente invenção é, portanto, indicado pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior. Todas as alterações que caem dentro do significado e faixa de equivalência das reivindicações devem ser incluídas no âmbito da presente invenção.
Claims (5)
1. Micro-organismo Escherichia sp. que produz O-succinil homoserina que expressa um polipeptídeo que tem uma resistência à inibição de feedback pela metionina e uma atividade de homoserina O-succiniltransferase, caracterizado por o polipeptídeo ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que o gene thrB que codifica a homoserina quinase é ainda eliminado.
2. Micro-organismo Escherichia sp. que produz O-succinil homoserina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o micro-organismo Escherichia sp. ser Escherichia coli.
3. Micro-organismo Escherichia sp. de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o gene metB que codifica cistationina gama sintase ser ainda eliminado.
4. Micro-organismo Escherichia sp. de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o gene metA que codifica homoserina O-succiniltransferase ser ainda eliminado.
5. Método de produção de O-succinil homoserina caracterizado por compreender: a) cultura do micro-organismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 em um meio; e b) obtenção de O-succinil homoserina a partir do micro-organismo ou do meio.
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