CN108004192A - 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株、构建方法及其应用 - Google Patents

鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸡白痢沙门菌crp‑cya双基因缺失株，它为crp基因和cya基因都不表达的鸡白痢沙门菌；本发明还公开了上述鸡白痢沙门菌crp‑cya双基因缺失株的一种构建方法及其在应用。本发明提供的鸡白痢沙门菌crp‑cya双基因缺失株，可以使鸡白痢沙门菌毒性减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染，本发明的双基因缺失株基因涉及合理，不影响整体鸡白痢沙门菌的整体性能，构建方法简单、过程易于操作、控制，通过动物实验发现，突变株毒力显著降低，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌能提供良好的保护作用。本发明适用于制备鸡白痢沙门菌crp‑cya双基因缺失株，并进一步应用于鸡白痢沙门菌活疫苗中。

Description

鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株、构建方法及其应用
技术领域
本发明属于禽沙门菌病的防治领域，涉及一种鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株及其应用。
背景技术
鸡白痢是由鸡白痢沙门菌（Salmonella Pullorum）引起的一种多发性传染病，对我国的养鸡业危害极大。该病原菌除了能够水平传播，还可以经蛋垂直传播，严重影响孵化率和雏鸡成活率。鸡白痢沙门菌多侵害20日龄以内的雏鸡，以白色下痢为特征，表现为急性败血症，发病率和死亡率相当高；成年鸡多呈慢性或隐性带菌，一般无明显症状。目前，国内常采用抗生素类药物控制该菌，但长期使用药物易引起细菌耐药性和药物残留等问题，因此，以疫苗防治鸡白痢的研究颇受重视。
最初预防沙门菌的疫苗为全菌灭活疫苗，因该疫苗只能激发机体产生体液免疫，且容易产生副作用，此外，还存在需要多次免疫和免疫工作量大等问题，因而不能广泛应用。目前，该领域很多学者以沙门菌减毒株作为疫苗口服实验动物，以模拟沙门菌肠道自然感染方式，结果发现，减毒沙门菌可以有效的保护实验动物。相比于灭活苗，减毒沙门菌具有以下的优越性：
1. 能侵入机体的淋巴系统，有效的刺激机体产生细胞免疫和体液免疫；
2. 可通过口服、喷雾等自然感染途径，刺激黏膜淋巴细胞产生分泌型IgA，形成保护屏障，防止经黏膜感染的微生物对宿主细胞的侵染和定殖；
3. 减毒沙门菌本身具有免疫佐剂的功能，免疫时无需额外加入佐剂；
4. 免疫具有持续性，减毒沙门菌免疫机体后，可在宿主体内生存并繁殖，因其毒性减弱，最终可被宿主清除。
5. 该疫苗接种简单，易于大规模免疫应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，它为crp基因和cya基因都不表达的鸡白痢沙门菌；
本发明的另外一个目的，是提供一种鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的构建方法及其在鸡白痢沙门菌活疫苗中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，它为crp基因和cya基因都不表达的鸡白痢沙门菌。
作为本发明的限定，它为crp基因和cya基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。
作为本发明的进一步限定：
①被敲除的crp基因的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
ATGGTGCTTG GCAAACCGCA AACAGACCCG ACTCTTGAAT GGTTCTTGTC TCATTGCCAC
ATTCATAAGT ACCCGTCAAA GAGCACGCTG ATTCACCAGG GTGAAAAAGC AGAAACGCTG
TACTACATCG TTAAAGGCTC CGTGGCAGTG CTGATCAAAG ATGAAGAAGG GAAAGAAATG
ATCCTTTCTT ATCTGAATCA GGGTGATTTT ATTGGTGAAC TGGGCCTGTT TGAAGAAGGC
CAGGAACGCA GCGCCTGGGT ACGTGCGAAA ACCGCATGTG AGGTCGCTGA AATTTCCTAC
AAAAAATTTC GCCAATTAAT CCAGGTCAAC CCGGATATTC TGATGCGCCT CTCTTCCCAG
ATGGCTCGTC GCTTACAAGT CACCTCTGAA AAAGTAGGTA ACCTCGCCTT CCTTGACGTC
ACCGGGCGTA TCGCTCAGAC GCTGCTGAAT CTGGCGAAAC AGCCCGATGC CATGACGCAC
CCGGATGGGA TGCAGATCAA AATCACTCGT CAGGAAATCG GCCAGATCGT CGGCTGCTCC
CGCGAAACCG TTGGTCGTAT TTTGAAAATG CTGGAAGATC AAAACCTGAT CTCCGCGCAT
GGCAAGACCA TCGTCGTCTA CGGCACCCGT TAA
②被敲除的cya基因的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：
ATGACGGGTA GCAACATCAG GCGATACGTC TTGTACCTCT ATATTGAGAC TCTGAAACAG
AGACTGGATG CCATAAATCA ACTGCGTGTG GATCGCGCGC TTGCTGCCAT GGGACCCGCT
TTTCAGCAGG TTTACAGTCT TCTGCCGACA TTATTGCACT ATCACCATCC ACTGATGCCG
GGTTACCTTG ATGGTAACGT TCCCAGCGGT ATTTGCTTCT ACACGCCTGA TGAAACCCAA
CGCCACTATC TGAACGAACT TGAGCTGTAC CGCGGTATGA CGCCGCAGGA CCCGCCGAAG
GGCGAGCTGC CGATTACCGG CGTTTACACC ATGGGCAGCA CCTCCTCGGT TGGGCAGAGC
TGCTCGTCCG ACCTGGATAT CTGGGTGTGC CATCAGTCCT GGCTCGACGG TGAAGAGCGT
CAGTTGCTGC AACGTAAGTG TAGCCTGCTG GAAAGCTGGG CCGCCTCGCT TGGCGTTGAG
GTGAGCTTCT TCCTGATCGA CGAGAACCGT TTCCGCCATA ACGAAAGCGG CAGTCTGGGC
GGGGAAGACT GTGGTTCTAC GCAGCATATC CTGTTGCTTG ATGAGTTTTA TCGTACCGCT
GTGCGCCTGG CCGGGAAACG TATCCTGTGG AGTATGGTGC CGTGCGACGA AGAAGAGCAT
TACGACGACT ATGTCATGAC GCTCTACGCG CAGGGCGTAT TAACGCCAAA CGAATGGCTG
GATCTGGGGG GCTTAAGCTC GCTCTCCGCC GAAGAGTACT TTGGCGCCAG CCTGTGGCAG
CTATACAAGA GCATTGACTC GCCGTACAAA GCGGTGCTGA AAACGCTGCT GCTGGAAGCC
TATTCATGGG AATATCCTAA CCCACGTCTG CTGGCGAAAG ATATTAAACA ACGTCTGCAT
GACGGTGAAA TCGTATCGTT TGGACTCGAT CCCTACTGCA TGATGCTGGA ACGGGTCACT
GAATACCTGA CGGCGATTGA AGATCCGACG CGGCTGGATT TAGTCCGCCG CTGCTTTTAC
CTGAAAGTGT GCGAGAAATT AAGTCGCGAG CGTGCCTGCG TAGGCTGGCG TCGGGAAGTA
TTAAGCCAGT TAGTCAGCGA GTGGGGATGG GACGACGCGC GTCTGACCAT GCTCGATAAT
CGCGCAAACT GGAAAATCGA TCAGGTGCGC GAAGCCCACA ACGAATTGCT CGACGCCATG
ATGCAAAGCT ATCGTAATCT GATTCGCTTT GCGCGGCGCA ACAACCTCAG CGTGAGTGCC
AGCCCGCAGG ATATCGGCGT ACTGACGCGT AAGCTGTACG CTGCTTTTGA AGCGTTGCCG
GGTAAAGTCA CGCTGGTGAA CCCGCAGATA TCGCCGGATC TGTCCGAGCC GAATTTAACC
TTTATCCATG TGCCGCCGGG ACGCGCCAAC CGTTCAGGCT GGTATCTCTA CAACCGCGCG
CCGAACATGG ATTCCATCAT CAGCCATCAG CCGCTGGAAT ATAACCGTTA TCTTAATAAG
CTGGTCGCGT GGGCGTGGTT CAACGGCCTG CTGACGTCGC GAACGCATCT GTTTATTAAG
GGCAACGGTA TTGTCGACCT GCCTAAGTTG CAGGAGATGG TCGCCGATGT TTCGCACCAT
TTCCCGCTGC GCTTGCCTGC TCCGACGCCG AAAGCGCTCT ACAGCCCCTG TGAAATTCGC
CATCTGGCGA TTATCGTTAA CCTCGAATAT GACCCGACGG CGGCGTTTCG CAATAAAGTG
GTCCATTTTG ACTTCCGTAA GCTGGATGTT TTCAGCTTTG GCGAAGAGCA AAACTGTCTG
ATAGGCAGTA TCGACTTGTT ATATCGCAAC TCGTGGAACG AAGTGCGTAC TCTGCACTTT
CACGGCGAGC AGGCGATGAT CGAAGCGCTG AAAACGATTC TGGGGAAAAT GCACCAGGAT
GCCGCGCCGC CGGATAGCGT GGAGGTGTTC TGCTACAGTC AGCATCTTCG CGGTCTGATT
CGCACCCGCG TGCAGCAACT GGTCTCCGAA TGTATCGAGC TACGTCTTTC CAGCACCCGT
CAGGAGACCG GTCGCTTCAA GGCGCTGCGG GTTTCCGGGC AGACGTGGGG ACTATTCTTC
GAACGCTTGA ATGTCTCGGT GCAGAAGCTG GAGAACGCTA TCGAATTCTA CGGCGCGATT
TCGCATAACA AGCTGCACGG GCTGTCGGTA CAGGTGGAAA CCAACCAGGT GAAATTGCCG
TCAGTGGTGG ATGGCTTCGC CAGCGAAGGG ATTATCCAGT TCTTCTTTGA AGAAACGGGC
GATGAGAAAG GCTTTAATAT TTATATTCTG GATGAAAGTA ACCGGGCGGA AGTGTATCAC
CACTGCGAAG GTAGCAAGGA AGAACTGGTG CGCGACGTCA GTCGCTTCTA TTCATCATCG
CACGATCGCT TCACGTATGG CTCCAGTTTT ATCAACTTTA ACCTGCCGCA GTTCTACCAG
ATAGTGAAAA CCGATGGCCG CGCGCAGGTG ATCCCATTCC GTACGCAGCC TATCAACACC。
进一步地，所述鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株还可以经过其它基因改造。
所述的其他基因改造是指除crp基因和cya基因双敲除以外的基因改造。所述其他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目的基因的改造。理论上可以不断对其基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没有特别限制。
基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增添、缺失引起的变换。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。
优选地，本发明SEQ ID NO.1所示的crp基因被敲除并更换为FRT位点序列，所述FRT位点序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGA
ACTTCGGAATAGGAACT。
优选地，本发明SEQ ID NO.2所示的cya基因被敲除并更换为FRT位点序列，所述FRT位点序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGA
ACTTCGGAATAGGAACT。
上述FRT位点序列的引入，并不影响鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的性能。
本发明的第二方面，是提供一种鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的构建方法，它包括步骤：将鸡白痢沙门菌中的crp基因和cya基因都敲除。
作为本发明鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的构建方法的一种限定，采用同源重组的方法敲除crp基因和cya基因；
敲除crp基因和cya基因，可以采用现有的基因编辑方法敲除所述的crp基因和cya基因，在本发明中，采用Red同源重组的方法敲除crp基因和cya基因。当然还可以采用其他方法实现基因敲除，并不限于本发明所列举的方法。
基于crp基因的敲除，crp基因的完整序列从染色体DNA中被去除；基于cya基因的敲除，cya基因的部分序列从染色体DNA中被去除。
鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株在2017年09月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株的分类命名为：肠沙门氏菌肠亚种鸡白痢血清型 salmonella enterica subsp. enterica serovarpullorum，保藏编号为CGMCC No.14593。
在具体实施过程中，先构建crp基因敲除的鸡白痢沙门菌突变株，并在此基础上敲除cya基因。
cya基因编码环腺苷酸合成酶，crp基因编码环腺苷酸受体蛋白，crp-cya双基因缺失影响了菌体碳水化合物和氨基酸的代谢,进而降低了菌体生长增殖的速度，从而在不影响免疫原性的基础上实现了减毒的目的。crp-cya双基因敲除，不仅实现了减毒的目的，还极大的降低了减毒活疫苗在实际应用过程中转化成野生型菌株的可能性。
本发明的第三方面，提供了鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的用途，它用于制备鸡白痢沙门菌活疫苗，即：该活菌疫苗，含有鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明提供的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，可以使鸡白痢沙门菌毒性减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染，本发明的双基因缺失株基因涉及合理，不影响整体鸡白痢沙门菌的整体性能，构建方法简单、过程易于操作、控制，通过动物实验发现，突变株毒力显著降低，接种后鸡只无不良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌能提供良好的保护作用。
本发明适用于制备鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，并进一步应用于鸡白痢沙门菌活疫苗中。
本发明下面将结合具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为鸡白痢沙门菌crp基因打靶片段的PCR扩增图（图中，M：DL2000 DNA Marker；1：crp打靶基因片段，2：crp打靶基因片段）；
图2为ΔcrpC533菌落PCR鉴定图（图中，M：DL2000 DNA Marker； 1：以ΔcrpC533:KanR菌落为模板扩增的片段；2：以CVCC533菌落为模板扩增的片段；3：以ΔcrpC533菌落为模板扩增的片段）；
图3为鸡白痢沙门菌cya打靶片段的PCR扩增图（图中，M：DL2000 DNA Marker；1：cya打靶基因片段）；
图4为ΔcyaC533菌落PCR鉴定图（图中，M：DL2000 DNA Marker； 1：以CVCC533菌落为模板扩增的cya片段；2：以ΔcyaC533菌落为模板扩增的Δcya片段）；
图5为鸡白痢沙门菌ΔcrpΔcyaC533菌落PCR图（图中，M：DL2000 DNA Marker；1：以CVCC533菌落为模板扩增的crp片段；2：以ΔcrpΔcyaC533菌落为模板扩增的Δcrp片段；3：以 CVCC533菌落为模板扩增的cya片段；4：以ΔcrpΔcyaC533菌落为模板扩增的Δcya片段）；
图6为鸡白痢沙门菌CVCC533和双基因突变株ΔcrpΔcyaC533生长曲线图；
图7为双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533传代Δcya基因检测图（图中，M：DL2000 DNAMarker；1：以 CVCC533菌落为模板扩增的cya片段；2-11：以ΔcrpΔcyaC533菌落为模板扩增的Δcya片段）；
图8为双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533传代Δcrp基因检测图（图中，M：DL2000 DNAMarker；1：以 CVCC533菌落为模板扩增的crp片段；2-11：以ΔcrpΔcyaC533菌落为模板扩增的Δcrp片段）。
具体实施方式
本发明下述的具体实施方式中，除非另有说明，本发明所公开的试验方法、检测方法、制备方法均采用本领域常规的分子生物学、生物化学、人色提结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术以及相关领域的常规技术；未说明的试剂均为现有的市售试剂。
当下述实施例中给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两端点及两个端点之间任何一个数值均可以选用。除非另外定义，本发明所使用的所有技术和科学术语与本领域的技术人员通常理解的意义相同。除非本实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本领域的技术人员对现有技术的掌握以及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下述具体实施例1-3中实验相关引物设计如下：
参照https://www.ncbi.nlm.nih.gov/登陆的鸡白痢沙门菌ATCC9120株的crp基因和cya基因（GenBank NO. CP012347.1）以及pKD46质粒和pCP20质粒序列设计12条相关引物（见表1），用于鸡白痢沙门菌亲本株CVCC533（购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心，CVCC）和双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的构建和鉴定。各引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
表1 用于双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533构建的引物序列
实施例1 鸡白痢沙门菌基因缺失株ΔcrpC533的构建方法
11. crp打靶基因片段的制备
以pKD4质粒为模板，C1和C2为引物PCR扩增crp打靶基因片段，反应条件：94℃变性5min，94℃、30s，58℃、30s，72℃、90s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。将PCR产物用DPNⅠ酶消化2h，回收目的片段，回收的目的片段为crp打靶基因，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。crp打靶基因鉴定见图1。
12. pKD46质粒转化CVCC533
以CVCC533为菌种，在LB平板划线，37℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养，当OD600约为0.6时，停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管，冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存，即制备感受态细胞。
取10ng pKD46质粒加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，30℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Amp+），30℃倒置培养40h，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pKD46质粒已成功转化CVCC533，将此菌株命名为pKD46/C533。
13. crp打靶基因转化pKD46/C533
以pKD46/C533为菌种，在LB平板划线，30℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，30℃、200rpm培养，待OD600为0.2-0.3时，加入L-阿拉伯糖诱导（终浓度10-30Mm/L），待OD600为0.5-0.6时停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管，冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存。
取200ng crp打靶片段（步骤11所制备的crp打靶基因）加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，37℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Kan+），37℃倒置培养40h，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，crp打靶基因片段已成功重组到C533基因组中，将此菌株命名为pKD46/ΔcrpC533:KanR。
将pKD46/Δcrp C533：KanR划线LB平板（Kan+），37℃~43℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pKD46质粒已成功被消除，将此菌株命名为ΔcrpC533:KanR。
14. KanR基因的消除
以ΔcrpC533:KanR为菌种，在LB平板划线，37℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养，当OD600约为0.6时，停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管，冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存，即得到感受态细胞。
取10ng pCP20质粒加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，30℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Amp+），30℃倒置培养40h，挑取单菌落接种LB液体培养基（Amp+），30℃、200rpm培养18~24h，取菌液进行PCR鉴定，结果表明，pCP20质粒成功转入ΔcrpC533:KanR且KanR已成功被消除，将此菌株命名为pCP20/ΔcrpC533。
将pCP20/ΔcrpC533划线LB平板， 42℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR验证，验证结果表明pCP20质粒已成功被消除，将此菌株命名为ΔcrpC533。ΔcrpC533菌落PCR鉴定见图2。
实施例2 鸡白痢沙门菌基因缺失株ΔcyaC533的构建方法
21. cya打靶基因片段的制备
以pKD4质粒为模板，C5和C6为引物PCR扩增cya打靶基因片段，反应条件：94℃变性5min，94℃、30s，58℃、30s，72℃、90s，进行30个循环，最后72℃延伸5min。将PCR产物用DPNⅠ酶消化2h，回收目的片段，目的片段为cya打靶基因，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带。cya打靶基因鉴定见图3。
22. cya打靶基因转化CVCC533
取200ng cya打靶片段（步骤21中所制备的cya打靶基因）加入pKD46/C533感受态细胞（制备方法同实施例1中步骤12），然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，37℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Kan+），37℃倒置培养40h，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，crp打靶基因片段已成功重组到C533基因组中，将此菌株命名为pKD46/ΔcyaC533:KanR。
将pKD46/ΔcyaC533:KanR划线LB平板（Kan+），37℃~43℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pKD46质粒已成功被消除，将此菌株命名为ΔcyaC533:KanR。
23. KanR基因的消除
以ΔcyaC533:KanR为菌种，在LB平板划线，37℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养，当OD600约为0.6时，停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管，冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存，即得到感受态细胞。
取10ng pCP20质粒加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，30℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Amp+），30℃倒置培养40h，挑取单菌落接种LB液体培养基（Amp+），30℃、200rpm培养18-24h，取菌液进行PCR鉴定，结果表明pCP20质粒成功转化ΔcyaC533:KanR且KanR成功被消除，将此菌株命名为pCP20/ΔcyaC533。
将pCP20/ΔcyaC533划线LB平板， 42℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pCP20质粒已成功被消除，将此菌株命名为ΔcyaC533。ΔcyaC533菌落PCR鉴定见图4。
实施例3 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）的构建方法
31. pKD46质粒转化ΔcrpC533
以ΔcrpC533为菌种（该菌种的制备方法同实施例1），在LB平板划线，37℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养，当OD600约为0.6时，停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管，冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存，即制备得到感受态细胞。
取10ng pKD46质粒加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，30℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Amp+），30℃倒置培养40h，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pKD46质粒已成功转化ΔcrpC533，将此菌株命名为pKD46/ΔcrpC533。
32. cya打靶基因转化pKD46/ΔcrpC533
以pKD46/ΔcrpC533为菌种，在LB平板划线，30℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，30℃、200rpm培养，待OD600为0.2-0.3时，加入L-阿拉伯糖诱导（终浓度10-30Mm/L），待OD600为0.5-0.6时停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管），冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存。
取200ng cya打靶片段（制备方法同实施例2中步骤21）加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，37℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Kan+），37℃倒置培养40h，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，crp打靶基因片段已成功重组到C533基因组中，将此菌株命名为pKD46/ΔcrpΔcyaC533:KanR。
将pKD46/ΔcrpΔcyaC533:KanR划线LB平板（Kan+），37℃~43℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pKD46质粒已成功被消除，将此菌株命名为ΔcrpΔcyaC533:KanR。
33. KanR基因的消除
以ΔcrpΔcyaC533:KanR为菌种，在LB平板划线，37℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养，当OD600约为0.6时，停止培养，将菌液转至50mL无菌预冷离心管，冰上放置20min，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，加入10mL预冷10%甘油溶液洗涤3次，4℃、4000rpm离心5min，收集菌体，再加入120μL预冷的10%甘油溶液，轻柔重悬菌体，按每管60μL进行分装，冰上保存。
取10ng pCP20质粒加入感受态细胞，然后转移至预冷电击杯（1mm）中，2500V，电击5ms，立刻加入LB液体培养基800μL，30℃、200rpm活化2h，4000rpm离心5min，去除700μL上清液，重悬菌体，全部涂入LB平板（Amp+），30℃倒置培养40h，挑取单菌落接种LB液体培养基（Amp+），30℃、200rpm培养18~24h，取菌液进行PCR鉴定，结果表明pCP20质粒成功转化ΔcrpΔcyaC533:KanR且KanR成功被消除，将此菌株命名为pCP20/ΔcrpΔcyaC533。
将pCP20/ΔcrpΔcyaC533划线LB平板，42℃过夜培养，挑取单菌落进行PCR验证，结果表明，pCP20质粒已成功被消除，将此菌株命名为ΔcrpΔcyaC533。ΔcrpΔcyaC533菌落PCR鉴定见图5。
本实施例通过上述步骤制备得到鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，构建方法简单，过程易于控制。
实施例4 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株生物学特性
本实施例对实施例3制备而得到的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）进行生物学鉴定试验。
1. 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的表型鉴定
将缺失株ΔcrpΔcyaC533和亲本株C533划线LB平板，然后转接葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、卫矛醇、硫化氢、鸟氨酸脱羧酶生化鉴定管研究其生化特性。结果表明（见表2），双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533生化特性与亲本株C533一致。
表2 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533与亲本株C533的生化特性比较
2. 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的生长特性检测
将双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533和亲本株C533划线LB固体培养基，37℃培养20h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养20h，用无菌LB液体培养基连续10倍稀释，取100µL适当稀释度菌液均匀涂布在LB固体培养基上，每个稀释度做3个重复，37℃培养36h，计数并取平均值计算原菌液活菌浓度。然后以终浓度108CFU接种相同体积的LB液体培养基，37℃、200rpm培养，每1h取样测OD600值并平板计，绘制生长曲线。结果显示（如图6），双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533生长速度显著慢于亲本株CVCC533。
3. 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的遗传稳定性测定
将ΔcrpΔcyaC533在LB固体培养基划线培养，随机挑取单菌落接种LB固体培养基，37℃培养36h，随机挑取单菌落接种LB固体培养基，连续传代50次。利用crp基因检测引物（C3/C4）和cya基因检测引物（C7/C8）进行PCR检测，鉴定双基因缺失株的crp和cya缺失基因的稳定性。如图5、图6所示，双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的第5、10、15、20、25、30、35、40、45和50代模板均能扩增出缺失型159bp的Δcrp片段和195bp的Δcya片段，亲本株CVCC533扩增出野生型677bp的crp片段和2565bp的cya片段，表明本发明制备的双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533能够稳定遗传缺失型159bp的Δcrp片段和195bp的Δcya片段。
双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533传代Δcya基因检测图见图7，双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533传代Δcrp基因检测图见图8。
实施例5 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）在疫苗中的应用及该疫苗的制备
实施例3所制备的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）可以应用于鸡白痢沙门活菌疫苗中。
疫苗的制备方法如下：
将双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533在LB固体培养基划线培养36h，挑取单菌落接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养24h，再按2%接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养16h，用新鲜无菌LB培养基连续10倍稀释以平板计数法测定活菌数，最终以新鲜无菌LB培养基调整适当细菌浓度，得到所用疫苗。
实施例6 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）疫苗的毒力测定
本实施例分对第一大组、第二大组、第三大组、第四大组、空白组和无菌组进行疫苗的毒力测定。
第一大组：鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）疫苗；
第二大组：鸡白痢沙门菌crp单基因缺失株疫苗（菌株为Δcrp C533，它为实施例1所制备的菌株按照实施例5的疫苗制备方法制备而成）；
第三大组：鸡白痢沙门菌cya单基因缺失株疫苗（菌株为Δcya C533，它为实施例2所制备的菌株按照实施例5的疫苗制备方法制备而成），
第四大组：CVCC533菌株疫苗（由CVCC533菌株按照实施例5的疫苗制备方法制备而成）；
空白组：无任何疫苗；
对照组：无菌LB液体培养基代替疫苗。
其中：第一大组～第四大组，每大组50只雏鸡，每大组均分为5小组（每小组10只雏鸡）；
空白组和对照组：每组各10只雏鸡。
具体过程如下：
第一大组口服感染ΔcrpΔcyaC533疫苗，每小组每只感染量分别为3.25×109CFU、2.87×108CFU、3.47×107CFU、3.11×106CFU和3.77×105CFU；第二大组口服感染C533疫苗，每小组每只感染量分别为2.31×108CFU、2.17×107CFU、1.98×106CFU、2.44×105CFU和2.24×104CFU；第三大组口服感染ΔcrpC533疫苗，每小组每只感染量分别为2.11×109CFU、2.55×108CFU、2.25×107CFU、2.31×106CFU和2.66×105CFU；第四大组口服感染ΔcyaC533疫苗，每小组每只感染量分别为2.27×109CFU、2.51×108CFU、2.47×107CFU、2.07×106CFU和2.33×105CFU。记录雏鸡死亡情况，并根据Bliss法计算半数致死量(LD50)，以评价鸡白痢沙门菌双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533毒力减弱情况。
对照组每只口服100µL LB液体培养基。
结果表明（表3）表明，空白和对照组无雏鸡死亡，双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的LD50高于3.25×109 CFU，单基因缺失株ΔcyaC533和ΔcrpC533的LD50分别为7.07×108CFU和1.27×109CFU，而亲本株C533的LD50为2.74×106CFU，与单基因缺失株和亲本株相比，双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的毒力已明显降低。
表3 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533、单基因缺失株ΔcrpC533、ΔcyaC533
及亲本株C533毒力比较
实施例7 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株（ΔcrpΔcyaC533）疫苗对雏鸡的免疫效力检测
1. 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533疫苗对雏鸡的安全性试验
对100只1日龄雏鸡口服双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533疫苗（实施例5提供），免疫剂量为2×109CFU/只，连续观察28d，发现免疫前后雏鸡无明显临床症状，说明本发明的双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533疫苗对雏鸡是安全的。
2. 免疫保护实验
对3日龄雏鸡口服双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533疫苗，免疫剂量为2×109CFU/只，免疫14天后，以亲本株C533口服攻毒，攻毒剂量为3×108CFU/只（约LD50的100倍），攻毒后连续观察28d，记录雏鸡死亡情况。攻毒时设立未免疫攻毒组和健康对照组，每组10只。结果表明（表4），双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533对雏鸡具有理想的保护效力，经强毒亲本株CVCC533攻毒后，存活率为100%，而未经免疫的雏鸡存活率仅为20%。
表4 双基因缺失株ΔcrpΔcyaC533的保护效力
实施例3-5，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明所作的其它形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。
序列表
<110> 河北科星药业有限公司
<120> 鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株、构建方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 633
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actcttgaat ggttcttgtc tcattgccac 60
attcataagt acccgtcaaa gagcacgctg attcaccagg gtgaaaaagc agaaacgctg 120
tactacatcg ttaaaggctc cgtggcagtg ctgatcaaag atgaagaagg gaaagaaatg 180
atcctttctt atctgaatca gggtgatttt attggtgaac tgggcctgtt tgaagaaggc 240
caggaacgca gcgcctgggt acgtgcgaaa accgcatgtg aggtcgctga aatttcctac 300
aaaaaatttc gccaattaat ccaggtcaac ccggatattc tgatgcgcct ctcttcccag 360
atggctcgtc gcttacaagt cacctctgaa aaagtaggta acctcgcctt ccttgacgtc 420
accgggcgta tcgctcagac gctgctgaat ctggcgaaac agcccgatgc catgacgcac 480
ccggatggga tgcagatcaa aatcactcgt caggaaatcg gccagatcgt cggctgctcc 540
cgcgaaaccg ttggtcgtat tttgaaaatg ctggaagatc aaaacctgat ctccgcgcat 600
ggcaagacca tcgtcgtcta cggcacccgt taa 633
<210> 2
<211> 2520
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacgggta gcaacatcag gcgatacgtc ttgtacctct atattgagac tctgaaacag 60
agactggatg ccataaatca actgcgtgtg gatcgcgcgc ttgctgccat gggacccgct 120
tttcagcagg tttacagtct tctgccgaca ttattgcact atcaccatcc actgatgccg 180
ggttaccttg atggtaacgt tcccagcggt atttgcttct acacgcctga tgaaacccaa 240
cgccactatc tgaacgaact tgagctgtac cgcggtatga cgccgcagga cccgccgaag 300
ggcgagctgc cgattaccgg cgtttacacc atgggcagca cctcctcggt tgggcagagc 360
tgctcgtccg acctggatat ctgggtgtgc catcagtcct ggctcgacgg tgaagagcgt 420
cagttgctgc aacgtaagtg tagcctgctg gaaagctggg ccgcctcgct tggcgttgag 480
gtgagcttct tcctgatcga cgagaaccgt ttccgccata acgaaagcgg cagtctgggc 540
ggggaagact gtggttctac gcagcatatc ctgttgcttg atgagtttta tcgtaccgct 600
gtgcgcctgg ccgggaaacg tatcctgtgg agtatggtgc cgtgcgacga agaagagcat 660
tacgacgact atgtcatgac gctctacgcg cagggcgtat taacgccaaa cgaatggctg 720
gatctggggg gcttaagctc gctctccgcc gaagagtact ttggcgccag cctgtggcag 780
ctatacaaga gcattgactc gccgtacaaa gcggtgctga aaacgctgct gctggaagcc 840
tattcatggg aatatcctaa cccacgtctg ctggcgaaag atattaaaca acgtctgcat 900
gacggtgaaa tcgtatcgtt tggactcgat ccctactgca tgatgctgga acgggtcact 960
gaatacctga cggcgattga agatccgacg cggctggatt tagtccgccg ctgcttttac 1020
ctgaaagtgt gcgagaaatt aagtcgcgag cgtgcctgcg taggctggcg tcgggaagta 1080
ttaagccagt tagtcagcga gtggggatgg gacgacgcgc gtctgaccat gctcgataat 1140
cgcgcaaact ggaaaatcga tcaggtgcgc gaagcccaca acgaattgct cgacgccatg 1200
atgcaaagct atcgtaatct gattcgcttt gcgcggcgca acaacctcag cgtgagtgcc 1260
agcccgcagg atatcggcgt actgacgcgt aagctgtacg ctgcttttga agcgttgccg 1320
ggtaaagtca cgctggtgaa cccgcagata tcgccggatc tgtccgagcc gaatttaacc 1380
tttatccatg tgccgccggg acgcgccaac cgttcaggct ggtatctcta caaccgcgcg 1440
ccgaacatgg attccatcat cagccatcag ccgctggaat ataaccgtta tcttaataag 1500
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ggcaacggta ttgtcgacct gcctaagttg caggagatgg tcgccgatgt ttcgcaccat 1620
ttcccgctgc gcttgcctgc tccgacgccg aaagcgctct acagcccctg tgaaattcgc 1680
catctggcga ttatcgttaa cctcgaatat gacccgacgg cggcgtttcg caataaagtg 1740
gtccattttg acttccgtaa gctggatgtt ttcagctttg gcgaagagca aaactgtctg 1800
ataggcagta tcgacttgtt atatcgcaac tcgtggaacg aagtgcgtac tctgcacttt 1860
cacggcgagc aggcgatgat cgaagcgctg aaaacgattc tggggaaaat gcaccaggat 1920
gccgcgccgc cggatagcgt ggaggtgttc tgctacagtc agcatcttcg cggtctgatt 1980
cgcacccgcg tgcagcaact ggtctccgaa tgtatcgagc tacgtctttc cagcacccgt 2040
caggagaccg gtcgcttcaa ggcgctgcgg gtttccgggc agacgtgggg actattcttc 2100
gaacgcttga atgtctcggt gcagaagctg gagaacgcta tcgaattcta cggcgcgatt 2160
tcgcataaca agctgcacgg gctgtcggta caggtggaaa ccaaccaggt gaaattgccg 2220
tcagtggtgg atggcttcgc cagcgaaggg attatccagt tcttctttga agaaacgggc 2280
gatgagaaag gctttaatat ttatattctg gatgaaagta accgggcgga agtgtatcac 2340
cactgcgaag gtagcaagga agaactggtg cgcgacgtca gtcgcttcta ttcatcatcg 2400
cacgatcgct tcacgtatgg ctccagtttt atcaacttta acctgccgca gttctaccag 2460
atagtgaaaa ccgatggccg cgcgcaggtg atcccattcc gtacgcagcc tatcaacacc 2520

Claims (7)

1.一种鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，其特征在于：它为crp基因和cya基因都不表达的鸡白痢沙门菌。
2.根据权利要求1所述的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，其特征在于：它为crp基因和cya基因都被敲除的鸡白痢沙门菌。
3.根据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，其特征在于：被敲除的crp基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求2所述的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株，其特征在于：被敲除的cya基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1～4中任一项所述鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的构建方法，其特征在于包括步骤：将鸡白痢沙门菌中的crp基因和cya基因都敲除。
6.根据权利要求5所述的鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的构建方法，其特征在于：采用同源重组的方法敲除crp基因和cya基因。
7.如权利要求1～4中任一项所述鸡白痢沙门菌crp-cya双基因缺失株的用途，其特征在于：它用于制备鸡白痢沙门菌活疫苗。
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