CN105087418B - 用于哺乳动物细胞中rna干扰的沙门氏菌菌株、其制备方法及应用 - Google Patents

用于哺乳动物细胞中rna干扰的沙门氏菌菌株、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，其是含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。同时，本发明还公开了该沙门氏菌菌株的制备方法及应用。

Description

用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株、其制备方法及 应用
技术领域
本发明属微生物技术领域，涉及一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株、其制备方法及应用。
背景技术
RNA干扰技术已经成为沉默特定基因的有效研究工具，同时RNA干扰技术在癌症等疾病治疗方面也有巨大的应用前景(Lieberman J等人,Trends Mol Med 2003；9:397-403)。RNA干扰技术可以靶向降解某一特定RNA，调控细胞的增殖和凋亡(Lakka SS等人,Oncogene 2004；23:4681-4689；Gondi CS等人,Cancer Res 2004；64:4069-4077；FlemingJB等人,Mol Cancer Res 2005；3:413-423)。但是，如何将RNA干扰片段转运到细胞的胞浆中等难题阻碍了RNA干扰技术的发展和应用。尽管病毒载体(Devroe E等人,Expert OpinBiol Ther 2004；4:319-327；Kargiotis O等人,Oncogene 2008；27:4830-4840)、纳米粒子(Wang Y等人,Curr Drug Metab2010；11:182-196)和脂质体(Ozpolat B等人,Adv DrugDeliv Rev 2014；66C:110-116)已用于转运RNA干扰片段，但是这些转运系统在动物体内都表现出较高的毒副作用，并且会在体内产生靶向并沉默正常细胞的基因表达的问题。
兼性厌氧鼠伤寒沙门氏菌可以靶向聚集在厌氧组织(例如，肿瘤等组织)中并产生潜在的抑肿瘤等细胞生长效果(Zhao M等人,Proc Natl Acad Sci U S A 2007；104:10170-10174)。作为蛋白质表达质粒载体递送系统，沙门氏菌能够显著抑制了肿瘤的生长和转移(Zhang L等人,Cancer Res 2007；67:5859-5864；Ganai S等人,Br J Cancer 2009；101:1683-1691)。但是野生型沙门氏菌表现出较高的毒性。为了降低沙门氏菌感染动物出现脂多糖诱导的败血症休克的几率，之前的研究人员通过基因改造获得了减毒沙门氏菌VNP20009，在这一改造过程中，在鼠和猪中诱发毒性的基因purI和msbB被敲除(Low KB等人,Nat Biotechnol 1999；17:37-41；Clairmont C等人,J Infect Dis 2000；181:1996-2002)。这一突变体表现出显著降低的副作用并且在小鼠中的乏氧组织(例如肿瘤)靶向性，增殖和抑制乏氧组织(如肿瘤)生长现象得以保留(Toso JF等人,J Clin Oncol 2002；20:142-152)。作为药物传输系统进行应用时，减毒沙门氏菌VNP20009由于具备的生物学安全性，自主复制能力和较高的厌氧(如肿瘤)特异性，故而它已被用于表达外源蛋白(内皮抑素，TRAIL和CCL21)来提高其生物学效果(Loeffler M等人,Cancer Immunol Immunother2009；58:769-775；Chen J等人,Cancer Sci 2012；103:325-333；Chen J等人,Mol CellProteomics 2011；10:M111009399)。减毒沙门氏菌VNP20009可以在宿主细胞中生存和增殖，但由于它在细胞内为细胞内的囊泡所包裹，因此它不能或极少释放干扰质粒进入宿主细胞的胞浆中，所以减毒沙门氏菌VNP20009并不适合作为shRNA表达质粒载体，用以沉默哺乳动物细胞中的基因。
沙门氏菌phoP/phoQ操纵子是典型的细菌双组分调控系统，由膜相关传感器激酶(phoQ)和胞质转录调节因子(phoP)组成(Hohmann EL等人,Vaccine 1996；14:19-24；GalanJE等人,Microb Pathog 1989；6:433-443)。初步研究显示phoP/phoQ操纵子具有调控细菌重要毒力的功能，比如细菌在巨噬细胞中的存活水平和对内源性抗菌肽的抵抗能力(Miller SI等人,Proc Natl Acad Sci U S A 1989；86:5054-5058；Miller SI等人,Vaccine 1993；11:122-125)。当phoP/phoQ基因位点被敲除后，细菌在巨噬细胞中的存活率和细菌对BALB/c小鼠的毒性都显著降低(Miller SI等人,J Bacteriol 1990；172:2485-2490；Fields PI等人,Proc Natl Acad Sci U S A 1986；83:5189-5193)。phoP/phoQ敲除的沙门氏菌菌株能够被应用于作为有效的疫苗和shRNA表达质粒传输载体(Hohmann EL等人,J Infect Dis 1996；173:1408-1414；Jia H等人,Cancer Immunol Immunother 2012；61:1977-1987；Tian Y等人,Cancer Gene Ther 2012；19:393-401；Li X等人,J CancerRes Clin Oncol 2013；139:971-980)。
尽管上述两种沙门氏菌菌株已经具有了较好的生物安全性和较好的作为基因表达传输载体的性能，但是仍然存在着如下问题：
1、phoP/phoQ基因敲除的细菌在巨噬细胞内由于不再被细胞内的囊泡所包裹，因此细菌的存活率显著降低，从而直接使得phoP/phoQ基因敲除细菌的应用受到局限。
2、phoP/phoQ基因敲除的细菌由于其在巨噬细胞等细胞内的存活能力下降，导致细菌对BALB/c小鼠等动物的毒性显著降低，但是其仍然对动物具有一定的毒副作用。
3、尽管减毒沙门氏菌VNP20009通过基因改造剔除了purI和msbB两个基因而降低了细菌对动物的毒副作用，但是其对动物仍然具有相当的肝脏、脾脏、免疫等毒副作用(Chen G等人,Cancer Science 2009；100:2437-2443)。
4、尽管减毒沙门氏菌VNP20009能够作为基因表达载体的运载工具，但是其不能作为RNA干扰的运载系统。
5、尽管减毒沙门氏菌VNP20009在体内应用时对乏氧组织(例如肿瘤等)具有较高的靶向性，但是其在脾脏、肝脏等正常组织仍然有一定的分布，从而导致潜在的副作用(Chen G等人,Cancer Science 2009；100:2437-2443)。。
发明内容
为克服目前沙门氏菌菌株作为RNA干扰传输载体以及在应用时面临的生物安全性等方面存在的难题，本发明的目的在于提供一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰和基因表达的沙门氏菌菌株，其制备方法及其在干扰细胞内基因表达或/和同时进行基因表达的应用、在体内干扰乏氧组织的基因表达或/和同时进行基因表达的应用和制备抗肿瘤药物上的应用。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，是含有且不仅局限于purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
优选地，所述沙门氏菌菌株携带表达质粒、在细胞内同时表达RNA干扰和基因表达。
优选地，所述沙门氏菌菌株能够高丰度富集于乏氧组织。
一种上述的沙门氏菌菌株的制备方法：扩增2个末端含有拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组系统取代拟敲除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮重复上述基因敲除过程，最终获得含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
一种上述的沙门氏菌菌株的制备方法：所述沙门氏菌菌株通过如下方法制得：扩增2个末端含有拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，将PCR产物片段克隆在pKD46质粒中，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组系统取代拟敲除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮重复上述基因敲除过程，最终获得含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
上述的沙门氏菌菌株的制备方法，可直接在purI和msbB基因已经突变的VNP20009菌株上进行构建突变菌株，也可以在phoP和phoQ已经突变的沙门氏菌菌株上进行构建突变菌株，也可以在野生型沙门氏菌菌株上进行构建突变菌株。
一种含有上述沙门氏菌菌株的药物。
上述的沙门氏菌菌株在制备抗乏氧组织相关疾病药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备基因治疗药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备RNA干扰药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗乏氧组织相关疾病药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗肿瘤药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗乳腺癌药物中的应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物与化疗、放疗、生物治疗、中药治疗药物或方法的联合应用。
上述的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗肿瘤药物与化疗、放疗、生物治疗、中药治疗药物或方法的联合应用。
上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，对动物具有更低的毒副作用和更高的生物安全性：其在正常小鼠的肝脏和脾脏中的滴度低于VNP20009。
上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，在细胞内具有更低的生存率：其在巨噬细胞和包括肿瘤细胞在内的乏氧细胞中的生存率比VNP20009显著降低。
上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，对包括肿瘤在内的乏氧组织的靶向能力与VNP20009相比显著提高。
上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，对包括肿瘤在内的乏氧组织生长抑制能力与VNP20009相近。
上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，能够在宿主细胞中比VNP20009更为有效地释放shRNA表达和基因表达质粒，作为RNA干扰和基因表达的输送载体高效沉默靶基因并表达特定基因。
上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株，能够在包括肿瘤组织在内的乏氧组织中发挥作为RNA干扰和进行基因表达的输送载体的作用，有效地释放shRNA表达和基因表达质粒，在组织中高效沉默靶基因并表达特定基因，VNP20009则不具备该种功能。
本发明公开的上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株在干扰细胞内基因表达并进行基因表达的应用：将含有RNA干扰和表达基因(例如EGFP)的表达质粒转染上述一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌，然后以与细胞:细菌按一定的比率(1:3-1:30)加入到培养细胞中。细胞在37℃温育1小时对细菌进行吞噬作用，并用PBS除去游离的细菌，含有RNA干扰和表达基因(例如EGFP)的表达质粒即可在细胞中发挥RNA干扰作用，沉默靶基因并表达特定基因。
本发明公开的上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株在在体内干扰乏氧组织的基因表达并进行基因表达的应用：将带有RNA干扰和表达基因(如EGFP)表达质粒的所述用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株通过口服、静脉注射或者腹腔注射动物体内，在乏氧组织中脾脏或者肿瘤中用免疫荧光观察要表达的目的基因的表达情况，用定量PCR和免疫印迹western blot方法验证RNA干扰靶基因表达的结果。
本发明公开的上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株在制备抗肿瘤药物上的应用：将带有RNA干扰表达质粒的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株通过口服、静脉注射或者腹腔注射到肿瘤动物模型体内，观察分析带有RNA干扰表达质粒的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株的抗肿瘤效果。
本发明的有益效果：(1)在体外细胞内更低的生存率：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)在体外细胞(包括巨噬细胞、包括肿瘤细胞等不同类型的细胞)内的生存能力与VNP20009相比明显减弱，这使得VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)在体外具有更好的生物安全性，不易在细胞内存活。(2)在体内更低的毒副作用：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)感染正常小鼠的毒性效应比VNP20009显著降低、其对肝脏和脾脏肿大的影响显著低于VNP20009。(3)在体内更好安全性和更高的乏氧组织特异性：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)感染动物后，在正常组织肝脏和脾脏中的细菌滴度比比VNP20009显著降低；但是在荷瘤小鼠模型中，VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)感染小鼠乏氧(肿瘤)组织的细菌滴度比VNP20009有显著增加。VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)与VNP20009相比表现出优异的安全性并具有更高程度的乏氧(肿瘤)组织特异性。(4)更好的RNA干扰质粒表达效果：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)能够在细胞和组织水平表达质粒并释放干扰RNA，还能同时再进行目标基因的表达。(5)更强的抗肿瘤应用效果：上述的一种用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)无论在单独应用，还是在携带RNA干扰表达质粒应用时都能比VNP20009产生更好的抗肿瘤治疗效果。
附图说明
图1.VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)[简写为：VNP(phoP/Q–)]感染正常小鼠的毒性效应A.体重，*P<0.05，感染VNP(phoP/Q–)或VNP200093天后的体重与感染1，2天后的体重相比。B.脾重。C.肝重，*P<0.05，感染VNP(phoP/Q–)或VNP200093天后的肝重与感染1，2天后的肝重相比。
图2.正常小鼠肝脏和脾脏中免疫细胞亚群分析
A.肝脏中的CD4+T细胞。B.肝脏中的CD8+T细胞。C.肝脏中的F4/80+巨噬细胞。D.肝脏中的Gr-1+粒细胞。E.脾脏中的CD4+T细胞。F..脾脏中的CD8+T细胞。G.脾脏中的F4/80+巨噬细胞，*P<0.05，感染3天后VNP20009感染小鼠中的巨噬细胞与VNP(phoP/Q–)感染小鼠相比。H.脾脏中的Gr-1+粒细胞。
图3.VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)在体外细胞内的生存。
A.巨噬细胞中细菌的数量，*P<0.05，VNP20009与VNP(phoP/Q–)相比。B.肿瘤细胞中细菌的数量，*P<0.05，VNP20009与VNP(phoP/Q–)相比。
图4.VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)在正常小鼠和荷瘤小鼠中的生物分布。
A-B.正常小鼠中肝脏和脾脏中的细菌滴度，*P<0.05，VNP20009与VNP(phoP/Q–)相比。C.感染VNP20009和VNP(phoP/Q–)后荷瘤小鼠中肝脏，脾脏和乏氧肿瘤组织中的细菌滴度，*P<0.05，VNP20009与VNP(phoP/Q–)相比。D.感染VNP20009和VNP(phoP/Q–)后荷瘤小鼠中乏氧肿瘤组织与肝脏和脾脏中的细菌滴度比例，*P<0.05，VNP20009与VNP(phoP/Q–)相比。
图5.VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)的抗肿瘤作用。
A.肿瘤生长曲线，*P<0.05，PBS组与VNP20009感染组和VNP(phoP/Q–)感染组相比。B.肿瘤倍增时间，*P<0.05，PBS组与VNP20009感染组和VNP(phoP/Q–)感染组相比。C.生长延迟时间，，PBS组与VNP20009感染组和VNP(phoP/Q–)感染组相比。
图6.VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)释放质粒的作用。
A.乏氧肿瘤组织中EGFP的表达。B.乏氧肿瘤组织巨噬细胞中的EGFP表达。C.乏氧肿瘤组织中4T1肿瘤细胞的EGFP表达。
图7.带有STAT6干扰质粒的VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6(简称VpSi-STAT6)可在肿瘤组织中的表达并下调STAT6的mRNA表达水平。
具体实施方式
VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)的构建
(1)重组DNA片段的制备
以在VNP20009菌株基础上进行构建的制备方法为例，VNP(phoP/Q-)的构建依据文献报道的经典方法进行(Datsenko KA等人,Proc Natl Acad Sci U S A 2000；97:6640-6645)，按如下步骤进行：将沙门氏菌染色体上的phoP/phoQ基因被PCR扩增产生的带有卡那霉素(Kna)抗性的基因片段所取代。这一卡那霉素抗性片段是以pkd4质粒为模板通过PCR扩增所得，所使用的引物序列如下：
PhoP-F:
5’-CACCATAATCAACGCTAGACTGTTCTTATTGTTAACACAAGGGAGAAGAGGTGTAGGC TGGAGCTGCTTC-3’，
phoQ-R:
5’-CGATTATAACGGATGCTTAACGAGATGCGTGGAAGAACGCACAGAAATGTCATATGAATATCCTCCTTAG-3’。
在以上引物的5’末端包含有与phoP/phoQ基因同源的40-50碱基对。PCR产物用来通过RedA基因重组系统取代phoP/phoQ基因的编码序列。
为了获得用于基因重组的PCR产物，将10μl的5×Prime STAR缓冲液(Mg2+Plus)、4μl的dNTP混合液(各2.5mM)、1μl的PhoP-F:(25pmol/L)、1μl的PhoP-F:(25pmol/L)、1μl的pKD4质粒、1μl的Prime STAR酶及32μl的重蒸水混合形成反应混合物，该反应混合物的总体积为50μl。
将上述反应混合物在下述反应条件下进行PCR扩增：94℃预变性5min后进行94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸2min、30个循环，然后72℃延伸10min后保存于4℃。PCR扩增结束后取10μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，检测条带特异性。为了增加PCR浓度，将10管50μl的反应体系混合，用乙醇沉淀法进行浓缩。样品最终溶于19μl无菌双蒸水中，备用。
经浓缩的PCR产物片段进行甲基化处理：将17μl的PCR产物片段、1μl的DnpⅠ、2μl的10×buffer进行混合后，置于37℃水浴锅中反应1h，再采用乙醇沉淀法回收PCR产物片段，溶于无菌双蒸水，存于4℃备用。PCR产物用来通过RedA基因重组系统取代phoP/phoQ基因的编码序列。
(2)携带pKD46质粒的VNP20009菌株制备和诱导
制备VNP20009的电转化感受态，将pKD46质粒电转化进入VNP20009菌株，涂布于含AMP抗性的LB平板上，置于30℃培养16h后挑取菌落，接种于液体LB培养基中培养至过夜，次日按照1：100接种携带pKD46质粒的菌株VNP20009于25ml LB培养基中，并加入阿拉伯糖，使其终浓度为0.1M，然后30℃培养4h后，5000rpm/min离心5min收集细菌，用预冷的无菌双蒸水洗涤4次，然后重悬于80μl10％甘油中，冰上放置30min后，加入800ng的1.2.1.1浓缩的DNA片段，冰上静置5min后，电转化，然后向电转化溶液中加入350ml的SOC培养基，在30℃培养30min，离心细菌，弃上清，收集沉淀，并涂布含卡那霉素的LB平板上，置于37℃培养箱倒置培养16h。
(3)重组阳性菌株的鉴定及pKD46质粒的剔除
从培养于37℃细菌平板挑取单克隆，采用鉴定鉴定引物：K1:5’-CAGTCATAGCCGAATAGCCT-3’；PhoP(Y):5’-CAGAAAGAGGGTGACTATTTGTCTG-3’。
为了获得用于基因重组的PCR产物，将10μl的10×Taq酶缓冲液(Mg2-)、4μl的dNTP混合液(各2.5mM)、1μl的K1(25pmol/L)、1μl的PhoP-F:(25pmol/L)、挑取的集落1μl、1μl的Taq DNA polymerase及32μl的重蒸水混合形成反应混合物，该反应混合物的总体积为50μl。
将上述反应混合物在下述反应条件下进行PCR扩增：94℃预变性5min后进行94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸2min、30个循环，然后72℃延伸10min后保存于4℃。PCR结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，阳性克隆可在500bp处可见DNA条带，则为阳性克隆。
挑取阳性克隆，接种于含50μg/ml的LB培养基中，37℃220rpm/min振荡培养12h后，吸取菌液，梯度稀释后接种于含50μg/ml的LB平板上，待菌落长出后挑取菌落，分别接种于新鲜含50μg/ml氨苄霉素和卡那霉素的LB培养基中，如细菌仅在含卡那霉素的培养基中生长，而无法再含氨苄霉素的培养基中生长，则表明pKD46质粒已经丢失。然后对该菌株提取质粒，进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒是否存在。如无质粒，证实质粒以完全剔除，VNP(PhoP/Q-)菌株构建成功。
小鼠4T1乳腺癌肿瘤动物模型的构建
培养在含10％胎牛血清(FBS)的RPMI medium 1640中的4T1乳腺癌细胞被收集悬浮在PBS(pH 7.4)中。为了获得原发性肿瘤模型，2×105个散布在100μL PBS中4T1细胞皮下注射到Balb/c小鼠的后侧面区域并让其生长。
细菌在正常小鼠和荷瘤小鼠中的生物学分布
为了确定细菌的生物学分布，正常小鼠和荷瘤小鼠分别通过腹腔内注射VNP20009和VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)。正常小鼠在1,2和3天后处死，荷瘤小鼠在6天后处死。组织样品(肝脏，脾脏和乏氧肿瘤组织)称重后在确定体积的PBS中匀浆并在连续稀释后涂布在LB固体培养基(不含盐分)中。涂布后的培养基在37℃下培养16小时后，通过菌落计数并将计数结果与组织重量相除(集落形成单位[cfu]/g组织)确定细菌滴度。
VNP(phoP/Q-)和VNP20009感染小鼠2天后小鼠的体重及肝脏和脾脏的重量略有下降，但与感染1天后的结果并没有显著改变(P>0.05)，感染3天后的小鼠体重及肝脏重量与感染1天后的相比有了显著增加(P<0.05)。但是，VNP(phoP/Q-)和VNP20009感染3天后并没有引起脾脏重量的任何增加(P>0.05)。感染2天后，与VNP20009感染相比，VNP(phoP/Q-)感染并没有引起任何显著改变(P>0.05)。感染3天后，VNP(phoP/Q-)感染引起体重、肝脏和脾脏重量的增加幅度显著低于VNP20009(P<0.05；图1A-1C)。实验结果表明：VNP20009和NP(phoP/Q-)能在正常小鼠的脾脏和肝脏中繁殖，且VNP(phoP/Q-)的毒性效应比VNP20009显著降低、并且其肝脏和脾脏的肿大也明显低于VNP20009。
本发明在正常小鼠和荷瘤小鼠中接种VNP(phoP/Q-)和VNP20009，以确定细菌感染后在体内的生物分布。正常小鼠在VNP(phoP/Q-)或VNP20009细菌感染1，2和3天后处死并取出肝脏和脾脏进行匀浆，分别进行细菌滴度测定。实验结果显示：在感染1，2和3天后VNP20009感染小鼠的肝脏和脾脏中的细菌滴度比VNP(phoP/Q-)感染小鼠的相应脏器有显著增加(P<0.05；图4A、4B)。此外，在感染1，2和3天后，观察VNP(phoP/Q-)感染荷瘤小鼠中的细菌分布。在荷瘤小鼠中，VNP20009和VNP(phoP/Q-)倾向于聚集到乏氧的肿瘤组织中并达到1.0×109cfu/g的浓度。而且VNP(phoP/Q-)感染小鼠乏氧肿瘤组织的细菌滴度与VNP20009感染小鼠相比有显著增加(P<0.05；图4C)。除乏氧的肿瘤组织之外，在正常组织(例如脾脏和肝脏)中也同样有VNP20009和VNP(phoP/Q-)的浸润。但是，在感染细菌6天后，VNP20009感染荷瘤小鼠肝脏和脾脏中的细菌滴度显著低于VNP(phoP/Q-)感染小鼠(P<0.05；图4C)。VNP(phoP/Q-)感染荷瘤小鼠乏氧的肿瘤组织与感染肝脏和脾脏中的细菌滴度的比例比VNP20009感染小鼠有显著提高，大约为VNP20009的2.5倍以上(P<0.05；图4D)。因此，与VNP20009相比，VNP(phoP/Q-)表现出优异的安全性并具有更高程度的乏氧肿瘤组织特异性。
本发明还将VNP(PhoP/Q-)用于十多种不同的实体肿瘤的乏氧肿瘤组织特异性分析，都获得了类似的结果，即VNP(PhoP/Q-)在十多种不同的实体肿瘤中都具有优异的安全性并具有更高程度的乏氧肿瘤组织特异性。
流式细胞分析
正常小鼠通过腹腔内注射VNP20009和VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)。小鼠在1,2和3天后处死，感染后收集肝脏和脾脏进行免疫细胞的亚种群分析(图6)。概述如下：肝脏由胶原酶Ⅳ消化，脾脏直接研磨，利用细胞过滤器(BD Falcon)获得单细胞悬液并利用红细胞裂解液(Sigma)去除红细胞接着用RPMI 1640培养基洗两遍。为了确定肝脏和脾脏组织中免疫细胞的比例，106个细胞重悬于含1％FCS的PBS中在4℃下着色30min，然后加入藻红朊(phycoerythrin)共价连接的CD4抗体，CD8抗体，F4/80抗体和FITC共价连接的Gr抗体于黑暗中孵育45min。最后PBS洗过后细胞样品使用CELLQUEST软件(BD Biosciences)进行流式细胞分析。
为了进一步分析VNP20009和VNP(phoP/Q-)感染正常小鼠后肝脏和脾脏内免疫细胞的改变，本发明通过流式细胞分析确定了在感染细菌1,2和3天后在肝脏和脾脏中CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞和粒细胞的比例及变化。结果显示：VNP20009和VNP(phoP/Q-)感染引起了CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞和粒细胞的浸润，在肝脏中的感染峰值出现在感染2天后，在感染3天后水平有所降低(图2A-2D)。VNP20009或VNP(phoP/Q-)感染小鼠肝脏中的CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞和粒细胞的比例没有统计学差异(P>0.05)。在脾脏中，CD4+T细胞，CD8+T细胞和巨噬细胞的比例在VNP20009和VNP(phoP/Q-)感染小鼠的过程中持续增加。此外，在感染细菌1,2和3天后VNP20009或VNP(phoP/Q-)感染小鼠脾脏中的CD4+T细胞，CD8+T细胞和粒细胞的比例没有统计学差异(P>0.05)。在感染细菌1,2天后，VNP20009或VNP(phoP/Q-)感染小鼠脾脏中的巨噬细胞的比例没有统计学差异(P>0.05)；与之相比，在感染细菌3天后，VNP(phoP/Q-)感染小鼠脾脏中的巨噬细胞的比例比VNP20009感染小鼠显著降低(P<0.05)。一般说来，VNP20009和VNP(phoP/Q-)表现出相似的生物学安全性，但是后者的安全指数优于前者。
在巨噬细胞和肿瘤细胞内生存分析
细菌的细胞内生存能力利用Buchmeier和Heffron的方法进行测定：分别将1×106个Raw264.7巨噬细胞和肿瘤细胞置于加有5％FCS的不含有抗生素RPMI中并放入6孔板的每个孔中进行贴壁培养。VNP20009和VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)分别以细胞(巨噬细胞和肿瘤细胞):细菌为1:10的比率加入到每孔中。将细胞37℃温育1小时进行吞噬作用，并用PBS除去游离的细菌。接着加有5％FCS的含庆大霉素(25微克/毫升)(去除细胞外细菌)的RPMI加到6孔板中并在37℃下进行细胞培养。细菌感染3小时后除去培养基并用0.5ml含0.1％Triton X-100的PBS裂解巨噬细胞和肿瘤细胞，最后用0.5ml PBS漂洗每个孔并在连续稀释后涂布在LB固体培养基(不含盐分)中。涂布后的培养基在37℃下培养16小时后，通过菌落计数最终确定细菌滴度。
phoP和phoQ参与鼠伤寒沙门氏菌的细胞内生存。本发明在敲除phoP和phoQ基因后分析沙门氏菌在体外细胞内的生存能力，结果显示在RAW 264.7巨噬细胞和4T1肿瘤细胞中VNP(phoP/Q-)的细胞内生存能力与VNP20009相比明显减弱(P<0.05；图3A和3B)。
动物模型体内抗肿瘤分析
肿瘤体积达到150mm3的4T1乳腺癌小鼠随机分为3组：PBS组，VNP20009感染组和VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)感染组。PBS组每只小鼠腹腔注射100μLPBS，VNP20009感染组和VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)感染组每只小鼠分别腹腔注射1×105cfu的VNP20009和VNP(purI-/msbB-/phoP-/phoQ-)。6天后，4组小鼠重复上述的实验方案处理。同时使用游标卡尺(Mytutoyo Co.,Japan)对肿瘤的长度和宽度每2天进行一次测量。肿瘤体积通过以下公式进行计算：肿瘤体积＝长度×宽度2×0.52。记录小鼠死亡的数量和日期来计算生存率。
发明人以前的研究表明，腹腔注射VNP20009能显著抑制Lewis肺癌模型和B16F10黑色素瘤模型。本发明进一步分析敲除VNP20009和VNP(phoP/Q-)在4T1乳腺癌模型中具体应用时的抗肿瘤效果。结果表明：与PBS相比，VNP20009或VNP(phoP/Q-)显著抑制了4T1乳腺癌的生长(P<0.05；图5A)。但是VNP(phoP/Q-)与VNP20009表现出相似的抗肿瘤作用(P<0.05；图5A)。肿瘤倍增时间由PBS对照组的5.30天(CI，4.5天--6.25天)显著延长到VNP20009组的7.13天(CI，6.64天--7.70天)和VNP(phoP/Q-)组的7.33天(CI，6.52天--8.38天)(P<0.05；图5B和表1)。肿瘤生长延迟时间由PBS对照组的15.62天(CI，15.41天--15.91天)明显增加到VNP20009组的22.07天(CI，21.51天--22.72天)和VNP(phoP/Q-)组的23.27天(CI，22.24天--24.60天)(P<0.05；图5C和表1)。
本发明还将VNP(PhoP/Q-)用于十多种不同的实体肿瘤的抗肿瘤效果分析，都获得了类似的结果，即VNP(PhoP/Q-)在十多种不同的实体肿瘤中都具有与VNP20009表现出相似的抗肿瘤作用。
本发明还将VNP(PhoP/Q-)与化疗(紫杉醇、顺铂等)、放疗、生物治疗(抗体药物、恩度、TRAIL等)、中药(雷公藤多甙、冬凌草甲素等)用于联合治疗十多种不同的实体肿瘤的抗肿瘤效果分析，都获得了类似的结果，即VNP(PhoP/Q-)可以与化疗、放疗、生物治疗、中药联合治疗肿瘤，发挥更好的抗肿瘤效果。
表1.细菌应用对于肿瘤生长和生存率疗效的回归分析
a从最初治疗开始以对应时间(d,days)的体积(V,cm3)做回归生长曲线，相关系数以r表明。
b肿瘤倍增时间来于指数增长曲线。*P<0.05，PBS组与VNP20009组和VNP(phoP/Q-)组相比。
c生长延迟时间以达到1000mm3的时间间隔来确定。*P<0.05，PBS组与VNP20009组和VNP(phoP/Q-)组相比。
免疫荧光检测
将肿瘤体积生长达到150mm3的4T1乳腺癌荷瘤小鼠随机分为2组。一组小鼠腹腔注射100μL转入pRNA U6.1RNA干扰质粒(表达EGFP)的VNP20009，另一组小鼠腹腔注射100μL转入pRNA U6.1RNA干扰质粒的VNP(phoP/Q–)。治疗6天后，处死两组小鼠并使用标准程序制备冰冻肿瘤切片。为了分析4T1肿瘤细胞的EGFP表达水平，4T1肿瘤细胞用大鼠抗小鼠CD44(BDPharmingenTM,USA)染色。二抗使用Cy3标记的山羊抗大鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch,USA)。细胞的细胞核用DAPI染色。EGFP的表达表明了肿瘤细胞中的干扰质粒表达shRNA的能力。
本发明具体分析了VNP(phoP/Q-)能否释放shRNA表达质粒载体进入宿主细胞的胞浆中以便制备shRNA。干扰载体pRNA U6.1RNA(表达EGFP)通过VNP20009和VNP(phoP/Q-)靶向进入乏氧肿瘤组织。EGFP的表达表明在乏氧肿瘤细胞中出现了干扰质粒的shRNA表达。低功率透镜下的免疫荧光结果表明VNP(phoP/Q-)-pRNA U6.1RNA感染的小鼠乏氧肿瘤组织的EGFP表达水平与VNP20009-pRNA U6.1RNA感染的小鼠相比明显提升(图6A)。我们进一步通过共定位确定了表达EGFP的细胞，结果显示EGFP蛋白是由4T1肿瘤细胞和巨噬细胞表达(图6B和6C)。总之，VNP(phoP/Q-)能够释放shRNA表达质粒进入4T1肿瘤细胞和巨噬细胞的胞浆中表达shRNA和EGFP蛋白。
小鼠STAT6基因RNA干扰片段的设计
根据Genbank提供的小鼠STAT6序列，按照siRNA设计原则设计两对STAT6 siRNA片段，序列片段如下：siSTAT6-1 sense:5’-CGA AUG UGA UAC AAC UGU AUC-3’；siSTAT6-1antisense:5’-UAC AGU UGU AUC ACA UUC GAG-3’。
本发明利用VNP(PhoP/Q-)菌株携带具有干扰效果的siSTAT6表达质粒pSi-STAT6(含有EGFP基因)。本发明分析了VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6在肿瘤细胞中释放干扰质粒的效果和对乏氧的肿瘤组织的细胞中STAT6 mRNA表达的影响。siSTAT6表达质粒携带的EGFP的免疫荧光分析显示：VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6处理的肿瘤组织中CD44阳性的4T1乳腺癌细胞中有明显的EGFP表达，而在VNP(PhoP/Q-)处理的肿瘤组织中未观察到。说明VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6在乏氧肿瘤组织中感染细胞后能够释放干扰质粒，并启动干扰质粒的表达。本发明还进一步提取了肿瘤组织总RNA，采用实时荧光定量PCR分析了不同治疗肿瘤组织中STAT6 mRNA的表达水平，结果显示VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6(简称VpSi-STAT6)应用于治疗的乏氧肿瘤组织中STAT6 mRNA的表达水平较PBS和VNP(PhoP/Q-)-pSi-Vector空载质粒感染组(简称VpSi-Vector)显著性下降(P<0.05)。而PBS和VNP(PhoP/Q-)-pSi-Vector空载质粒感染组治疗组之间STAT6 mRNA的表达水平比较无差异(P>0.05)(图7)。
本发明还将VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6用于十多种不同的实体肿瘤的STAT6 RNA干扰，都获得了类似的同时下调STAT6 mRNA的表达水平和表达EGFP基因的结果。
本发明还将VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6与化疗(紫杉醇、顺铂等)、放疗、生物治疗(抗体药物、恩度、TRAIL等)、中药(雷公藤多甙、冬凌草甲素等)用于联合治疗十多种不同的实体肿瘤的抗肿瘤效果分析，都获得了类似的结果，即VNP(PhoP/Q-)-pSi-STAT6可以与化疗、放疗、生物治疗、中药联合治疗肿瘤，发挥更好的抗肿瘤效果。
可以理解的，可以直接在purI和msbB基因已经突变的VNP20009菌株上构建上述用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株。
可以理解的，可以在phoP和phoQ基因已经突变的沙门氏菌菌株上构建上述用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株。
可以理解的，可以在野生型沙门氏菌菌株上构建上述用于哺乳动物细胞中RNA干扰的沙门氏菌菌株。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种沙门氏菌菌株的制备方法，其特征在于：扩增2个末端含有拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组系统取代拟敲除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮重复上述基因敲除过程，最终获得含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
2.一种沙门氏菌菌株的制备方法，其特征在于：扩增2个末端含有拟敲除基因同源重组序列、中间含有抗生素基因的PCR产物片段，将PCR产物片段克隆在pKD46质粒中，转入拟敲除的沙门氏菌中，通过RedA基因重组系统取代拟敲除基因的编码序列，经过抗生素筛选、PCR反应鉴定获得突变菌株，经过多轮重复上述基因敲除过程，最终获得含有purI、msbB、phoP、phoQ基因敲除的沙门氏菌突变菌株。
3.一种含有权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株的药物。
4.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备抗有乏氧区的肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备基因治疗药物中的应用。
6.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备RNA干扰药物中的应用。
7.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的药物中的应用。
8.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗有乏氧区的肿瘤药物中的应用。
9.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗乳腺癌药物中的应用。
10.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备抗有乏氧区的肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述药物与化疗中紫杉醇或顺铂、放疗、生物治疗中的抗体药物、恩度或者TRAIL、中药治疗药物中的雷公藤多甙或者冬凌草甲素的联合应用。
11.如权利要求1或2中所述方法制备的沙门氏菌菌株在制备具有RNA干扰或/和基因治疗性能的抗有乏氧区的肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述药物与化疗中紫杉醇或顺铂、放疗、生物治疗中的抗体药物、恩度或者TRAIL、中药治疗药物中的雷公藤多甙或者冬凌草甲素的联合应用。
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