ES2926800T3

ES2926800T3 - Carbapenem fluorescentes

Info

Publication number: ES2926800T3
Application number: ES11730583T
Authority: ES
Inventors: Gregor Golz; Hans Rudolf Pfaendler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2011-07-04
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2031-07-04
Also published as: NZ603186A; US9296752B2; JP2013535960A; AU2011276157B2; WO2012003955A4; CA2800714A1; CA2800714C; US20130102017A1; US9969737B2; EP2590977B1; WO2012003955A1; AU2011276157A1; EP2590977A1; JP5920601B2; US20160251356A1

Abstract

Los carbapenémicos cromogénicos o fluorescentes según la fórmula I, en los que Ar es un grupo aromático carbocíclico mono o disustituido o un grupo aromático heterocíclico opcionalmente mono o disustituido, son compuestos útiles para la detección de carbapenemasas bacterianas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Carbapenem fluorescentes

[0001] La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

[0002] Se divulgan carbapenem fluorescentes o cromogénicos de la fórmula I

y/o sus sales, donde R1 se selecciona de entre hidrógeno o alquilo y acilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono y donde Ar es un grupo aromático carbocíclico monosustituido o disustituido o un grupo aromático heterocíclico opcionalmente monosustituido o disustituido, donde el resto aromático carbocíclico es monocíclico, bicíclico o tricíclico con 6 a 14 átomos de carbono y el resto aromático heterocíclico es monocíclico, bicíclico o tricíclico y contiene de 1 a 13 átomos de carbono y contiene de 1 a 5 heteroátomos, que se seleccionan, independientemente entre sí, de entre oxígeno, nitrógeno o azufre y donde los sustituyentes R2 y R3 de las partes aromáticas Ar se seleccionan, independientemente entre sí, de entre hidrógeno, amino, hidroxi, oxo, fluoro, cloro, bromo, nitro, ciano, carboxi, carbamoilo, sulfamoilo, amidino, guanidino, sulfo o alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, monoalquilamino, dialquilamino, trialquilamonio, N, N-dialquilcarbamoilo, N-alquilcarbamoilo y alcoxicarbonilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono.

[0003] La invención se refiere a carbapenem fluorescentes o cromogénicos de fórmula I, caracterizados por el hecho de que el grupo aromático carbocíclico Ar se selecciona de entre fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 2-bifenilo, 4-bifenilo, fenantrilo, 9,10-dihidroantrilo o antrilo y el grupo aromático heterocíclico se selecciona de entre 2- o 4-piridilo, 2- o 4-piridinio, 2-pirimidilo, 4-pirimidinilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 1,3,4-triazolilo, indolilo, quinolilo, isoquinolilo, benztiazolilo, benzoxalilo, cumarilo, carbolinilo, fenantrolinilo y carbazolilo.

[0004] Más preferiblemente, la invención se refiere a carbapenem fluorescentes o cromogénicos de fórmula I, caracterizados por el hecho de que el grupo aromático carbocíclico Ar es fenilo, 2-bifenilo o 4-bifenilo y el grupo aromático heterocíclico Ar es 2-piridilo, 4-piridilo o 2-pirimidinilo.

[0005] Más preferiblemente, la invención se refiere a carbapenem fluorescentes o cromogénicos de fórmula I, caracterizados por el hecho de que el grupo aromático Ar es carbocíclico y se selecciona de entre fenilo, 2-bifenilo o 4-bifenilo.

[0006] Más preferiblemente, la invención se refiere a carbapenem fluorescentes o cromogénicos de fórmula I, caracterizados por el hecho de que el grupo aromático Ar es fenilo, 2-bifenilo o 4-bifenilo, R2 es hidrógeno y R3 es acilo con 1 a 6 átomos de carbono.

[0007] Los p-lactámicos representan la clase de antibióticos más importante y segura. Sin embargo, desde que la aplicación de la resistencia a las penicilinas se ha vuelto frecuente y con un aumento gradual de la potencia después del uso extensivo de antibióticos p-lactámicos. La resistencia es causada principalmente enzimas llamadas p-lactamasas. Estas enzimas bacterianas catalizan la hidrólisis del resto p-lactámico con la formación de metabolitos inactivos (Chemother. J. 2004, 13, 206, Chemotherapie Journal, geschaeftsstelle@p-e-g.org). En 2001, se conocían más de 340 p-lactamasas diferentes (Clin. Infect. Dis. 2001, 32, 1085).

[0008] Más recientemente, se han dado a conocer las p-lactamasas, incluso capaces de hidrolizar carbapenem, que durante mucho tiempo se consideraron estables a las p-lactamasas (JAMA, 2009, 301 (19), 1979). Aunque existen muchas clases de enzimas de resistencia, la mayoría de ellas se pueden clasificar como metalo-plactamasas o serina-p-lactamasas. Son abundantes en muchas bacterias gramnegativas, por ejemplo, en Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus, Citrobacter y otras.

[0009] La detección de p-lactamasas es más importante para que los microbiólogos hospitalarios respalden su decisión o aconsejen cómo tratar enfermedades infecciosas bacterianas. Además, mediante la detección temprana se puede minimizar el uso indebido de antibióticos que puede conducir a una mayor resistencia y posiblemente a infecciones cruzadas en los hospitales.

[0010] Las cefalosporinas cromogénicas, tales como Nitrocefin, Padac o Centa (Journ. Amer. Chem. Soc. 1978, 100, 6491; Journ. Lab. Med. 1983, 7 (2), 33; Journ. Clin. Microbiol. 1982, 15 (5), 954) se han usado como herramientas valiosas para la detección de p-lactamasas. Las cefalosporinas cromogénicas son sustratos excelentes para la p-lactamasa que catalizan la hidrólisis de su anillo p-lactámico inherente, lo que da como resultado un cambio de color. Estos diagnósticos ampliamente usados son hidrolizados prácticamente por todas las p-lactamasas comunes, incluidas las carbapenemasas. Por lo tanto, sobre esta base no es posible una fácil diferenciación entre penicilinasas, cefalosporinasas o ESBL frente a carbapenemasas, lo más importante para la determinación de la terapia.

[0011] Se ha puesto a disposición una penicilina fluorescente para la detección de proteínas de unión a penicilina (Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43 (5), 1124). Se preparó un meropenem de fluoresceína para etiquetar las p-lactamasas y fue útil para detectar intermediarios de acil-enzima que forman complejos inhibidores estables con carbapenemas (Poster 23, Midwest Enzyme Chemistry Conference, University of Chicago, 4 de octubre de 2008).

[0012] Se ha desarrollado específicamente un marcador de fluorescencia que no contiene p-lactámicos que lleva un grupo mercapto para detectar metalozimas purificadas (Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 17). La WO2009/095258 divulga antibióticos etiquetados para la identificación de la resistencia a los antibióticos.

[0013] También se han desarrollado marcadores de fluorescencia para la detección del ADN que codifica las plactamasas.

[0014] Actualmente existen tres métodos para detectar carbapenemasas.

[0015] Métodos microbiológicos: estas pruebas se basan en la determinación de la susceptibilidad bacteriana reducida hacia los carbapenem, normalmente imipenem, meropenem o ertapenem. Esto se puede hacer con pruebas de difusión en agar. Los antibióticos se pueden añadir con discos de papel o se pueden disolver en el agar, por lo que se genera un medio selectivo para el crecimiento de cepas resistentes únicamente. De forma más fiable, la resistencia bacteriana se puede detectar mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC). Una modificación actualmente usada y recomendada para investigar la carbapenemasa de Klebsiella pneumoniae es la prueba de Hodge modificada (prueba de la hoja de trébol), una técnica que usa meropenem, la bacteria en investigación y una bacteria de prueba diferente E. Coli. Se recomienda una prueba específica para metalo-p-lactamasa usando etilendiaminotetraacetato (EDTA) e imipenem (Indian J. Med. Res.

2005, 121, 780).

[0016] Los métodos microbiológicos de difusión en agar ofrecen una indicación rápida de la resistencia. La determinación de la MIC es más laboriosa. Por otro lado, los resultados de susceptibilidad dependen en gran medida del inóculo y pueden dar lugar a resultados falsos (prueba de la hoja de trébol, véase Journ. Antimicrob. Chemother. 2010, 65 (2), 249). Además, la mezcla de dos bacterias diferentes en la última prueba, una alternativa resistente y la otra susceptible, da lugar a peligrosas transferencias de genes de resistencia. Solo con métodos microbiológicos, la susceptibilidad reducida no puede atribuirse inequívocamente a la aparición de plactamasas. Otros mecanismos, por ejemplo, la disminución de la permeabilidad de la membrana o la alteración del sistema de salida también pueden conducir a una susceptibilidad reducida a los carbapenem (Science 1992, 257, 1064; Journ. Antimicrob. Chemother. 2005, 55 (6), 954; Ann. Clin. Lab. Sci. 2010, 40, 43).

[0017] Además, el método microbiológico no es fiable para la detección de p-lactamasa cuando se investigan mezclas de dos o más cepas bacterianas diferentes. Dichas poblaciones bacterianas mixtas son frecuentes con muestras de bacterias patológicas.

[0018] Investigación de la actividad enzimática: las p-lactamasas de bacterias gramnegativas se pueden solubilizar mediante el ablandamiento o la lisis inducido/a química o mecánicamente de la pared celular bacteriana. Las enzimas solubilizadas se pueden detectar por su capacidad para desactivar imipenem en soluciones tampón acuosas. Durante esta reacción, el espectro UV del sustrato cambia. Este método es fiable para la detección de carbapenemasas y su diferenciación de las cefalosporinases, incluidas las p-lactamasas de espectro extendido (ESBL). Sin embargo, el método requiere equipo adicional (espectrofotómetro UV) y normalmente una purificación de las enzimas para eliminar otros compuestos activos UV (Antimicrob. Agents and Chemother. 1996, 40 (9), 2080) y apenas es útil para investigaciones de rutina en un laboratorio clínico.

[0019] Detección del gen de la carbapenemasa por reacción en cadena de la polimerasa (PCR): este método es útil para la identificación rápida de p-lactamasas, incluidas las carbapenemasas de un tipo sospechoso de bacteria, por ejemplo, Klebsiella pneumoniae (www.hain-lifescience.de:u Consulte KPC-ESBL Systeme). El éxito de este método depende en gran medida de la elección de un cebador adecuado. En 2001 se conocían más de 340 betalactamasas diferentes (Clin. Infect. Dis. 2001, 32, 1085). En consecuencia, debido a la gran variabilidad de las numerosas enzimas y bacterias, esta tecnología se está expandiendo (BMJ 2008, 336 (7650); 927-30). Para una detección general de todos los tipos de carbapenemasas, apenas es útil en la investigación de rutina. Además, el método no permite diferenciar entre el ADN de bacterias viables o muertas (www.pflegewiki.de/wiki/Methicillinresistenter_Staphylococcus _aureus).

[0020] Por lo tanto, era deseable desarrollar un método general y fiable para la detección rápida y selectiva de todos los tipos de carbapenemasas, que permitiera al personal médico una decisión temprana sobre la conveniencia de una terapia con carbapenemas. La prueba también debería permitir distinguir entre ESBL (P-lactamasas de espectro extendido) y carbapenemasas mortales. La prueba debería realizarse dentro de las 24 h y ser útil en investigaciones de rutina y en sistemas automatizados. La prueba también debería ser aplicable para muestras de especies bacterianas mixtas.

[0021] Por lo tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar compuestos adecuados para la detección específica de carbapenemasas bacterianas.

[0022] La solución a este problema técnico se logra mediante la presente invención: En esta solicitud de patente se describe la primera síntesis de una nueva clase de carbapenemas fluorescentes y su aplicación como sustratos para carbapenemasas bacterianas. La propiedad fluorescente surge de una extensión del sistema pi conjugado del resto carbapenem-carboxilato, inherente a todos los antibióticos carbapenémicos comunes (por ejemplo, en meropenem) mediante la incorporación de anillos aromáticos carbocíclicos Ar, sustituidos por al menos un grupo atractor de electrones. Alternativamente, se pueden incorporar anillos heterocíclicos, que son atractores de electrones per se. Solo tras la hidrólisis del anillo |3-lactámico se rompe la conjugación extendida y desaparece la fluorescencia. Esto contrasta con la etiqueta de fluoresceína-meropenem anteriormente mencionado, donde la fluoresceína está unida a la amina de la cadena lateral de meropenem y, por lo tanto, carece de la conjugación extendida requerida. En este último caso, la fluorescencia se debe esencialmente a la etiqueta. Se espera que se retenga después de la escisión hidrolítica de p-lactámicos.

conjugación extendida conjugación rota

[0023] En consecuencia, en la presente invención se prueba la presencia de carbapenemasa mediante la rápida hidrólisis enzimática y la desaparición de la fluorescencia. Para la detección es útil una lámpara UV estándar de laboratorio (longitud de onda larga) de 366 nm. A diferencia de las cefalosporinas cromogénicas del estado de la técnica, por ejemplo, nitrocefina, los nuevos carbapenem fluorescentes son sustratos estrictamente para las carbapenemasas, lo que permite su diferenciación de las penicilinasas, las cefalosporinases y las p-lactamasas ESBL. Mediante una ligera modificación de la prueba, simplemente añadiendo un inhibidor específico (EDTA), se puede evitar la hidrólisis enzimática por metalo-p-lactamasas. Por lo tanto, después de la detección de una actividad de carbapenemasa, las enzimas bacterianas pueden investigarse adicionalmente en presencia de EDTA y luego coordinarse con metalo-p-lactamasas u otras carbapenemasas.

[0024] Sorprendentemente, los carbapenem fluorescentes según la invención mostraron cambios de Stokes muy grandes de aproximadamente 200 nm. En comparación, la proteína verde fluorescente (GFP) muestra un cambio de Stokes de 114 nm.

[0025] Los carbapenem fluorescentes según la invención son compuestos útiles para detectar carbapenemasas abundantes en bacterias patógenas, por ejemplo, en Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, Serratia marescens, Acinetobacter, especies de Proteus, especies de Citrobacter, Haemophilus influenza, Enterobacter cloacae, Klebsiella aerogenes (Enterobacter aerogenes), Moraxella catarrhalis, Acinetobacter baumannii, especies de Aeromonas, especies de Salmonella y similares.

[0026] Los carbapenemas fluorescentes según la invención también se pueden usar para la diferenciación entre bacterias gramnegativas resistentes a carbapenem y bacterias gramposivas reistentes a carbapenem, por ejemplo, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina o enterococos. Las últimas dos especies bacterianas, aunque resistentes a los carbapenem, actualmente no producen carbapenemasas.

[0027] Los carbapenem fluorescentes según la invención son universalmente útiles para la investigación y/o detección de carbapenemasas en cepas bacterianas individuales o en mezclas bacterianas que también permiten la presencia de micobacterias u hongos. Son útiles para investigar y/o dectectar carbapenemasas en cepas de bacterias deprimidas y cepas con y sin carbapenemasa inducible. Permiten investigar y/o detectar carbapenemasa en presencia de otras p-lactamasas, por ejemplo, penicilinasas, cefalosporinasas o ESBLs.

[0028] Los carbapenemas fluorescentes según la invención también son compuestos útiles para la investigación y/o la detección rápida de inhibidores de carbapenemasas conocidos o sospechosos, por ejemplo, inhibidores de serina proteasas o inhibidores de metalo proteasas o similares.

[0029] Un proceso caracterizado por el hecho de que un carbapenem fluorescente es hidrolizado por una carbapenemasa conocida o sospechosa permite evaluar la presencia y reactividad de las enzimas bacterianas.

[0030] Determinadas bacterias producen cantidades sustanciales de carbapenemasa solo tras su cultivo en presencia de carbapenem, por ejemplo, imipenem o cefoxitina, donde estos últimos actúan como promotores. Dichos tipos de carbapenemasas se conocen como carbapenemasas inducibles (Chemoter. J. 2003, 12,151-167, Chemotherapie Journal PEG, geschaeftsstelle@p-e-g.org). Una enzima relevante en el proceso de inducción es, por ejemplo, glicósido hidrolasa. Los compuestos según la invención también pueden ser útiles para la investigación y/o detección de inhibidores conocidos o sospechosos de enzimas inductoras de carbapenemasas, por ejemplo, glucósido hidrolasa y similares. Los compuestos inhibidores pueden ser compuestos derivados de p-lactama u otras moléculas pequeñas (J. Biol. Chem. 2007, 282, 21382). En presencia de dichos inhibidores, la inducción de carbapenemasa ya no es posible o se ve sustancialmente disminuida. Los compuestos según la invención son útiles para evaluar dichos inhibidores, por ejemplo, mediante la comparación de las cantidades de carbapenemasa inducida después del crecimiento bacteriano con y sin inhibidor.

[0031] La investigación y/o detección anteriormente mencionada de inhibidores de enzimas inductoras de carbapenemasas se puede llevar a cabo con o sin promotores añadidos, tales como imipenem o cefoxitina. En este último caso, sin promotor añadido, los compuestos según la invención también pueden adoptar por sí mismos el papel de promotor.

[0032] Los carbapenem fluorescentes según la invención también son compuestos útiles para usar en kits de prueba.

[0033] La presente invención se refiere a un kit para investigar y/o detectar la resistencia microbiana a los carbapenem, que comprende un compuesto, tal y como se define en la presente invención, un detergente iónico o no iónico y un vehículo farmacéutico o diluyente del mismo, e instrucciones de uso, en uno más recipientes.

[0034] El inhibidor de carbapenemasa puede ser un inhibidor de serina proteasa o un inhibidor de metaloproteasa o similar.

[0035] Para una aplicación racional, los compuestos según la invención se pueden mezclar con otros componentes, también necesarios para detectar la resistencia a los carbapenem. Dichos componentes son, por ejemplo, compuestos de tampón sólidos, medios de nutrición sólidos, sales sólidas, antibióticos sólidos y/o detergentes iónicos o no iónicos sólidos. Las composiciones resultantes se pueden almacenar en estado seco durante un largo periodo de tiempo y disolverse inmediatamente antes de la investigación y/o la detección de la resistencia a los carbapenem. Un solvente preferido para la disolución es el agua o una solución acuosa de cloruro de sodio. Se prefiere especialmente agua estéril o solución de cloruro de sodio estéril.

[0036] Los carbapenem fluorescentes según la invención se pueden usar para detectar p-lactamasas en un diluyente, preferiblemente agua, más preferiblemente en soluciones tampón acuosas en un rango de pH de 4 a 9, un rango preferido es de 5 a 8, muy preferiblemente es pH 7,4. El carácter del tampón es variable. Los ejemplos de dichos medios son los tampones fosfato, tris- o HEPES. Los tampones preferidos se basan en fosfato o carbonato de hidrógeno. Los diluyentes se pueden usar como tales o suplementados con solventes orgánicos, por ejemplo, etanol, isopropanol y dimetilsulfóxido o con sales, por ejemplo, cloruro de sodio o cloruro de potasio o con compuestos que permitan la permeabilización o lisis de las paredes celulares bacterianas. Dichos compuestos o dichas mezclas de compuestos se conocen en la técnica y/o están disponibles comercialmente. Los ejemplos de dichos aditivos son polimixina B, neomicina, tris-hidrocloruro y similares (Antimicrob. Agents Chemotherapy 1984, 26 (1), 48) o detergentes iónicos o no iónicos, por ejemplo, SDS, colato o desoxicolato de sodio, detergentes de óxido de alquilfosfina, por ejemplo, óxido de dimetildecilfosfina, N, N-bis-(3-gluconamidopropil)colamida (CHAP), éteres de polioxietilenglicol, por ejemplo, dodeciléter de polioxietilenglicol, mono-n-dodeciléter de octaetilenglicol, polioxietileno (23), lauril éter o glucósidos de alcoholes grasos, por ejemplo, dodecilglucopiranósido y similares. Además de los componentes bacterianos y el carbapenem fluorescente, el medio de prueba también puede contener una variedad de otros ingredientes, como sales inorgánicas, por ejemplo, sales de zinc o hierro y/o inhibidores de crecimiento, por ejemplo, sulfito de sodio o antibióticos, por ejemplo, clorhexidina, aztreonam, quinolonas o polimixina B y similares.

[0037] Cuando se lleva a cabo en solución tampón acuosa, un requisito previo para el éxito de la reacción de prueba enzimática inventiva es que la carbapenemasa citoplasmática sea accesible por el carbapenem fluorescente. En muchos casos, esto requiere un pretratamiento de la pared celular de la especie bacteriana. Además de los métodos químicos mencionados anteriormente, existen otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, el tratamiento mecánico por prensa francesa o por tratamiento ultrasónico, el tratamiento con soluciones salinas acuosas hipotónicas o hipertónicas o la congelación y descongelación repetidas de las bacterias son útiles para las preparaciones de muestras. La tecnología correspondiente se conoce en la técnica per se.

[0038] El rango de temperatura en el proceso de hidrólisis enzimática que utiliza solución tampón es de 15 °C a 50 °C, el rango de temperatura preferido es de 20 °C a 40 °C. Se prefiere bastante la temperatura ambiente o 37 °C.

[0039] La desaparición de la fluorescencia después de la hidrólisis enzimática se puede detectar simplemente mediante visión en luz UV. En los sistemas automatizados se prefiere monitorear la luz de fluorescencia emitida por dispositivos electrónicos, por ejemplo, fotocélulas o fototransistores y similares, que permiten investigar la hidrólisis enzimática continuamente mediante la determinación cuantitativa de la fluorescencia de los compuestos restantes según la invención. La comparación de la fluorescencia inicial con la de una fase relativamente temprana de la reacción de hidrólisis enzimática permite establecer la presencia de carbapenemasas dentro de un periodo más corto de tiempo.

[0040] Se descubrió que los tipos individuales de carbapenemasas hidrolizan los carbapenem fluorescentes a diferentes velocidades, desde minutos hasta algunas horas. Las velocidades de hidrólisis son paralelas a las observadas con los antibióticos meropenem o imipenem. En consecuencia, los carbapenem fluorescentes no solo permiten detectar la presencia de la presente enzima bacteriana, sino que también permiten una mayor investigación: mediante dicha investigación, se puede determinar la reactividad de la presente enzima bacteriana, lo que permite al terapeuta evaluar la gravedad de la enfermedad infecciosa.

[0041] Alternativamente, la reacción de prueba enzimática que usa los carbapenem fluorescentes se puede realizar con bacterias nativas en un medio de nutrición, por ejemplo, caldo Müller Hinton. En dichos medios, el inóculo bacteriano se incuba junto con el carbapenem fluorescente según la invención. Durante el crecimiento exponencial de la bacteria, se producen grandes cantidades de carbapenemasa, lo que permite la hidrólisis completa de los carbapenem fluorescentes con la extinción concomitante de la fluorescencia amarilla.

[0042] La temperatura usando medios de nutrición es de 30 a 40 °C. Los ajustes de temperatura preferidos son 32 °C o 37 °C. Se prefiere bastante 37 °C.

[0043] Para evaluar la presencia de metalo-p-lactamasa, además del carbapenem fluorescente y los suplementos anteriormente mencionados, el medio de prueba puede contener inhibidores específicos de metalop-lactamasas, por ejemplo, agentes complejantes, como ácido acético de etilenetetramina. Después de añadir dichos inhibidores, se puede desactivar la metalo-p-lactamasa (pero no otras carbapenemasas). Entonces ya no es posible la hidrólisis del carbapenem fluorescente por medio de metalo-p-lactamasas. Al realizar experimentos paralelos, es decir, con y sin inhibición de la reacción de prueba enzimática, se hace posible una diferenciación entre metalocarbapenemasas o no metalocarbapenemasas. Alternativamente, la metalo-p-lactamasa se puede caracterizar mediante la adición de sales de zinc, por ejemplo, sulfato de zinc al medio de prueba, capaz de acelerar la hidrólisis mediante estas enzimas específicas.

[0044] Las sales de los compuestos de fórmula I son sales inorgánicas u orgánicas, por ejemplo, sales de litio, sodio, potasio o magnesio, calcio o zinc. Las sales orgánicas son sales derivadas de bases orgánicas, por ejemplo, sales de procaína, trialquilamonio, amidinio o guanidinio. Las sales pueden presentarse como polvos liofilizados o pueden existir en el estado cristalino. Las sales preferidas son bien solubles en solución acuosa, por ejemplo, sales de magnesio, potasio o sodio. Son muy preferidas las sales de sodio o potasio.

[0045] Alternativamente, las sales pueden existir como sales internas o zwitteriónicas. Dichas sales internas pueden surgir de la incorporación de grupos básicos R2 o R3, por ejemplo, grupos amino, monoaliclamino inferior o dialquilamino o grupos amidino o guanidina. Además, las sales internas también pueden surgir de la basicidad del propio grupo aromático Ar, por ejemplo, Ar = imidazolilo o 1,3,4-triazolilo.

[0046] En la fórmula I, los grupos aromáticos carbocíclicos Ar se derivan de hidrocarburos aromáticos. Los ejemplos de dichos grupos son los grupos fenilo, 1- o 2-naftilo, 4-bifenilo, fenantrilo, antrilo o 9,10-dihidroantrilo. Los grupos carbocíclicos preferidos son fenilo o bifenilo. El fenilo es muy preferido. Los sustituyentes atractores de electrones R2 y R3 se unen preferiblemente en la posición orto y/o para de los grupos fenilo Ar con respecto a la posición del núcleo carbapenémico unido. Con monosustitución (R2 = H) se prefiere bastante la posición para del sustituyente.

[0047] Con los grupos 1-naftilo, los sustituyentes atractores de electrones se unen preferiblemente en las posiciones 2, 4 o 5 para permitir la conjugación extendida del sistema de electrones pi.

[0048] En cuanto a los grupos 1,1 '-bifenilo disustituidos Ar, los sustituyentes atractores de electrones R2 y R3 se unen preferiblemente en la posición 3, 2' o 4' y el núcleo de carbapenem se une en la posición 4. Para los grupos 1,1'-bifenilo monosustituidos (R2 = H), el grupo atractor de electrones R3 se une preferiblemente en la posición 3 o 4' y el núcleo de carbapenem se une en la posición 4.

[0049] En la fórmula I, los grupos aromáticos heterocíclicos Ar se derivan de heterociclos aromáticos. Los ejemplos de dichos grupos monocíclicos son 2- o 4-piridilo, 2- o 4-piridina, 2-pirimidilo, 4-pirimidinilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo y 1,3,4-triazolilo. Se prefiere 4-piridilo. Se prefieren las posiciones 2 y 4 de los sustituyentes (opcionales) R2 y R3.

[0050] Los ejemplos de grupos aromáticos heterocíclicos bicíclicos Ar son indolilo, quinolilo, isoquinolilo, benztiazolilo, benzoxalilo, cumarilo y similares.

[0051] Los ejemplos de grupos heterocíclicos tricíclicos Ar son carbolinilo, fenantrolinilo, carbazolilo y similares.

[0052] Con los compuestos que tienen grupos carbocíclicos Ar para un cambio sustancial de color o fluorescencia durante la hidrólisis enzimática por carbapenemasa, es esencial que al menos un sustituyente atractor de electrones (por ejemplo, R3) se una en posiciones adecuadas para permitir la extensión del sistema pi conjugado. Con los grupos fenilo Ar, estas son las posiciones o,p. Por la misma razón, en los grupos heterociclilo Ar deficientes en electrones, los heteroátomos deben estar situados preferiblemente en las posiciones o,p.

[0053] Un requisito previo para la característica cromógena o fluorescente es la naturaleza atractora de electrones del grupo aromático Ar unido. El efecto de atracción de electrones puede surgir, por ejemplo, con grupos Ar carbocíclicos, de los sustituyentes R2 y R3 unidos. Para un efecto de atracción de electrones máximo, R2 y R2 son ambos sustituyentes atractores de electrones, por ejemplos, ambos son grupos acetilo. Sin embargo, como se muestra en la sección de ejemplos, la fluorescencia ya se logra con un sustituyente atractor de electrones, por ejemplo, con Ar = fenilo, R2 = H, R3 = acetilo). Por lo tanto, la naturaleza del segundo sustituyente (no atractor de electrones) no es muy crítica. Dichos sustituyentes pueden incluso ser grupos donantes de electrones, por ejemplo, amino o hidroxi y similares. El objetivo de usar dichos sustituyentes es, por ejemplo, aumentar la solubilidad en solución acuosa.

[0054] En cuanto a los compuestos según la invención con grupos heterocíclicos Ar, el carácter atractor de electrones mencionado anteriormente ya se puede lograr sin los sustituyentes atractores de electrones adicionales R2 y R3, por ejemplo, en Ar = 2- o 4-piridilo. La presencia y el efecto de atracción de electrones de dichos sustituyentes tampoco son críticos, siempre que la parte aromática heterocíclica Ar sea suficientemente atractora de electrones.

[0055] Los grupos 2-arilcarbapenémicos se han preparado y ensayado en cuanto a actividad antibiótica según J. Med. Chem. 1987, 30, 871-880. Sin embargo, carecían de uno o dos grupos atractores de electrones adicionales. En nuestras manos, los 2-fenilcarbapenemas simples no mostraron color ni fluorescencia y, por lo tanto, no fueron útiles para la detección simple de carbapenemasa según la invención. De manera similar, en los 3-piridilcarbapenemas mencionados, el efecto atractor de electrones no es lo suficientemente grande como para permitir la formación de color o fluorescencia y, por lo tanto, esta calidad no se observó ni se informó.

[0056] Los compuestos de fórmula I y sus sales pueden existir en varias formas estereoisoméricas. Las formas preferidas son aquellas con la configuración (5R) según la nomenclatura biciclo. Los compuestos que tienen la configuración (4S, 5R, 6S), es decir, una geometría análoga a la de los antibióticos carbapenémicos convencionales son muy preferidos. La configuración preferida del grupo 6-hidroxietilo o sus formas alquiladas o aciladas es 1'R.

[0057] Los carbapenem fluorescentes según la invención se preparan según el siguiente esquema de reacción:

2

Hid

[0058] La síntesis del cetoéster con TES protegido se describe en J. Organomet. Chem. 2002, 253, 279-287.

[0059] La protección del grupo alcohólico se puede llevar a cabo usando grupos protectores que son conocidos per se. Dichos grupos se describen, por ejemplo, en T. W. Greene y P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, New York, p. 10 - 118. Los grupos de protección preferidos son grupos que se eliminan fácilmente mediante tratamiento con ácido suave, por ejemplo, grupos trialquilsililo o mediante hidrogenólisis, por ejemplo, grupos p-nitrobenciloxicarbonilo o mediante catalizadores de rodio, por ejemplo, grupos aliloxicarbonilo.

[0060] En cuanto a los grupos éster que también funcionan como grupos protectores del resto de ácido carboxílico, se puede usar una gran variabilidad y se conoce per se y se publica en la referencia mencionada anteriormente en las páginas 224 - 276. Los grupos protectores muy adecuados, especialmente útiles para la química de p-lactámicos se proporcionan en H. Wild "The Organic Chemistry of p-Lactams (I. Georg Ed.) VCH, Nueva York 1992, p. 1 - 48. Los grupos protectores preferidos del ácido carboxílico son alilo, acetonilo, pmetoxibencilo, p-nitrobencilo y similares. La química de desprotección se conoce per se y también se describe en las referencias anteriormente mencionadas. Los ejemplos de procedimientos de desprotección son la escisión catalizada por rodio, la hidrólisis o hidrogenólisis alcalina suave y similares.

[0061] Alternativamente, en el paso de protección, el cloruro de trietilsililo (TESCI) se puede reemplazar por un yoduro de alquilo, lo que conduce al producto de fórmula I (R1 = alquilo) o un cloruro de acilo, lo que conduce a I (R1 = acilo). Alternativamente, estos tipos de productos también se pueden obtener por alquilación o acilación del grupo hidroxilo después del paso de acoplamiento cruzado y desprotección. Los grupos alquilo o acilo R1 se retienen durante la hidrogenólisis, por lo que se proporcionan compuestos de fórmula I con R1 = alquilo o acilo.

[0062] En el paso de acoplamiento cruzado se puede usar una variedad de catalizadores de paladio, como se describe en Tet. Lett. 1993, 34, 3211-3214 o J. Organomet. Chem. 2002, 253, 279 - 287. Un catalizador de acoplamiento preferido es Pd(dba)2. La reacción se lleva a cabo en un solvente orgánico, preferiblemente tetrahidrofurano o cloruro de metileno, preferiblemente a temperatura ambiente. Como base, son útiles una base orgánica, por ejemplo, trietilamina o diisopropiletilamina o una base inorgánica, por ejemplo, hidróxido de sodio o fosfato de potasio. Se prefieren trietilamina o fosfato de potasio.

[0063] Los siguientes ejemplos ilustran la preparación y el uso de los compuestos según la invención: Ejemplo 1

Preparación de potas¡o-(4S,5R,6S)-3-(4-acet¡l-fen¡l)-6-((TR)-h¡drox¡et¡l)-4-met¡l-7-oxo-1-azab¡c¡clo[3,2,01hept-2-eno-2-carboxilato

[0064]

Ác¡do_____ (4S,5R.6S)-3-(4-acet¡l-fen¡l)-4-met¡l-7-oxo-6-((TR)-tr¡et¡ls¡lan¡lox¡-et¡l)-1-azab¡c¡clo[3,2,01hept-2-eno-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster

[0065] En un matraz Schlenk de 25 ml equ¡pado con un septo de goma, ag¡tador magnét¡co y un globo lleno de n¡trógeno seco a -78 °C a una soluc¡ón de ác¡do (4R,5S,6S)-4-met¡l-3,7-d¡oxo-6-(TR)-tr¡et¡ls¡lan¡lox¡-et¡l)-1-azab¡c¡clo(3,2,01heptano-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster (526 mg, 1,10 mmol) en d¡clorometano seco (4,3 ml) se añad¡ó tr¡et¡lam¡na (153 pl, 1,10 mmol). Después de 15 m¡n, se añad¡ó anhídr¡do tr¡fluorometanosulfón¡co (187 pl, 1,10 mmol) a la soluc¡ón de color amar¡llo-naranja resultante. Después de 30 m¡n a -78 °C, Pd(dba)²(33 mg, 0,057 mmol, 5 % mol), se añad¡eron secuenc¡almente una soluc¡ón de ác¡do 4-acet¡lfen¡lborón¡co (158 mg, 0,96 mmol) en tetrah¡drofurano (7,2 ml), y K³PO⁴(712 mg, 3,35 mmol). Se ret¡ró el baño de h¡elo seco/acetona y se dejó calentar la mezcla a temperatura amb¡ente. Una vez completada la reacc¡ón, la soluc¡ón de color rojo v¡no se d¡luyó en tolueno (200 ml), se lavó tres veces con porc¡ones (50 ml) de agua y una vez con salmuera (50 ml) y se secó sobre sulfato de magnes¡o. Después de la f¡ltrac¡ón, el solvente se el¡m¡nó en un evaporador rotator¡o al vacío y dejó un ace¡te pardusco. El producto bruto fue pur¡f¡cado por cromatografía en columna de gel de sílice usando tolueno-ace¡te de et¡lo (19:1), lo que produjo un ace¡te amar¡llo (200 mg, 36 %). Espectro IR (ATR): 2956, 2876, 2359, 2344, 1779, 1730, 1684, 1605, 1523, 1457, 1431, 1403, 1376, 1346, 1264, 1228, 1190, 1148, 1108, 1015, 958, 847, 804, 736, 697 cm’1.

Ác¡do (4S,5R,6S)-3-(4-acet¡l-fen¡l)-4-met¡l-7-oxo-6-((TR)-h¡drox¡et¡l)-1-azab¡c¡clo[3,2,01hept-2-eno-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster

[00661 En un matraz de fondo redondo de 50 ml equ¡pado con un septo de goma y un ag¡tador magnét¡co a temperatura amb¡ente se añad¡ó ác¡do clorhídr¡co acuoso (1,0 M, a pH 2,3) a una soluc¡ón de ác¡do (4S,5R,6S)-3-(4-acet¡l-fen¡l)-4-met¡l-7-oxo-6-((1'R)-tr¡et¡ls¡lan¡lox¡-et¡l)-1-azab¡c¡clo[3,2,01hept-2-eno-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster (190 mg, 0,328 mmol) en tetrah¡drofurano (48 ml) y agua (9,5 ml). Después de ag¡tar durante 1 h, la soluc¡ón amar¡lla se d¡luyó en d¡clorometano (180 ml), se lavó una vez con NaHCO³acuoso al 10 % (60 ml), dos veces con porc¡ones (50 ml) de agua y se secó sobre sulfato de magnes¡o. Después de la f¡ltrac¡ón, el solvente se el¡m¡nó en un evaporador rotator¡o al vacío. Se obtuvo un ace¡te amar¡llo (195 mg). Espectro IR (ATR): 3444, 2957, 2875, 1773, 1725, 1682, 1601, 1521, 1456, 1432, 1403, 1378, 1346, 1265, 1195, 1107, 1014, 959, 911, 845, 774, 733, 696 cm-1.

Potas¡o-(4S,5R,6S)-3-(4-acet¡l-fen¡l)-6-((1'R)-h¡drox¡et¡l)-4-met¡l-7-oxo-1-azab¡c¡clo[3,2,01hept-2-eno-2-carbox¡lato

[00671 En un matraz Schlenk de 25 ml equ¡pado con un ag¡tador magnét¡co, bureta de h¡drogenac¡ón y un globo lleno de h¡drógeno a 0 °C, a una suspens¡ón de palad¡o sobre carbón act¡vado (25 mg, 10 %) en tetrah¡drofurano (1,8 ml) se le añad¡ó una soluc¡ón de ác¡do (4S,5R,6S)-4-met¡l-3,7-d¡oxo-6-((1'R)-h¡drox¡et¡l)-1-azab¡c¡clo[3,2,01heptano-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster (50 mg, 0,11 mmol) en tetrah¡drofurano (0,7 ml) y KHCO3 acuoso (1,1 ml, 0,1 M). La suspensión de reacción se agitó en atmósfera de hidrógeno. Después de 20 min se centrifugó el catalizador y se decantó el líquido sobrenadante. El residuo negro se lavó una vez con una mezcla (5 ml) de tetrahidrofurano y agua (2:1). Las capas acuosas combinadas se lavaron dos veces con porciones (4 ml) de acetato de etilo y la capa acuosa se concentró a un volumen pequeño al vacío. Después de la filtración estéril y liofilización a -25 °C, se obtuvo una espuma amarilla (32 mg, 80 %). Espectro IR (ATR): 3283, 2926, 2541, 1750, 1677, 1602, 1394, 1265, 1141, 1015, 838, 690 cm-1.

Ejemplo 2

Preparación de potas¡o-(4S,5R6S)-6-[(1'R)-h¡drox¡et¡ll-4-met¡l-7-oxo-3-(4-am¡no-fen¡0-1-azab¡c¡clo[3,2,0lhept-2-eno-2-carboxilato

[0068]

Ácido______(4S,5R6SM-met¡l-3-(4-n¡tro-fen¡0-7-oxo-6-((1'ft)-tr¡et¡ls¡lan¡lox¡-et¡0-1-azab¡c¡clo[3,2,0lhept-2-eno-2-carboxilíco 4-nitrobencil éster

[0069] En un matraz Schlenk de 25 ml equipado con un septo de goma, agitador magnético y un globo lleno de nitrógeno seco a -78 °C se añadió trietilamina (128 pl, 0,92 mmol) a una solución de ácido (4R5S,6S)-4-metil-3,7-dioxo-6-((1'R)-trietilsilaniloxi-etil)-1-azabiciclo[3,2,0]heptano-2-carboxílico 4-nitrobencil éster (440 mg, 0,92 mmol) en diclorometano seco (3,6 ml). Después de 15 min, se añadió anhídrido trifluorometanosulfónico (156 pl, 0.92 mmol) a la solución de color amarillo-naranja resultante. Después de 30 min a -78 °C, Pd(dba)2 (28 mg, 0,048 mmol, 5 % mol), se añadieron secuencialmente una solución de ácido 4-nitrofenilborónico (132 mg, 0,80 mmol) en tetrahidrofurano (6,0 ml) e hidróxido de potasio acuoso (520 pl, 2,28 mmol, 5.4 M). Se retiró el baño de hielo seco/acetona y se dejó calentar la mezcla a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción, la solución marrón se diluyó en tolueno (200 ml), se lavó tres veces con porciones (50 ml) de agua y una vez con salmuera (50 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de la filtración, el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio al vacío y dejó un aceite pardusco. El producto bruto fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando tolueno-acetato de etilo (19:1), lo que produjo un aceite amarillo (100 mg, 21 %). Espectro IR (ATR): 3079, 2955, 2910, 2875, 1776, 1725, 1601, 1517, 1456, 1413, 1376, 1345, 1290, 1271, 1192, 1145, 1105, 1088, 1052, 1002, 962, 850, 805, 770, 736, 697, 616 cm-1.

Ácido (4S,5R6S)-6-((1'R-hidroxieti0-4-metil-3-(4-nitro-feni0-7-oxo-1-azabiciclo[3,2,0]hept-2-eno-2-carboxílico 4-nitrobencil éster

[0070] En un matraz de fondo redondo de 50 ml equipado con un septo de goma y un agitador magnético a temperatura ambiente se añadió ácido clorhídrico acuoso (1,0 M, a pH 2,3) a una solución de ácido (4S,5R6S)-4-metil-3-(4-nitro-fenil)-7-oxo-6-((1'R)-trietilsilaniloxi-etil)-1-azabiciclo[3,2,0]hept-2-eno-2-carboxílico 4-nitrobencil éster (100 mg, 0,17 mmol) en tetrahidrofurano (25 ml) y agua (5 ml). Después de agitar durante 2 h, la solución amarilla se diluyó en diclorometano (180 ml), se lavó tres veces con porciones (60 ml) de agua y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de la filtración, el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio al vacío. Se obtuvo un aceite amarillo, que fue purificado por cromatografía en columna de gel de sílice usando toluenoacetato de etilo (2:1), lo que produjo un aceite amarillo (60 mg, 75 %). Espectro IR (ATR): 3502, 3112, 3080, 2968, 2930, 2873, 2856, 1769, 1722, 1602, 1600, 1514, 1454, 1379, 1344, 1274, 1192, 1139, 1103, 1037, 1014, 936, 910, 850, 806, 772, 751, 731, 697, 648 cm-1.

Potas¡o-(4S.5R.6S)-6-r(1lR)-h¡drox¡et¡ll-4-met¡l-7-oxo-3-(4-am¡nofen¡n-1-azab¡c¡clor3.2.0l hept-2-eno-2-carboxilato

[0071] En un matraz Schlenk de 25 ml equ¡pado con un ag¡tador magnét¡co, bureta de h¡drogenac¡ón y un globo lleno de h¡drógeno a 0 °C a una suspens¡ón de palad¡o sobre carbón act¡vado (30 mg, 10 %) en tetrah¡drofurano (1,8 ml) se le añad¡ó una soluc¡ón de ác¡do (4S,5R,6S)-6-((1'R)-h¡drox¡et¡l)-4-met¡l-3-(4-nitro-fen¡l)-7-oxo-1-azab¡c¡clo[3,2,0]hept-2-eno-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster (30 mg, 0,064 mmol) en tetrah¡drofurano (0,7 ml) y KHCO3 acuoso (0,64 ml, 0,1 M). La suspens¡ón de reacc¡ón se agitó en atmósfera de h¡drógeno. Después de 10 m¡n se centr¡fugó el catal¡zador y se decantó el líquido sobrenadante. El res¡duo negro se lavó una vez con una mezcla (5 ml) de tetrah¡drofurano y agua (2:1). Las capas acuosas comb¡nadas se lavaron dos veces con porc¡ones (4 ml) de acetato de et¡lo y la capa acuosa se concentró a un volumen pequeño al vacío. Después de la f¡ltrac¡ón estér¡l y l¡of¡l¡zac¡ón a -25 °C, se obtuvo una espuma amar¡lla (9 mg, 42 %). Espectro IR (ATR): 3342, 2958, 1733, 1606, 1513, 1393, 1296, 1263, 1218, 1179, 1137, 841 cm-1.

Ejemplo 3

Preparación_______ de______ potasio-^S^R^S^-^'-acetil-bifeniM-in^-K 1 'R)-hidrox¡et¡l-4-met¡l-7-oxo-1 -azab¡c¡clo[3■2■0lhept-2-eno-2-carbox¡lato

[0072]

Ácido (4S■5R■6S)-3-(4'-acet¡l-b¡fen¡l-4-¡l)-4-met¡l-7-oxo-6-((1'R)-tr¡et¡ls¡lan¡lox¡-et¡l)-1-azab¡c¡clo[3■2■0lhept-2-eno-2-carboxílíco 4-n¡trobenc¡l éster

[0073] En un matraz Schlenk de 25 ml equ¡pado con un septo de goma, ag¡tador magnét¡co y un globo lleno de n¡trógeno seco a -78 °C se añad¡ó tr¡et¡lam¡na (32 pl, 0,23 mmol) a una soluc¡ón de ác¡do (4R,5S,6S)-4-metil-3,7-d¡oxo-6-(1|R)-tr¡et¡ls¡lan¡lox¡-et¡l)-1-azab¡c¡clo[3,2,0]heptano-2-carboxíl¡co 4-n¡trobenc¡l éster (110 mg, 0,23 mmol) en d¡clorometano seco (0,9 ml). Después de 15 m¡n, se añad¡ó anhídr¡do tr¡fluorometanosulfón¡co (39 pl, 0,23 mmol) a la soluc¡ón de color amar¡llo-naranja resultante. Después de 30 m¡n a -78 °C, Pd(dba)²(7 mg, 0,012 mmol, 5 % mol), se añad¡eron secuenc¡almente una soluc¡ón de ác¡do 4'-acet¡lb¡fen¡lborón¡co (48 mg, 0,20 mmol) en tetrah¡drofurano (2,5 ml) e h¡dróx¡do de potas¡o acuoso (130 pl, 0,7 mmol, 5,4 M) Se retiró el baño de h¡elo seco/acetona y se dejó calentar la mezcla a temperatura amb¡ente. Una vez completada la reacc¡ón, la soluc¡ón de color rojo v¡no se d¡luyó en tolueno (170 ml), se lavó tres veces con porc¡ones (40 ml) de agua y una vez con salmuera (40 ml) y se secó sobre sulfato de magnes¡o. Después de la f¡ltrac¡ón, el solvente se el¡m¡nó en un evaporador rotator¡o al vacío y dejó un ace¡te pardusco. El producto bruto fue pur¡f¡cado por cromatografía en columna de gel de síl¡ce usando tolueno-acetato de et¡lo (19:1), lo que produjo un ace¡te amar¡llo (23 mg, 18 %). Espectro IR (ATR): 2957, 2876, 1773, 1724, 1681, 1603, 1521, 1496, 1457, 1415, 1376, 1346, 1264, 1228, 1190, 1148, 1053, 1004, 958, 818, 736 cm-1.

Ácido______ (4S■5R■6S)-3-(4'-acet¡l-b¡fen¡l-4-¡l)-6-((1'R)-h¡drox¡et¡l)-4-met¡l-7-oxo-1-azab¡c¡clo[3■2■0lhept-2-eno-2-carboxílíco 4-n¡trobenc¡l éster

[0074] En un matraz de fondo redondo de 50 ml equipado con un septo de goma y un agitador magnético a temperatura ambiente se añadió ácido clorhídrico acuoso (1,0 M, a pH 2,3) a una solución de ácido (4S,5R,6S)-3-(4'-acetil-bifenil-4-il)-4-metil-7-oxo-6-((1'R)-trietilsilaniloxi-etil)-1-azabiciclo[3,2,0]hept-2-eno-2-carboxílico 4-nitrobencil éster (20 mg, 0,031 mmol) en tetrahidrofurano (5 ml) y agua (1 ml). Después de agitar durante 40 min, la solución amarilla se diluyó en diclorometano (180 ml), se lavó una vez con NaHCO3 acuoso al 10 % (60 ml), dos veces con porciones (50 ml) de agua y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de la filtración, el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio al vacío. Se obtuvo un aceite amarillo (23 mg). Espectro IR (ATR): 3438, 2957, 2925, 2855, 1770, 1724, 1679, 1604, 1521, 1496, 1456, 1377, 1346, 1266, 1187, 1140, 1106, 1039, 1016, 1004, 959, 909, 819, 768, 731, 648 cm-1.

Potas¡o-(4S,5R,6S)-3-(4l-acet¡l-b¡fen¡l-4-¡l-6-r(1lR)-h¡drox¡et¡l-4-met¡l-7-oxo-1-azab¡c¡clor3,2,0lhept-2-eno-2-carboxilato

[0075] En un matraz Schlenk de 25 ml equipado con un agitador magnético, bureta de hidrogenación y un globo lleno de hidrógeno a 0 °C, a una suspensión de paladio sobre carbón activado (9 mg, 10 %) en tetrahidrofurano (1.8 ml) se le añadió una solución de ácido (4S,5R,6S)-3-(4'-acetil-bifenil-4-il)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3,2,0]hept-2-eno-2-carboxílico 4-nitrobencil éster (17 mg, 0,031 mmol) en tetrahidrofurano (0,7 ml) y KHCO3 acuoso (0,31 ml, 0,1 M). La suspensión de reacción se agitó en atmósfera de hidrógeno. Después de 10 min se centrifugó el catalizador y se decantó el líquido sobrenadante. El residuo negro se lavó una vez con una mezcla (5 ml) de tetrahidrofurano y agua (2:1). Las capas acuosas combinadas se lavaron dos veces con porciones (4 ml) de acetato de etilo y la capa acuosa se concentró a un volumen pequeño al vacío. Después de la filtración estéril y la liofilización a -25 °C, se obtuvo una espuma amarilla (4,4 mg, 59 %). Espectro IR (ATR): 3364, 2925, 2727, 1743, 1674, 1631, 1602, 1400, 1267, 1112, 1007, 830, 704 cm-1.

Ejemplo 4

Preparación de potasio-(4S,5R,6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-[( 1 'R)-acetox¡etill-4-met¡l-7-oxo-1 -azabiciclo[3,2,0lhept-2-eno-2-carboxilato

[0076]

Ácido______(4S,5R,6S)-3-(4'-acet¡l-b¡fen¡l-4-¡l)-6-((1'R)-acetox¡-et¡l-4-met¡l-7-oxo-1-azab¡c¡clo[3,2,0lhept-2-eno-2-carboxílico 4-nitrobencil éster

[0077l En un matraz Schlenk de 10 ml equipado con un septo de goma, agitador magnético y un globo lleno de nitrógeno seco a 0 °C, a una solución de ácido (4S,5R,6S)-4-metil-3,7-dioxo-6-((1'R)-hidroxietil)-1-azabiciclo[3,2,0]heptano-2-carboxílico 4-nitrobencil éster (10 mg, 0,022 mmol) en diclorometano seco (2,0 ml) se le añadió una solución de dimetilpiridin-4-il-amina (2,7 mg, 0,022 mmol) en diclorometano seco (0,5 ml). Se añadió cloruro de ácido acético (1,6 pl, 0,022 mmol). Después de 1 h a 0 °C, la solución opaca se diluyó en tolueno (20 ml), se lavó una vez con NaHCO3 acuoso saturado (10 ml), una vez con agua (10 ml), una vez con salmuera (10 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. Después de la filtración, el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio al vacío. Se obtuvo Un aceite amarillo (10 mg). Espectro IR (ATR): 3420, 2960, 2927, 2874, 1777, 1728, 1682, 1646, 1601, 1562, 1521, 1455, 1374, 1346, 1264, 1237, 1192, 1107, 1073, 1015, 957, 912, 847, 807, 775, 734, 696 cm-1.

Ejemplo 5

Detección de carbapenemasas de Klebsiella pneumoniae (KPC) mediante potasio-(4S.5R.6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-((1'R)-hidroxietin-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3,2.01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico después de la ruptura física por sonicación

[0079] La cepa bacteriana Klebsiella pneumoniae (que produce KPC-2. Heidelberg) se cultivó durante la noche a 37 °C (220 rpm) en el caldo Mueller Hinton (10 ml) usando un tubo Falcon de 45 ml. se recolectó mediante centrifugación a 13.000 rpm (2 min. 1 ml para estudios analíticos. McFarland 10). se lavó una vez con PBS (1 ml) y se resuspendió en PBS (500 jl). Posteriormente. las células se lisaron mediante sonicación con un Bandelin Sonopuls (5 x 15 s). pulsado al 80 % de máxima potencia. Se añadieron PBS (500 jl) y carbapenem fluorogénico (100 |jg) adicionales. Después del almacenamiento a temperatura ambiente durante 5 min. se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia verde-amarillo (luz UV A = 366 nm). lo que indica la producción de carbapenemasas por parte de Klebsiella pneumoniae.

Ejemplo 6

Detección de carbapenemasas de Klebsiella pneumoniae (KPC) mediante potasio-(4S.5R.6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3.2.01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico durante la ruptura física por sonicación con perlas de vidrio

[0080] La cepa bacteriana de Klebsiella pneumoniae (que produce KPC-2. Heidelberg) se cultivó durante la noche a 37 °C en el caldo Mueller Hinton (10 ml). A una muestra (1 ml. McFarland 0.5) se le añadieron carbapenem fluorogénico (100 jg ) y perlas de vidrio (100 mg. Sigma-Aldrich. G9018.150-212 jm . sin lavar) usando un tubo de vidrio de 5 ml con un fondo plano. Las células se lisaron mediante sonicación con un baño de ultrasonido disponible comercialmente. Después de un tratamiento durante 45 min. se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia verde-amarillo (A = 366 nm). lo que indica la producción de carbapenemasas por parte de Klebsiella pneumoniae.

Ejemplo 7

Detección de carbapenemasas inducibles (tipo Oxa) de Escherichia coli mediante potasio-(4S.5R.6S)-3-(4-acetilfenil)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3.2.01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico después de la ruptura física por sonicación

[0081] La cepa bacteriana Escherichia coli (que produce Oxa-48. Heidelberg) se cultivó durante la noche a 37 °C (220 rpm) en el caldo Mueller Hinton (10 ml) usando un tubo Falcon de 45 ml. Una muestra (1 ml. McFarland 10) se diluyó en el caldo Mueller Hinton (10 ml) y se incubó con imipenem (2 jg/ml) durante 4 h usando un tubo Falcon de 45 ml. Después de la centrifugación a 13.000 rpm (2 min. 1 ml para estudios analíticos). la muestra se lavó una vez con PBS (1 ml) y se resuspendió en PBS (500 jl). Posteriormente. las células se lisaron mediante sonicación con un Bandelin Sonopuls (5 x 15 s). pulsado al 80 % de máxima potencia. Se añadieron PBS (500 jl) y carbapenem fluorogénico (100 jg ) adicionales. Después del almacenamiento a temperatura ambiente durante 5 min. se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia verde-amarillo (luz UV A = 366 nm). lo que indica la producción de carbapenemasas Oxa-48 por parte de Escherichia coli. La muestra no inducida correspondiente no mostró ningún cambio en el color de fluorescencia en 30 minutos.

Ejemplo 8

Detección de metalocarbapenemasas mediante potasio-(4S.5R.6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3.2.01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico en PBS durante la incubación

[0082] Las cepas bacterianas Klebsiella pneumoniae (VIM-1. Heidelberg) y Pseudomonas aeruginosa (IMP. Heidelberg) se cultivaron durante la noche a 37 °C en el caldo Mueller Hinton (10 ml). A cada PBS (1 ml) de carbapenem fluorogénico (100 jg ) se le añadieron cinco gotas del inóculo correspondiente (McFarland 0.5). Después de una incubación adicional durante la noche a 37 °C. se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia amarillo-verde (luz UV A = 366 nm). lo que indica la producción de carbapenemasas.

Ejemplo 9

Detección de carbapenemasas mediante potasio-(4S.5R.6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3.2.01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico durante la incubación

[0083] Las cepas bacterianas Escherichia coli (ESBL-1. Heidelberg). Escherichia coli (ESBL-2. Heidelberg). Escherichia coli (Oxa-48). Klebsiella pneumoniae (KPC-2. Heidelberg). Klebsiella pneumoniae (VIM-1. Heidelberg), Pseudomonas aeruginosa (GES-2, Heidelberg), Pseudomonas aeruginosa (IMP, Heidelberg) y Pseudomonas aeruginosa (VIM-2. Heidelberg) se cultivaron durante la noche a 37 °C en el caldo Mueller Hinton (10 ml). A cada muestra (1 ml. McFarland 0.5) se le añadió carbapenem fluorogénico (100 jg). Después de una incubación adicional durante la noche a 37 °C. se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia verde amarillo (luz UV A = 366 nm) para cada cepa productora de carbapenemasa. Los productores de ESBL correspondientes no mostraron ningún cambio en color.

Ejemplo 10

Detección de carbapenemasas mediante potasio-(4S,5R,6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3,2,01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico durante la incubación optimizada

[0084] Las cepas bacterianas Escherichia coli (ESBL-1, Heidelberg), Escherichia coli (ESBL-2, Heidelberg), Escherichia coli (Oxa-48), Klebsiella pneumoniae (KPC-2, Heidelberg), Klebsiella pneumoniae (VIM-1, Heidelberg), Pseudomonas aeruginosa (GES-2, Heidelberg), Pseudomonas aeruginosa (IMP, Heidelberg), Pseudomonas aeruginosa (VIM-2, Heidelberg) se incubaron durante 6 h a 37 °C (220 rpm) en el caldo Mueller Hinton (10 ml) usando tubos Falcon de 45 ml. A cada muestra (1 ml) se le añadió carbapenem fluorogénico (100 |jg) usando tubos Falcon de 15 ml. Después de una incubación adicional durante la noche a 37 °C, se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia verde-amarillo (A = 366 nm) para cada cepa productora de carbapenemasas. Los productores de ESBL correspondiente no mostraron ningún cambio en el color de fluorescencia.

Ejemplo 11

Detección de carbapenemasas mediante potasio-(4S,5R,6S)-3-(4-acetil-fenil)-6-((1'R)-hidroxietil)-4-metil-7-oxo-1-azabiciclo[3,2,01hept-2-eno-2-carboxilato fluorogénico durante la lisis química

[0085] Las cepas bacterianas Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 (sin resistencia), Pseudomonas aeruginosa (VIM-2, Heidelberg) y Klebsiella pneumoniae (KPC-2, Heidelberg) se incubaron durante la noche a 37 °C en placas de agar Mueller Hinton. Se suspendió una muestra de cada cepa (McFarland 10) en una solución tampón libre de amina primaria (1 ml) de un detergente de Merck (Alemania). Se añadió carbapenem fluorogénico (100 jg). Después de una incubación adicional durante 6 h a 37 °C, se pudo observar la desaparición del color de fluorescencia verde-amarillo (A = 366 nm) para ambas cepas productoras de carbapenemasas. La muestra correspondiente de Pseudomonas aeruginosa DSM 1117 no mostró ningún cambio en el color de fluorescencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Carbapenem fluorescente o cromogénico de la fórmula I

y/o sus sales, donde R1 se selecciona de entre hidrógeno o alquilo y acilo, cada uno

con 1 a 6 átomos de carbono y donde Ar es un grupo aromático carbocíclico monosustituido o disustituido o un grupo aromático heterocíclico opcionalmente monosustituido o disustituido, seleccionado de entre fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 2-bifenilo, 4-bifenilo, fenantrilo, 9,10-dihidroantrilo o antrilo y el grupo aromático heterocíclico se selecciona de entre 2- o 4-piridilo, 2- o 4-piridina, 2-pirimidilo, 4-pirimidinilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, 1,3,4-triazolilo, indolilo, quinolilo, isoquinolilo, benztiazolilo, benzoxalilo, cumarilo, carbolinilo, fenantrolinilo y carbazolilo y donde los sustituyentes R2 y R3 de las partes aromáticas Ar se seleccionan, independientemente entre sí, de entre hidrógeno, amino, hidroxi, oxo, fluoro, cloro, bromo, nitro, ciano, carboxi, carbamoilo, sulfamoilo, amidino, guanidino, sulfo o alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, monoalquilamino, dialquilamino, trialquilamonio, N, N-dialquilcarbamoilo, N-alquilcarbamoilo y alcoxicarbonilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono.

2. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el grupo aromático carbocíclico Ar es fenilo, 2-bifenilo o 4-bifenilo y el grupo aromático heterocíclico Ar es 2-piridilo, 4-piridilo o 2-pirimidinilo.

3. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el grupo aromático Ar es carbocíclico y se selecciona de entre fenilo, 2-bifenilo o 4-bifenilo.

4. Compuesto según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el grupo aromático Ar es fenilo, 2-bifenilo o 4-bifenilo, R2 es hidrógeno y R3 es acilo con 1 a 6 átomos de carbono.

5. Composición que comprende un compuesto según la reivindicación 1 y un detergente iónico o no iónico y un vehículo farmacéutico o diluyente del mismo.

6. Composición que comprende un compuesto según la reivindicación 1, un medio de nutrición y un soporte farmacéutico o diluyente del mismo.

7. Método para sintetizar un compuesto según la reivindicación 1, que comprende los siguientes pasos: a) reacción de acoplamiento cruzado de dos compuestos de fórmulas

donde Ar es como se define en la reivindicación 1, Tf es trifluorometanesulfonilo y R4 y R5 son grupos protectores, caracterizado por el hecho de que los dos compuestos se hacen reaccionar en presencia de un catalizador de acoplamiento cruzado y una base orgánica o inorgánica en un diluyente;

b) reacción de desprotección de un compuesto de fórmula

donde Ar es como se define en la reivindicación 1, y R4 y R5 son grupos protectores, caracterizado por el hecho de que el compuesto se hace reaccionar con uno o dos agentes desprotectores.

8. Método de síntesis de un compuesto según la reivindicación 1, que comprende los siguientes pasos: a) reacción de acoplamiento cruzado de dos compuestos de fórmulas

donde Ar es un grupo aromático carbocíclico monosustituido o disustituido o un grupo aromático heterocíclico opcionalmente monosustituido o disustituido según la reivindicación 1, Tf es trifluorometanesulfonilo y R4 es un grupo protector y R5 se selecciona de entre alquilo o acilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono, caracterizado por el hecho de que los dos compuestos se hacen reaccionar en presencia de un catalizador de acoplamiento cruzado y una base orgánica o inorgánica;

b) reacción de desprotección de un compuesto de fórmula

donde Ar es un grupo aromático carbocíclico monosustituido o disustituido o un grupo aromático heterocíclico opcionalmente monosustituido o disustituido según la reivindicación 1, R4 es un grupo protector y R5 se selecciona de entre alquilo o acilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono, caracterizado por el hecho de que el compuesto se hace reaccionar con un agente desprotector.

9. Kit para detectar resistencia microbiana a los carbapenemas, que comprende un compuesto según la reivindicación 1, un detergente iónico o no iónico y un vehículo farmacéutico o diluyente del mismo, e instrucciones de uso, en uno o más recipientes.

10. Proceso, caracterizado por el hecho de que un compuesto según la reivindicación 1 es hidrolizado por una carbapenemasa bacteriana sospechosa o probada en solución acuosa.

11. Uso de un carbapenem fluorescente o cromogénico de fórmula I

y/o sus sales, donde R1 se selecciona de entre hidrógeno o alquilo y acilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono y donde Ar es un grupo aromático carbocíclico monosustituido o disustituido o un grupo aromático heterocíclico opcionalmente monosustituido o disustituido, donde el resto aromático carbocíclico es monocíclico, bicíclico o tricíclico con 6 a 14 átomos de carbono y el resto aromático heterocíclico es monocíclico, bicíclico o tricíclico y contiene de 1 a 13 átomos de carbono y contiene de 1 a 5 heteroátomos, que se seleccionan, independientemente entre sí, de entre oxígeno, nitrógeno o azufre y donde los sustituyentes R2 y R3 de las partes aromáticas Ar se seleccionan, independientemente entre sí, de entre hidrógeno, amino, hidroxi, oxo, fluoro, cloro, bromo, nitro, ciano, carboxilo, carbamoilo, sulfamoilo, amidino, guanidino, sulfo o alquilo, alcoxi, acilo, acilamino, monoalquilamino, dialquilamino, trialquilamonio, N, N-dialquilcarbamoilo, N-alquilcarbamoilo y alcoxicarbonilo, cada uno con 1 a 6 átomos de carbono, para la detección ex vivo de la resistencia microbiana a los carbapenemas o para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de la carbapenemasa bacteriana o para la prueba ex vivo de inhibidores de carbapenemasas mediante la monotorización de la desaparición de laa fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos.

12. Uso según la reivindicación 11 para detectar la resistencia microbiana a los carbapenemas.

13. Uso según la reivindicación 11 para probar inhibidores de carbapenemasas.

14. Uso según la reivindicación 11 para probar inhibidores de la inducción de carbapenemasas.

15. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de carbapenemasa bacteriana monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, un medio de nutrición y al menos una especie bacteriana se incorporan a un diluyente.

16. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de carbapenemasa bacteriana monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, un detergente iónico o no iónico y al menos una especie bacteriana se incorporan en un diluyente.

17. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de carbapenemasa bacteriana monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, y una preparación obtenida por lisis de al menos una especie bacteriana se incorporan en un diluyente.

18. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de carbapenemasa bacteriana monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que la intensidad de la fluorescencia de un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, se monitorea en un diluyente mediante visión o mediante dispositivos fotoelectrónicos.

19. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de inhibidores de carbapenemasas monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un inhibidor conocido o sospechoso, un compuesto de fórmula I, como se define en las reivindicaciones 4-11, un medio de nutrición y al menos una especie bacteriana productora de carbapenemasas se incorporan en un diluyente.

20. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de inhibidores de carbapenemasas monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un inhibidor conocido o sospechoso, un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, y una preparación obtenida por lisis de una especie bacteriana productora de carbapenemasas se incorporan en un diluyente.

21. Método según la reivindicación 19 o 20, donde el inhibidor es un inhibidor de serina proteasa o de metaloproteasa.

22. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de inhibidores de la inducción de carbapenemasas monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, un inhibidor conocido o sospechoso, un promotor de carbapenemasas, un medio de nutrición y al menos una especie bacteriana, capaz de producir carbapenemasa inducible, se incorporan en un diluyente.

23. Método para la investigación ex vivo y/o la detección ex vivo de inhibidores de la inducción de carbapenemasas monitoreando la desaparición de la fluorescencia tras la hidrólisis de p-lactámicos, caracterizado por el hecho de que un compuesto de fórmula I, como se define en la reivindicación 11, un inhibidor conocido o sospechoso, un medio de nutrición y al menos una especie bacteriana productora de carbapenemasas se incorporan en un diluyente.