DK174969B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en levende ikke-virulent vaccine, Salmonella-stamme og vaccine indeholdende ddenne stamme - Google Patents

Description

DK 174969 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en levende ikke-virulent vaccine ud fra en virulent patogen bakterie, en levende Salmonella-stamme og en vaccine indeholdende denne Salmonella-stamme.

5 Vaccination med levende svækkede stammer anvendes i stor udstrækning og med gode resultater til forebyggelse af forskellige virussygdomme hos mennesker, såsom polio, kopper og mæslinger. I modsætning hertil anvendes levende vacciner kun imod nogle få bakteriesygdomme hos mennesker og husdyr BCG-vaccine til forebyggelse af tuberkulose, stamme 19-vaccine 10 imod okse-brucellose og Sterne's sporevaccine imod miltbrand hos kvæg. I mange undersøgelser af eksperimentelle Salmonella-infektioner har levende vacciner ikke desto mindre vist fordele i forhold til dræbte vaccinen (i) De vil ofte forebygge (og ikke blot udskyde) multiplikationen af Salmonella i lever og milt, hvilken multiplikation kan føre til døden, (ii) de giveren god beskyttelse 15 imod angreb véd oral indgivelse i situationer, hvor dræbte vacciner, der indgives ved injektion eller oralt, er relativt ineffektive, og (iii) injektioner med levende vaccine vil i visse tilfælde frembringe en evne til hurtigt at eliminere de angribende bakterier fra lever, milt etc., sandsynligvis igennem en celle-formidlet immunitet, hvilket er i modsætning til dræbte vacciner, som først og 20 fremmest fremkalder humoral immunitet uden nogen større evne til at eliminere virulente bakterier. Anvendelsen af levende Salmonella-vacciner vanskeliggøres imidlertid af et antal faktorer. Nogle stammer, som kunne tænkes anvendt som levende vacciner, opretholder en uacceptabel høj grad af virulens, enten ved reversion eller på anden måde. Visse levende vacciner udvi-25 ser kun en kortvarig immunitet, som kan forklares ved, at vaccinestammen på et tidligt tidspunkt forsvinder fra værtsorganismens væv, og i visse tilfælde er der tale om en ufuldstændig immunitet, således at nogle af de vaccinerede dyr vil dø efter et større angreb af en virulent stamme. 1

De ikke-virulente stammer, som anvendes som vacciner, er blevet frembragt på forskellige måder. Således blev BCG-stammen udviklet ved empiriske 2 DK 174969 B1 procedurer under forlænget dyrkning in vitro, og stammens ikke-virulens kan sandsynligvis tilskrives adskillige ikke-identificerede mutationer. Sterne's Bacillus anthracis sporevaccine er en stamme, som har mistet evnen til at syntetisere den polypeptid-kapsel, som er vigtig som en determinant for virulen-5 sen, men ikke som et "beskyttende" antigen. Nogle forskere har som levende vaccine simpelthen anvendt en sub-letal dosis af en "vild" stamme med relativ lav virulens forstået på den måde, at LD50 var et stort antal bakterier. Dette er en situation, hvor der er en evident risiko for, at en alvorlig eller dødelig infektion kan udvikles hos nogle af de vaccinerede individer, samt risiko for 10 overføring til andre værter.

I den senere tid har man udviklet bakteriestammer til anvendelse som levende vacciner, hvilke stammer er streptomycin-afhængige mutanter af stammer af forskellige pathogene arter. Shigella flexneri og Shigella sonnei streptomy-15 cin-afhængige mutanter har i stor udstrækning været anvendt som levende vacciner, som giver beskyttelse ved indgivelse gennem munden, og de har vist sig at være både sikre og effektive. I eksperimentelle Salmonellainfektioner synes de streptomycin-afhængige mutanter imidlertid kun at være moderat tilfredsstillende. Generelt er de "rå" mutanter i Gram-negative bakte-20 riearter, dvs. mutanter, der er ude af stand til at frembringe normalt lipopoly-saccharid, ikke-virulente, men de har vist sig utilfredsstillende som levende vacciner, fordi de ikke frembringer beskyttelse. Der skal dog peges på to undtagelser: (i) I Salmonella forhindrer en mutation af genet gal E en normal lipopolysaccharid-syntese, med mindre bakterierne forsynes med på forhånd 25 dannet galactose. En gal E-mutant af S. typhimurium var i realiteten ikke-virulent i små laboratoriedyr, men den fremkaldte en god immunitet. Eftersom der dannedes anti-O-antistoffer, må ga1E-bakterieme have opnået en tilstrækkelig mængde galactose inden for værtsorganismens væv til at kunne frembringe i det mindste en vis mængde O-specifikt lipopolysaccharid. For 30 nylig har en Ga1 E-mutant af S. typhi, som blev indgivet oralt til frivillige forsøgspersoner, vist sig at være ikke-virulent, og den frembragte en rimelig DK 174969 B1 ** w beskyttelse imod senere orale angreb med en virulent stamme af den samme art. Endvidere har de første rapporter over en markprøve af denne stamme, som blev indgivet oralt til skolebørn i Alexandria, Egypten, vist, at stammen gav en særdeles god beskyttelse imod risikoen for at pådrage sig typhoid 5 feber, som forekommer hyppigt hos sådanne børn. Ikke-virulensen af gal E-stammer synes at være betinget af tilstedeværelsen af normale forsvarsmekanismer i værtscellerne, eftersom en indgivelse af det cytotoxiske middel cyclophosphamid til mus, som forinden var blevet injiceret med en ga1E-mutant af S. typhimurium, der er ikke-pathogen over for ubehandlede dyr, 10 frembragte dødelige infektioner som følge af en multiplikation af gal E- stammen. (ii) En "rå" mutant af S. dublin anvendes rutinemæssigt i Storbritannien som levende vaccine, der indgives ved parenteral injektion til beskyttelse af nyfødte kalve imod de ofte dødelige Salmonella-infektioner, som tidligere var fremherskende. Da den anvendte stamme tilsyneladende mangler 15 den O-specifikke del af lipopolysaccharidet, virker den sandsynligvis ved at fremkalde en "ikke-specifik immunitet”, muligvis ved at bevirke en aktivering af makrophager.

Eftersom levende vacciner har en betydeligt større sandsynlighed for med 20 gode resultater at kunne beskytte værtsorganismen imod et efterfølgende angreb af en virulent vild stamme, er det ønskeligt at udvikle nye levende vacciner, hvormed man kan undgå de ulemper, som karakteriserer de tidligere fremstillede vacciner. Eftersom et hvirveldyrs immun-respons over for antigener, i særdeleshed overfladeantigener, af den pathogene mikroorganisme 25 er den grundlæggende mekanisme for beskyttelse gennem vaccination, bør en levende vaccine opretholde det antigene komplement af vildtype-stammen. Den levende vaccine bør være ikke-virulent, og den bør være i det væsentlige ude af stand til at multiplicere i værtscellen, ligesom der i det væsentlige ikke bør være nogen sandsynlighed for, at den vender tilbage til en 30 virulent vild stamme.

4 DK 174969 B1

En ikke-virulent levende vaccine kan også tjene som vært for udtrykkelse af antigener, som kan være lokaliseret i dens cytoplasma, translokaliseret til dens plasma eller ydre membran eller udskilt til dannelse af immunogener til frembringelse af en immunogen respons hos pattedyr-værtsorganismen. Ved 5 at anvende en levende vaccine som bærer for et immunogen, i særdeleshed en angribende værtsorganisme, såsom Salmonella typhi, kan man bibringe immunsystemet, i særdeleshed det humorale immunsystem, en kraftig stimulus. På denne måde kan man opnå mange af de fordele, der er knyttet til anvendelse af svækkede levende pathogene organismer, såsom bakterier, 10 svampe, protozoer og virus, uden bekymring for, at der sker en reversion til en virulent form.

Sandhu et al., Infection and Immunity (1976) 13, 527, beskriver tabet af virulens hos Asperigilius fumigatus i en mutant auxotrof for p-aminobenzoeesyre.

15 Moms et al. Brit. J. Exptl. Path. (1976) 57:354, beskriver virkningen af T- og B-lymphocyt-udtynding på beskyttelsen af mus vaccineret med en ga1E-mutant af Salmonella typhimurium. Lyman et al., Inf. Imm. (1977) 15:491, sammenlignede virulensen af 0:9,12 og 0:4,5,12 S. typhimurium his+-transduktanterfor mus. Beskrivelser af anvendelsen af translokaliserbre ele-20 menter til fremkaldelse af udelukkelser eller inversioner kan findes i Kleckner et al., J. Mol. Biol. (1977) 166,125; Kleckner et al., ibid 127, 89; og Kleckner et al., Genetics, 90:427-464 (1978). US patentskrift nr. 4 337 314 beskriver fremstillingen af levende H. influenza-vaccine-stammer ved kombination af tilfældige mutationer i en enkelt stamme. Hoiseth og Stocker, J. Bacteriol.

25 (1985) 163:355-361, beskriver slægtskabet mellem aroA- og serC-gener af S. typhimurium. I en privat kommunikation har dr. John Roth, Department of Biology, University of Utah, udviklet to stammer af S. typhimurium LT2, som hver især har fået indført et transposon Tn10, som bibringer resistens over for tetracyclin, i genet for den aromatiske biosyntesevej, hvilket frembringer 30 en manglende evne til at syntetisere den fælles præcursor for de aromatiske aminosyrer og for to bakterie-metaboliter, nemlig p-aminobenzoeat (præcur- 5 DK 174969 B1 sor for den vigtige metabolit folinsyre) og dihydroxybenzoeat (præcursor for den med jern chelat-dannende forbindelse enterochelin eller enterobactin).

R. J. Yancey (1979), Infection and Immunity, 24,174, rapporterer, at en mutation, som bevirker en manglende evne til at syntetisere enterochelin, der 5 var fastholdt i en muse-virulent stamme af S. typhimurium, frembragte en meget betydelig reduktion af virulensen. Den metaboliske blokering var mellem chorisminsyre og enterobactin, således at mutationen ikke frembragte et behov for p-aminobenzoeat. I maj 1979 fremkom et skrift af Stocker og Hoi-seth, benævnt "Effect of Genetic Defects in Iron Assimilation on Aromatic of 10 Salmonella typhimurium". Hoiseth et al. Nature Vol. 291 (1981 ):238-239 beskriver metoder til dannelse af non-virulente Salmonella stammer ved at indføre en enkelt auxotrof mutation i aro A biosyntesevejen for Salmonella stammen via introduktion af et tetracyclin resistent transposon med et transducerende Phag. De levende non-virulente stammer har udvist beskyttelse i 15 mus.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes levende vacciner til brug ved vaccination af en værtsorganisme imod en patogen bakterie, og vaccinerne ifølge opfindelsen kan også tjene som bærere for immunogener af andre 20 pathogene organismer, især mikroorganismer, herunder virus, prokaryoter og eukaryoter. De levende vacciner ifølge opfindelsen fremstilles ved at frembringe auxotrofe mutanter af en pathogen stamme, hvori to biosyntetiske veje er blokeret, således at bakteriemutanten til sin formering kræver to nærende stoffer, som normalt ikke er tilgængelige i værtsorganismen i den mængde, ^ 25 som mikroorganismen kræver.

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen er derfor karakteriseret ved det, der er angivet i den kendetegnede del af krav 1. Den levende Salmonella-stamme er karakteriseret ved det, der er angivet i den kendetegnede del af krav 7.

30 Vaccinen ifølge opfindelsen er karakteriseret ved det, der er angivet i den kendetegnede del af krav 10.

6 DK 174969 B1

Den auxotrofe mutation er et resultat af en genetisk ændring i et struktur-gen, hvilken ændring ikke kan afhjælpes af noget enkelt trin. Sådanne genetiske ændringer omfatter udelukkelse og/eller inversion af et polynucleotid-5 segment af genet, i særdeleshed i de tilfælde, hvor en inversion optræder umiddelbart ved siden af en indført fremmed nucleotid-sekvens i genet. Til opfindelsens formål vil disse ændringer blive benævnt som "ikke-tilbagevendende mutationer”. Normalt vil den ikke-tilbagevendende mutation ikke påvirke antigen-konstitutionen af den pathogene mikroorganisme, og 10 den vil i særdeleshed ikke ændre overflade-antigenerne, af hvilke nogle kan være vigtige determinanter for pathogenicitet. De resulterende auxotrofe mutanter har en sandsynlighed for reversion på praktisk talt nul, samtidig med, at de har de samme (eller næsten de samme) immunogene karakteristika som den virulente stamme, således at der frembringes en effektiv immuno-15 gen respons.

Nærmere bestemt frembringer man auxotrofe mutanter ved at anvende en virulent stamme, der fortrinsvis har en genetisk markering, som muliggør dens udvælgelse, og at tilvejebringe mindst én ikke-tilbagevendende mutati-20 on i ét eller flere gener, således at man iværksætter en fuldstændig blokering af biosyntesen af én eller flere essentielle metaboliter, som normalt ikke er tilgængelige i vævet hos hvirveldyr. Ved at isolere mutanten og foretage en screening for den manglende evne til at "vende tilbage", for manglen på virulens og for evnen til at immunisere ved anvendelse som levende vacciner 25 kan man opnå stammer, som er nyttige i sådanne levende vacciner.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes vacciner fremstillet udfra levende, ikke-vimlente bakterier, hvilke vacciner er særligt nyttige til vaccination af hvirveldyr, som er modtagelige for sygdomme fremkaldt af tilsvarende 30 pathogene bakterier. De ikke-virulente bakterier kan tjene som bærere for antigener for andre pathogener, således at der frembringes en sammensat 7 DK 174969 B1 immunogen respons, og således at den humorale og/eller cellulære beskyttelse imod to eller flere pathogener forstærkes. Bakterierne er auxotrofe, idet de har en ikke-tilbagevendende tæt blokering af flere biosyntetiske veje, hvilket skaber et behov for næringsstoffer, der ikke er til stede i dyret, som skal 5 vaccineres, i mængder, der er tilstrækkelige til at tillade en multiplikation af bakterien. De omhandlede vaccinestammer kan således dyrkes på medier, der er suppleret med næringsstoffer, og når de introduceres i værtsorganismen, vil de fortsætte med at leve (indtil de elimineres af værtsorganismens immun-respons), men de vil være ude af stand til at formere sig.

10

Den ikke-tilbagevendende blokering frembringes ved at introducere en mutation i et gen, der indkoder et enzym, som ubetinget er nødvendigt i et bestemt trin i en biosyntese. Eftersom produktet af biosyntesen ikke er tilgængeligt i værtsorganismen, som skal vaccineres, vil bakterien være ude af 15 stand til at formere sig, selv om den er i live og opretholder sine naturlige antigen-karakteristika. Mutationen er ikke-tilbagevendende, fordi en genoprettelse af den normale gen-funktion kun kan optræde ved en tilfældig samtidig forekomst af mere end én begivenhed, idet hver af disse begivenheder indtræder yderst sjældent.

20 Når der er tale om en udelukkelsesmutation, vil en genoprettelse af den genetiske information kræve mange tilfældige og samtidige indføringer af nucleotider i tandem, hvis den tabte genetiske information skal genetableres.

Hvis der er tale om en indføring ledsaget af en inversion, vil en genoprettelse 25 af gen-funktionen kræve en nøjagtig udslettelse af den indførte sekvens og en nøjagtig re-inversion af den hosliggende omvendte sekvens, og hver af disse hændelser forekommer med en hyppighed, som er yderst lille og faktisk upåviseligt lav. Hver af de to typer af "ikke-tilbagevendende" auxotrofe mutationer har således en sandsynlighed for at vende tilbage til prototrofi, 30 som i praksis er nær ved nul.

8 DK 174969 B1

Mens en enkelt ikke-tilbagevendende blokering frembringer en høj grad af sikkerhed imod en mulig tilbagevenden til virulens, er der stadig hændelser tilbage, som ganske vist er usandsynlige, men som dog har en endelig sandsynlighed for at kunne indtræde. Lejligheden til reversion eksisterer, når der 5 findes bakterier i værtsorganismen, der ved konjugation kan overføre den genetiske evne til den ikke-virulente organisme. Der kan desuden findes en kryptisk alternativ biosyntesevej, som ved sjælden mutation eller under belastning kunne blive virksom. For det tredje kan et næringsstof, som indgives til værtsorganismen, tjene som den nødvendige metabolit, hvilket resulterer i 10 en pathogen formering og virulens. Det er derfor af en vis interesse at udvikle levende bakterie-vacciner med to separate og ikke-relaterede syntevej-blokeringer, hvilke vacciner vil være levedygtige og leve i relativt lang tid i værtsorganismen, tilvejebringe en kraftig immun-respons efter indgivelse til værtsorganismen og tjene som et bærestof for antigener af andre pathogene 15 organismer og derved sikre en immun-beskyttelse imod sådanne pathogene organismer.

Ud over de auxotrofe mutationer, som forhindrer en multiplikation i det vaccinerede dyr, er det ønskeligt, at bakterien, som skal anvendes som levende 20 vaccine, har én eller flere genetiske "markør-karakterer", som gør det let at skelne den fra andre bakterier af den samme art, enten vilde stammer eller andre levende vaccinestammer. Denne "markør" kan bekvemt være et næringsmæssigt krav, såsom et histidin-behov. Sådanne markører er nyttige til at skelne vaccinestammen fra stammer af vildtypen, især når en vaccineret 25 patient bukker under for en Salmonella-infektion som et resultat af en eksponering, inden vaccine-immuniteten er blevet etableret.

Efter at have manipuleret bakterien på en sådan måde, at der indføres én eller flere ikke-tilbagevendende mutationer i nogle af populationens med-30 lemmer, dyrker man bakterien under betingelser, som letter isolationen af de auxotrofe mutanter, enten under betingelser, ved hvilke sådanne mutanter DK 174969 B1 g har en selektiv fordel i forhold til forældrebakterieme, eller under betingelser, der gør det let at genkende mutanterne og skelne disse fra de ikke-forandrede bakterier eller mutanter af andre typer. De isolerede auxotrofe mutanter klones og underkastes screening for virulens, for den manglende 5 evne til tilbagevenden og for evnen til at beskytte værtsorganismen imod en virulent pathogen stamme.

Den omhandlede fremgangsmåde til fremstilling af vaccinerne er fordelagtig, ligesom vaccinerne i sig selv udviser en lang række fordele i forhold til kendte 10 vacciner. I modsætning til andre vacciner er det med den foreliggende opfindelse muligt at påvise den eksakte årsag til tabet af virulens. Til forskel fra andre levende vaccinestammer, som er ikke-virulente på grund af ændringer i lipopolysaccharid-karakteren, bliver de omhandlede vacciner i det væsentlige ikke ændret med hensyn til O-antigen-karakteren såvel som med hensyn 15 til andre overflade-antigener, som kan være relevante for virulensen og immuniteten, såsom de vigtige proteiner i den ydre membran. De omhandlede vacciner vil således stimulere produktionen af anti-O-antistoffer, som vides at være vigtige komponenter i den immunitet, der kan opnås ved vaccination.

De omhandlede stammer er i stand til at forblive i værtsorganismen i forlæn-20 gede tidsperioder, sædvanligvis i uger, til forbedring af den immuniserende effektivitet ved kontinuerlig stimulering af værtsorganismens immunsystem, indtil dette har uskadeliggjort alle organismerne. De auxotrofe mutanter, som har ikke-tilbagevendende tætte mutationer, vil i praksis have en sandsynlighed på nul for at vende tilbage til virulens-tilstand. I lyset af det faktum, at 25 ikke-virulensen afhænger af fraværet af relevante metaboliter i værtsorganismens væv og ikke af nogen værtscellefunktion, vil de omhandlede stammer være ikke-virulente, også i værtsorganismer med immundefekter.

Blandt bakterier er den foreliggende opfindelse særligt anvendelig på en lang 30 række Salmonella-stammer, nærmere bestemt hørende til grupperne A, B og D, der omfatter de fleste arter, som er specifikke pathogener af bestemte 10 DK 174969 B1 hvirveldyr. Som illustrative eksempler på Salmonella-arter, der fremkalder sygdomme, imod hvilke der kan produceres levende vacciner, kan anføres S. typhimurium, S. typhi, S. abortus-ovi, S. abortus-equi, S. dublin, S. gallinarum og S. pullorum såvel som andre arter, som vides at fremkalde infektioner hos 5 pattedyr, eller som senere kan vise sig at fremkalde sådanne infektioner.

Andre organismer, på hvilke den foreliggende opfindelse kan finde anvendelse, omfatter Shigella, især S. flexneri og S. sonnei, Haemophilus, især H. influenzae, nærmere bestemt type b, Bordetella, især B. pertussis, Neisseria, 10 især N. meningitidis og N. gonorrohoeae, Pasteuralla, især P. multocida, og Yersinia, især Y. pestis.

Vaccinerne kan benyttes på en række husdyr såvel som på mennesker.

Blandt de husdyr, som i dag behandles med vacciner, eller som senere kan 15 behandles, hvis de bliver modtagelige for bakteriefremkaldte sygdomme, kan nævnes kyllinger, køer, svin, heste, får og geder, for blot at nævne de vigtigste husdyr.

Når man skal fremstille de levende vacciner, vælger man en stamme af den 20 pathogene bakterie, som fortrinsvis indeholder en markør til at skelne den auxotrofe mutant, der skal produceres, fra de øvrige medlemmer af stammen. Alternativt kan en sådan markør introduceres i vaccinestammen. Der kan anvendes forskellige former for markører, såsom resistens over for antibiotika eller syntetiske antibakterielle medikamenter, en blokering i biosynte-25 sevejen, som fremkalder et behov for en aminosyre, eksempelvis histidin, eller lignende. Begrænsningen på den enkelte markør er, at den ikke må påvirke mikroorganismens immonogene karakter, og den må ikke gribe ind i den forarbejdning af bakterien, der fører til den levende vaccine. Markøren vil ændre fænotypen, hvilket muliggør en genkendelse af den pågældende bak-30 terien.

11 DK 174969 B1

Den pågældende bakterie bearbejdes derefter på en sådan måde, at der fremkommer flere ikke-tilbagevendende mutationer. Hver af disse ikke-tilbagevendende mutationer involverer et polynucleotid på mere end 5 nucleotider, fortrinsvis et polynucleotid på mindst 10 nucleotider, og hver mu-5 tation vil blokere flere biosynteseveje, normalt to eller flere biosynteseveje. Mutationerne kan være udelukkelser, indføringer eller inversioner, eller der kan være tale om kombinationer deraf. De blokerede biosynteseveje bør ikke involveres i produktionen af de antigener, der har at gøre med bakteriens virulens, og heller ikke i værtsorganismens immun-respons til infektioner 10 fremkaldt af bakterien. Man kan anvende forskellige teknikker til at introducere udelukkelser eller indføringsinversioner, således at man opnår en bakterie med de ønskede "tætte" ikke-tilbagevendende blokeringer af biosynteseveje.

Valget af gen bestemmes af evnen til at mutere genet uden at ødelægge 15 bakteriens levedygtighed, den essentielle natur af produktet, der udtrykkes af genet, og den usandsynlige tilstedeværelse af produktet i den påtænkte værtsorganisme. Det blokerede gen skal forhindre, at der dannes et enzym, som er nødvendigt ved biosyntesen af en metabolit, der er nødvendig for multiplikationen, men ikke på anden måde nødvendig for levedygtigheden.

20 Gener af særlig interesse omfatter flere aro-gener, pab-genet, som er involveret i produktionen af p-aminobenzoeesyre, og pur-generne, som er involveret i omdannelsen af inosinmonophosphat til adenosinmonophosphat, hvilken omdannelse kræver adenin eller en adenin-forbindelse.

25 En af teknikkerne til frembringelse af en ikke-tilbagevendende blokering af en biosyntesevej består i at anvende translokaliserbare elementer, i særdeleshed transposon'er. Transposon'er er segmenter af dobbeltstrenget DNA, som er opbygget af nogle tusinde nucleotider, og som normalt omfatter et gen for resistens over for et antibiotikum eller et andet antibakterielt medikament 30 sammen med gener, som kan bevirke indføring af en kopi af det pågældende transposon på et af mange mulige steder i DNA'et af den bakterie, som huser 12 DK 174969 B1 det pågældende transoson. En indføring af et transposon i et gen, som specificerer aminosyresekvensen af et enzymatisk aktivt protein, bevirker et fuldstændigt tab af evnen til at syntetisere dette protein i aktiv form. Hele det pågældende transposon bliver imidlertid med lav frekvens (f.eks. lO^/bak-5 terie/generation) udelukket eller udskåret fra genet, hvori det er indført, og som følge heraf bliver genet omdannet til sin oprindelige tilstand, således at det atter specificerer et enzymatisk aktivt protein. En sådan præcis udskæring af et transposon bevirker et tab af den resistens over for et antibiotium eller et andet antibakterielt medikament, som var et resultat af resistens-10 genets indvirkning på transposon'et.

Udover den præcise udskæring sker tabet af resistens også som følge af andre hændelser, som indtræder væsentligt oftere end den præcise udskæring, og som ikke resulterer i en gendannelse af genets oprindelige form, 15 hvilket betyder, at den tabte gen-funktion ikke genetableres. Der findes to typer af sådanne hændelser, som resulterer i dannelse af en ikke-tilbagevendende, ikke-funktionel form af genet, hvori transposon'et blev indført: Den ene hændelse er en udelukkelse af et DNA-segment, der omfatter hele transposon'et eller en del heraf, herunder dets resistens-gen, og et 20 DNA-segment, der udstrækker sig til den ene side af indføringsstedet, og som således udstrækker sig til (eller under tiden gennembryder) den del af genet, hvori transposon'et blev indført, til den ene side af indføringsstedet.

Den anden hændelse er en udelukkelse afen del af transposon'et og en samtidig inversion af et DNA-segment, som omfatter genetisk materiale, der 25 udstrækker sig til den ene side fra det oprindelige indføringssted. Det påvirkede gen kan derefter kun vende tilbage til sin oprindelige tilstand ved en præcis udelukkelse af den resterende del af transposon'et sammen med en re-inversion af præcis det modsatte DNA-segment, hvilket vil sige, at der samtidigt skal optræde to hændelser, som hver for sig må forventes at fore-30 komme yderst sjældent, muligvis så sjældent, at det ikke kan påvises.

13 DK 174969 B1

Konsekvensen af en af disse to typer af hændelser, dvs. udelukkelse eller udelukkelse plus inversion, som optræder i en bakterie ved indføring af et transposon i et gen, der specificerer et biosyntetisk enzym, er at dette transposon, som indeholder en auxotrof bakterie med antibiotisk resistens og 5 med en genetisk læsion, der fremkalder en enzym-defekt, der ganske vist er fuldstændig, men som i sjældne tilfælde kan undergå reversion, ændres til en bakterie med antibiotisk sensitivitet og med den samme enzym-defekt som før, bortset fra det intakte transposon og bortset fra, at det ikke længere kan korrigeres gennem sjældent forekommende reversion. Når transposon'et så-10 ledes indføres i et gen, der specificerer et enzym, som anvendes i en biosyn tese, der fører til en metabolit eller til metaboliter, der er vigtige for bakteriens multiplikation, men som ikke er tilgængelige i værtsorganismen, er slutresultatet en bakteriestamme med en fuldstændig og ikke-tilbagevendende mutation, der bevirker ikke-virulens.

15

Isolationen af auxotrofe mutanter kan lettes ved at anvende penicillin med henblik på at dræbe ikke-auxotrofe bakterier og derved forøge mængden af næringskrævende mutanter i populationen. Når først en mutant med den ønskede auxotrofe karakter er blevet isoleret, kan en stor population af mutan-20 ten underkastes screening for tilstedeværelse af eventuelle efterkommere, der er i stand til at vokse uden den relevante metabolit. På denne måde tester man sandsynligheden for reversion af mutanten. Denne test gøres strengere, hvis populationen først udsættes for ét eller flere mutagene midler, der kan inducere en række forskellige mutationsmæssige ændringer, eksem-25 pelvis basesubstitutioner, rammeforskydninger etc.. Hvis der desuden fore- ligger et rekombinationssystem, kan en mutant med et udelukket segment af et gen, der dækker stederne svarende til to eller flere punktmutanter, blive genkendt ved fraværet af vildtype-rekombinanter, når udelukkelsesmutanten krydses med hver af de pågældende punktmutanter. På denne måde kan 30 man sikre sig, at den undersøgte auxotrofe mutant med næsten fuldstændig sikkerhed er et resultat af en udelukkelse og ikke et resultat af en punktmuta- 14 DK 174969 B1 tion.

En generel transducerende phag, såsom phag P1, som kan adsorberes på bakterier af en række forskellige slægter (om nødvendigt efter passende ge-5 netisk modifikation af deres lipopolysaccharid-karakter for at tilvejebringe den nødvendige evne til at adsorbere phagen), kan benyttes til at transducere et ikke-funktionelt biosyntetisk gen, såsom et aro- eller pur-gen inaktiveret ved indføring af et transposon eller på anden måde, fra den oprindelige værtsorganisme til en pathogen bakteriestamme afen anden art eller slægt, hvori 10 det vil have en vis sandsynlighed for at kunne inkorporeres i chromosomet, hvor det erstatter det homologe vildtype-gen under dannelse af en auxotrof transduktant. Den hyppighed, hvormed en sådan udskiftning sker, vil imidlertid med en vis sandsynlighed blive reduceret kraftigt som følge af den ufuldstændige basesekvens-homologi imellem tilsvarende gener i bakterier af for-15 skellige slægter. Den DNA-formidlede tranformation eller bakteriekonjugation kan på lignende måde benyttes til at overføre et aro- eller pur-gen eller et andet biosyntetisk gen, som er inaktiveret ved transposon-indføring eller på anden måde, til bakterier afarter eller slægter, der afviger fra den oprindelige stamme, til opnåelse af auxotrofe bakterier, som nu er ikke-virulente på 20 grund af behovet for en metabolit, der ikke findes i hvirveldyr-værtsorganismen, og som er ude af stand til at vende tilbage til prototofi som følge af tilstedeværelsen af enten en udelukkelses-inversion eller en indføringsinversion.

25 Man kan også anvende konjugation, som involverer en konjugationskrydsning af en virulent stamme med en ikke-virulent, men "medgørlig" stamme, som indeholder det ønskede ikke-tilbagevendende muterede gen. Ved at anvende en Hfr- eller F+-stamme med en Fvirulent stamme kan en overføring af det muterede gen til den virulente stamme foregå under rekombina-30 tion, hvilket resulterer i en erstatning af det vilde gen med det muterede gen.

Derefter foretages en udvælgelse for den auxotrofe mutant som beskrevet i 15 DK 174969 B1 det foregående.

Man kan også anvende en transducerende phag, DNA-formidlet transformation og/eller konjugation til successivt at indføre to eller flere uafhængigt mu-5 terede gener i en enkelt værtsstamme, som skal anvendes som vaccine. Tilstedeværelsen af to helt uafhængige mutationer, der hver især har en ekstremt lav sandsynlighed for reversion, medfører en næsten absolut sikkerhed for, at vaccinestammen ikke kan blive virulent. I de følgende eksempler beskrives konstruktionen af to sådanne dobbeltmutationer (aroA', purA ), hvor-10 under man anvender den transducerende phag P22 til at overføre de uafhængige mutationer.

Ifølge opfindelsen fremstiller man vacciner ved at introducere en ikke-tilbagevendende mutation i mindst ét gen, idet hver mutation indeholder et 15 tilstrækkeligt antal baser i tandem til at sikre, at sandsynligheden for reversion er praktisk talt nul, og at sikre, at ingen af de muterede gener udtrykkes, hvilket vil sige, at generne er totalt ude af stand til at bestemme produktionen af et enzymatisk aktivt protein. Desuden vil hvert af de udvalgte gener være involveret i to biosynteseveje til produktion af metaboliter, som enten er sjæl-20 dent til stede i værtsorganismen eller fuldstændigt fraværende. Den udvalgte gen-type og det udvalgte antal gener vil resultere i en sandsynlighed for, at værtsorganismen for vaccinen vil tilvejebringe de nødvendige næringsstoffer til formering, som er tilnærmelsesvis nul. Disse fordringer har vist sig at bliv opfyldt af aroA- og purA-geneme af Salmonella, især typhimurium, dublin og 25 typhi, og derfor foretrækkes disse gener, selv om også andre gener som tidligere nævnt kan tjene som basis for den ikke-tilbagevendende mutation.

Når der er tale om transduktion, har transposon'et en markør, som muliggør en udvælgelse af den transducerede mikroorganisme. Hvis eksempelvis 30 transposon'et tilvejebringer resistens over for en biostat eller et biocid, f.eks. et antibiotikum, ved dyrkning af den transducerede bakterie i et næringsme- 16 DK 174969 B1 dium indeholdende det bioaktive middel, vil man udvælge for den transducerende stamme. Man kan derefter anvende andre teknikker som beskrevet i det følgende til at udvælge medlemmer af transduktant-stammen, som undergår en udskæring af hele transposon'et eller en del deraf, når dette 5 transposon medfører en del af genet, hvori det er blevet integreret, eller når det medfører en inversion af en del af genet.

Med henblik på at isolere den auxotrofe stamme (uanset om denne er frembragt ved tranduktion, mutagenese, transformation eller på anden måde) er 10 det ønskeligt at tilvejebringe et selektivt tryk på den behandlede virulente stamme for at forøge indholdet af den ønskede auxotrofe stamme. En anvendelig teknik består i at benytte et medikament, eksempelvis et penicillin, som kun er letalt over for bakterier, som formerer sig. Ved at anvende et næringsmedium, som ikke tilvejebringer ét eller flere af det metaboliske produk-15 ter, som kræves af den auxotrofe stamme som følge af den ovenfor introducerede mutation, vil man forhindre den auxotrofe stamme i at formere sig, mens den virulente forældrestamme vil formere sig og derfor blive dræbt af penicillinet. Normalt vil mindst ca. 99 % af bakterierne blive dræbt, men ikke alle 100 %, således at de overlevende ca. 0,05 til 1 % af de oprindelige bak-20 terier har en kraftigt forøget koncentration af den auxotrofe stamme. Man kan derefter dyrke de overlevende bakterier i et supplerende medium, som vil gøre det muligt for den auxotrofe stamme at formere sig, hvorefter man kan gentage den dræbende proces med penicillin, indtil man kan isolere den auxotrofe mutant fra en enkelt koloni og etablere et fuldstændigt fravær af den 25 virulente forældrestamme.

Den resulterende auxotrofe stamme vil være en ikke-virulent levende vaccine, som har den ønskede immunogenicitet således at forstå, at udelukkelsen ikke vil påvirke produktionen af de antigener, som udløser værtsorganismens 30 naturlige immun-respons. På samme tid vil udelukkelsen resultere i en ikke-virulent levende vaccine, som er ude af stand til at vokse i værtsorganismen og ude af stand til at vende tilbage til en virulent tilstand.

17 DK 174969 B1

To særligt værdifulde stammer, som havde aroA-udelukkelser, blev generelt fremstillet på følgende måde: En karakteriseret Salmonella-stamme blev ud-5 sat for en transducerende phag, som var dyrket på en anden Salmonellastamme, nærmere bestemt aroA554::Tn10 og man foretog en udvælgelse for forøget resistens over for tetracyclin. De tetracyclin-resistente tranduktanter, som var afhængige af aromatiske forbindelser, blev inkuberet påBochner-medium. Mutanter, som voksede godt på dette medium, blev derefter udtaget 10 og screenet for den manglende evne til tilbagevenden til uafhængighed af aromatiske forbindelser, hvilket varen indikation afen udelukkelses-mutation eller en udelukkelses-inversionsmutation i aroA. Tranduktanteme kan underkastes screening ved anvendelse af mus og en stamme, som er ikke-virulent, og som giver beskyttelse imod podning med en udvalgt virulent stamme. Af 15 bekvemmelighedsgrunde kan man indføre en markering, f.eks. i form af au-xotrofi, til frembringelse af et specifikt næringsmæssigt krav, som derefter muliggør en hurtig bestemmelse af, hvorvidt der har været tilbagevenden i de tilfælde, hvor værtsorganismen går i kombination med Salmonella på tidspunktet for en efterfølgende vaccination med en vaccine fremstillet ifølge op-20 findelsen. Eksemplerne beskriver også konstruktionen af aroA', purA‘-Salmonella-stammer.

For at tilvejebringe antigener af andre arter end den ikke-virulente værtsorganisme kan man introducere flere gener, der koder for de ønskede antige-25 ner, i værtsorganismen i form af udtrykkelseskassetter, eller man kan introducere gener, der koder for enzymer til syntese af de ønskede antigener.

Ved "udtrykkelseskassette" forstås de regioner, der påbegynder og afslutter transkriptionen og translationen, og som afgrænser strukturgenet af interesse sammen med strukturgenet under regulerende kontrol af sådanne regioner, 30 dvs. med korrekt afstand og i henholdsvis 5'- og 3'-position i forhold til strukturgenet. Når bakterie- eller bakteriophag-strukturgener er involveret, vil de 18 DK 174969 B1 naturlige regulerende regioner eller de regulerende regioner af vildtypen sædvanligvis, men ikke altid, være tilstrækkelige. Når der er tale om strukturgener fra eukaryoter (herunder virus) og til tider også prokaryoter, vil strukturgenet blive knyttet til regulerende regioner, som genkendes af den bakte-5 helle værtsorganisme.

"Udtrykkelseskassetten" kan være en konstruktion, eller den kan helt eller delvist være et naturligt forekommende plasmid, såsom det plasmid, der koder for enzymerne til produktion af den O-specifikke del af LPS i Shigella 10 sonnei. Hvis udtrykkelseskassetten er en konstruktion, kan den være knyttet til et replikationssystem til episomal opretholdelse, eller den kan introduceres i bakterien under rekombinations- og integrationsbetingelser. Konstruktionen vil normalt være knyttet til en markør, eksempelvis et strukturgen og regulerende regioner, der tilvejebringer antibiotisk resistens eller komplementering i 15 en auxotrof værtsorganisme, således at udtrykkelsesvektoren sædvanligvis omfatter et replikationssystem, eksempelvis et plasmid eller et virus, én eller flere markører og "udtrykkelseskassetten" af et strukturgen af interesse.

Strukturgener af interesse kan komme fra forskellige kilder, såsom bakterier, 20 virus, svampe, protozoer, metazoan-parasitter eller lignende. Strukturgenerne kan indkode kappe-proteiner, capsid-proteiner, overfladeproteiner eller toxiner, såsom exotoxiner eller enterotoxiner, eller generne af interesse kan specificere proteiner, enzymer eller andre proteiner, der er nødvendige for syntesen af et polysaccharid- eller oligosaccharid-antigen eller til modifikation 25 af et saccharid, der indeholder et antigen, såsom LPS, af værtsbakteriestammen, eller til syntese af et polypeptid-antigen, såsom kapsel-antigenet af Bacillus anthrasis. Disse gener kan isoleres på konventionel måde under anvendelse af prober, hvori mindst en partiel aminosyresekvens eller nucleinsy-resekvens er kendt, idet man anvender "Western blot"-teknik til påvisning af 30 udtrykkeisen, og i det man anvender Agt11 til udtrykkelse af de sammensatte proteiner til opnåelse af probér, identifikation af antigenet ved omsætning af 19 DK 174969 B1 de transkonjugerende bakteriekolonier med antistof og påvisning af kompleksdannelsen, eksempelvis agglutination etc.

Specifikke gener af interesse omfatter de gener, som specificerer de varme-5 labile og varmestabile enterotoxiner af enterotoxigene E. Coli- eller Vibrio cholerae-stammer, HBsAg, overflade-, kappe- eller capsid-proteiner af T. cruzi, B. pertussis, Streptococci, f. eks. S. pneumoniae, Haemophilus, f. eks.

H. influenzae, Neisseria, f. eks. N. meningitidis, Pseudomonas, f. eks. P. aeruginosa, Pasteurella, Yersinia, Chlamydia, Rickettsiae, adenovirus, astrovi-10 rus, arenavirus, coronavirus, herpes virus, myxovirus, paramyxovirus, papo-vavirus, parvovirus, picomavirus, poxvirus, reovirus, retrovirus, rhabdovirus, rotavirus, togavirus etc; og gener, der specificerer de enzymer, som er nødvendige til syntese af polysaccharid-antigener, eksempelvis Meningococcus-kapsel-polysaccharider, eller til modifikation af oligo- eller polysaccharid-15 antigenet af bakteriestammen, der tjener som værtsorganisme.

Konstruktionen eller vektoren kan introduceres i værtsstammen på en hvilken som helst bekvem måde, eksempelvis ved konjugation, f. eks. med F+- eller hfr-stammén, transformation, eksempelvis med Ca-precipiteret DNA, trans-20 fektion, transduktion etc. De modificerede værtsorganismer kan derefter udvælges på et selektivt medium under anvendelse af markørens fænotype.

De omhandlede vacciner kan anvendes i en lang række hvirveldyr. Navnlig finder vaccinerne anvendelse på pattedyr, herunder mennesker og husdyr.

25 Til husdyrene hører kvæg, får, svin, heste, geder, høns, harer og kaniner samt andre dyr, som holdes i fangenskab, eller som kan virke som vektor for en sygdom, der angriber husdyr.

Den måde, hvorved vaccinen indgives, kan varieres inden for vide grænser, 30 idet man kan anvende en hvilken som helst konventionel metode, der kan benyttes på levende vaccine. Blandt disse metoder kan nævnes oral indgi- 20 DK 174969 B1 velse, enten på en fast fysiologisk acceptabel base eller i en fysiologisk acceptabel dispersion, og der kan også være tale om parenteral indgivelse, indsprøjtning eller lignende. Den indgivne dosis af vaccinen (antallet af bakterier eller antallet af indgivelser) vil afhænge af den valgte indgivelsesvej og 5 vil endvidere variere i afhængighed af den dyreart, der skal beskyttes. For mus, der vejer 15 - 20 g, synes en enkelt dosis på ca. 3 x 105 levende bakterier af en ikke-tilbagevendende aro'-vaccinestamme af S. typhimurium, som indgives i et volumen på 0,2 ml i saltvand ved intraperitoneal injektion, at være både sikker og effektiv, hvilket kan bedømmes ud fra resultatet af et sene- 10 re parenteralt angreb med virulent S. typhimurium. Man har også prøvet at indgive mus ca. 3 x 107 levende bakterier af den samme stamme i småstykker brød fugtet med 0,1 ml af den fugtige kultur, idet musene i de seneste 6 timer ikke havde fået anden føde. Denne dosis viste sig at være harmløs, og den viste sig også at forøges immun-beskyttelsen. Observationer på vaccine- 15 rede kalve antyder, at en indgivelse af levende bakterier af den samme stamme, enten ved intramuskulær injektion eller via foderet, i doser, der er flere tusind gange større end doserne anvendt på mus, er sikker og kan være hensigtsmæssig. Man kan foretage en eller flere yderligere indgivelser som hjælpedoser, sædvanligvis med passende intervaller, såsom to eller tre uger.

20

De levende vacciner kan formuleres på en række forskellige måder, idet formuleringen fortrinsvis skal sikre en forøget immunogen-respons. Den levende vaccine kan indgives på et stykke sukker eller brød, i puffer-holdigt saltvand, i en fysiologisk acceptabel olie eller på lignende måde.

25

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

Eksempel 1 Konstruktion af aro'-stammer 30 En levende vaccine afledt af Salmonelle typhimurium blev fremstillet på følgende måde: som forældrestamme anvendtes en muse-virulent S. typhimu- 21 DK 174969 B1 rium SL4522, som er en efterkommer af en "vild" S. typhimurium-stamme M7471 af S. typhimurium-undergruppen, som benævnes FIRN (Morgenroth og Duguid, Gent. Res. (1968), 11:151-169). Denne undergruppe er defineret ved sin manglende evne til at fermentere rhamnose eller inositol samt sin 5 manglende evne til at producere hår eller "frynser" af type 1. Stammen M7471 blev givet en colicin-faktor eller et plasmid, Co1 E1-K30, ved konjugation, hvorefter stammen, ved gentagne eksponeringer med et mutagen, blev gjort maltose-negativ, leucin-krævende og cystin-krævende. Derpå blev stammen gjort histidin-krævende ved at transducere i mutationen hisC527 10 (en amber-mutation). Den genetiske sammensætning af udgangsstammen, SL4522, er således S. typhimurium M7471 (Co1E1-K30), malB479, leu-1051, cysl1173 hisC527 (MacPhee et al., J. Gen. Microbiol. (1975) 87:1-10). Denne stamme, som opretholder sin muse-virulens, blev re-isoleret fra en mus, som var død af en lille mængde podestof, og re-isolatet blev betegnet SL3201.

15 S. typhimurium, som indeholderet transposon til fremkaldelse aftetracyclin-resistens, og som er tilstede i genet aroA, betegnet stamme TT1455 og med den genetiske konstitution S. typhimurium LT2, aroA554::Tn10, blev anvendt som kilde fordet transposon, som anvendtes ved præparationen. Denne 20 stamme er udviklet af (og kan fås fra) dr. John Roth, Department of Biology, University of Utah, Salt Lake City, og den er deponeret hos ATCC under nummeret 33275. Indføringsstedet i transposon Tn10 ligger i genet aroA, som er lokaliseret i position 19 på bindingsdiagrammet, og som specificerer enzymet 3-enolpyruvylshikimat-5-phosphat-synthetase. Stammen TT 1455 25 kan ikke vokse på kemisk definerede medier, med mindre den forsynes med de essentielle metaboliter afledt af chorisminsyre, dvs. de aromatiske aminosyrer tyrosin, phenylalanin og tryptophan samt to mindre betydende aromatiske metaboliter, nemlig p-aminobenzoeat, der er nødvendig som præcursor for folinsyre, og 2,3-dihydroxybenzoesyre, der tjener som præcursor for den 30 med jern chelat-dannende forbindelse enterobactin (enterochelin).

22 DK 174969 B1

Til transduktionen anvendtes en kraftigt transducerende mutant, nemlig HT105/1 (Schmiger, Mol. Gen. Genet. (1972) 119:75-88) af den generelt transducerende phag P22, som har en yderligere mutation benævnt int, der hindrer lysogeniseringen og letter fremstillingen af større phag-kulturer. I 5 overensstemmelse med konventionelle teknikker blev denne phag dyrket på stammen TT1455. Det resulterende lysat blev, efter fjernelse af alle bakterier ved centrifugering, yderligere behandlet ved membranfiltrering. En plade af nærende agar (Oxoid blodagar-base nr. 2, kode CM55), suppleret med tetra-cyclin (25/ug/ml), blev podet under strømning med en flydende kultur af reci-10 pient-stammen SL3201. Dråber af phag-lysatet med et volumen på omkring 0,01 ml blev overført til pladerne, som derefter blev inkuberet ved 37 -C i omkring 18 timer. Efter inkubationen viste hvert dråbeareal mange store kolonier (med en diameter på omkring 2 mm) af tetracyclin-resistente "komplette" transduktanter (sammen med et større antal meget små kolonier af døde 15 transduktanter), hvorimod agaren ikke udviste nogen vækst imellem dråberne. Der opnåedes to tetracyclin-resistente transduktant-kloner, som blev re-isoleret fra enkeltkolonier og testet for at bekræfte, at de var fri for phag P22, og de blev derefter betegnet som stamme SL3217 og stamme SL3218. De udviste den forventede fænotype, idet de til deres vækst krævede tilførsel af 20 tyrosin, phenylalanin, tryptophan, p-aminobenzoeat og 2,3-dihydroxy- benzoeat. Stammerne SL3217 og SL3218 udviste det forventede tab af muse-virulens, forudsat at de var dyrket i nærværelse af tetracyclin, til forebyggelse af en accumulering af revertanter, der var uafhængige af aromatiske forbindelser.

25

Isolationen af tetracyclin-sensitive varianter lettes af det faktum, at tetracyclin i passende koncentrationer forebygger en multiplikation af tetracyclin-sensitive bakterier, men undlader at dræbe dem, hvorimod penicillin dræber bakterier under formering, men skåner de bakterier, der ikke formerer sig.

30 Man benyttede penicillin-udvælgelsesteknikken til at isolere tetracyclin- sensitive varianter af aroA::Tn10 stammen SL3218. Stammen blev først dyr- 23 DK 174969 B1 ket i væske uden tetracyclin til en koncentration på omkring 9x10® cfu/ml.

Denne kultur blev derefter fortyndet 1:10 i dyrkningsvæske indeholdende tetracyclin (5/ug/ml), hvorefter den fortyndede kultur blev inkuberet ved 37 -C under beluftning i 75 minutter. Der tilsattes 2,5/ug/ml ampicillin, og man fort-5 satte med at inkubere under rystning i 290 minutter. Derefter blev kulturen holdt ved stuetemperatur uden rystning natten over. De overlevende bakterier blev vasket på et membranfilter til fjernelse af ampicillin, hvorefter de blev udsået på et indikatormedium, der indholdt farvestoffer og en meget lav koncentration af tetracyclin. På dette medium producerer tetracyclin-sensitive 10 bakterier små mørke kolonier, hvorimod de tetracyclin-resistente bakterier producerer store lyse kolonier. Behandlingen med ampicillin reducerede antallet af levedygtige bakterier med omkring 10'5. Seks ud af 386 overlevende kolonier, som blev testet, viste sig at være tetracyclin-sensitive. To sådanne isolater, betegnet SL3235 og SL3236, viste sig at minde om deres forældre-15 stamme SL3218 med hensyn til den næringsmæssige karakter, men at afvige fra forældrestammen, ikke blot ved tetracyclin-sensitiviteten, men også ved mangelen på produktion af revertanter, der var uafhængige af aromatiske forbindelser, i forsøg, som skulle have vist en reversion med en frekvens på 1:1011/bakterie/generation. En af disse stammer, SI3235, udviste, når den 20 anvendtes som levende vaccine på mus og kalve, ingen reversion til virulens eller uafhængighed af aromatiske forbindelser. En anden ikke-tilbagevendende aro‘-vaccinestamme blev fremstillet ud fra S2357/65, en Salmonella typhimurium-stamme, der fra andre eksperimenter vides at være særdeles virulent for kalve. Stammen S2357/65 er prototrofisk: for at opnåen 25 markeringskarakter blev stammen fremstillet ved først at transducere hisD8557::Tn10 (fænotypisk med et histidin-behov, der ikke kan tilfredsstilles af histidinol, og tetracyclon-resistent), og derefter blev stammen ved en anden transduktion Omdannet til hisD+ hisG46 (fænotypisk med behov for histi-din eller histidinol og tetracyclin-sensitiv). Dette derivat, SL1323, viste sig at 30 fremkalde en dødelig infektion ved indgivelse til en kalv. Stammen mærket SL1344 blev derefter omdannet til aroA544::Tn10 ved transduktion fra 24 DK 174969 B1 TT1455 som beskrevet ovenfor. Den således opnåede hisG46 aroA544::Tn10 stamme blev betegnet SL1346. En tetracyclin-sensitiv mutant, der stadig krævede aromatiske forbindelser, men som nu var ude af stand til at vende tilbage til aromatisk uafhængighed, blev herefter isoleret fra 5 SL1346 ved en ny metode, nærmere bestemt udvælgelse på næringsagar indeholdende chlortetracyclin (50/ug/ml), der var tilsat før autoklaveringen, og fusarinsyre (12/ug/ml), der var tilsat efter autoklaveringen. Dette medium bevirker en forhindring (eller i det mindste en kraftig forsinkelse) afvæksten af tetracyclin-resistente bakterier, men tillader en god vækst af tetracyclin-10 sensitive bakterier. Både denne stamme og to aroA::Tn10 stammer, SL3217 og SL3218, dyrket med tetracyclin til forebyggelse afen akkumulering af tetracyclin-sensitiv aro+ (og derfor virulent og tilbagevendende) har vist sig at være effektive som levende vaccine, når de indgives til mus ad intraperito-neal vej.

15 (i) Eksperimenter med stammerne SL3217 og SL3218: CF1-mus blev indgivet levende vaccine i form af ca. 2 x 105bakterier intraperitonealt. To måneder senere blev de udsat for angreb af 2 x 106 bakterier (dvs. mere end 20.000 x LD50) af den virulente S. typhimurium-stamme SL3201. Angrebet 20 foregik intraperitonealt. Der observeredes ingen dødsfald i løbet af to måneders observation, (ii) CBA/N x DBA/LN F1 hunmus blev indgivet 106 eller 105 levende vacciner af stammen SL3235 intraperitonealt. Fem uger senere blev musene angrebet intraperitonealt med 106 bakterier (ca. 100 x LD50) af den virulente S. typhimurium-stamme TML. Der observeredes ingen dødsfald i 25 løbet af 15 dages observation. I andre eksperimenter har den stabile aro*-vaccinestamme SL3235 vist sig ikke at fremkalde dødsfald (eller nogen andre tydelige sygdomsvirkninger) ved intraperitoneal injektion, selv ikke ved injektion i mus, som var exceptionelt modtagelige for Salmonella typhimu-rium-infektioner, og dette skyldtes enten en forudgående intravenøs injektion 30 af silica-makropartikler (til destruktion af den phagocytiske funktion af ma-krophageme), eller også var der tale om mus, hvis exceptionelle følsomhed 25 DK 174969 B1 skyldtes en genetisk defekt med hensyn til evnen til at respondere over for lipopolysaccharid, dvs. stammen C3H/Heg. Et ikke-tilbagevendende derivat med aromatisk afhængighed, som opnåedes på denne måde og fik nummeret SL3261, har vist sig at være ikke-virulent over for mus og kalve ved pa-5 renteral eller oral indgivelse. Desuden har et derivat af typen aroA::Tn10, som på lignende måde ved transduktion er afledt af en kalve-virulent stamme af den okse-pathogene art Salmonella dublin, vist sig at være ikke-virulent for mus, og aroA::Tn1 O-derivater, som mentes at være ikke-virulente, er blevet fremstillet ved transduktion fra flere for nyligt isolerede stammer af den hu-10 mane pathogene Salmonella typhi.

Den levende aro'-vaccine S. typhimurium SL1479 blev fremstillet på følgende måde: forældrestammen var S. typhimurium UCD108-11 (dr. Bradford Smith, University of California i Davis). Et re-isolat af stammen UCD108-11, som 15 havde passeret igennem en kalv, blev tildelt stamnummeret SL1420 og karakteriseret som værende uden næringsmæssige krav, resistent over for forskellige antibiotika, herunder tetracyclin, og glat men resistent over for de O-specifikke generelle transducerende phager, herunder P22. Stammen SL1420 blev udsat for en transducerende phag dyrket på en aroA554:::Tn10 20 stamme af S. typhimurium, og man foretog en udvælgelse for forøget resistens over for tetracyclin ved udsåning på et nærende agar-medium med tetracyclin (50 mg/ml). Repræsentative transduktanter med forøget tetra-cyclin-resistens, som var afhængige af aromatiske forbindelser og uændrede med hensyn til phag-sensitivitetsmønsteret, blev udvalgt, og en af disse ud-25 valgte transduktanter blev betegnet som stamme SL1421. Forældrestammen voksede godt på Bochner medium (Bochner et al. (1980) J. Bact. 143:926-933), hvilket antydede, at tetracyclin-resistensen bestemtes af en anden mekanisme end den resistens, som frembragtes af Tn10. Stammen SL1421 voksede dårligt på Bochner-medium, hvilket gjorde det muligt at udvælge 30 kolonier, der udviklede sig på plader af Bochner-medium suppleret med di-hydrobenzoesyre. En sådan variant viste sig at være afhængig af aromatiske 26 DK 174969 B1 forbindelser og uændret med hensyn til phag-mønster, og den frembragte ikke revertanter, der var afhængige af aromatiske forbindelser, med påviselig frekvens (et udbytte af Aro* på nul i en endelig population på omkring 9 x 1010 bakterier på plader af et medium med et vækst-5 begrænsende indhold af tryptophan). Denne mutant, som blev betegnet SL1452, blev testet for virulens. Fem BALB/c-mus (af hankøn, alder omkring 18 uger) modtog hver omkring 3,5 x 106 levende bakterier af stammen SL1452 ved intraperitoneal (i.p.) injektion.

10 De anvendte mus var fra en koloni af den indavlede linie BALB/c, født ved kejsersnit og opretholdt med en veldefineret tarmflora. Musene hidrørte fra the Department of Radiology, Stanford University School of Medicine. Musene fra denne linie har en velkendt høj modtagelighed for S. typhimurium-infektioner og en kendt manglende evne til at kunne beskyttes imod en sådan 15 infektion gennem immunisering med varmedræbt vaccine (Robson og Vas (1972) J. Infect. Dis. 126:378-386). Alle musene overlevede dag 50 og så raske ud gennem hele perioden.

For at teste den immuniserende evne hos stammen SL1452 blev de fem 20 mus, som alle havde overlevet den intraperitoneale injektion, syv dage efter vaccinationen angrebet med en intraperitoneal injektion af omkring 5 x 105 bakterier af stammen SL1420 (virulent forældrestamme). Fire kontrolmus, der ikke var vaccineret, døde på henholdsvis dag 4, 4, 4 og 5 efter angrebet.

En af de fem vaccinerede mus døde af S. typhimurium-infektionen, mens de 25 andre fire vaccinerede mus overlevede og virkede raske indtil dag 14 efter angrebet.

En genetisk "markør"-karakter blev derefter introduceret i vaccinestammen SL1452 for at muliggøre identifikation. Stammen SL1452 blev behandlet med 30 en transducerende phag dyrket på en S. typhimurium-stamme, som var bærer af hisD8557::Tn10, og man foretog en udvælgelse for forøget tetracyclin- 27 DK 174969 B1 resistens. Repræsentative transduktanter viste sig at være af den forventede næringsmæssige karakter, nemlig Aro' HisD' (dvs. et behov for histidin, der ikke kan tilfredsstilles af histidinol). Den udvalgte transduktant blev betegnet stamme SL1474. Denne stamme blev eksponeret for en transducerende 5 phag dyrket påen hisC527 linie af S. typhimurium, og man foretog en udvælgelse på et defineret medium med aromatiske forbindelser og med histidinol som histidin-kilde. Nogle af transduktanteme var stadig afhængige af aromatiske forbindelser og behøvede histidin, men de var i stand til at benytte histidinol i stedet for histidin (dvs. af den næringsmæssige karakter, som måtte 10 forventes ved erstatning af hisD: :Tn10 hisC+ fra recipienten med hisD+hisC527 fra donoren). En sådan transduktant med nummeret SL1479, der havde konstitutionen UCD108-111 aroA554::Tn10/DI hisC527, blev anvendt til forsøg med kalve (Dl-udelukkelses-inversions-tilfælde).

15 Ti kalve, som var to uger gamle, blev indgivet den levende S. typhimurium-vaccinestamme SL1479 ved intramuskulær (i.m.) injektion, sædvanligvis omkring 1,5 x 109levende bakterier som den første vaccination. Ingen af kalvene tabte appetitten eller blev alvorligt syge, og kun en enkelt udviklede diarré.

Ingen af kalvene gav i afføringen anledning til en positiv dyrkning af Salmo-20 nella. Tre kalve, der var to uger gamle, blev indgivet omkring 1,5 x 1011 levende bakterier af stammen SL1479 igennem munden som deres første vaccination. Ingen af dem tabte appetitten, men den ene udviklede diarré. Alle tre kalve gav som forventet anledning til positive kulturer i deres afføring. Reaktionerne på endnu en dosis levende vaccine, indgivet ad intramuskulær 25 eller oral vej, var ikke mere alvorlige end reaktionerne på den første dosis.

For at teste den beskyttelse, som tilvejebringes ved vaccination, blev grupper af fem uger gamle kalve, som enten ikke var vaccineret (kontrol) eller vaccineret to gange med levende S. typhimurium SL1479 ved intramuskulær eller 30 oral indgivelse, angrebet ved oral indgivelse af 1,5 x 1011 levende bakterier af en kalve-virulent S. typhimurium-stamme, i de fleste tilfælde stammen 28 DK 174969 B1 UCD108-111, idet nogle af kalvene fik indgivet stammen SL1323.

Alle de 16 angrebne kontrolkalve udviste anorexi og depression. Femten af dyrene havde diarré, og 14 døde. Ud af 7 kalve, som havde fået to doser le-5 vende vaccine intramuskulært, udviste de tre diarré efter sygdomsangrebet, mens to fik anorexi og depression, og en enkelt døde. Forskellene imellem kontrolkalvene og de kalve, der var vaccineret intramuskulært, med hensyn til dødsfald (14 ud af 16 imod 1 ud af 7) og med hensyn til anorexi og depression (16 ud af 16 imod 2 ud af 7) er statistisk signifikante (idet sandsynligheden 10 p er mindre end 0,001 for hver enkelt sammenligning). Blandt tre kalve, som havde fået to doser levende SL1479-vaccine ved oral indgivelse, udviste de to diarré efter sygdomsangrebet, mens den ene udviste anorexi og depression. Ingen af kalvene døde. Forskellene imellem kontnolkalvene og de oralt vaccinerede kalve med hensyn til dødsfald (14 ud af 16 imod 0 ud af 3) og 15 med hensyn til anorexi og depression (16 ud af 16 imod 1 ud af 3) er statistisk signifikante, idet p er mindre end 0,01 for hver enkelt sammenligning.

Udviklingen af S. dublin-stammen SL1438 fulgte i det væsentlige den procedure, som er beskrevet for S. typhimurium ovenfor. Udgangsstammen S.

20 dublin S4454 (dr. Clifford Wray, Central Veterinary Laboratory of the British Ministry of Agriculture, Weybridge, England) viste sig at være af den forventede næringsmæssige karakter (dvs. med en ufuldstændig afhængighed af nikotinsyre og ellers ingen afhængighed), og den var glat, men resistent eller kun svagt sensitiv over for de generelle transducerende O-specifikke phager 25 P22, P22h, KB1 og A3. Endvidere var den sensitiv over for alle de testede antibiotika, herunder tetracyclin. Stammen fik nummeret SL1363 og viste sig at være virulent ved intraperitoneal injektion i en mængde på 4 x 104 levende bakterier i BALB/c-mus.

30 Stammen SL1363 blev udsat for transducerende phager dyrket på S. typhimurium TT47 med genotypen hisD8557::Tn10, og de tetracyclin-resistente transduktanter blev udvalgt. En transduktant af den HisD'-nærende 29 DK 174969 B1 transduktanter blev udvalgt. En transduktant af den HisD-nærende fænotype og med uændret phag-sensitivitetsmønster blev udvalgt og fik betegnelsen SL1365. Den blev eksponeret for phager dyrket på en S. typhimurium-stamme med genotype hisG46 hisD+. Transduktanteme blev udvalgt på et 5 medium med histidinol som den eneste histidin-kilde og en udvalgt transduktant med uændret phag-mønster, som enten krævede histidin eller histidinol (dvs. hisD+ hisG46), og som fik betegnelsen SL1367. Når tre BALB/c-mus, som forinden havde undværet foder i adskillige timer, blev indgivet omkring 3 x 107 bakterier af stammen SL1367 på en terning brød, døde alle tre mus 10 omkring 7 dage senere. Når den samme stamme blev indgivet til en kalv, bevirkede den meget hurtigt en dødelig infektion, og et re-isolat viste sig at være uændret med hensyn til ernærings-fænotype. Stammen SL1372 blev derefter behandlet med phager dyrket på en aroA554::Tn10 stamme af S. typhimurium, og man foretog en udvælgelse for tetracyclin-resistens. En ud-15 valgt transduktant, som krævede aromatiske suppleringer såvel som histidin og nikotinsyre, og som havde et uændret phag-mønster, blev betegnet SL1437. Tetracyclin-sensitive mutanter af stammen SL1437 blev udvalgt ved inkubation på plader bestående af Bochner-medium suppleret med 2,3-dihydroxybenzoesyre, hvilket muliggjorde en syntese af enterobactin. En te-20 tracyclin-sensitiv, men stadig Aro', variant blev udvalgt og fik nummeret SL1438, og den viste sig ikke at producere revertanter, der var uafhængige af aromatiske forbindelser, med påviselig hyppighed.

Stammen SL1438 blev indgivet intraperitonealt i forskellige mængder til tre 25 grupper på hver fem mus, idet stammen hidrørte fra en ikke-rystet væskekultur, der havde stået natten over ved 37 -C. Ingen af de vaccinerede mus udviste nogen synlige sygdomstegn, heller ikke efter indgivelse af 3 x 106 bakterier, som var den største indgivne dosis. For at teste den immuniserende evne hos stammen SL1438 blev musene fra det ovenfor beskrevne eksperi-30 ment sammen med en kontrolgruppe på fem ikke-vaccinerede mus angrebet 30 dage efter vaccinationen ved intraperitoneal indsprøjtning af 3 x 105 bak- 30 DK 174969 B1 terier af stammen SL1372 (dvs. den virulente S. dublin-stamme gjort hi$G46 og re-isoleret fra en kalv inficeret gennem foderet). Resultaterne, som blev samlet efter 93 dages forløb efter angrebet, viste, at de fem kontroldyr var døde pé dag 4, 4, 5, 5 og 6. Blandt de dyr, der var vaccineret på niveauet 3 x 5 104, var 3 ud af 5 døde på dagene 5, 8 og 8, mens de sidste 2 blev syge for senere at komme sig. Blandt de dyr, der var vaccineret på et niveau svarende til 3 x 105, døde de to på dagene 7 og 13. De resterende tre så syge ud, men kom sig senere. Blandt de dyr, der blev vaccineret på et niveau svarende til 3 x 106 levende bakterier af stammen SL1438, var der ingen der døde, 10 og de så alle fem raske ud under hele forsøget. På niveauet svarende til 3 x 106 levende bakterier af stammen SL1438 viste det sig, at en enkelt intraperi-toneal dosis kunne beskytte den ellers modtagelige stamme af BALB/c-mus.

Derefter anvendtes fem uger gamle kalve, som enten var vaccinerede eller 15 ikke-vaccinerede (som kontrol), for at teste tilstrækkeligheden af S. dublin-stammen SL1438 som levende vaccine. Til vaccinationen anvendtes to in-tramuskulære doser på hver 1,5 x 109 bakterier af den pågældende stamme.

Alle kalvene blev derefter angrebet ved indgivelse af 1,5 x 101° bakterier af en kalve-virulent S. dublin-stamme benævnte SL1367. Alle tre kontrolkalve 20 døde, hvorimod ingen af de fem vaccinerede kalve døde.

Eksempel 2 Konstruktion af aro' pur-stammer

Transduktionsprocedure 25

Hvert af trinene i transduktionsproceduren blev gennemført ved anvendelse af et "højt transducerende" ikke-lysogeniserende derivat af phag P22 (P22 HT105/1 int). Denne phag blev opformeret ved standardmetoder på den S. typhimurium-stamme, der benyttedes som donor. Det anvendte lysat var bak-30 teriologisk sterilt og havde et indhold af den P22-sensitive indikatorstamme S. typhimurium SL1027 på 3 x 109 i det mindste pletdannende enheder pr.

31 DK 174969 B1 ml. Transduktanteme blev opnået ved den såkaldte "drop-on-lawn"-procedure, hvor plader bestående af et medium, som er selektivt for trans-duktantens fænotype, blev podet ved overstrømning med en væskekultur af recipient-stammen. Den overskydende væske blev frasuget med en pipette, 5 hvorefter agarens overflade fik lov at tørre ved fordampning. Dråber af phag-lysat, rent og i passende fortynding, blev derefter påført og fik lov at tørre, hvorefter man foretog en inkubation ved 37 °C.

Tetracyclin-resistente transduktanter blev udvalgt påOxoid" blodagar-base, 10 kode CM55, suppleret med 25/ug/ml tetracyclin. For recipient-stammer, som var mangelfulde med hensyn til aromatisk biosyntese, blev dette medium suppleret med 2,3-dihydroxybenzoesyre (DBA) for at muliggøre en syntese af interobactin, som kræves til at opfange trivalent jem. Til udvælgelse af transduktanter med ændret emæringskarakter benyttedes et simpelt veldefi-15 neret medium suppleret med tryptophan og cystin (som krævet af S. typhi af vildtypen).

Transduktionsplademe blev inspiceret efter 1,2, 3 og 4 dages inkubation, og de kolonier, der viste sig i dråbearealerne, blev opsamlet og renset ved ud-20 strygning og udvælgelse af adskilte kolonier på det samme medium, hvorpå udvælgelsen blev foretaget. Generelt blev transduktant-kolonierne udviklet senere og i væsentligt ringere antal, eksempelvis ved en faktor 103, i krydsninger, hvori recipienten var S. typhi, sammenlignet med de krydsninger, hvori recipienten var S. typhimurium ligesom donoren. Dette var sandsynlig-25 vis et resultat af en ufuldstændig genetisk homolog i imellem generne i S. typhimurium-donoren og de tilsvarende gener i S. typhi-recipienten, hvilket bevirker en kraftig reduktion i antallet af overkrydsninger og dermed en kraftig reduktion af integrationen af donor-gener i recipientens chromosomer.

Rensede transduktant-kloner blev testet for at sikre, at de var S. typhi og ikke 30 luft-kontaminanter, og for at bekræfte, at de var af den efterstræbte fænotype.

32 DK 174969 B1

Introduktion af aroA-udelukkelse

En introduktion af aroA-udelukkelsen blev fremkaldt ved to transduktionstrin.

5 I det første trin blev forældrestammen (CDC80-10) behandlet med phag-lysat G2077, som er phag P22HT 105/1 int dyrket på S. typhimurium-stammen TT472, der er aroA (serC) 1121 :Tn10. De ønskede transduktanter måtte forventes at være tetracyclin-resistente og auxotrofe, idet de krævede såvel aromatiske metaboliter (p.g.a. tabet af funktionen af genet aroA) som serin 10 plus pyridoxin (p.g.a. tabet af funktionen af genet serC) som et resultat af indføringen af transposon’et Tn10 i chromosomet i den promotor-proximale del af serC, aroA-operon’et. Efter rensning blev de tetracyclin-resistente transduktanter testet for emæringskarakter med henblik på at konstatere, hvor vidt de havde fået opfyldt de forventede behov. CDC10-80-15 forældrestammens ara* serC* transduktant blev betegnet 511Ty.

51 OTy, 511Ty-transduktanterne blev benyttet som recipient i en anden trans-duktion, hvor man anvendte phag-lysat G2013 dyrket på S. typhimurium SL5253, som har en udelukkelse DEL407, der strækker sig fra det indre af 20 transposon'et Tn10 indført i aroA554:Tn10 "mod højre", således at der sker en fjernelse af tetracyclin-resistens-genet i transposon’et, et at dettes to IS 10-elementer og den hosliggende del af genet aroA, som omfatter stederne for aro-punktmutationeme 1,89,102, 55,46 og 30, der alle kan rekombi-nere med hinanden til dannelse af aro+ og derved definere forskellige steder i 25 genet aroA. De ønskede transduktanter måtte forventes at have en udelukkelse af en del af aroA, men at opretholde en normal serC-funktion og derfor kræve aromatiske metaboliter, men ikke serin eller pyridoxin. De fundne transduktant-kloner, som stadig behøvede aromatiske metaboliter, men som var tetracyclin-sensitive og uden behov for serin eller pyridoxin, måtte formo-30 des at være opstået ved udskiftning af aroA(serC)::Tn10 i recipienten med en serC4 aroA-udelukkelse i donoren. Transduktanten afledt af 511Ty blev be- 33 DK 174969 B1 tegnet 515Ty.

Indføring af et histidin-behov som markør 5 Den første donorstamme, som anvendtes, var stammen SL5173, som er S. typhimurium hisD8557::Tn10, som har Tn10 indført i genet hisD, og som bevirker en manglende evne til at fremkalde det sidste trin i histidin-biosyntesen samt et behov for histidin, som ikke kan tilfredsstilles ved at tilvejebringe histidinol. Lysatet G2023 fra phager dyrket på stammen SL5173 blev påført 10 S. typhi-stammen 515Ty, som havde den ovenfor beskrevne aroA- udelukkelse. Man udvalgte tetracyclin-resistente transduktanter, og efter rensning foretog man en test til bestemmelse af den ernæringsmæssige karakter. En klon med et histidin-behov, der ikke kunne tilfredsstilles ved tilvejebringelse af histidinol, blev udvalgt og fik betegnelsen 521 Ty.

15

Transduktanten blev derefter behandlet med phag-lysatet G1715 dyrket på S. typhimurium-stammen hisG46, der havde en mutation i et gen af his (histi-din-biosyntese) operon'et, der var forskellig fra hisD, hvilket frembragte et behov for histidin, som kan tilfredsstilles ved at tilføre histidinol. Man foretog 20 en udvælgelse på et veldefineret medium suppleret med cystin og aromatiske metaboliter sammen med histidinol (100/ug/ml). En transduktant, som kræver aromatiske metaboliter såvel som enten histidin eller histidinol, fik betegnelsen 523Ty.

25 Introduktion af purA-udelukkelsen

Stammerne SL5475 og SL5505 er begge S. typhimurium LT2 purA155_ zjb-908::Tn10 derivater af S. typhimurium-stammen LT2, der har en udelukkelsesmutation (purA155) inden for genet purA, og som har et transposon Tn10 30 indført i et "stille sted” (zbj-908), der er tæt nok på purA til at tillade ca. 80% co-transduktion af purA155 med zjb-908::Tn10, når den transducerende 34 DK 174969 B1 phag P22 HT105/1 int dyrket på stammen SL5475 eller stammen SL5505 påføres en tetracyclin-sensitiv pur+ S. typhimurium-recipient. Stammen SL5475 blev konstrueret ved standardmetoden (Kleckner et al. (1977) J. Mol.

Biol. 116:125) til frembringelse af en transposon-indføring i et chromosomalt 5 sted, der ligger tæt ved et gen af interesse, på følgende måde: stammen LT2 purA155 (som vides at have udelukket en del af genet purA) blev behandlet med transducerende phager dyrket på flere tusind tetracyclin-resistente kloner, som hver er et resultat af en uafhængig indføring af transposon’et Tn10 på et tilfældigt sted i chromosomet af en S. typhimurium-stamme af vildtypen.

10 Flere hundrede tetracyclin-resistente transduktanter, som således blev fremkaldt af stammen purA155, blev underkastet screening med henblik på at påvise, hvilke transduktanter der var blevet purin-uafhængige. En sådan klon blev fundet og betegnet SL5464. Det måtte formodes, at der i denne klon var inkorporeret et transduceret chromosom-fragment, der omfattede genet pu-15 rA+ og en hosliggende Tn 10-indføring. Ved den konvention, som angiver den omtrentlige lokalisering af chromosomale indføringer, blev denne stamme givet betegnelsen zjb-908::Tn10. Et transducerende phag-lysat af stammen SL5464 (LT2 purA+ zjb-908::Tn10) blev derefter benyttet til at frembringe tetracyclin-resistente transduktanter fra stammen LT2 purA155. Ud af 12 tetra-20 cyclin-resistente kloner, som blev opnået på denne måde, var kun de 3 purin-afhængige ligesom deres ophav. De formodedes at være et resultat af en inkorporering af transduceret zjb-908::Tn10 uden inkorporering af det hosliggende purA+-gen fra donoren. En af disse tre kloner med konstitutionen pu-rA155 zjb-908::Tn10 blev betegnet SL5475 og anvendt som donor for de to 25 nærliggende bundne gener.

For at introducere purA155-udelukkelsen i 523Ty påførte man et phag-lysat af stammen SL5475 på de tetracyclin-sensitive S. typhi-recipientsstammer, hvorefter man foretog en udvælgelse for tetracyclin-resistente transduktanter 30 ved den samme procedure som beskrevet ovenfor i forbindelse med introduktion af aroA(serC)::Tn1 O-mutationen. Efter enkeltkoloni-reisolation blev de 35 DK 174969 B1 tetracyclin-resistente transduktant-kloner testet for adenin-behov (ud over deres tidligere behov for aromatiske metaboliter og histidin). Der opnåedes en purA155-udelukketzjb906::Tn10-transduktant, som fik betegnelsen 531 Ty.

5

Fjernelse af tetracyclin-resistens

Tetracyclin-sensitive mutanter af 531 Ty blev frembragt ved at udsprede en fortyndet væskeformig kultur på et medium, som hindrer væsken af stammer, 10 der er tetracyclin-resistente som følge af tilstedeværelsen af Tn10 (Bochner et al. (1980) J. Bacteriol. 143:926). Dette medium blev modificeret ved tilsætning af 2,3-dihydroxybenzoesyre i en mængde på 1/ug/ml p.g.a. aro-mangelen hos den anvendte S. typhi-stamme. De således opnåede tetracyclin-sensitive mutanter, som opstår ved udelukkelse af en del af det 15 transposon, der bevirker tetracyclin-resistens, blev kontrolleret med henblik på at bekræfte, at de havde en uændret emæringsmæssig karakter, og at de havde antigen-karakteristika svarende til deres S. typhi-ophav af vildtypen. Et sådant isolat, betegnet 541 Ty, udgør en Vi-positiv aro(udelukket) his pu-rA(udelukket) tetracyclin-sensitiv levende vaccinestamme i CDC10-80-linien.

20

Fremstilling af aro' pur Vi'-stammer

Vi-negative mutanter opnås fra 531 Ty ved udstrygning af kolonier af phag-resistente mutante bakterier, som udvikler sig i lyseringsområder, fremkaldt 25 ved påføring af Vi phag I, II (tilpasning til A eller E1) eller IV eller en blanding af samtlige disse fire phager. De phag-resistente mutanter blev, efter enkelt-koloni-reisolation, testet for tilstedeværelse eller fravær af Vi-antigen ved agglutineringsforsøg på objektglas under anvendelse af kommercielt tilgængeligt anti-Vi-serum og ved at teste for sensitivitet over for hver af de Vi-30 specifikke phager. En mutant, som viser sig Vi-negativ ved begge forsøg, og som opretholder forældreorganismens emæringsmæssig karakter og den 36 DK 174969 B1 nedarvede O-antigene karakter, blev betegnet 543Ty, og den udgjorde en Vi-negativ levende vaccinestamme.

Såvel 541 Ty som 543Ty blev indgivet til forsøgspersoner med generelt til-5 fredsstillende resultater. Ingen af forsøgspersonerne udviste sygdomstegn, og nogle af forsøgspersonerne viste serologiske tegn på immunrespons.

Desuden udskilte nogle af forsøgspersonerne vaccinestammen i en dag eller to, hvilket viste en i det mindste kortvarig levedygtighed.

10 Clements og Et-Morshidy, Infect. Immun. (1984) 46:564-569, beskriver fremstillingen af plasmid pJC217, der indeholder genet for udtrykkelse af 56kD B-regionen af det varmelabile enterotoxin-operon af E. coli. Plasmid pJC217 transformeres til stammerne 541Ty og 543Ty som beskrevet af Clements og E1-Morshidy, supra. Udtrykkeisen af LT-B bekræftes afen ELISA-15 analyse. Mikrotiter-plader belægges på forhånd med blandede gangliosider (type III) i en mængde på 7,5/ug pr. fordybning, hvorefter hver fordybning forsynes med 1/ug renset LT-B. Reagenser og antisera kan fås fra Sigma Chemical Co. Prøverne fortyndes serievis i PBS (pH 7,2) og 0,05% Tween-20.

De ampicillin-resistente kolonier testes for LT-B. De LT-B-positive transfor-20 manter benyttes derefter til immunisering over for såvel S. typhi som varme-labilt enterotoxin som tidligere beskrevet.

Den omhandlede procedure kan benyttes med en række forskellige pathoge-ne organismer ved at benytte et passende transposon til at opnå aro' eller 25 andre mutante derivater. Andre organismer af særlig interesse er Escherichia, især E. coli, Klebsiella, især K. pneumoniae, og Shigella. Ved at anvende et passende transposon, som indføres i et passende gen for aromatisk biosyntese, kan man anvende sådanne teknikker som transduktion med en passende almen transducerende phag, eksempelvis P1, til at tilvejebringe 30 aro' eller andre mutante ikke-virulente pathogene organismer, som er ikke-tilbagevendende.

37 DK 174969 B1 I det foregående er opfindelsen blevet beskrevet i detaljer under henvisning til specifikke illustrative eksempler, men det er indlysende, at man inden for opfindelsens rammer kan foretage ændringer og modifikationer.

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en levende ikke-virulent vaccine ud fra en virulent patogen bakterie, hvilken vaccine i det væsentlige er ude af stand 5 til at vende tilbage til den virulente tilstand i et hvirveldyr, som er modtageligt for bakterien, samtidigt med, at der tilvejebringes en kraftig immunrespons, kendetegnet ved, at man transducerer celler af en immunrespons-fremkaldende stamme af bakterien 10 med en første transducerende phag, der indeholder i det mindste en del af et første gen, som udtrykker et protein i en første biosyntesevej til en første essentiel metabolit, der normalt ikke er tilgængelig i værtsorganismen, og hvilket gen omfatter en ikke-tilbagevendende mutation, hvorved der opnås en kultur af en første auxotrof ikke-virulent mutant, 15 foretager en udvælgelse for den auxotrofe mutant ved hjælp af den første auxotrofe mutation eller en anden markering indført ved ovennævnte transducerende phag, 20 transducerer den første auxotrofe mutant med en anden transducerende phag, der indeholder i det mindste en del af et andet gen, som udtrykker et protein i en anden biosyntesevej til en anden essentiel metabolit, der normalt ikke er tilgængelig i værtsorganismen, og hvilket andet gen omfatter en ikke-tilbagevendende mutation, hvorved der opnås en kultur af en anden auxotrof 25 ikke-virulent mutant, foretager en udvælgelse for den anden auxotrofe mutant ved hjælp af den anden auxotrofe mutation eller en anden markering indført ved ovennævnte transducerende phag og 30 isolerer de sekundære auxotrofe ikke-tilbagevendende mutante transduktan- DK 174969 B1 ter til opnåelse af en levende vaccine.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det første og det andet gen er forskellige og er valgt blandt medlemmer af gruppen af aro-, 5 pur- og pab-gener.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at bakterien er Salmonella.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den indeholder et yderligere trin, hvor man introducerer en udtrykkelseskassette i den patogene bakterie, der koder for et antigen af et andet patogen end den patogene bakterie, hvorved antigenet produceres i bakterien.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at antigenet er et membran-protein.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at antigenet er et bakterielt protein. 20

7. Levende Salmonella-stamme, kendetegnet ved, at stammen er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1-6 og at den kræver aromatiske metaboliter og adenin som et resultat af ikke-tilbagevendende udelukkelser.

8. Levende Salmonella-stamme ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den er aroA' og purA\

9. Vaccine, kendetegnet ved, at den består af en levende Salmonellastamme ifølge krav 8 i en mængde og en koncentration, der kan fremprovo-30 kere en immun respons, sammen med et fysiologisk acceptabelt bærestof.