TWI473626B - 牙齦紫單胞菌（ｐ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染之預防、治療及診斷技術 - Google Patents

牙齦紫單胞菌（ｐ.ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）感染之預防、治療及診斷技術 Download PDF

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Description

牙齦紫單胞菌(P.GINGIVALIS)感染之預防、治療及診斷技術 發明領域
本發明係關於胜肽及嵌合或融合蛋白質，及關於此等蛋白質提引出用於預防及治療牙齦紫單胞菌(Porphyromonas gingivalis)相關病症及疾病之細胞免疫反應及體液免疫反應之用途。
 發明背景
慢性牙周炎為牙齒支承組織之發炎性疾病結果導致齒槽骨的再吸收及最終導致牙齒脫落。對全部社會，本疾病為重大公共衛生問題，估計患者高達成人的15%，重度患者高達5-6%。
慢性牙周炎的發展及進行係與齦下牙菌斑中的特定革蘭氏陰性菌相關聯。齦下牙菌斑存在有牙齦紫單胞菌(Porphyromonas gingivalis)與該疾病強烈有關。
牙周炎病人於治療(洗牙及牙根面平整術)後齦下牙菌斑的牙齦紫單胞菌持續存在業已報告與進行性齒槽骨骨質流失有顯著關聯。此外，藉附著性損耗、牙周囊袋深度及探察時出血測量，齦下牙菌斑的牙齦紫單胞菌細胞數目增加顯示與疾病嚴重程度相關。
口腔感染牙齦紫單胞菌顯示於小鼠、大鼠及非人靈長類誘發牙周骨質流失。此外，牙周病及牙齦紫單胞菌感染與心血管病及某些癌症的關聯增加。
已經報告多種毒害因子促成牙齦紫單胞菌的致病性，該等毒害因子包括：LPS、纖毛素(fimbriae)、血球凝集素、溶血素及胞外水解酶(特別為Arg-X及Lys-X特異性蛋白酶)，又稱「牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素」。
公共衛生問題嚴重因而需要有抗血清，特別為可對牙齦紫單胞菌感染提供強力保護反應之特異性抗體及提供該抗血清之手段。
一個問題為未知如何對於有多項毒害因子須作選擇的牙齦紫單胞菌感染獲得強力保護反應。
多個毒害因子中之抗原決定部位(epitope)之相對免疫原性尚未徹底瞭解，一個給定毒害因子上抗原決定部位的相對免疫原性也尚未徹底瞭解，特別未知是否仍有額外抗原決定部位有待識別。
一項特定問題為多種毒害因子係由多個功能部位形成，難以表達因而呈現趨近於牙齦紫單胞菌之組態之組態。進一步，當此等功能部位係呈離散單元表現時，亦即與其它毒害因子功能部位隔離時，此等功能部位傾向於摺疊成與牙齦紫單胞菌之組態不同的組態。
進一步，用於修改毒害因子之免疫原性之多種不同選項中，未知哪一個選項最可能提供保護性免疫反應。
於結果獲致本發明之研究工作中，發明人識別出具有與形成牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之一區的胺基酸序列相同胺基酸序列或共享同源性之胜肽，該區定義該酵素中用於將含Lsy或Arg的胜肽中之位在C端的胜肽鏈結裂解成為Lsy或Arg之位置，以及將此種胜肽摻混入嵌合或融合蛋白質，該等蛋白質當用作為疫苗時，比較由天然牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素所形成的已純化的蛋白酶-黏附素複體或已殺死的全細胞，可提供對抗牙周組織破壞的更佳保護效果。
 發明概要
於一個面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌(Porphyromonas gingivalis)之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括第一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至第二胜肽，其中：
(A)該第一胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與SEQ ID No：1所示序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與SEQ ID No：2所示序列相同或同源；
(B)該第二胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
於另一個面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至一多肽，其中：
(A)該胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與SEQ ID No：1所示序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與SEQ ID No：2所示序列相同或同源；
(B)該多肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
於另一面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之胜肽，該胜肽具有一序列：
(i)其係與SEQ ID No：64至66中之一者所示序列相同或同源；及
(ii)其係與SEQ ID No：67或68所示序列相同或同源。
於一個面相中，具有一序列其係與SEQ ID No：64至68中之一者所示序列相同或同源之該胜肽可以嵌合或融合蛋白質形式提供，其中該胜肽係直接接合或經由一鏈接基接合至第二胜肽，其中該第二胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
於又另一面相中，本發明提供一種組成物諸如抗原組成物特別為疫苗組成物包括如前文廣義說明之嵌合或融合蛋白質或胜肽，視需要可與輔劑結合。
於此面相中，本發明也提供一種於個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度之方法，包含對該個體投予如前文說明之嵌合或融合蛋白質或前述組成物。
於此一面相中，本發明進一步提供如前述嵌合或融合蛋白質或前述組成物用於個體預防或減少牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度之用途，或用於製造用於該項用途之藥物。
於另一面相中，本發明提供一種對如前文廣義說明之嵌合或融合蛋白質或胜肽所產生之抗體，特別為單株抗體。
於此一面相中，本發明也提供一種於個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之嚴重程度之方法，包含對該個體投予如前文說明之抗體。
於此一面相中，本發明進一步提供如前述抗體用於個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度之用途，或用於製造用於該項用途之藥物。
於又另一面相中，本發明也提供一種核酸分子，包括編碼如前文廣義說明之嵌合或融合蛋白質之一核苷酸序列，視需要可操作式鏈接至至少一個調節元體。
於此一面相中，本發明進一步提供一種包括此種核酸分子之載體以及包括此種核酸分子之原核細胞或真核細胞。
於此一面相中，本發明也提供一種於一個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度之方法，包含對該個體投予如前文說明之核酸分子、如前文說明之載體、或如前文說明之原核細胞或真核細胞。
於此一面相中，本發明進一步提供如前文說明之核酸分子、如前文說明之載體、或如前文說明之原核細胞或真核細胞用於一個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之嚴重程度之用途或用於製造用於此項用途之藥物。
於又一面相中，本發明提供一種用於一個體診斷或監視牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之方法，包含使用如前文說明之嵌合或融合蛋白質檢測於得自該個體之生物樣本中之抗牙齦紫單胞菌抗體。
於此一面相中，本發明也提供如前文說明之嵌合或融合蛋白質用於檢測得自一個體之生物樣本中之抗牙齦紫單胞菌抗體。
於又另一面相中，本發明提供一種用於一個體診斷或監視牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之方法，包含使用如前文說明之抗體來檢測於得自該個體之生物樣本中牙齦紫單胞菌之存在。
於此一面相中，本發明也提供如前文說明之抗體用於檢測得自一個體之生物樣本中之牙齦紫單胞菌的存在之用途。
於另一面相中，本發明提供具有部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌Lys-X或Arg-X蛋白酶序列相同或同源之胜肽或編碼該胜肽之核酸用於製造嵌合或融合蛋白質用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之用途。於此一面相中，該胜肽可具有SEQ ID No：17、18、25或26中之一者所示之序列。
圖式簡單說明
第1圖顯示重組Kgp蛋白質之SDS-PAGE凝膠之庫馬西藍染色。線道1=KAS2-KLA、線道2=KLA1、線道3=KsA1、線道4=KAS1-KsA1。分子量標記係以kDa指示。
第2圖顯示KAS2胜肽及經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞之抗體確認。(A)KAS2胜肽係使用對經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞(FK-W50)提引出之抗血清、重組蛋白質KAS1-KsA1、KAS2-KLA1、及合成KAS2-DT軛合物及PBS於ELISA探測。(B)經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞係使用對經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞(FK-W50)提引出之抗血清、重組蛋白質KAS1-KsA1、KAS2-KLA1、KLA1及PBS於ELISA探測。抗體反應係以所得ELISA力價OD415 減背景位準之雙倍表示，各力價表示三個數值之平均±標準差。
第3圖顯示以重組蛋白質及重組嵌合體蛋白質、經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌及單獨輔劑(PBS、IFA)免疫接種之小鼠或未經口感染(未經挑釁)小鼠之牙齦紫單胞菌誘發上顎臼齒之水平骨質流失。本圖中，KAS2-KLA1係顯示為AS2-LA1、KLA1係顯示為LA1、KAS1-KsA1係顯示為AS1-sA1、KsA1係顯示為sA1。骨質流失之測量值為左上顎骨及右上顎骨二者各自的上顎臼齒之頰側由釉質牙骨質接面(CEJ)至齒槽骨脊(ABC)以平方毫米(mm2 )測量得之面積之平均值。藉李文氏(Levene’s)變因均質度測量，資料為常態分布，且係以平方毫米表示之平均值(n=12)呈現，且使用單向變因分析及丹尼特氏(Dunnett’s)T3測試分析。*指示比較對照(感染)組具有顯著(P<0.001)較少骨質流失之組。指示比較AS2-LA1組具有顯著(P<0.001)較多骨質流失之組。
第4圖顯示於牙周炎研究模型中已免疫接種小鼠之血清抗體亞類反應。得自小鼠之血清A(經口接種之前)及B(經口接種之後)係以重組蛋白質KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1免疫接種及經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50用於ELISA，以經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50作為吸附抗原。抗體反應IgG(黑柱)、IgG1(灰柱)、IgG2a(白柱)、IgG2b(水平條紋柱)、及IgG3(對角線條紋柱)係以所得ELISA力價(log2)減背景位準表示，各力價表示三個數值之平均值±標準差。
第5圖顯示對表示KAS2胜肽序列433-468之重疊胜肽之胜肽特異性抗體反應性之PEPSCAN分析。(A)以KAS1-KsA1(白柱)、KAS2-KLA1(黑柱)、抗血清探測之KAS2重疊胜肽(偏移值1，重疊7)。(B)以KAS2-DT軛合物抗血清探測之KAS2重疊胜肽(偏移值，重疊7)。各柱顯示抗體反應性(於415奈米之光密度[OD])。
第6圖。嵌合體AS2-LA1於遠系小鼠誘導抗體反應其確認牙齦紫單胞菌全細胞及RgpA-Kgp複體。CD1遠系小鼠使用嵌合體AS2-LA1免疫接種(50毫克/小鼠)，收集的血清用於使用AS2-LA1之ELISA(A)、經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50(B)、及RgpA-Kgp複體(C)作為吸收抗原之ELISA。本圖中，KAS2-KLA1顯示為AS2-LA1。各免疫球蛋白同型對各抗原之力價經測定，資料係以所得ELISA力價(‘000)減背景位準之雙倍表示，各力價代表三個數值之平均值±標準差。
第7圖。Kgp蛋白酶之蛋白質模型。KAS2[Asn433-Lys468](A)、KAS4[Asp388-Va1395](B)、KAS5[Asn510-Asp516](C)及KAS6[Ile570-Tyr580](D)。
 較佳實施例之詳細說明
須瞭解於本說明書所揭示及定義之本發明可延伸至由上下文或說明書中所述且顯然易知之個別特徵中之二者或多者之全部替代性組合。全部此等不同組合組成本發明之多個其它面相。
發明人發現旁出於或以其它方式界定胜肽鍵之催化裂解位置或活性裂解位置之牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素且確實足以提供對牙齦紫單胞菌感染之體液反應。特別發現包括此等區中之一者或多者之嵌合或融合蛋白質提供對抗齒槽骨流失之保護效果係大於對全細胞及其它免疫原提引出的抗體所見的保護效果。此項發現特別出人意外，原因在於至今日為止發現牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之催化功能部位係屬相對微弱免疫原性。
於一個面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括第一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至第二胜肽，其中：
(A)該第一胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與SEQ ID No：1所示序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與SEQ ID No：2所示序列相同或同源；
(B)該第二胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
如此處使用，「胜肽」一詞用來表示至多約40個胺基酸殘基，較佳5個至40個胺基酸殘基之胺基酸序列。
於一個實施例中，多肽用來替代或取代「第二胜肽」。「多肽」一詞用來表示含至少約40個胺基酸殘基之胺基酸序列。
如此於另一個面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至一多肽，其中：
(A)該胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與SEQ ID No：1所示序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與SEQ ID No：2所示序列相同或同源；及
(B)該多肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
於另一面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之胜肽，該胜肽係選自於由下列所組成之組群：
(i)其係與SEQ ID No：64至66中之一者所示序列相同或同源；及
(ii)其係與SEQ ID No：67或68所示序列相同或同源。
於本發明之另一面相中，此處該胜肽具有SEQ ID No：64至68之序列，該胜肽可呈嵌合或融合蛋白質形式提供，其中該胜肽係直接接合或經由一個鏈接基而接合至第二胜肽。於一個實施例中，嵌合或融合蛋白質之第二胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
於前述實施例中，多肽係用來替代或換言之取代第二胜肽。如此，於另一個面相中，本發明提供一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至一多肽，其中：
(A)該胜肽包括：
(i)其係與SEQ ID No：64至66中之一者所示序列相同或同源；或
(ii)其係與SEQ ID No：67或68所示序列相同或同源；及
(B)該多肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
如此處使用，述及胜肽或多肽之「同系物」係指一種胜肽或多肽其具有胺基酸序列與首述胜肽或多肽之胺基酸序列共享同源性或為同源性或具有相同度，當藉BLAST演繹法則進行比較時，較佳具有至少90%序列相同度，更佳至少95%序列相同度及又更佳至少98%序列相同度，其中該演繹法則之參數係經選擇而獲得於個別參考序列全長之個別序列間的最大匹配。序列相同度係指進行比較之二序列之胺基酸間確切匹配。此種同系物可能衍生自牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶之天然變異株或單離株。另外可為得自牙齦紫單胞菌Lys-X-蛋白酶或Arg-X-蛋白酶之胜肽或多肽之「保留性取代」變異株，其中一個或多個胺基酸殘基已經改變而未變更胜肽或多肽之總體組態及功能；包括但絕非限於以具有類似性質之一個胺基酸置換一個胺基酸。具有類似性質的胺基酸為技藝界眾所周知。舉例言之，可互換的極性/親水性胺基酸包括天冬醯胺、麩胺、絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天冬酸及麩胺酸；可互換之非極性/斥水性胺基酸包括甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、酪胺酸、苯基丙胺酸、色胺酸、及蛋胺酸；可互換之酸性胺基酸包括天冬酸及麩胺酸；及可互換之鹼性胺基酸包括組胺酸、離胺酸及精胺酸。較佳此種保留性取代變異 株具有少於20個，更佳少於15個，更佳少於10個，及最佳少於5個胺基酸變化。
界定酶中用於胜肽鍵裂解位置之牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素，特別為Lys-X-蛋白酶(Kgp)或Arg-X-蛋白酶(RgpA)之一區可遵照本文說明書之教示決定，特別有關第7圖及實例9，其舉例說明預測當催化位置出現於牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶上之三度空間組態之方法。實例10提供用於模型化Arg-X-蛋白酶三度空間組態之方法。
於若干實施例中，嵌合或融合蛋白質或其第一胜肽組分或第二胜肽組分可由胜肽模擬物形成。胜肽模擬物為模擬一給定胜肽之一項或多項特性諸如組態之分子，及其包括胺基酸殘基且若干胺基酸殘基並非天然胺基酸殘基。
已經識別催化位置之免疫原區，發明人測定可提引出體液反應之多種胜肽免疫原之序列。特別，已經界定旁出於或以其它方式界定催化位置之「六區」：KAS1/RAS1、KAS2/RAS2、KAS3/RAS3、KAS4/RAS4、KAS5/RAS5及KAS6(參考表1)。採用本資訊，發明人可查詢蛋白質序列資料庫來判定與形成旁出於催化位置之各區且因而表示出現於牙齦紫單胞菌之免疫原性抗原決定部位之各區之胺基酸序列共享同源性之胜肽。此等胜肽之序列係以如下結構式識別：
發明人發現包括此等胜肽之嵌合蛋白質具有多項用途。舉例言之，如此處所述，如於慢性牙周炎觀察，某些嵌合蛋白質產生用於骨質流失之治療或預防上有高度保護效果之體液反應。胜肽也可用於診斷檢定分析，其中胜肽可檢測或監視個體血清中之特異性，藉此指示該個體是否感染，且若是，該個體是否需要治療，或若提供治療則該等治療是否有效。
須瞭解界定於用於裂解位在Lys或Arg C-端之胜肽鍵的酶中之位置的牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之該區並未包含Lys-X蛋白酶或Arg-X蛋白酶之完整序列。
如此處使用，「同源蛋白質」或「嵌合或融合蛋白質」等詞係用來表示由衍生自不同來源之胺基酸之功能單元、功能部位、序列或區所組成之蛋白質，或係衍生自相同來源且已經組裝因而具有一種組織其係與該功能單元、功能部位、序列或區所衍生或所相關之分子觀察得之組織不同的蛋白質。本發明之嵌合或融合蛋白質之共通特徵為其含有至少一個胜肽，其具有胺基酸序列係與界定用於裂解胜肽鍵的催化位置之牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之一序列相同或共享同源性。
於較佳實施例中，此處第一胜肽包含得自Kgp[432-468]區之胜肽，其係較佳(i)包含選自於VSFANYTA及VGFANYTA之序列，更佳選自於GVSFANYT、GVGFANYT、VSFANYTA及VGFANYTA之序列之一胜肽；或包含選自於ETAWAD、ETSWAD、TAWADP及TSWADP之一序列，較佳選自於SETAWAD、SETSWAD、ETAWADP、ETSWAD、TAWADP及TSWADP之一序列，更佳選自於GSETAWAD、GSETSWAD、SETAWADP、SETSWADP、ETAWADPL、ETSWADPL、TAWADPLL及TSWADPLL之一序列之一胜肽。更佳此一胜肽為表1所示KAS1[432-454]、KAS2[433-468]及KAS3[436-455]胜肽。另外，第一胜肽可為PAS1K[432-453]胜肽，也稱作為PAS1(K48)，揭示於國際專利申請案第PCT/AU98/00311號(WO 98/049192)。與此等胜肽相對應之序列識別符係顯示為表3。
同理，於另一個較佳實施例中，此處第一胜肽包含得自RgpA[426-462]區之胜肽，此一胜肽較佳係選自於表1所示RAS1[426-448]、RAS2[427-462]及RAS3[430-449]胜肽。另外，第一胜肽可為PAS1R[426-446]胜肽，也稱作為PAS1(R45)，揭示於國際專利申請案第PCT/AU98/00311號(WO 98/049192)。
於本發明之嵌合或融合蛋白質中，第二胜肽可為得自牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之黏附素功能部位諸如Lys-X-蛋白酶(Kgp)或Arg-X-蛋白酶(RgpA)或HagA之胜肽(參考表2)。此等功能部位偶爾也稱作為血球凝集素。於Lys-X-蛋白酶中，較佳功能部位為表2識別之KA1、KA2、KA3、KA4、KA5。Arg-X-蛋白酶中，較佳功能部位為表2識別之RA1、RA2、RA3及RA4。HagA中，較佳功能部位為HagA1、HagA1*及HagA1**。
除了改良對本發明胜肽之體液反應之外，諸如KAS1、KAS2、KAS3、KAS4、KAS5及KAS6或RAS1、RAS2及RAS3、RAS4及RAS5當含括此種胜肽於嵌合或融合蛋白質時，黏附素功能部位也含有免疫原性抗原決定部位，因而導致產生多重特異性來提引出保護的免疫原性反應。發現當提供於本發明之嵌合或融合蛋白質時，黏附素功能部位之免疫原性抗原決定部位係以趨近於牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之形式保有乃出乎意外者。
須瞭解於本發明之此等實施例中，嵌合或融合蛋白質可含有選自於KAS1/RAS1、KAS2/RAS2、KAS3/RAS3、KAS4/RAS4、KAS5/RAS5及KAS6/RAS6之胜肽中之任何一者或多者連同牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素之任何一者或多者黏附素功能部位，特別連同Lys-X-蛋白酶黏附素功能部位(KA1、KA2、KA3、KA4及KA5)或Arg-X-蛋白酶黏附素功能部位(RA1、RA2、RA3及RA4)或HagA功能部位HagA1、HagA1*及HagA1**中之任何一者或多者。
也將瞭解黏附素功能部位無需如同於牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素中觀察得的完整功能部位。舉例言之，黏附素功能部位可為此種功能部位之片段，特定言之，較佳片段為Lys-X-蛋白酶A1功能部位之KsA1及KLA1功能部位片段(參考表2)。當該功能部位為黏附素功能部位之一片段時，其通常含有一個或多個黏附素功能部位特異性抗原決定部位。
與黏附素相關胜肽相對應之序列識別符顯示於表3。
於一個實施例中，第二胜肽或多肽包括SEQ ID NO：69至79中之一者或多者或83至85中之一者或多者所示序列。
本發明之嵌合或融合蛋白質也包括選自於Lys-X-蛋白酶之Kgp[432-468]區中之一個或多個額外胜肽及/或Arg-X-蛋白酶之RgpA[426-462]區中之一個或多個額外胜肽。
於本發明之較佳實施例中，嵌合或融合蛋白質包括KAS1、KAS2、KAS3、KAS4、KAS5及KAS6中之一者或多者，或RAS1、RAS2、RAS3、RAS4及RAS5中之一者或多者，連同KsA1或KLA1。
如此於若干實施例中，該嵌合或融合蛋白質可包括至少一個額外胜肽，其中該額外胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與SEQ ID No：1所示序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與SEQ ID No：2所示序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iv)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(v)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
其它可含括於如此處所述之嵌合或融合蛋白質之功能部位、單元序列或區之實例包括用於結合受體或配體之功能部位諸如Fc結合區或Fc受體、用於改良半生期之功能部位諸如白蛋白或用於協助嵌合或融合蛋白質之表現或純化之功能部位。
於本發明之嵌合或融合蛋白質中，第一胜肽之C-端殘基可共價鏈接至黏附素功能部位多肽之N端殘基，或第一胜肽之N-端殘基可共價鏈接至黏附素功能部位多肽之C端殘基。於此種配置中，第一胜肽與黏附素功能部位多肽係稱作「直接鏈接」或「相鄰」。
於其它實施例中，嵌合或融合蛋白質包括用於將第一胜肽鏈接至黏附素功能部位多肽之鏈接基。該鏈接基可為可接合胜肽至多肽之任一種鏈接基，包括胺基酸鏈接基及非胺基酸鏈接基。較佳該鏈接基為非免疫原性。適當鏈接基之長度可長達15個胺基酸，但以少於5個胺基酸為佳。鏈接基之功能係將第一胜肽與黏附素功能部位多肽調整成比較通常於牙齦紫單胞菌似胰蛋白酶酵素中觀察得的空間配置更緊密的空間配置。另外可隔開第一胜肽與黏附素功能部位多肽。
本發明之嵌合或融合蛋白質可藉重組表現系統(諸如重組DNA技術)或藉化學合成(諸如固相胜肽合成)製造。此等技術為業界眾所周知。
同源蛋白質或嵌合蛋白質為特別優異，原因在於其改良所得體液反應超過單獨使用嵌合或融合蛋白質之第一或第二胜肽組分所能獲得的體液反應。
發明人也發現包括此等胜肽之嵌合蛋白質具有多項用途。舉例言之，如此處所述，如於慢性牙周炎觀察，某些嵌合蛋白質產生用於骨質流失之治療或預防上有高度保護效果之體液反應。胜肽也可用於診斷檢定分析，其中胜肽可檢測或監視個體血清中之特異性，藉此指示該個體是否感染，且若是，該個體是否需要治療，或若提供治療則該等治療是否有效。
於一個實施例中，嵌合或融合蛋白質誘生保護性免疫反應，典型為至少減少或限制牙齦紫單胞菌感染所引發之結締組織損壞之反應。於一個實施例中，保護性反應至少減少或限制牙齦紫單胞菌誘生骨質流失。此處討論用於測量因牙齦紫單胞菌感染媒介的骨質流失之模型系統。典型地保護性免疫反應主要為體液反應。於若干實施例中，保護性免疫反應也包括細胞反應。
本發明也提供一種包括如此處廣義說明之嵌合或融合蛋白質之組成物。典型地該組成物為抗原性或免疫原性。特定言之，本發明提供一種適合用於提引出對抗牙齦紫單胞菌感染之保護性或治療性免疫反應之組成物，該組成物包括該嵌合或融合蛋白質視需要可組合輔劑。此種組成物也包括用於調節或增強免疫反應之另一種組分。一個實施例中，該組成物係呈疫苗劑型。
已知多種輔劑可與疫苗組成物並用。該等輔劑協助調節免疫反應與比較單獨投予該疫苗抗原，協助使用更小量疫苗抗原或更少劑疫苗抗原達成更耐久且更高度的免疫力。輔劑之實例包括不完全弗氏(Freund’)輔劑(IFA)、輔劑65(含有花生油、一油酸甘露糖化物及一硬脂酸鋁)、油乳液、瑞比(Ribi)輔劑、普龍尼克(pluronic)多元醇類、多胺類、阿瑞丁(Avridine)、奎爾(Quil)A、皂素、MPL、QS-21、礦物凝膠類諸如鋁鹽類及鈣鹽類、奈米粒子諸如羥磷灰石、磷酸鈣、鋁鹽類、糖寡聚物及聚合物諸如甘露聚糖、甲殼聚糖。其它實例包括水包油型乳液諸如SAF-1、SAF-0、MF59、賽皮克(Seppic)ISA720、及其它粒狀輔劑諸如伊士康(ISCOM)及伊士康基體。綜合性但非排它的其它輔劑實例之表單係列舉於Cox及Coulter 1992[於：Wong WK(編輯)動物寄生蟲控制利用技術。Bocca Raton；CRC出版社，1992；49-112]。除了輔劑之外，疫苗組成物可包括習知藥學上可接受之載劑、賦形劑、填充劑、緩衝劑或稀釋劑，視何者適當而定。一劑或多劑含輔劑之疫苗組成物可作預防性投藥來預防牙周炎，或作治療性投藥來治療既存的牙周炎。
於較佳組成物中，嵌合或融合蛋白質組合黏膜輔劑及透過口、頰或鼻途徑投予。黏膜輔劑之實例為奈米粒子、霍亂毒素及熱不穩定性大腸桿菌(E.coli)毒素、此等毒素之無毒B亞單元、具有較低毒性之此等毒素之基因突變株。可用來經口/經頰/經鼻遞送抗原性蛋白質之其它方法包括藉微包囊將該蛋白質摻混或吸收至可生物分解聚合物之粒子(諸如丙烯酸酯類或聚酯類)或奈米粒子(諸如羥磷灰石)內或上來協助從胃腸道或其它黏膜表面吸收微球，且保護蛋白質不會分解。微脂粒、伊士康、水凝膠類屬於其它潛在方法之實例，可經由摻混用於遞送抗原性蛋白質至黏膜免疫系統之靶定分子諸如LTB、CTB或果膠來進一步提升其效果。除了抗原性蛋白質及黏膜輔劑或黏膜遞送系統外，該疫苗組成物可包括習知藥學上可接受之載劑、賦形劑、填充劑、塗覆劑、分散介質、抗菌劑或抗真菌劑、及緩衝劑或稀釋劑，視何者適當而定。
於此一面相中，本發明也提供一種於一個體預防或減少牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度之方法，包含對該個體投予如前文說明之嵌合或融合蛋白質或如前文說明之組成物。
該個體可為人類或其它動物體且較佳為人類。
典型地，牙齦紫單胞菌相關病症或疾病為慢性牙周炎，但也可為骨質流失，特別為齒槽骨流失或冠狀動脈病。
已知多種方法可用於將疫苗組成物投予人體或動物體，包括但非限於皮內、肌肉內、腹內、靜脈、皮下、鼻內、舌下、經頰及經口投予。此等投予途徑特別可用於疫苗接種。
於另一個面相中，本發明提供對如前文廣義說明之嵌合或融合蛋白質提引出之抗體，較佳為單株抗體。
此等抗體可藉標準技術製造，且可用於個體之被動免疫。如此，於此一面相中，本發明也提供一種於一個體預防或減輕牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之嚴重程度之方法，包含對該個體投予如前文說明之抗體。
於又一面相中，本發明提供一種核酸分子，包括編碼如前文廣義說明之嵌合或融合蛋白質之核苷酸序列，視需要可操作式鏈接至至少一個調節元體。於一個實施例中，該核酸係呈單離形式或實質上已純化形式提供。
核酸分子例如可插入用於製造嵌合蛋白質之適當表現載體呈經由該表現載體插入原核細胞或真核細胞之重組蛋白質。成功地表現重組蛋白質要求表現載體含有用於轉錄及轉譯所需的調節元體，該等元體係與用於表現的特定宿主細胞系統可相容，且係由該特定宿主細胞系統確認。多個宿主細胞系統可用於表現重組蛋白質，該等宿主細胞系統包括但非限於以噬菌體載體、質體載體、或黏接質體DNA所轉形之細菌；含酵母載體之酵母；含真菌載體之真菌；以病毒(例如桿病毒)感染之昆蟲細胞系；及以質體表現載體或病毒表現載體轉移感染或以重組病毒(例如牛痘病毒、腺病毒、腺相關聯之病毒、反錄病毒等)感染之哺乳動物細胞系。
使用分子生物學業界已知方法，多種啟動基因及加強基因可合併入表現載體來增加重組蛋白質的表現，只要增加表現的胺基酸序列係與所使用之該特定宿主細胞系統可相容(例如對其無毒)即可。
啟動基因的選擇將取決於所使用之表現系統。啟動基因之強度各異，亦即啟動基因協助轉錄的能力各異。通常期望使用強力啟動基因來獲得編碼核苷酸序列的高度轉錄與高度表現成重組蛋白質。舉例言之技藝界已知於宿主細胞系統包括大腸桿菌觀察得有高度轉錄之細菌性、噬菌體或質體啟動基因包括lac啟動基因、trp啟動基因、recA啟動基因、核糖體RNA啟動基因、PR 及PL 啟動基因、lacUV5、ompF、bla、Ipp等可用來提供已插入的編碼胺基酸序列之核苷酸序列的轉錄。
其它用於有效轉錄或轉譯的控制元體包括加強基因及調節信號。加強基因序列為DNA元體，其顯然可以與相對於鄰近編碼核苷酸序列的位置及方向性相對獨立無關之方式提高轉錄效率。如此依據所使用之宿主細胞表現載體系統，加強基因可位於所插入的編碼序列上游或下游來提高轉錄效率。其它調節位置諸如轉錄或轉譯起始信號可用來調節編碼序列的表現。
於另一個實施例中，載體可為病毒性或細菌性疫苗載體，且用來提供重組病毒性疫苗、重組細菌性疫苗、重組減毒病毒性疫苗、或去活化重組病毒性疫苗。牛痘疫苗為技藝界目前已知經基因改造來表現衍生自其它有機體的疫苗抗原之傳染性病毒的最佳實例。經過減毒或以其它方式處理使病毒的本身不會致病之重組活牛痘病毒用來免疫接種宿主。隨後於宿主體內複製重組病毒，提供以疫苗抗原連續刺激免疫系統，藉此提供長期免疫力。
其它活疫苗載體包括：腺病毒、細胞巨病毒且較佳為痘病毒諸如牛痘[Paoletti及Panicali，美國專利案第4,603,112號]及減毒沙門氏桿菌屬(Salmonella)種系[Stocker等人，美國專利案第5,210,035；4,837,151；及4,735,801號；及Curtiss等人，1988，疫苗6：155-160]。活疫苗為特別優異，原因在於活疫苗連續刺激免疫系統，可提供實質上長期免疫力。當免疫反應係對抗隨後牙齦紫單胞菌感染的保護效果時，活疫苗本身可用於對抗牙齦紫單胞菌之預防性疫苗。特別，活疫苗可基於屬於口腔共生體的細菌。此種細菌可使用載有重組嵌合蛋白質之載體轉形，及然後用來殖民口腔特別口腔黏膜。一旦已經殖民口腔黏膜，重組蛋白質的表現將刺激淋巴組織相關的黏膜來產生中和抗體。為了進一步舉例說明本實施例，使用技藝界眾所周知之分子生物技術，編碼本發明之嵌合蛋白質之核苷酸序列可插入牛痘病毒基因體DNA，位在允許抗原決定部位的表現位置，但該位置不會對牛痘病毒載體的生長或複製造成負面影響。所得重組病毒可用於疫苗配方作為免疫原。相同方法可用於構成去活化重組病毒疫苗配方，但重組病毒被去活化，諸如於用作為免疫原之前藉技藝界已知之化學手段去活化而實質上並不影響所表現之免疫原的免疫原性。已去活化之重組疫苗可使用適當輔劑配方來提升對疫苗抗原的免疫反應。
本發明也提供包括編碼本發明之嵌合或融合蛋白質之核苷酸序列的核酸分子直接用作為疫苗調配物。編碼嵌合蛋白質之核苷酸序列操作式鏈接至一個或多個調節元體可直接用來疫苗接種個體(「直接基因轉移」)對抗牙齦紫單胞菌之病原種系。直接基因轉移入疫苗接種個體，結果導致被疫苗接種的個體諸如血管內皮細胞以及重要器官組織的基因物質表現，已經藉技藝界之技術驗證，諸如直接靜脈注射表現質體：陽離子性微脂粒複體[Zhu等人，1993，科學261：209-211]。其它將載體DNA遞送至標靶細胞的有效方法為技藝界已知。於一個實例中，含病毒性基因之已純化的重組質體DNA用來接種(無論係腸道外、黏膜或透過基因腔免疫接種)疫苗來誘導保護性免疫反應[Fynan等人，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90:11478-11482]。於另一個實例中，由個體移出的細胞可藉技藝界已知之標準程序轉移感染或電泳，結果導致將重組病毒DNA導入標靶細胞。然後含有重組載體DNA之細胞可使用技藝界已知方法諸如使用於該載體表現的選擇標記選出，而被選出的細胞然後重新導入該個體來表現重組蛋白質。
於此一面相中，本發明進一步提供一種於一個體預防或減少牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度之方法，包含對該個體投予前述核酸分子、前述載體或前述原核細胞或真核細胞。
於其它實施例中，提供一種包括前述嵌合或融合蛋白質或抗體之藥學組成物。該組成物進一步包括稀釋劑、賦形劑、或載劑或用於治療牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之化學治療劑且適合經口投藥。本發明組成物可摻混入口含錠或口香膠或其它產品，例如經由攪拌入溫熱樹膠基劑內部或塗覆於樹膠基劑外表面，其說明例例如為滂阡樹膠(jelutong)、橡膠膠乳、乙烯系樹脂(vinylite resins)等，若屬期望可組合習知塑化劑或軟化劑、糖或其它甜味劑或諸如葡萄糖、山梨糖醇等。
含有前述藥學組成物之本發明之口服組成物可製備成且以施用於口腔之多種劑型使用，諸如牙粉包括牙膏、牙粉及液體牙粉、漱口水、喉片、口香膠、牙糊、牙齦按摩霜、漱口錠、乳製品及其它食品。根據本發明之口服組成物依據特定口服組成物之類別及形式而定可包括額外眾所周知的成分。
於本發明之若干較佳形式中，口服組成物之特性實質上為液體，諸如漱口水或清洗液。於此種製劑中，載媒劑典型為水-醇混合物期望包括保濕劑，容後詳述。通常水對醇之重量比係於由約1:1至約20:1之範圍。此型製劑中之水-醇混合物總量典型係於占製劑之約70%至約99.9%重量比之範圍。醇典型為乙醇或異丙醇。以乙醇為佳。
本發明之此種液體製劑或其它製劑之pH通常係於由約5至約9且典型由約5.0至7.0之範圍。pH可使用酸(例如檸檬酸或苯甲酸)或鹼(例如氫氧化鈉)控制或pH可經緩衝(例如使用檸檬酸鈉、苯甲酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等)。
於本發明之其它期望形式中，藥學組成物之特性可實質上為固體或糊狀，諸如牙粉、牙錠或牙膏(牙霜)或凝膠牙粉。此種固體或糊狀口腔製劑之載媒劑通常含有牙齒可接受的研磨材料。
於牙膏中，液體載媒劑包含水及保濕劑，典型係占該製劑由約10%至約80%重量比之範圍。甘油、丙二醇、山梨糖醇及聚丙二醇為適當保濕劑/載劑之實例。也屬較佳者為水、甘油及山梨糖醇之液體混合物。於透明凝膠中，折射率是一個考量重點，較佳採用約2.5%至30% w/w水，0%至約70% w/w甘油及約20%至80% w/w山梨糖醇。
牙膏、牙霜及牙凝膠典型含有天然或合成增稠劑或膠凝劑之比例約0.1%至約10%，較佳約0.5%至約5% w/w。適當增稠劑為合成水輝石、合成膠體鎂鹼金屬矽酸鹽錯合黏土例如可以合成鋰皂石(Laponite)(例如CP、SP 2002、D)之名獲得，拉波特工業公司(Laporte Industries Limited)出售。合成鋰皂石D以重量計為約58.00% SiO2 、25.40%MgO、3.05% Na2 O、0.98% Li2 O，及若干水及微量金屬。其真正比重為2.53，於8%水含量具有名目體積密度為1.0克/毫升。
其它適當增稠劑包括愛爾蘭苔蘚、ι鹿角菜膠、西黃蓍膠、澱粉、聚乙烯基吡咯啶酮、羥乙基丙基纖維素、羥丁基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素(以那左索(Natrosol)之名獲得)、羥甲基纖維素鈉、及膠體二氧化矽諸如經過細磨的西羅伊(Syloid)(例如244)。也可包括增溶劑諸如保濕劑多元醇類諸如丙二醇、二丙二醇及伸己基二醇；溶纖素類諸如甲基溶纖素及乙基溶纖素；直鏈含有至少約12個碳之植物油類及蠟類諸如橄欖油、蓖麻油及石蠟；及酯類諸如乙酸戊酯、乙酸乙酯、及苯甲酸苄酯。
須瞭解如習知，口腔製劑通常係以加適當標籤的包裝出售或以其它方式分銷。如此口腔清洗液瓶有標籤來具體說明其係口腔清洗液或漱洗水且有使用指示；及牙膏、牙霜或牙凝膠通常可置於擠壓管內，典型為鋁管、有內襯的鉛管或塑膠管，或其它可擠壓、可泵送或加壓的配送器用來計量送出內容物，有標籤來具體說明內容物為牙膏、牙凝膠或牙霜。
有機界面活性劑可用於本發明組成物來達成提升預防作用，協助達成活性劑的徹底且完全地分散遍佈口腔，以及讓本組成物變成美容上更加可接受性。有機界面活性劑較佳為陰離子性、非離子性、或兩親性，且較佳不會與活性劑交互作用。較佳使用對組成物提供清潔性質及發泡性質的清潔材料作為界面活性劑。陰離子性界面活性劑之適當實例為高碳脂肪酸一酸甘油酯一硫酸酯之水溶性鹽類，諸如氫化椰子油脂肪酸之一硫酸化一酸甘油酯之鈉鹽、高碳烷基硫酸酯諸如硫酸月桂酯鈉、烷基芳基硫酸酯諸如十二烷基苯磺酸鈉、高碳烷基硫代乙酸酯、1,2-二羥丙烷磺酸之高碳脂肪酸酯類、及低碳脂肪族胺羧酸化合物之實質上飽和高碳脂肪族醯胺類，諸如脂肪酸、烷基或醯基等有12個至16個碳原子者。末述醯胺類之實例為N-月桂醯基肌胺酸、及N-月桂醯基肌胺酸、N-肉豆蔻醯基肌胺酸、或N-棕櫚醯基肌胺酸、之鈉鹽、鉀鹽、及乙醇胺鹽，其實質不含皂或類似的高碳脂肪酸材料。適合使用之水溶性非離子性界面活性劑之實例為環氧乙烷與多種具有長斥水鏈(例如約12個至20個碳原子之脂肪族鏈)之多種與其具有反應性之含反應性氫之化合物之縮合產物，該等縮合產生(「乙氧聚合物(ethoxamers)」)含有斥水性聚氧伸乙基部分，諸如聚(環氧乙烷)與脂肪酸、脂肪醇、脂肪醯胺、多羥基醇(例如山梨聚糖一硬脂酸酯)及聚環氧丙烷(例如普龍尼克(Pluronic)材料)之縮合產物。
界面活性劑典型係以約0.1%至5%重量比之數量存在。值得注意者界面活性劑可協助本發明之活性劑的分散，藉此減少增溶作用保濕劑的需要量。
多種其它材料可摻混於本發明之口腔製劑諸如增白劑、保藏劑、聚矽氧類、葉綠素化合物及/或銨化材料諸如尿素、磷酸二銨、及其混合物。此等輔劑當存在時係以不會對期望的性質及特性實質上造成不良影響的數量摻混於製劑。
也可使用任一種適當矯味劑或甜味劑。適當矯味成分之實例為矯味油諸如留蘭香油、薄荷油、冬綠油、黃樟油、丁香油、鼠尾草油、桉油、馬郁蘭油、桂皮油、檸檬油、及橙皮油、及水楊酸甲酯油。適當甜味劑包括蔗糖、乳糖、麥芽糖、山梨糖醇、木糖醇、環己胺磺酸鈉、紫蘇糖、AMP(天冬胺醯基苯基丙胺酸，甲酯)、糖精等。矯味劑及甜味劑適合各自占或共同占該製劑由約0.1%至5%以上。
意圖供口腔使用之組成物可根據技藝界已知用於製備藥學組成物之任一種方法製備，此等藥學組成物含有選自於由甜味劑、矯味劑、著色劑及保藏劑所組成之組群中之一種或多種化學劑來提供藥學藥學上美感可口的製劑。錠劑含有活性成分混合適合用於錠劑之製造的無毒藥學上可接受之賦形劑。此等賦形劑例如可為惰性稀釋劑諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；造粒劑及崩散劑例如玉米澱粉或褐藻酸；黏結劑例如澱粉明膠或金合歡膠；及潤滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包衣，或可藉已知技術包衣來延長於胃腸道或牙周囊袋中的崩解及吸收，藉此提供較長時間持續作用。例如可使用時間延遲材料諸如一硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
供口腔使用之調配物也可呈硬明膠膠囊劑，其中活性成分混合惰性固體稀釋劑例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土；或呈軟凝膠膠囊劑，其中活性成分係混合水或油介質，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。
水性懸浮液劑含有活性材料混合適合用於製造水性懸浮液劑之賦形劑。此等賦形劑為懸浮劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、褐藻酸鈉、聚乙烯基吡咯啶酮、西黃蓍膠及金合歡膠；分散劑或濕潤劑可為天然磷脂例如卵磷脂或環氧烷與脂肪酸之縮合產物例如聚氧伸乙基硬脂酸酯或環氧乙烷與長鏈脂肪醇之縮合產物例如十七伸乙基氧鯨蠟醇、或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇之部分酯之縮合產物諸如聚氧伸乙基山梨糖醇一油酸酯、或環氧乙烷與衍生自脂肪酸及己糖醇酐之部分酯之縮合產物諸如聚伸乙基山梨聚糖一油酸酯。
水性懸浮液劑也可含有一種或多種保藏劑或抗微生物劑例如苯甲酸酯類諸如對羥苯甲酸-乙酯或-正丁酯，另一個實例為氯西汀(chlorhexidine)葡萄糖酸酯；一種或多種著色劑、一種或多種矯味劑及一種或多種甜味劑諸如蔗糖或糖精。
油性懸浮液劑之調配方式係經由將活性成分懸浮於植物油例如花生油、橄欖油、芝麻油、或椰子油，或懸浮於礦油諸如液體石蠟而製備。油性懸浮液劑可含有增稠劑例如蜂蠟、硬石蠟或鯨蠟醇。甜味劑諸如前文列舉者及矯味劑可添加至其中來提供可口的口腔製劑。此等組成物可藉添加抗氧化劑諸如抗壞血酸來保藏。
於又一面相中，本發明提供一種用於一個體診斷或監視牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之方法，包含使用前述嵌合或融合蛋白質來檢測於得自該個體之生物樣本中之抗牙齦紫單胞菌抗體。
於又另一面相中，本發明提供一種用於一個體診斷或監視牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之方法，包含使用前述抗體來檢測於得自該個體之生物樣本中牙齦紫單胞菌的存在。
於又另一面相中，本發明提供一種用以誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之胜肽，包括於SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列。於一個實施例中，該胜肽具有與SEQ ID No：17、18、25及26中之一者同源之序列。該胜肽可具有5個至40個胺基酸長度。
於又另一面相中，本發明提供一種核酸，其編碼具有SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列之胜肽。
於又另一面相中，本發明提供一種具有SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列之胜肽或編碼具有SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列之胜肽之核酸用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之嵌合或融合蛋白質之製造之用途。
於又另一面相中，本發明提供一種具有SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列之胜肽或編碼具有SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列之胜肽之核酸用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之用途。於一個實施例中，該胜肽係與一第二胜肽同時投予或循序投予，該第二胜肽包括：
(i)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(ii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或同源；或
(iii)部分或全部序列其係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或同源。
進一步藉下列實例舉例說明本發明，該等實例係含括用於舉例說明本發明而非限制性。
實例1 方法及材料
細菌種系及生長條件。 牙齦紫單胞菌W50之已凍乾的培養物於補充5微克/毫升氯高鐵血紅素(haemin)，0.5微克/毫升半胱胺酸之已溶解馬血瓊脂平板(HB瓊脂少於10次繼代培養)上於37℃無氧生長。經3至4日後，菌落用來接種含5微克/毫升氯高鐵血紅素、0.5微克/毫升半胱胺酸之腦心浸液培養基(1)。批次培養係於MK3無氧工作站(唐惠特尼科學公司(Don Whitley Scientific Ltd.)，澳洲，阿德萊德)無氧生長。細胞於指數生長期藉離心(7500g，30分鐘，4℃)收穫，及於無氧工作站使用PG緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2 、及5mM半胱胺酸-HCl、pH 8.0)洗兩次。使用分光光度計(型號295E，博金艾瑪公司(Perkin-Elmer))於650奈米監視批次培養的生長。培養純度藉革蘭氏染色、顯微鏡檢及使用根據Slots(2)之多種生物化學試驗例行性檢查。
含黏附素序列及黏附素序列與N-端添加Kgp蛋白酶序列之pET28構成體之構成。 表示活性位置(AS)及KgpA1黏附素(A1)功能部位之胜肽及嵌合胜肽之Kgp殘基於大腸桿菌使用pET表現載體(諾瓦金公司(Novagen))過度表現為有六-His標籤之重組(r)蛋白質。所表現之r蛋白質為rKAS2及rKLA1及r嵌合蛋白質為rKAS2-KLA1、rKAS1-KsA1及rKAS4-KAS3-KAS6-KLA1(也稱作為多KAS-KLA1)。表示多個A1及AS功能部位之胺基酸序列係說明於表1及表2。
kgp基因之多個KAS及KA1功能部位係使用表4列舉之引子、Taq DNA聚合酶(因維左金公司(Invitrogen))及PC-960熱循環器(科博研究技術公司(Corbett Research Technologies))，分別由pNS1(3.5kb BamHI lys片段於pUC18)或牙齦紫單胞菌基因體DNA擴增。引子對KAS2-FOR及KAS2-REV、以及KLA1-FOR及KLA1-REV使用下列反應條件分別產生編碼KAS2及KLA1之PCR片段：94℃、3分鐘，接著為28週期的94℃、45秒(變性)；62℃、40秒(煉合)及70℃、20秒(延伸)，接著為一個最末週期的72℃、5分鐘。
KAS2-KLA1嵌合PCR產物係藉如下重疊延伸(SOE化作用)藉基因剪接製造：PCR產物係使用前述條件使用引子對KAS2-FOR及KAS2-KLA1-嵌合體-REV以及KAS2-KLA1-嵌合體-FOR及KLA1-REV製造。然後PCR產物經過煉合，使用引子KAS2-FOR及KLA1-REV進行最終PCR(94℃，2分鐘，接著為28週期的94℃、30秒；50℃、30秒及72℃、40秒，接著為最末週期的72℃、5分鐘)。
用於製備KAS1-KsA1 PCR產物，使用KAS1-KsA1-REV引子進行連續兩次PCR，接續使用KAS1-KsA1-FOR引子1及2(反應條件94℃、2分鐘接著為35週期的94℃、15秒；63℃、30秒及72℃、2分鐘)製造KAS1-KsA1 PCR產物。KAS1-KsA1-FOR1及KAS1-KsA1-FOR2引子含有3’延伸部重疊先前PCR產物的5’。
用於製備多KAS-KLA1 PCR片段，使用多-REV引子進行連續四次PCR，接續使用多-FOR引子1、2、3及4(反應條件95℃、2分鐘接著為35週期的95℃、20秒；68℃、1.5分鐘)製造多KAS-KLA1 PCR產物。各個多-FOR引子含有3’延伸部重疊先前PCR產物之5’。
編碼KAS2、KLA1、KAS2-KLA1、KAS1-KsA1及多KAS-KLA1之全部PCR片段遵照製造商的指示使用PCR純化管柱(奎金公司(Qiagen))純化，接合入TA轉殖載體，皮金梯易(pGem-T Easy)(普米嘉公司(Promega))及轉形入大腸桿菌JM109。已純化的重組皮金梯易構成體使用NcoI及Xhol消化，及直接轉殖入經NcoI/Xhol消化之pET28b(諾瓦金公司)及轉形入非表現寄主大腸桿菌JM109[DH5α]。重組pET28構成體經純化及轉形入大腸桿菌表現載體、BL21(DE3)[HMS174(DE3)](諾瓦金公司)及遵照製造商的指示於含50微克康黴素(kanamycin)之LB上選擇。藉DNA序列分析證實各個插子的完好。
若有所需，寡核苷酸引子(表4)已經設計來結合限剪酶位置、中止密碼子及六-His標籤。用於rKAS2、rKLA1及rKAS2-KLA1之引子係設計用來限制含括額外編碼序列至r-蛋白質中不超過三個胺基酸加六-His標籤。rKAS及rKLA1係設計來於N端及C端分別含有六-His標籤，故可與於N端及C端二者具有六-His標籤的rKAS2-KLA1直接比較。於rKAS1-KsA1及r多KAS-KLA1中，該等六-His標籤係出現於C端。
重組蛋白質之表現與純化。 藉由使用異丙基β-D-硫半乳糖苷酶(IPTG)從pET28::KLA1(KAS2、KAS2-LA1、KAS1-SA1、多KAS-KLA1)構成體表現重組蛋白質。全部重組蛋白質皆製造為6-His標籤融合蛋白質且使用NI-NTA純化系統(因維左金公司)變性條件下純化。簡言之大腸桿菌(DE3)單一菌落轉形株用來接種含50微克/毫升康黴素之20毫升魯立亞-布塔尼(Luria-Bertani(LB))培養醪，於37℃於軌道振搖機上放置隔夜。然後本接種物用來接種1升含50微克/毫升康黴素的LB。本培養物之OD60 允許達到0.5-0.7(中對數期)，隨後使用0.1mM異丙基IPTG於37℃以200rpm振搖2小時誘導蛋白質表現。收穫細胞(7,500g)，再懸浮於變性結合緩衝液(8M尿素、20mM磷酸鈉pH 8.0 ＆ 500mM NaCl)及使用班森(Branson)索尼夫(Sonifer)250細胞崩解器(班森超音波公司(Branson Ultronics Corporation)，康乃迪克州丹博利)，微梢端設定於3，於冰上以30秒間隔經歷3次15秒叢發脈衝超音波振盪處理，然後於4℃於39,000g離心30分鐘。由上清液純化重組蛋白質，經由將上清液載荷至預先經過平衡之Ni-NTA瓊脂糖管柱上，然後使用變性洗滌緩衝液(8M尿素、20mM磷酸鈉pH 6.0 ＆ 500mM NaCl)洗滌來洗提出未結合的蛋白質。然後使用10倍體積量結合緩衝液B洗滌管柱，使用變性洗提緩衝液(8M尿素、20mM磷酸鈉pH 6.0、500mM NaCl ＆ 0.5M咪唑)洗提重組蛋白質。已純化之蛋白質對2M尿素-PBS透析，及儲存於-80℃。
藉SDS-PAGE分析重組蛋白質樣本，使用ProtParam線上(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)測定其分子量。全部樣本之蛋白質濃度係藉拜雷(Bio-Rad)蛋白質檢定分析使用BSA作為標準品測定。
免疫接種及小鼠牙周炎研究模型 。小鼠牙周炎實驗係如前文說明進行(3)，由墨爾本大學動物實驗倫理委員會核准。BALB/c小鼠6-8週齡(每組12頭小鼠)圈養於微隔離器內，使用各50微克重組蛋白質或RgpA-Kgp複體，2x109 經福馬林殺死的牙齦紫單胞菌種系W50細胞或PBS皮下免疫接種(s.c.100微升)；各抗原係於不完全弗氏輔劑(IFA)中調成乳液。30日後，小鼠以抗原追加接種(皮下注射，於IFA乳化)，然後於12日後從眼球後血管叢採血。第二次免疫接種後4日，小鼠自由給予康黴素(西革瑪亞利敘公司(Sigma-Aldrich)，澳洲新南威爾斯)1毫克/毫升於去離子水歷經7日。抗生素治療後3日(採血後2日)，小鼠經口接種1x1010 可存活牙齦紫單胞菌W50(25微升)於PG緩衝液(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl2 、及5mM半胱胺酸-HCl、pH 8.0)含2%(wt/vol)羧基甲基纖維素(CMC；西革瑪亞利敘公司，澳洲新南威爾斯)對照組係使用單含2%(wt/vol)CMC的PG緩衝液sham感染，接種4次，間隔2日。接種物係於無氧隔間內準備，然後即刻施用至上顎臼齒的牙齦邊緣。兩週後，小鼠又接受四劑(間隔2日)1x1010 細胞可存活牙齦紫單胞菌W50(25微升)於含2%(wt/vol)CMC的PG緩衝液。各個接種物中的可存活細菌數目經由於血瓊脂上計數證實。小鼠係餵飼軟性粉狀膳食(巴拉史塔克(Barastock)，澳洲)及圈養於裝備有升高線網籠底的籠內來防止接近褥墊。末劑給予後四週，小鼠由眼後血管叢放血及殺死，取出上顎，切成對半，一半(右半)用於齒槽骨流失之測量，而另一半(左半)用於即時-PCR。
右半上顎骨於去離子水中沸騰(1分鐘)，以機械方式除肉，及浸泡於2%(wt/vol)氫氧化鉀(16小時，25℃)。然後洗滌半個上顎(使用去離子水洗兩次)，浸泡於3%(wt/vol)過氧化氫(6小時，25℃)。於洗滌半個上顎(使用去離子水洗兩次)後，以0.1%(wt/vol)水性低甲基藍染色，半個上顎各自的頰側數位影像係使用奧林帕斯(Olympus)DP12數位相機架設於切片顯微鏡上拍攝，使用歐里西亞(OLYSIA)BioReport軟體3.2版(奧林帕斯澳洲公司，澳洲新南威爾斯)評估水平骨質流失。水平骨質流失係出現於水平面垂直於齒槽骨脊(ABC)的骨質流失，結果導致脊高度的減低。各半塊上顎經過校準，讓各牙齒影像的臼齒頰側齒尖及舌側齒尖重疊，使用微米尺規於框架內拍攝影像，因此各影像的測量值可標準化，使用歐里西亞BioReport軟體3.2版成像軟體測量各臼齒由釉質牙骨質接面(CEJ)至齒槽骨脊(ABC)的面積。使用隨機盲目方案藉單一檢驗者作骨質流失的測量兩次。
藉ELISA測定亞類抗體。 為了測定小鼠血清之亞類抗體反應，進行酶聯結免疫吸附檢定分析(ELISA)，重複三次，使用5微克/毫升經福馬林殺死的牙齦紫單胞菌W50於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(0.01M Na2 HPO4 、1.5mM KH2 PO4 、0.15M NaCl)、pH7.0含0.1%(vol/vol)吞恩(Tween)20(PBST)之溶液塗覆平底聚乙烯微力價孔板(戴納科技實驗室(Dynatech Laboratories)，維吉尼亞州麥克林)之各孔。於去除塗覆溶液後，含2%(wt/vol)脫脂乳粉的PBST添加至各孔來於室溫遮蔽未經塗覆的塑膠歷1小時。於各孔以PBST洗四次後，添加一系列稀釋的小鼠血清於含0.5%(wt/vol)脫脂乳PBST(SK-PBST)至各孔及於室溫培養16小時。各孔以PBST洗六次後，添加1/2,000山羊IgG稀釋液至小鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3(西革瑪公司，澳洲新南威爾斯)於SK-PBST且允許其於室溫結合2小時。孔板於PBST洗六次，辣根過氧化酶軛合兔抗山羊免疫球蛋白(西革瑪公司，澳洲新南威爾斯)於SK-PBST之1/5,000稀釋液添加至各孔及於室溫培養1小時。各孔以PBST洗六次後，經由添加100微升ABTS酶基質[0.9mM 2,2’-次偶氮-貳(3-乙基苯并-噻唑啉-6)磺酸於含0.005%(vol/vol)過氧化氫之80mM檸檬酸，pH 4.0]至各孔來檢測已結合的抗體。使用微孔板讀取器(拜雷微孔板讀取器，型號450)測量於415奈米之光密度。
SDS-PAGE凝膠電泳及西方墨點分析 。重組蛋白質(10微克)使用X細胞雪勒克迷你細胞(XCell surelock Mini-Cell)電泳系統分析。重組蛋白質混合於20微升還原性樣本緩衝液(10%[wt/vol]SDS、0.05%[wt/vol]溴酚藍、25%[vol/vol]甘油、及0.05%[vol/vol]2-巰乙醇)。使用1.5M Tris-HCl將pH調整至pH 8.0，然後溶液於100℃加熱5分鐘。重組蛋白質(10微克/線道)載荷至諾維克(Novex)12%(wt/vol)Tris-甘胺酸預先澆鑄的迷你凝膠上，使用30毫安培至50毫安培電流及125伏特電位差使用諾維克電泳系統(諾維克公司，加州聖地牙哥)進行電泳。使用0.25% w/v庫馬西藍R250讓蛋白質變成目測可見。
Kgp蛋白酶活性位置胜肽(KAS-2)序列之抗原決定部位分析 。使用Fmoc化學之標準固相胜肽合成方案，於多針(multipin)胜肽合成系統(奇隆技術公司(Chiron Technologies)，澳洲墨爾本)上藉合成N端生物素化重疊八個殘基胜肽(偏位一個殘基，重疊七個殘基)測定Lys-特異性蛋白酶活性位置胜肽KAS2(433-468 SEQ ID No：28)之抗體結合位置。生物素化胜肽(5微克/毫升)於0.1M PBS、pH 7.4結合至鏈絲菌抗生物素塗覆的孔板，於4℃放置隔夜(努克公司(Nunc)，澳洲新南威爾斯)。各孔使用PBS洗四次後，遵照奇隆技術公司的指示使用小鼠血清於1% w/v非脂脫脂乳粉於0.1M PBS、pH 7.4、含0.1%v/v吞恩20(SK-PBST)之1:1000稀釋液中藉ELISA進行於孔板結合之胜肽的抗原決定位置之拼圖。各孔以PBST洗六次後，山羊IgG對小鼠IgG之1/2,000稀釋液(西革瑪公司，澳洲新南威爾斯)添加於SK-PBST且允許其於室溫結合2小時。孔板於PBST洗六次，辣根過氧化酶軛合兔抗山羊免疫球蛋白(西革瑪公司，澳洲新南威爾斯)於SK-PBST之1/5,000稀釋液添加至各孔及於室溫培養1小時。各孔以PBST洗六次後，經由添加100微升ABTS酶基質[0.9mM 2,2’-次偶氮-貳(3-乙基苯并-噻唑啉-6)磺酸於含0.005%(vol/vol)過氧化氫之80mM檸檬酸，pH 4.0]至各孔來檢測已結合的抗體。使用微孔板讀取器(拜雷微孔板讀取器，型號450)測量於415奈米之光密度。
統計分析。 使用單向變因分析(ANOVA)及丹尼特氏T3試驗(用於微軟公司視窗(Windows)之SPSS，12版)進行骨質流失資料的統計分析。IgA、IgM、及IgG亞類抗體力價係使用SPSS軟體(用於微軟公司視窗之SPSS，12版)使用學生t試驗進行統計分析。
實例2
重組蛋白質(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1)之特徵化及純化 。為了特徵化Kgp黏附素A1功能部位片段及嵌合體Kgp蛋白酶與Kgp黏附素A1功能部位片段保護免於牙齦紫單胞菌感染的能力，發明人表現及純化重組蛋白質：-KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1。重組蛋白質(KsA1及KLA1)及重組嵌合體蛋白質(KAS1-KsA1及KAS2-KLA1)係使用鎳螯合親和層析術純化自包涵體，純化後之蛋白質藉SDS-PAGE分析(第1圖)。各個純化後之重組蛋白質包含一主要蛋白質帶，具有分子量40、36、31及32kDa分別係與KAS2-KLA1、KLA1、KsA1及KAS1-KsA1相對應，而此等分子量係與使用ProtParam計算得His-tag重組蛋白質之分子質量相對應。為了特徵化重組蛋白質之免疫原性，KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1用來免疫接種小鼠，而血清用來探測KAS2經胜肽塗覆之孔板及經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞塗覆之孔板(第2圖)。發現重組嵌合體蛋白質KAS1-KsA1及KAS2-KLA1抗血清於類似於KAS2特異性抗血清(KAS2-白喉類毒素軛合物)之位準可辨識KAS2胜肽(第2A圖)，以及辨識經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞(第2B圖)。但抗重組蛋白質KLA1之抗血清只能辨識已殺死的牙齦紫單胞菌W50細胞(第2B圖)。
實例3
於小鼠牙周炎研究模型中使用重組蛋白質(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1)免疫接種對牙齦紫單胞菌誘發齒槽骨骨質流失的影響。 重組蛋白質KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1、經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50及RgpA-Kgp複體用來基於Baker等人(4)之報告，使用已修改的小鼠牙周骨質流失研究模型，測定及比較對牙齦紫單胞菌誘發齒槽骨骨質流失之保護效果。小鼠使用重組蛋白質KsA1、KLA1、KAS1-KsA1或KAS2-KLA1、RgpA-Kgp複體或經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50(FK-W50)細胞或單獨PBS輔劑免疫接種(第0日及第30日)，然後以可存活的牙齦紫單胞菌W50經口挑釁。使用全部重組抗原、RgpA-Kgp複體及FK-W50細胞免疫接種，皆可保護BALB/c小鼠免於牙齦紫單胞菌誘發齒槽骨骨質流失，原因在於此等動物比較經PBS免疫接種組具有顯著(p<0.001)較低的骨質流失(第3圖)。但經KAS2-KLA1免疫接種小鼠比較以KLA1(p<0.01)、KsA1(p<0.001)、RgpA-Kgp複體(p<0.001)、FK-W50細胞(p<0.001)及未經挑釁的小鼠(p<0.001)免疫接種的小鼠具有顯著較低的骨質流失。KAS2-KLA1與KAS1-KsA1免疫接種小鼠間之骨質流失並無顯著差異。此外，KAS1-KsA1免疫接種小鼠具有比較未經挑釁之小鼠(p<0.01)及RgpA-Kgp複體免疫接種的小鼠(p<0.05)顯著較少的骨質流失，但與KsA1、KLA1、及FK-W50免疫接種的小鼠有顯著差異。經KsA1、KLA1、RgpA-Kgp複體及FK-W50免疫接種小鼠間之骨質流失並無顯著差異。
實例4
於小鼠牙周炎研究模型中經由使用重組蛋白質(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1)免疫接種誘生抗體亞類反應。 於使用可存活牙齦紫單胞菌細胞經口接種挑釁之前及之後，小鼠採血及藉離心收集血清。第4圖顯示於小鼠牙周炎研究模型中，各個免疫原(KsA1、KLA1、KAS1-KsA1或KAS2-KLA1或經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50(FK-W50)細胞)對經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞之抗體亞類反應性。全部保護性免疫原對FK-W50誘導高度IgG抗體力價。使用，各種保護性免疫原誘導的主要抗體亞類為IgG1只帶有微弱免疫反應性IgG2a、IgG2b及IgG3FK-W50-特異性抗體(第4圖)。經口接種前(第4A圖)及經口接種後(第4B圖)二者藉各免疫原誘生的主要抗體亞類為IgG1。
實例5
KAS2(433-468)之抗原決定部位拼圖。 對KAS2(433-468)之重疊生物素化八個殘基胜肽(偏移一個，重疊七個)經合成且用來塗覆經鏈絲菌抗生物素塗覆之孔板)。然後使用得自以KAS1-KsA1、KAS2-KLA1及KAS2-白喉類毒素軛合物免疫接種小鼠的抗血清識別抗體結合抗原決定部位(第5圖)。光密度(415奈米)兩倍增加高於背景數值被視為陽性抗體反應(臨界值OD)。抗血清辨識衍生自SEQ ID No.28之下列胜肽序列，亦即KAS1-KsA1辨識胜肽435-442、436-443、445-452、446-453及447-454(臨界值OD=0.07，第5A圖)，而KAS2-KLA1辨識胜肽435-442、447-454及448-455(臨界值OD=0.07，第5A圖)。如此提示辨識多個最小抗原決定部位，亦即胜肽436-442(VSFANYT及其變異株VVGFANYT)、胜肽447-452(ETAWAD及其變異株ETSWAD)、及胜肽448-453(TAWADP及其變異株TSWADP)。包括胜肽436-442抗原決定部位之胜肽包括GVSFANYT、GVGFANYT、VSFANYTA及VGFANYTA。包括胜肽447-452及/或448-453抗原決定部位之胜肽包括SETAWAD、SETSWAD、ETAWADP、ETSWAD、TAWADP及TSWADP，更特別GSETAWAD、GSETSWAD、SETAWADP、SETSWADP、ETAWADPL、ETSWADPL、TAWADPLL及TSWADPLL。
實例6
用於軛合至蛋白質之KAS及RAS胜肽之合成。
胜肽係手動合成或使用CEM微波胜肽合成器合成。整個過程使用用於Fmoc化學之標準固相胜肽合成方案。胜肽使用由Rink鏈接基衍生之AM-sure樹脂(AAPPTEC,KY,USA)組裝成羧醌胺形式。使用4當量Fmoc-胺基酸及6當量DIPEA，以HBTU/HOBt活化完成偶合。藉20%哌啶於1M HOBt/DMF移除Fmoc基。
載有KAS或RAS胜肽的樹脂於DMF中溶脹，藉2% v/v DBU於含2% v/v哌啶之DMF移除N端Frnoc基。然後使用5當量SAMA-OPfp及5當量HOBt使用S-乙醯基巰乙酸(SAMA)基衍生N端胺基。藉三硝苯磺酸(TNBSA)試驗監視反應。當得到陰性TNBSA試驗結果時，樹脂經洗滌(5 x DMF，3 x DCM及3 x乙醚)。然後樹脂於減壓下乾燥，依據胜肽之精胺酸含量而定，使用TFA：酚：TIPS:EDT：水(92:2:2:2:2)裂解混合液進行由樹脂載體裂解胜肽歷經2.5小時或4小時。裂解後，樹脂藉過濾移除，於氮流下將濾液濃縮至約1毫升。於胜肽產物於冷醚沉澱後，離心及洗滌3次。胜肽沉澱溶解於5毫升至10毫升含0.1% v/v TFA之水，不溶性殘餘物藉離心去除。胜肽藉RP-HPLC純化。
多個不同化學部分可用於衍生用來軛合至蛋白質的胜肽，如此將導入反應性基團諸如；鹵基(溴、氯及碘)、順丁烯二醯亞胺基、丁二醯亞胺基、肼基、肟基、巰基，然後將已衍生的胜肽經由其天然半胱胺酸殘基軛合至蛋白質諸如KgpA1，或已經使用互補反應性基團衍生而允許化學接合反應進行而形成胜肽-蛋白質軛合物。
SAMA-胜肽軛合至KA1 。於含10毫克/毫升重組KA1或RgpA-Kgp複體之其它黏附素功能部位於磷酸鹽緩衝食鹽水(0.1M磷酸鈉，0.9% NaCl，pH 7.4)之溶液內，添加0.1毫升1% w/v溶液間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥丁二醯亞胺酯(MBS)於DMF之溶液。30分鐘後，去除未反應之MBS，及使用於軛合緩衝液(0.1M磷酸鈉，5mM EDTA；pH 6.0)平衡的PD10管柱(法瑪西亞公司(Pharmacia)，澳洲新南威爾斯)藉凝膠過濾收集經MBS改性之KA1。已純化之SAMA-胜肽(1.3微莫耳)溶解於200微升含0.5M Tris;2mM EDTA,pH 6.0之6M胍HCl，以800微升米立丘(MilliQ)水稀釋，藉添加25微升2M NH2 OH(40當量)溶解於米立丘水原位脫去保護。所收集之MBS-KA1即刻與已脫保護之SAMA-胜肽反應，於室溫攪拌1小時。使用於PBS pH 7.4平衡的PD10管柱，藉凝膠過濾由未反應之胜肽分離胜肽-KA1軛合物及冷凍乾燥。使用Ellmans試驗監視反應。
實例7
抗體之製備 。經由使用蛋白質皮下接種，於小鼠提引出抗重組蛋白質之多株抗血清。於第0日，使用25微克蛋白質於不完全弗氏輔劑接種小鼠，及於第30日使用25微克蛋白質於不完全弗氏輔劑接種小鼠。免疫接種係使用標準程序進行。獲得對蛋白質有高力價之多株抗血清。若有所需，使用標準程序獲得特異性針對對抗重組蛋白質之單株抗體。
實例8
用於產生抗體之免疫接種 。BALB/c小鼠或CD1(瑞士遠親小鼠)6-8週齡(每組10頭小鼠)皮下免疫接種(s.c. 100微升)50微克KAS2-LA1嵌合體及於不完全弗氏輔劑(IFA)乳化的抗原。30日後，小鼠以抗原追加接種(皮下注射，於IFA乳化)，12日後殺死小鼠，由心臟採血收集血清。
藉ELISA測定亞類抗體 。為了測定小鼠血清之亞類抗體反應，重複三次進行酶聯結免疫吸附檢定分析(ELISA)，使用5微克/毫升KAS2-LA1嵌合體或經福馬林殺死的牙齦紫單胞菌W50或RgpA-Kgp複體於含0.1%(vol/vol)吞恩20之磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)(0.01M Na2 HPO4 、1.5M KH2 PO4 、0.15M NaCl)、pH 7.0(PBST)之溶液來塗覆平底聚乙烯微力價孔板戴納科技實驗室，維吉尼亞州麥克林)之各孔。於移除塗覆溶液後，含2%(wt/vol)脫脂乳粉之PBST添加至各孔來於室溫至各孔遮蔽未經塗覆的塑膠歷1小時。於各孔以PBST洗四次後，添加一系列稀釋的小鼠血清於含0.5%(wt/vol)脫脂乳之PBST(SK-PBST)至各孔，及於室溫培養16小時。各孔以PBST洗六次後，山羊IgG抗小鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3(西革瑪公司，澳洲新南威爾斯)之1/2,000稀釋液添加於SK-PBST，允許其於室溫結合2小時。孔板於PBST洗六次，辣根過氧化酶軛合兔抗山羊免疫球蛋白(西革瑪公司，澳洲新南威爾斯)之1/5,000稀釋液於SK-PBST添加至各孔及於室溫培養1小時。各孔以PBST洗六次後，經由添加100微升ABTS酶基質[0.9mM 2,2’-次偶氮-貳(3-乙基苯并-噻唑啉-6)磺酸於含0.005%(vol/vol)過氧化氫之80mM檸檬酸，pH 4.0]至各孔來檢測已結合的抗體。使用微孔板讀取器(拜雷微孔板讀取器，型號450)測量於415奈米之光密度。
於遠親(CD1，瑞士)小鼠藉重組蛋白質KAS2-KLA1免疫接種誘生抗體亞類反應。CD1(瑞士)小鼠使用KAS2-LA1嵌合體免疫接種，採血，藉離心收集血清。第6圖顯示對KAS2-LA1嵌合體、經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞及RgpA-Kgp複體之抗體亞類反應性。KAS2-LA1嵌合體誘生強力IgG抗體，主要具有IgG1抗體反應，其辨識KAS2-LA1嵌合體且與FK牙齦紫單胞菌W50細胞及RgpA-Kgp複體強力交叉反應(第6圖)。此外，KAS2-LA1嵌合體只誘導微弱免疫反應性IgG2a、IgG2b及IgG3抗原特異性抗體(第6圖)。
實例9
Kgp結構模型的發展與活性位置表面可接取序列之識別。
發明人之研究工作顯示Kgp蛋白酶活性位置胜肽具高度免疫原性，且誘導對抗牙齦紫單胞菌誘生骨質流失之高度保護作用。試圖識別額外蛋白酶活性位置胜肽為疫苗候選者的嘗試中，使用Sybyl 7.3內部之Orchestrar套裝程式發展出Kgp之催化功能部位研究模型(第7圖)。模型係基於得自牙齦紫單胞菌之RgpB蛋白酶之PDB結構1crv，蛋白質具有23.58%成對身分，及Z分數為25.09(高信度模型)。Meta-PPisp蛋白質交互作用伺服器預測用於Kgp之兩個蛋白質-蛋白質交互作用表面：酶基質結合表面(如同於RgpB)，及Kgp獨特的第二表面。RgpB模型及Kgp模型間的主要差異係在於框出第二交互作用表面及於Kgp無法模型化落入第二交互作用表面內部的19-殘基間隙(Val526至Phe545)之迴路。第7圖顯示Kgp模型，較粗的帶子顯示環繞Kgp之蛋白酶活性位置之表面可接取序列，發現表面可接取序列為Asp388-Gln394、Leu421-Ala423、Ala443-Glu447帶有Ala451、Asn510-Trp513、及Ile570-Gly577帶有Tyr580。由該模型(第6圖)，顯然連同KAS2(A)，另三序列KAS4(Asp388-Val395)(B)、KAS5(Asn510-Asp516)(C)及KAS6(Ile570-Tyr580)(D)為顯著，且有足夠長度來成為疫苗標靶。如此可製造重組嵌合體蛋白質，各胜肽係符合序列且係接合至KLA1 N-端來製造多KAS-KLA1，其可用來誘生免疫反應且因而保護免於牙齦紫單胞菌相關病症或疾病。
實例10
模型化Arg-X-蛋白酶來識別旁出催化位置之免疫原區之方法。
根據Eichinger A、Beisel HG、Jacob U、Huber R、Medrano FJ、Banbula A、Potempa J、Travis J、Bode W.牙齦素(gingipain)R之晶體結構：帶有似卡斯伯酶(caspase)摺疊之Arg-特異性細菌性半胱胺酸蛋白酶。EMBO J. 1999年10月15日；18(20):5453-62之方法測定Arg-X-蛋白酶三維結構。
實例11
以下為含抗體之牙膏調配物之實例。
實例12
以下為牙膏調配物之實例。
實例13
以下為牙膏調配物之實例。
實例14
以下為牙膏調配物之實例。
實例15
以下為液體牙膏調配物之實例。
實例16
以下為漱口水調配物之實例。
實例17
以下為漱口水調配物之實例。
實例18
以下為口含片調配物之實例。
實例19
以下為牙齦按摩霜調配物之實例。
實例20
以下為口香膠調配物之實例。
實例21
以下為藥學調配物之實例。
實例22
以下為牙周凝膠調配物之實例。
須瞭解此處雖然已經以細節說明本發明，但實例僅供舉例說明之用。對分子生物學、牙科診斷學及相關學理技藝界之熟諳技藝人士顯然易知之本發明之實施例之其它修改例意圖皆係落入於本發明之範圍。
參考文獻
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第1圖顯示重組Kgp蛋白質之SDS-PAGE凝膠之庫馬西藍染色。線道1=KAS2-KLA、線道2=KLA1、線道3=KsA1、線道4=KAS1-KsA1。分子量標記係以kDa指示。
第2圖顯示KAS2胜肽及經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞之抗體確認。(A)KAS2胜肽係使用對經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞(FK-W50)提引出之抗血清、重組蛋白質KAS1-KsA1、KAS2-KLA1、及合成KAS2-DT軛合物及PBS於ELISA探測。(B)經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞係使用對經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌W50細胞(FK-W50)提引出之抗血清、重組蛋白質KAS1-KsA1、KAS2-KLA1、KLA1及PBS於ELISA探測。抗體反應係以所得ELISA力價OD415 減背景位準之雙倍表示，各力價表示三個數值之平均±標準差。
第3圖顯示以重組蛋白質及重組嵌合體蛋白質、經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌及單獨輔劑(PBS、IFA)免疫接種之小鼠或未經口感染(未經挑釁)小鼠之牙齦紫單胞菌誘發上顎臼齒之水平骨質流失。本圖中，KAS2-KLA1係顯示為AS2-LA1、KLA1係顯示為LA1、KAS1-KsA1係顯示為AS1-sA1、KsA1係顯示為sA1。骨質流失之測量值為左上顎骨及右上顎骨二者各自的上顎臼齒之頰側由釉質牙骨質接面(CEJ)至齒槽骨脊(ABC)以平方毫米(mm2 )測量得之面積之平均值。藉李文氏(Levene’s)變因均質度測量，資料為常態分布，且係以平方毫米表示之平均值(n=12)呈現，且使用單向變因分析及丹尼特氏(Dunnett’s)T3測試分析。*指示比較對照(感染)組具有顯著(P<0.001)較少骨質流失之組。指示比較AS2-LA1組具有顯著(P<0.001)較多骨質流失之組。
第4圖顯示於牙周炎研究模型中已免疫接種小鼠之血清抗體亞類反應。得自小鼠之血清A(經口接種之前)及B(經口接種之後)係以重組蛋白質KsA1、KLA1、KAS1-KsA1及KAS2-KLA1免疫接種及經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50用於ELISA，以經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50作為吸附抗原。抗體反應IgG(黑柱)、IgG1(灰柱)、IgG2a(白柱)、IgG2b(水平條紋柱)、及IgG3(對角線條紋柱)係以所得ELISA力價(log2)減背景位準表示，各力價表示三個數值之平均值±標準差。
第5圖顯示對表示KAS2胜肽序列433-468之重疊胜肽之胜肽特異性抗體反應性之PEPSCAN分析。(A)以KAS1-KsA1(白柱)、KAS2-KLA1(黑柱)、抗血清探測之KAS2重疊胜肽(偏移值1，重疊7)。(B)以KAS2-DT軛合物抗血清探測之KAS2重疊胜肽(偏移值，重疊7)。各柱顯示抗體反應性(於415奈米之光密度[OD])。
第6圖。嵌合體AS2-LA1於遠系小鼠誘導抗體反應其確認牙齦紫單胞菌全細胞及RgpA-Kgp複體。CD1遠系小鼠使用嵌合體AS2-LA1免疫接種(50毫克/小鼠)，收集的血清用於使用AS2-LA1之ELISA(A)、經福馬林殺死之牙齦紫單胞菌種系W50(B)、及RgpA-Kgp複體(C)作為吸收抗原之ELISA。本圖中，KAS2-KLA1顯示為AS2-LA1。各免疫球蛋白同型對各抗原之力價經測定，資料係以所得ELISA力價(‘000)減背景位準之雙倍表示，各力價代表三個數值之平均值±標準差。
第7圖。Kgp蛋白酶之蛋白質模型。KAS2[Asn433-Lys468](A)、KAS4[Asp388-Va1395](B)、KAS5[Asn510-Asp516](C)及KAS6[Ile570-Tyr580](D)。

Claims (59)

  1. 一種用於誘導對牙齦紫單胞菌(Porphyromonas gingivalis)之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括第一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至第二胜肽或多肽，其中：(A)該第一胜肽包括：(i)一序列之部分或全部，該序列係與SEQ ID No：1所示序列相同或至少90%同源；或(ii)一序列之部分或全部，該序列係與SEQ ID No：2所示序列相同或至少90%同源；(B)該第二胜肽或多肽包括：(i)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(ii)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(iii)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或至少90%同源；其中上述任一序列之該部分能夠誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應。
  2. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括示於SEQ ID No：3或4之序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括於SEQ ID No：5至8中之一者所示序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括SEQ ID No：9至12中之一者所示序列。
  5. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括SEQ ID No：13至18中之一者所示序列。
  6. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括SEQ ID No：19至26中之一者所示序列。
  7. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括SEQ ID No：27至30中之一者所示序列。
  8. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括於SEQ ID No：31至34中之一者所示序列。
  9. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括與SEQ ID No：3至34中之一者至少90%同源之序列。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之嵌合或融合蛋白質，其中該第二胜肽或多肽包括SEQ ID No：35所示序列或其片段，該片段包括SEQ ID No：36所示序列。
  11. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之嵌合或融合蛋白質，其中該第二胜肽或多肽包括SEQ ID No：36或37所示序列。
  12. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中：(a)該第一胜肽包括SEQ ID No：27至30中之一者所示序列；及 (b)該第二胜肽或多肽包括SEQ ID No：36或37所示序列。
  13. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之嵌合或融合蛋白質，其中該第二胜肽或多肽包括SEQ ID No：38所示序列或其片段，該片段包括SEQ ID No：39所示序列。
  14. 如申請專利範圍第13項之嵌合或融合蛋白質，其中該第二胜肽或多肽包括SEQ ID No：39所示序列。
  15. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中：(a)該第一胜肽包括SEQ ID No：31至34中之一者所示序列；及(b)該第二胜肽或多肽包括SEQ ID No：39所示序列。
  16. 一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之嵌合或融合蛋白質，該蛋白質包括一胜肽直接接合或經由一鏈接基接合至一多肽，其中：(A)該胜肽包括：(i)一序列之部分或全部，該序列係與SEQ ID No：1所示序列相同或至少90%同源；或(ii)一序列之部分或全部，該序列係與SEQ ID No：2所示序列相同或至少90%同源；(B)該多肽包括：(i)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(ii)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌 之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(iii)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或至少90%同源；其中上述任一序列之該部分能夠誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應。
  17. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括示於SEQ ID No：3或4之序列。
  18. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括於SEQ ID No：5至8中之一者所示序列。
  19. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括SEQ ID No：9至12中之一者所示序列。
  20. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括SEQ ID No：13至18中之一者所示序列。
  21. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括SEQ ID No：19至26中之一者所示序列。
  22. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括SEQ ID No：27至30中之一者所示序列。
  23. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括於SEQ ID No：31至34中之一者所示序列。
  24. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該胜肽包括與SEQ ID No：3至34中之一者至少90%同源之序列。
  25. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該多肽包括SEQ ID No：35所示序列或其片段，該片段包括SEQ ID No：36所示序列。
  26. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該多肽包括SEQ ID No：36或37所示序列。
  27. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中：(a)該胜肽包括SEQ ID No：27至30中之一者所示序列；及(b)該多肽包括SEQ ID No：36或37所示序列。
  28. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中該多肽包括SEQ ID No：38所示序列或其片段，該片段包括SEQ ID No：39所示序列。
  29. 如申請專利範圍第28項之嵌合或融合蛋白質，其中該多肽包括SEQ ID No：39所示序列。
  30. 如申請專利範圍第16項之嵌合或融合蛋白質，其中：(a)該胜肽包括SEQ ID No：31至34中之一者所示序列；及(b)該多肽包括SEQ ID No：39所示序列。
  31. 如申請專利範圍第1至9、12、15或16至30項中任一項之嵌合或融合蛋白質，包括至少一個額外胜肽其中：(C)該額外胜肽包括：(i)一序列部分或全部，該序列係與SEQ ID No：1所示序列相同或至少90%同源；或(ii)一序列部分或全部，該序列係與SEQ ID No：2 所示序列相同或至少90%同源；或(iii)一序列部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(iv)一序列部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(V)一序列部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或至少90%同源；其中上述任一序列之該部分能夠誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應。
  32. 如申請專利範圍第1至9、12、15或16至30項中任一項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽之C-端殘基係直接或透過鏈接基共價鏈接至該第二胜肽或多肽之N-端殘基，或其中該胜肽之C-端殘基係直接或透過鏈接基共價鏈接至該多肽之N-端殘基。
  33. 如申請專利範圍第1至9、12、15或16至30項中任一項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽之N-端殘基係直接或透過鏈接基共價鏈接至該第二胜肽或多肽之C-端殘基，或其中該胜肽之N-端殘基係直接或透過鏈接基共價鏈接至該多肽之C-端殘基。
  34. 如申請專利範圍第1至9、12、15或16至30項中任一項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽係透過長度至多15 個胺基酸之一鏈接基接合至該第二胜肽或多肽，或其中該胜肽係透過長度至多15個胺基酸之一鏈接基接合至該多肽。
  35. 一種組成物，包括如申請專利範圍第1至34項中任一項之嵌合或融合蛋白質。
  36. 如申請專利範圍第35項之組成物，進一步包括一輔劑。
  37. 一種如申請專利範圍第1至34項中任一項之嵌合或融合蛋白質或如申請專利範圍第35或36項之組成物於製造一藥物之用途，該藥物係用於一個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度。
  38. 一種對如申請專利範圍第1至34項中任一項之嵌合或融合蛋白質提引出之抗體。
  39. 如申請專利範圍第38項之抗體，其為單株抗體。
  40. 一種如申請專利範圍第38或39項之抗體於製造一藥物之用途，該藥物係用以於一個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之發生率或嚴重程度。
  41. 一種核酸分子，包括編碼如申請專利範圍第1至34項中任一項之嵌合或融合蛋白質之一序列。
  42. 如申請專利範圍第41項之核酸分子，其中該序列係操作式鏈接至至少一個調節元體。
  43. 一種載體，包括如申請專利範圍第41或42項之核酸分子。
  44. 如申請專利範圍第43項之載體，其為病毒性或細菌性疫苗載體。
  45. 一種原核或真核細胞，包括如申請專利範圍第41或42項之核酸分子或如申請專利範圍第43或44項之載體。
  46. 一種如申請專利範圍第41或42項之核酸分子、如申請專利範圍第43或44項之載體、或如申請專利範圍第45項之原核或真核細胞於製造一藥物之用途，該藥物係用以於一個體預防或減低牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之嚴重度。
  47. 一種用於一個體診斷或監視牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之方法，包括使用如申請專利範圍第1至34項中任一項之嵌合或融合蛋白質來活體外檢測於得自該個體之生物樣本中之抗牙齦紫單胞菌抗體。
  48. 一種如申請專利範圍第1至34項中任一項之嵌合或融合蛋白質之用途，其係用於活體外檢測於得自一個體之生物樣本中之抗牙齦紫單胞菌抗體。
  49. 一種用於一個體診斷或監視牙齦紫單胞菌相關病症或疾病之方法，包括使用如申請專利範圍第38或39項之抗體來活體外檢測於得自該個體之生物樣本中牙齦紫單胞菌之存在。
  50. 一種如申請專利範圍第38或39項之抗體之用途，其係用以活體外檢測於得自一個體之生物樣本中牙齦紫單胞菌之存在。
  51. 一種用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應之胜肽，包括SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列，或與其至少90%同源之序列。
  52. 如申請專利範圍第51項之胜肽，其中該胜肽係SEQ ID No：17、18、25及26中之一者所示序列。
  53. 如申請專利範圍第51或52項之胜肽，該胜肽具有5個至40個胺基酸長度。
  54. 一種核酸，編碼如申請專利範圍第51至53項中任一項之胜肽。
  55. 一種如申請專利範圍第51至53項中任一項之胜肽或如申請專利範圍第54項之核酸於製造一嵌合或融合蛋白質之用途，該嵌合或融合蛋白質係用以誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應。
  56. 一種如申請專利範圍第51至53項中任一項之胜肽用於製備一藥物的用途，該藥物係用於誘導對牙齦紫單胞菌之免疫反應。
  57. 如申請專利範圍第56項之用途，其中該胜肽係與一第二胜肽或多肽同時或循序投予，該第二胜肽或多肽包括：(i)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Lys-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(ii)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之Arg-X-蛋白酶之黏附素功能部位的序列相同或至少90%同源；或(iii)一序列之部分或全部，該序列係與牙齦紫單胞菌之HagA黏附素功能部位之序列相同或至少90%同源；其中上述任一序列之該部分能夠誘導對牙齦紫單胞菌 之免疫反應。
  58. 如申請專利範圍第1項之嵌合或融合蛋白質，其中該第二胜肽或多肽包括或由SEQ ID No：69至79中之一者或多者或83至85中之一者或多者所示序列所組成。
  59. 如申請專利範圍第58項之嵌合或融合蛋白質，其中該第一胜肽包括或由SEQ ID No：3至26中之一者或多者或SEQ ID No：64至68中之一者或多者所示序列所組成。
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