JP2000510817A - 歯周病の診断および治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はPorphyromonas gingivalisのPrtR-PrtK細胞表面タンパク質、特に、PrtRおよびPrtKタンパク質を含む多量体細胞結合タンパク質複合体に関する。そして、本発明はPorphyromonas gingivalisに対する抗体応答を生起させるのに使用するための、実質的に精製された抗原複合体を提供する。該複合体は、それぞれが１以上のアドヘシンドメインを含有するアルギニン特異性およびリジン特異性チオールエンドペプチダーゼの多量体タンパク質複合体を１以上含み、分子量は約200kDaより大きい。また本発明は、P.gingivalisが関係する歯周病の検出、予防および治療のための、この複合体を基礎とする医薬組成物および関連薬剤にも関係する。

Description

【発明の詳細な説明】 歯周病の診断および治療 発明の分野 本発明はPorphyromonas gingivalisのPrtR-PrtK細胞表面タンパク質、ならび に特にPrtRおよびPrtKタンパク質を含む多量体(multimeric)細胞結合タンパク質 複合体に関する。また、本発明はP.gingivalisに関連する歯周病の検出、予防お よび治療のための、この複合体を基礎とする医薬組成物および関連薬剤に関する 。 発明の背景 歯周病は細菌が関係する歯の支持組織の炎症疾患であり、歯肉組織の非特異的 で可逆的な炎症である、比較的軽症の歯肉炎から歯の支持組織の破壊に特徴があ るより劇症の歯周炎までの範囲がある。歯周炎は特定のグラム陰性細菌の集合体 の歯肉下(subgingival)の感染が関係し、歯周組織の破壊に至り、公衆衛生上大 きな問題である。相当関心を呼んでいる細菌の一つはP.gingivalisである。なぜ ならば成人の歯周炎病変からのこの微生物の回収は歯肉下の嫌気的に培養可能な フローラ(flora)の50％に上り、一方正常な部位からはP.gingivalisはほとんど 回収されず、したがって少数だからである。歯肉下プラーク中のP.gingivalisレ べルの相対的な増加は歯肉炎の悪化に関係があり、培養可能な歯肉下の微生物集 団の根絶にともなって病気が消失する。P.gingivalisの歯肉下植菌による非ヒト 霊長類における歯肉炎病変の進行が証明された。動物およびヒトの両方における これらの知見は成人歯周炎の発症についてのP.gingivalisの重要な役割を示唆し ている。 P.gingivalisは特定のアミノ酸の代謝からエネルギーを獲得する、黒色色素性 、嫌気性、井糖分解性、タンパク質分解性グラム陰性桿菌である。この微生物は 鉄、特にヘムまたはそのFe(III)酸化物のヘミンについて完全生育要求性であり 、実験動物では過剰ヘミン条件下で生育させたとき、強い毒性となる。P.gingiv allsの病原性については、莢膜、アドヘシン(adhesin)、細胞毒および細胞外加 水分解酵素を含む多数の毒性因子が関係するとされてきた。特に、プ ロテアーゼ類が構造タンパク質および防御に関するその他のタンパク質を含む広 い範囲にわたる宿主タンパク質を分解するその能力の点で大きな関心をよせられ てきた。P.gingivalisのタンパク質分解活性の基質であることがわかったタンパ ク質として、コラーゲンＩおよびIV型、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、 ラミニン、補体および血漿凝固カスケードタンパク質、α₁-抗トリプシン、α₂- マクログロブリン、抗キモトリプシン、抗トロンビンIII、抗プラスミン、シス タチンＣ、IgGおよびIgAが含まれる。この生物に関係する主要なタンパク質分解 活性が基質特異性によって定義されたが、それは“トリプシン様”、すなわちア ルギニンおよびリジン残基のカルボキシル側の開裂ならびにコラーゲン分解性で ある。しかし、その他の少数の活性も報告されている。 P.gingivalisのトリプシン様タンパク質分解活性は、補体を分解して生物学的 に活性なＣ5aを産生し、表面受容体を修飾することによって好中球の食細胞性お よびその他の機能を障害し、フィブリノーゲンの凝固能力を阻害して凝固時間を 延長することがわかった。P.gingivalisのトリプシン様タンパク質分解活性は、 またヒトIgG1からFc断片を産生して、単核細胞からの前炎症性サイトカインの放 出を刺激し、そしてこのことはカリクレイン−キニンカスケードの活性化による 血管破裂(disruption)および血管浸透の強化に関係する。トリプシン様活性が減 少したP.gingivalisの自然発生突然変異株およびトリプシン様プロテアーゼイン ヒビター、N-p-トシル-L-リジンクロロメチルケトンで処理した野性型細胞は動 物モデルにおいて無毒性である。さらに、制御されたヘミン過剰条件下で生育さ せたP.gingivalisの方が、ヘミンを制限した以外は同一の条件下で生育させた細 胞に比較して、より強いトリプシン様活性とより低いコラーゲン分解活性を発現 し、そしてマウスにおいて毒性が強いことが示された。毒性がより強いP.gingiv alisによる増大したトリプシン様活性の発現は、トリプシン様タンパク質分解活 性が感染または疾病の主要な決定因子であるという推定を導いた。しかし、現在 のところこのP.gingivalisの細胞結合トリプシン様タンパク質分解活性は特性決 定されていない。 細胞を含まない培養液からP.gingivalisのトリプシン様プロテアーゼを精製し て特性決定するための努力がかなり行なわれてきた。Chenら、(1992)［J Biol Chem 267:18896-18901］はP.gingivalis H66の培養液から50kDaのアルギニン特 異性チオールプロテアーゼを精製して特性決定し、Arg-gingipainと命名した。 同様のアルギニン特異性チオールプロテアーゼがJP 07135973に開示され、その アミノ酸配列がWO 9507286およびKirszbaumら、1995[Biochem Biophys Res Comm 207:424-431]に開示されている。Pikeら(1994)［J Biol Chem 269:406-411］は P.gingivalis H66の培養液から60kDaのリジン特異性システインプロテイナーゼ を特性決定し、Lys-gingipainと命名し、この酵素についての部分的遺伝子配列 がWO 9511298に開示され、そしてWO 9617936に完全に開示された。しかし、本発 明の開発以前には、P.gingivalisの細胞表面に、300kDaの、ともにアドヘシンド メインを含有するアルギニン特異性およびリジン特異性プロテアーゼの複合体が 存在することは知られていなかった。この300kDaの複合体はPrtR-PrtK複合体と 命名された。この、アドヘシン活性とともにアルギニン特異的およびリジン特異 的タンパク質分解活性の両方を示すPrtR-PrtK細胞表面複合体の存在はそれまで 知られていなかった。その上、本発明のこの新規なPrtR-PrtK複合体は細胞表面 に発現され、主要な毒性関連因子(virulence-associated factor)であり、個々 のドメインでは示されない独特のエピトープを含有する。それ以前に開示された アルギニン特異性およびリジン特異性チオールプロテアーゼは、論述されている ように、これらの特徴のいずれをも示さず、これまでのところ応用に限界がある ことが証明された。しかし、前記の特徴によって、本発明のPrtR-PrtK複合体は 診断用および免疫学的製品として理想的なものとなった。したがって、該PrtR-P rtK細胞表面複合体は診断、ならびに中和性抗体を含有する口内組成物を介した 受動免疫およびワクチンの開発による中和のために、特に重要である。特に、口 内組換え細菌ワクチンの開発にとって重要である。この場合、不活性化PrtR-Prt Kを発現する組換え細菌は一般的に遺伝子操作された口腔共生常在菌である。 発明の要約 したがって、第１の様相において、本発明は、Porphyromonas gingivalisに対 する抗体の応答を生起させるのに使用するための実質的に精製された抗原複合体 であって、この複合体がそれぞれ１以上のアドヘシンドメインを含有するアル ギニン特異性およびリジン特異性チオールエンドペプチダーゼの多量体タンパク 質複合体１以上を含み、かつこの複合体が約200kDa以上の分子量を有するもので 構成される。 この開示中、用語「アドヘシン」および「血球凝集素(hemagglutinin)」は同 義と考えることができる。 本発明の好ましい形態において、多量体タンパク質複合体はPorphyromonas gi ngivalisの毒性菌株に関係し、好ましくは約294から約323kDaの分子量を有し、 好ましくはP.gingivalis W50から誘導される。 また、多量体タンパク質が９タンパク質で構成されるものが好ましい。これら の９タンパク質は好ましくは以下のN-末端配列： を有する。 ここに記載するように、この９タンパク質がPrtK48，PrtR45，PrtR44，PrtK39 ，PrtK44，PrtR27，PrtR17，PrtK15およびPrtR15であるものが今のところ好まし い。 精製した抗原複合体は普通は酵素活性を有するので、多くの使用においてはチ オールエンドペプチダーゼを不活性化することが好ましい。これは多くの方法、 例えば、酸化または変異によって、達成することができる。ここでは酸化による 不活性化が好ましい。 本発明のさらに別の好ましい態様において、多量体タンパク質複合体が図８Ｂ および図９Ｂに示すＤＮＡ配列によってコードされる。 第２の様相において、本発明はPorphyromonas gingivalisに対する免疫応答を 誘発するのに使用するための組成物であって、この組成物が本発明の第１の様相 の複合体の有効量および好適なアジュバントおよび／または許容可能な担体を含 むもので構成される。 第３の様相において、本発明は本発明の第１の様相の複合体に対して特異的な 抗体を含む抗体調製品で構成される。この抗体はポリクローナル抗体でもモノク ローナル抗体でもよい。 第４の様相において、本発明はPorphyromonas gingivalis感染症に罹患した患 者の治療方法であって、この方法はPorphyromonas gingivalisのPrtR-PrtK複合 体を少なくとも部分的に中和するのに有効な量の本発明の第３の様相の抗体調製 品を患者に投与することを含むもので構成される。 当業者によって認識されるように、抗体調製品は多数の周知の経路のいずれに よっても投与することがができるが、ここでは調製品を経口投与するのが好まし い。 第５の様相において、本発明は個体におけるP.gingivalis感染の危険性および ／または疾病の程度を減少させる方法で構成され、この方法は個体におけるP.gi ngivallsに対する免疫応答を誘導するのに有効な量の本発明の第２の様相の組成 物を個体に投与するものである。 さらに別の様相において、本発明は組換え宿主細胞で構成され、この宿主細胞 は、適当な条件下で宿主細胞がPrtR-PrtKを発現するように配列を制御するため に機能的に連結した、PrtR-PrtKをコードするＤＮＡ配列（群）で形質転換され たものである。 別の様相において、本発明は、適当な宿主細胞中でPrtR-PrtKタンパク質を発 現し、これから発現したタンパク質を精製する目的で使用することができる、Pr tR-PrtK構築物が含まれる新規ＤＮＡ配列、およびプラスミドＤＮＡならびにヒ トウイルス、動物ウイルス、昆虫ウイルスまたはバクテリオファージなどのウイ ルスＤＮＡを含むベクターを対象とする。本発明の別の様相はPrtR-PrtK複合体 をコードする遺伝子の分子クローニング方法を提供する。本発明の核酸配列は、 核酸のハイブリダイゼーションによって、ならびに核酸の増幅および増幅し た核酸を検出する際のプライマーおよび／またはプローブとしての使用のための PrtR-PrtK配列特異的オリゴヌクレオチドの合成を含めて、P.gingivalis遺伝物 質(genetic material)の分子診断アッセイに使用することができる。その上、Pr tR-PrtK複合体はP.gingivalisの病原性菌株に対する予防および／または治療用 ワクチン製剤の免疫原として使用することができる。この免疫原は化学的に合成 、P.gingivalisから精製、または組換え発現ベクター系から精製のいずれでもよ い。あるいは、それ自身がPrtR-PrtKを産生するように操作された組換え細菌ま たはウイルスを含み、または他の病原性微生物の免疫原性エピトープを組み合わ せて、PrtR-PrtKをコードする遺伝子を細菌またはウイルスワクチン中に取り込 ませることができる。その上、１以上の調節要素に機能的に連結したPrtR-PrtK をコードする遺伝子を直接ヒト中に導入して、PrtR-PrtKを発現させ、防御性免 疫応答を誘発させることができる。ワクチンは、適当なベクター中に取り込ませ 、このベクターを含有する好適な形質転換された宿主（例えばE.coli，Bacillus subtilis，Saccharomyces cerevisiae，COS細胞、CHO細胞およびHeLa細胞）中 で発現された変異PrtR-PrtKの組換え体成分を基礎とするものでもよい。ワクチ ンは口内組換え細菌ワクチンを基礎とするものでもよく、この場合不活性化PrtR -PrtKを発現する組換え細菌は口腔の共生常在菌である。全P.gingivalisまたは これまでに調製されたフィンブリエ(fimbriae)または莢膜を基礎とする抗原とは 異なって、本発明のPrtR-PrtK複合体またはこれらの成分はP.gingivalisが関係 する歯周病の予防のためのワクチンの調製用の安全で有効な抗原である。したが って、本発明はPrtR-PrtK複合体を基礎とする各種の組換え生成物を提供する。 本発明はこのPrtR-PrtK複合体に対して誘発された、本明細書中で抗PrtR-PrtK 抗体と称する抗体をも提供する。この抗体は歯磨きペースト、うがい剤、歯磨き 粉および液体歯磨き剤、洗口剤、トローチ、チューインガム、歯科用軟膏、歯肉 マッサージクリーム、うがい錠剤、乳製品およびその他の食料品などの経口組成 物中に配合することができる。 別の様相において、本発明は、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイを含 む既知の技術の適用からなる、上に定義した抗体、抗原または核酸プローブのい ずれか一つまたは組合せの使用を特徴とする、P.gingivalisの存在を診断する方 法を提供する。 本発明は上に定義した抗体、抗原および／または核酸プローブを含む診断用キ ットをも提供する。 図面の簡単な説明 図１．P.gingivalis W50音波処理物のアニオン交換FPLC。50mM NaClを含有す るTC緩衝液中の音波処理物をHiload XK 16/10Ｑセファロースカラムに適用し、 O-100％緩衝液Ｂの直線勾配を使用し、流速2.0ml分-1で90分かけて溶離させた。 画分（6ml）をアゾカゼイン、Bz-L-Arg-pNAおよびZ-L-Lys-pNAを使用してタンパ ク質分解およびアミド分解活性についてアッセイした。Bz-L-Arg-pNAを使用した 各６ml画分のアミド分解活性をヒストグラムによって示す。 図２．Ｑセファロースアニオン交換FPLCからプールし濃縮した、タンパク質分 解／アミド分解活性を含有する画分のゲル濾過FPLC。タンパク質分解／アミド分 解活性の主要なピークを含有するアニオン交換画分をプールし、150mM NaClを含 有するTC緩衝液で平衡化し、濃縮し、４アリコートに分け、次にそれぞれを個別 にゲル濾過カラム（Superose 12HR 10/30）に適用し、同一の緩衝液を使用して 流速0.3ml分-1で溶離させた。画分（0.5ml）をタンパク質分解およびアミド分解 活性についてアッセイした。Bz-L-Arg-pNAのアミド分解活性をヒストグラムによ って示す。VoおよびVtはそれぞれカラムのボイド(void)および総容量を示す。標 準タンパク質、チログロブリン667kDa、カタラーゼ232kDaおよびアルドラーゼ15 8kDaの溶出量を表示している。 図３．ゲル濾過（Superose 12 HR 10/30）FPLCからの300kDaピークのSDS-PAGE （煮沸／還元条件）。レーン１，Pharmacia分子量標準(Mr、kDaで示す)。レーン ２，ゲル濾過FPLCからの300kDaピーク。クーマシーブルー染色ゲル。 図４．ゲル濾過FPLCからの300kDaに相当するタンパク質分解／アミド分解ピー クによるαsl−カゼインの特異的切断部位（矢印で表示）。タンパク質、αsl− カゼインはアルギニンおよびリジン残基のカルボキシル側のみで切断された。 図５．Arg-およびLys-特異的タンパク質分解活性を示す300kDaゲル濾過ピーク のArg-セファロースFPLC。タンパク質分解活性の主要ピーク（300kDa） を含有するゲル濾過画分をプールし、アルギニン−セファロースカラム（5mlア ルギニン−セファロース4B）に適用し、ベースラインが０にもどるまで、50mM N aClを含有するTC緩衝液で0.1ml分-1で洗浄した。次にカラムを500mM NaClでさら に洗浄し、50mM NaClを含有するTC緩衝液で再平衡化した。このカラムを最初に5 0mM NaClを含有するTC緩衝液中の200mMリジンで溶離させ、続いて同一緩衝液中 の750mMリジンで溶離させた。次にカラムを再平衡化させ、同一緩衝液中の200mM アルギニンで流速0.1ml分-1で溶離させた。ピークを回収し、アミド分解および タンパク質分解活性についてアッセイした。Bz-L-Arg-pNAのアミド分解活性をヒ ストグラムによって示し、矢印は各ステップ勾配の開始を示す。 図６．Arg-セファロースFPLCからの200mMリジン溶出液のSDS-PAGE(煮沸／還元 条件)。レーン１，Pharmacia分子量標準(Mr、kDaで示す)。レーン２，Arg-セフ ァロースFPLCからの200mMリジン溶出液。銀染色ゲル。 図７．アルギニン−セファロースFPLCからの750mMリジンおよび200mMアルギニ ン溶出液ならびに精製45kDa Arg-特異性エンドペプチダーゼのSDS-PAGE(煮沸／ 還元条件)。レーン１，750mMリジン溶出液。レーン２，200mMアルギニン溶出液 。レーン３，精製45kDa Arg-特異性エンドペプチダーゼ。レーン４，Pharmacia 分子量標準(Mr、kDaで示す)。クーマシーブルー染色ゲル。 図８ａ．prtR遺伝子の図式表示。PrtRの新生ポリプロテイン(polyprotein)は リーダー配列、プロ配列に続くArg-特異性システインプロテイナーゼPrtR45、な らびにすべてアルギニンまたはリジン残基が先導するアドヘシン、PrtR 44,PrtR 15，PrtR 17およびPrtR 27で構成される。 図８ｂ．prtRのヌクレオチド配列。 図９ａ.prtK遺伝子の図式表示。PrtKの新生ポリプロテインはリーダー配列、 プロ配列に続くLys-特異性システインプロテイナーゼPrtK 48、ならびにすべて アルギニンまたはリジン残基が先導するアドヘシン、PrtK 39，PrtK 15およびPr tK 44で構成される。 図９ｂ．prtKのヌクレオチド配列。 図10．ダイアフィルトレーション(diafiltration)によって精製したPrtR- PrtK複合体のSDS-PAGE。レーン１は分子量マーカーを示す。レーン２はダイアフ ィルトレーションによって精製したPrtR-PrtKの成分を示す。 図11．フロイント不完全アジュバント(Freund'sIncomplete Adjuvant)中で乳 化したPrtR-PrtK複合体で２回免疫感作した５匹のマウスからの血清のELISA力価 測定(titration)。吸着された抗原としてP.gingivalis W50音波処理物を使用し て、試験血清（TS 32-36）および免疫前血清（PIS 32-36）をスクリーニングし た。1/100，1/500，1/2500および1/12500の一次抗体希釈物を使用した。ホース ラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス抗体および3,3',5,5'テ トラメチルベンジジンを使用して結合抗体を測定した。プレートリーダー中で45 0nm干渉フィルターを使用して分光光度測定によって定量し、光学密度（O.D.） の読みとして記録した。 発明の詳細な説明 本発明の開発において使用し適用した方法を引用し、そして本発明を実施する 既知の最良の方法を提供する特定の実施例を引用して、本発明をここにさらに詳 細に記載する。 口内細菌、Pcrphyromonas gingivalisは細胞表面に、本明細書中でPrtR-PrtK 複合体と命名する294-323 kDaの、血球凝集素（アドヘシン）を有するArg-特異 性およびLys-特異性チオールエンドペプチダーゼのヘテロ二量体タンパク質複合 体として、主要なトリプシン様プロテイナーゼを保有している。このPrtR-PrtK 複合体は、P.gingivalis細胞から超音波処理またはクロロホルム抽出、続いてダ イアフィルトレーションまたはアニオン交換、そしてLys-セファロースまたはAr g-セファロースクロマトグラフィーによって精製することができる。次に、この 精製したPrtR-PrtK複合体を使用し、標準的な技術を使用して、抗体を産生させ る。抗体産生のために使用する動物はウサギ、ヤギ、ニワトリ、ヒツジ、ウマ、 ウシその他が可能である。イムノアッセイによってPrtR-PrtK複合体に対する高 い抗体力価が検出された場合は、その動物から採血するかまたはその卵もしくは ミルクを採取し、血清を調製し、そして／または標準的な技術を使用して抗体を 精製するが、あるいは標準的な技術を使用して脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させ ることによってモノクローナル抗体を作製する。培養液または腹 水液、血清、ミルクもしくは卵から塩析、ゲル濾過、イオン交換および／または アフィニティークロマトグラフィーなどによって抗体（イムノグロブリン画分） を分離することができるが、塩析をともなうものが好ましい。塩析法において、 抗血清またはミルクを硫酸アンモニウムで飽和させ、沈殿を生成させ、続いて沈 殿物を生理食塩水に対して透析して、特異的抗-(PrtR-PrtK)を含む精製されたイ ムノグロブリン画分を得る。ウマ抗血清およびウシ抗血清ならびにミルクから好 ましい抗体が得られる。本発明においては、不活性化したPrtR-PrtKで動物を免 疫感作させることによって得られた抗血清およびミルク中に含まれる抗体を経口 組成物に配合することができる。この場合、抗血清およびミルクから分離および 精製した抗体と同様に、抗血清およびミルクを使用することもできる。これらの 物質をそれぞれ単独で、または２以上を組み合わせて使用することができる。Pr tR-PrtKを中和することによって疾病を予防するため、PrtR-PrtKに対する抗体を 歯磨きペーストおよびうがい剤などの経口組成物中に使用することができる。こ の抗-(PrtR-PrtK)抗体は、チェアサイド(chairside)酵素結合イムノソルベント アッセイ(ELISA)による歯肉下プラークサンプル中のP.gingivalisの初期検出の ために使用することもできる。 経口組成物のためには、投与する上記の抗体の量が0.0001-50g/kg/dayで、上 記の抗体の含有量が組成物の0.0002-10重量％、好ましくは0.002-5重量％とする のが好ましい。上記の血清またはミルク抗体を含有する本発明の経口組成物を調 製して、歯磨きペースト、歯磨き粉および液体歯磨き剤を含む歯磨き剤、うがい 剤、トローチ、歯周ポケット洗浄具、チューインガム、歯科用軟膏、歯肉マッサ ージクリーム、うがい錠剤、乳製品ならびにその他の食料品などの口内に適用し 得る各種の形態で使用することができる。本発明にしたがう経口組成物に、特定 の経口組成物のタイプおよび形態に応じて、その他の公知の成分をさらに含有さ せることができる。 本発明のいくつかの高度に好ましい形態において、経口組成物は実質的にうが い剤または洗浄剤などに適した液体とすることができる。こうした調製品におい て、媒体(vehiole)は典型的には、望ましくは下記の湿潤剤を含む水−アルコー ル混合物である。一般的に、アルコールに対する水の重量比は約1:1から約20:1 の範囲である。この型の調製品における水−アルコール混合物の総量は典型的に は調製品の約70から99.9重量％の範囲である。アルコールは典型的にはエタノー ルまたはイソプロパノールであり、エタノールが好ましい。 本発明のこうした液体およびその他の調製品のｐＨは一般的に約4.5から約9の 範囲であり、典型的には約5.5から8の範囲である。ｐＨは好ましくは約6から約8 .0の範囲、好ましくは7.4である。ｐＨを酸（例えばクエン酸もしくは安息香酸 ）または塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御するか、あるいは（クエン酸、 安息香酸、炭酸、または炭酸水素のナトリウム塩、リン酸水素二ナトリウム、リ ン酸二水素ナトリウム、その他などで）緩衝化することができる。 本発明のその他の望ましい形態として、経口組成物を実質的に、歯磨き粉、歯 科用錠剤または歯磨きペースト（歯科用クリーム）状の歯磨き剤などの適当な固 体またはペーストもしくはゲル状歯磨き剤とすることができる。こうした固体ま たはペースト経口調製品の媒体は一般的に歯科用に許容可能な研磨剤を含有する 。研磨剤の例は非水溶性メタリン酸ナトリウム、メタリン酸カリウム、リン酸三 カルシウム、二水和リン酸カルシウム、無水リン酸二カルシウム、ピロリン酸カ ルシウム、オルトリン酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム、炭酸カルシウム 、アルミナ水和物、焼成アルミナ、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸ジルコニウム、 シリカ、ベントナイト、およびこれらの混合物である。その他の好適な研磨剤と して、メラミン−、フェノール−、および尿素−ホルムアルデヒド、ならびに架 橋ポリエポキシドおよびポリエステルなどの粒子状熱硬化性樹脂が含まれる。好 ましい研磨剤として、粒子サイズが約5ミクロンまで、平均粒子サイズが約1.1ミ クロンまでで、表面積が約50,000cm²/gmまでの結晶シリカ、シリカゲルまたはコ ロイド状シリカ、および非晶質アルミノケイ酸アルカリ金属塩が含まれる。 視覚的に透明なゲルを使用する場合、Syloid 72およびSyloid 74などの商標名 SYLOIDとして販売されているコロイド状シリカ、またはSantocel 100などの商標 名SANTOCELとしてのアルミノ−ケイ酸アルカリ金属塩が特に有用である。なぜな らばこれらは普通歯磨き剤に使用されるゲル化剤−液体（水および／または湿潤 剤を含む）系の屈折率に近似した屈折率を有するからである。 いわゆる“非水溶性”研磨剤の多くは適度なアニオン性であり、少量の水溶性 剤をも含有する。こうして、不溶性メタリン酸ナトリウムをThorpe's Dictionar y of Applied Chemistry,Volume 9,4th Edition,pp.510-511に説明されているよ うな任意の好適な方法で形成させることができる。Mardrell塩およびKurrol塩と して知られている不溶性メタリン酸ナトリウムの形態も好適な物質の別の例であ る。これらのメタリン酸塩は水に対してごくわずかな溶解性を示すだけなので、 普通不溶性メタリン酸塩（IMP）と称される。この中には、不純物として少量、 通常4重量％までの程度の数％の水溶性リン酸塩物質が存在する。不溶性メタリ ン酸塩の場合では水溶性トリメタリン酸ナトリウムが含まれるものと考えられる が、この水溶性リン酸塩物質の量は、所望ならば水で洗浄することによって減少 または除去することができる。不溶性メタリン酸アルカリ金属塩は典型的には37 ミクロンを超えるものが物質の1％以下であるような粒子サイズの粉末形態で使 用される。 研磨剤は一般的に約10％から約99％の重量濃度で固体またはペースト組成物中 に存在する。好ましくは、歯磨きペースト中に約10％から約75％、および歯磨き 粉中に約70％から約99％の量で存在する。歯磨きペースト中、研磨剤がシリカ質 で存在する場合、一般的に約10-30重量％存在する。他の研磨剤は典型的には約3 0-75重量％存在する。 歯磨きペースト中、液体媒体は典型的には調製品の約10％から約80重量％の範 囲の量の水および湿潤剤を含む。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビト ールおよびポリプロピレングリコールが好適な湿潤剤／担体の例である。水、グ リセリンおよびソルビトールの液体混合物も有用である。屈折率が重要な考慮点 となる透明ゲルにおいては、約2.5-30％w/wの水、０から約70％w/wのグリセリン および約20-80％w/wのソルビトールを使用するのが好ましい。 歯磨きペースト、クリームおよびゲルは典型的には約0.1から約10、好ましく は約0.5から約5％w/wの割合で天然または合成のシックナー(thickener)またはゲ ル化剤を含有する。好適なシックナーは合成ヘクトライト(hectorite)、例えば 、Laporte Industries Limitedによって市販されているLaponite（例えばCP，SP 2002，D）として入手可能な合成コロイドケイ酸マグネシウムアルカリ金属塩複 合体クレイである。Laponite Dは、重量で約58.00％のSiO₂,25.40％ のMgO，3.05％のNa₂O，O.98％Li₂O、およびいくらかの水と微量の金属かなって いる。その真の比重は2.53であり、水分8％で見がけのかさ密度が1.0g/mlである 。 その他の好適なシックナーとして、アイリッシュモス、イオタカラギーナン、 ガムトラガカント、スターチ、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピ ルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルース、ヒドロキシプロピルメチルセ ルロース、ヒドロキシエチルセルロース(例えばNatrosolとして入手可能)、カル ボキシメチルセルロースナトリウム、および微粉砕Syloid（例えば244）などの コロイド状シリカが含まれる。プロピレングリコール、ジプロピレングリコール およびヘキシレングリコールなどの湿潤剤ポリオール、メチルセソルブおよびエ チルセロソルブなどのセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油およびペトロラタムな どの直鎖中に約12炭素数を含有する植物油およびワックス、ならびに酢酸アミル 、酊酸エチルおよびベンジルベンゾエートなどのエステル、などの可溶化剤を含 ませることもできる。 通常のように、経口調製品は好適なラベルをつけた包装品で販売またはそれ以 外で配布されるべきものと理解される。したがって、うがい剤の容器にうがい剤 または洗口剤としての大略の説明と使用のための指示があるラベルをつけ、歯磨 きペースト、クリームまたはゲルは通常、歯磨きペースト、ゲルまたはクリーム としての大略の説明があるラベルをつけた、典型的には鉛またはプラスチックを ライニングしたアルミニウムの押し出しチューブ、あるいは内容物を計り出すた めの押し出し式、ポンプ式または加圧式のディスペンサーに入れられる。 予防作用を増強し、口腔内への活性剤の十分で完全な拡散の達成を補助し、現 状の組成物を美容上さらに受け入れられやすくするために、本発明の組成物中に 有機表面活性剤を使用する。該有機表面活性剤物質は好ましくは実際上本発明の 抗体を変性させない、アニオン、非イオンまたは両性であり、表面活性剤として 、組成物に抗体を変性させないで洗浄および発泡特性を付与するような洗浄剤を 使用するのが好ましい。アニオン表面活性剤の好適な例は、水素化ココナッツオ イル脂肪酸の一硫酸モノグリセリドナトリウム塩などの高級脂肪酸モノグリセリ ド一硫酸の水溶牲塩、硫酸ラウリルナトリウムなどの高級硫酸アルキル、ドデシ ル ベンゼン硫酸ナトリウムなどの硫酸アルキルアリール、高級アルキルスルホ−ア セテート、1,2-ジヒドロキシプロパンスルホネートの高級脂肪酸エステル、およ び脂肪酸、アルキルまたはアシルラジカルの中に12から16炭素を有するものなど の、低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルア ミド、などである。最後に記載したアミドの例は、N-ラウロイルサルコシン、お よび実質的にセッケンまたは類似の高級脂肪酸物質を含まないN-ラウロイル、N- ミリストイル、またはN-パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウムおよび エタノールアミン塩である。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト 化合物の使用は特に有利である。なぜならば、これらの物質は酸溶液中での歯エ ナメルの熔解性をいくらか減少させることで、炭水化物の分解による口腔内での 酸形成の阻害について延長された著しい効果を示すからである。抗体とともに使 用するのに好適な水溶性非イオン界面活性剤の例は、疎水性長鎖（例えば約12か ら20炭素原子の脂肪族鎖）を有するものとも反応し得る各種の反応性水素含有化 合物とユチレンオキサイドとの縮合生成物であり、この縮合生成物（「エトキサ マー」）は疎水性ポリオキシエチレン部分分子を含有し、脂肪酸、脂肪族アルコ ール、脂肪族アミド、多価アルコール（例えばソルビタンモノステアレート）と ポリ（エチレンオキサイド）の縮合生成物およびポリプロピレンオキサイド（例 えばPluronic物質）などである。 表面活性剤は典型的には約0.1-5重量％の量存在する。表面活性剤は本発明の 抗体の溶解を補助するようであり、それによって必要とする可溶化湿潤剤の量を 減少させることに注目すべきである。 本発明の経口調製品中に、ホワイトニング剤、保存剤、シリコーン、クロロフ ィル化合物および／または尿素、リン酸二アンモニウムなどのアンモニア化物質 、およびこれらの混合物などの各種のその他の物質を組み込むことができる。こ れらのアジュバントを存在させる場合、所望の性質および特徴に実質的に逆効果 を与えない量を調製品中に組み込む。 任意の好適な香味料または甘味料もまた使用することができる。好適な香味料 成分の例は、例えばスペアミント、ペパーミント、ウィンターグリーン、サッサ フラス、クローブ、セ−ジ、ユーカリプタス、マジョラム、シナモン、レモン、 およびオレンジのオイルなどの香味油、ならびにサリチル酸メチルである。好適 な甘味料として、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリ トール、ナトリウムチクラメート、ペリラルチン、AMP(アスパルチルフェニルア ラニン、メチルエステル)、サッカリン、などが含まれる。好適には、香味料お よび甘味料はそれぞれまたはともに調製品の約0.1％から5％以上含ませることが できる。 本発明の好ましい実用面において、本発明の組成物を含有するうがい剤または 歯磨き剤などの本発明に従う経口組成物を、ｐＨ約4.5から約9、一般的には約5. 5から約8、好ましくは約6から8で、毎日、または２日もしくは３日毎、あるいは 好ましくは１日に１回から３回、少なくとも２週間から８週間、または一生、規 則的に歯肉および歯に適用するのが好ましい。 本発明の組成物は、所望ならば通常の可塑剤または軟化剤、糖またはその他の 甘味剤、あるいはグルコース、ソルビトールなどとともに、例としてジェルトン グ(jelutong)、ゴムラテックス、ビニライト樹脂、その他が示される、温かいガ ムベース中に混ぜこむかまたはガムベースの外部表面にコーティングするなどに よって、トローチ、またはチューインガム、あるいはその他の製品中に組み込む ことができる。 本発明の組成物としては歯周ポケット洗浄具、コラーゲン、エラスチンなどの 目的部位までの配送具、もしくは歯周ポケット内に置くかまたは障壁膜として使 用するか、あるいは直接に歯根に適用する、合成スポンジ、膜または繊維も含ま れる。 本発明の別の重要な形態は、PrtR-PrtK複合体に対して特異的な免疫応答を生 成させ、それによってP.gingivalisのコロニー形成を減少させ、そしてPrtR-Prt Kを中和し、それによって疾病を予防するために、鼻噴霧、経口、または注射に よって送り込む、Porphyromonas gingivalisに対する免疫応答を誘発するのに使 用するための、PrtR-PrtK複合体および好適なアジュバントを基礎とする組成物 である。この複合体の強い酵素活性によって、典型的には複合体が不活性化され ることになる。ワクチンは、適当なベクター中に組み込み、このベクターを含有 する好適な形質転換宿主（例えばE.coli，Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae，COS細胞，CHO細胞およびHeLa細胞）中で発現させた PrtR-PrtKの組換え成分を基礎とするものでもよい。全P.gingivalis細胞または その他のフィンブリエまたは莢膜を基礎とするこれまでに調製された抗原とは異 なって、PrtR-PrtK複合体はP.gingivalisが関係する歯周病の予防用使用のため の組成物を調製するための安全で有効な抗原である。PrtR-PrtK複合体は本明細 書中で説明する組換えＤＮＡ法を使用して製造することができ、あるいは本発明 で開示されたアミノ酸配列から化学的に合成することができる。その他、本発明 にしたがって、P.gingivalisが原因となる歯周病および感染に対する受動免疫感 作に有用な抗血清を産生させるために、このPrtR-PrtK複合体を使用することが できる。 ワクチン製剤と組み合わせて、各種のアジュバントを使用する。アジュバント は免疫応答をモジュレートすることによって、ワクチン抗原のみを投与する場合 よりも、少量のワクチン抗原量または少投与回数を使用して、より永続性でより 高レベルの免疫力を達成するのに役立つ。アジュバントの例として、不完全フロ イントアジュバント(IFA)、アジュバント65(ピーナツ油、マンナイドモノオレエ ートおよびアルミニウムモノステアレートを含有)、油エマルジョン、Ribiアジ ュバント、プルロニックポリオール、ポリアミン、Avridine、QuilA、サポニン 、MPL、QS-21、およびアルミニウム塩などのミネラルゲルが含まれる。他の例と して、SAF-1，SAF-0，MF-59，Seppic ISA72Oなどの水中油エマルジョン、および ISCOM類ならびにISCOMマトリックスなどのその他の粒状アジュバントが含まれる 。アジュバントのその他の例の広範囲の、しかし全部ではないリストがCox and Coulter 1992［In:Wong WK(ed.) Animals parasite control utilising technol ogy.Bocca Raton;CRC press,1992;49-112］に掲載されている。アジュバントの 他に、ワクチンに通常の製薬上許容可能な担体、賦形剤、充填剤、緩衝液または 希釈剤を適当に含ませることができる。歯周炎の予防またはすでに存在する歯周 炎の治療のために、アジュバントを含有するワクチンの１以上の用量を投与する ことができる。 別の好ましい組成物において、調製品を粘膜アジュバントと組み合わせて経口 投与する。粘膜アジュバントの例はコレラ毒素および熱不安定E.coli毒素、こ れらの毒素の非毒性Ｂサブユニット毒性が減少されたこれらの毒素の遺伝的変異 体である。PrtR-PrtK複合体を経口的に送り込むために使用することができるそ の他の方法として、生物分解性ポリマー（アクリレートまたはポリエステルなど ）の粒子中にマイクロカプセル化によってプロテアーゼを組み込み、消化管から のミクロスフィアの摂取を促進し、タンパク質の分解を防止するものが含まれる 。リポソーム、ISCOM類、ヒドロゲルは別の可能な方法の例であり、PrtR-PrtK複 合体の送り込みのために、粘膜免疫系にLTB，CTBまたはレクチンなどの標的分子 を組み込ませることによってさらに強化することもできる。ワクチンおよび粘膜 アジュバントまたは送り込み系の他に、ワクチンに通常の製薬上許容可能な担体 、賦形剤、充填剤、被覆剤、分散剤、抗菌剤および抗カビ剤、緩衝液または希釈 剤を適当に含ませることができる。 この態様の別のモードは、P.gingivalisが原因となる感染に対して防御するた めに使用される、組換えウイルス生ワクチン、組換え細菌ワクチン、組換え弱毒 化細菌ワクチン、または不活化組換えウイルスワクチンを提供する。ワクシニア ウイルスは他の生物から誘導されたワクチン抗原を発現させるために加工される 感染ウイルスの当業界で最もよく知られた例である。宿主を免疫感作するため、 弱毒化するかまたはそれ自身が疾病の原因にならないように別の処理をした組換 え生ワクシニアウイルスを使用する。これに続く宿主内での組換えウイルスの複 製がPrtR-PrtK複合体などのワクチン抗原を含む免疫系の継続的な刺激を提供し 、それによって長期の免疫を提供する。 その他の生ワクチンベクターとして以下のものが含まれる：アデノウイルス、 サイトメガロウイルス、ならびに好ましくはワクシニア（Paoletti and Panical i,U.S.Patent No.4,603,112）などのポックスウイルスおよび弱毒化サルモネラ 株(Stockerら、U.S.Patent Nos.5,210,035；4,837,151；および4,735,801；なら びにCurtissら、1988,Vaccine 6:155-160)。生ワクチンは免疫系を継続的に刺激 し、実質的に長期の免疫を与えるので、特に有利である。免疫応答がその後のP. gingivalis感染を防御するものの場合、生ワクチン自体をP.gingivalis予防用ワ クチン中で使用することができる。特に、生ワクチンを口腔の共生常在菌である 細菌を基礎とすることができる。この細菌を組換え不活 性化PrtR-PrtKを保有するベクターで形質転換し、その後これを使用して口腔、 特に口内粘膜に移入することができる。口内粘膜に移入された後、この組換えタ ンパク質の発現が粘膜に連結しているリンパ組織を刺激して中和抗体を生成させ る。例えば、分子生物学的技術を使用して、ワクシニアウイルスのゲノムＤＮＡ 中の、ワクシニアウイルスベクターの増殖または複製に悪影響を与えないでエピ トープを発現させるような部位に、PrtR-PrtKをコードする遺伝子を挿入するこ ともできる。生成した組換えウイルスをワクチン製剤の免疫原として使用するこ とができる。紹換えウイルスを免疫原として使用する前に、当業界で知られた化 学的方法などによって、発現される免疫原の免疫原性に実質的に影響を与えずに 不活性化する以外は同一の方法を使用して、不活化組換えウイルスワクチン製剤 を構築することができる。 この態様の別の変法において、遺伝物質を直接ワクチン製剤として使用する。 １以上の調節要素を機能的に連結したPrtR-PrtKタンパク質複合体をコードする 配列を含有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を直接導入して、個体にP.gingival isの病原性株に対する予防接種とすることができる(「直接遺伝子トランスファー」 )。予防接種する個体に直接遺伝子トランスファーを実施し、その結果として予 防接種した個体の血管内皮細胞および主要臓器の組織などの細胞によってその遺 伝物質が発現することは、発現プラスミド：カチオン性リポソーム複合体の静脈 内注射などの当業技術によって証明されている(Zhuら、1993,Science 261:209-2 11)。ベクターＤＮＡを標的細胞に送り込むためのその他の有効な方法は当業界 で知られている。１例として、ウイルス遺伝子を含有する精製組換えプラスミド ＤＮＡを使用してワクチンを接種（腸管外、粘膜、または遺伝子ガン(gene-gun) による免疫感作）し、防御性免疫応答を誘導したものがある(Fynanら、1993,Pro c.Natl.Acad.Sci.USA 90:11478-11482)。別の例において、個体から取り出した 細胞に当業界で知られた標準的な操作によってトランスフェクトまたはエレクト ロポレートし、その結果、標的細胞中に組換えベクターＤＮＡを導入することが できる。その後、組換えベクターＤＮＡを含有する細胞を、ベクター中に発現し た選択マーカーによるなどの当業界で知られた方法を使用して選択し、つぎにそ の選択した細胞を個体中に再導入してPrtR-PrtK複 合体を発現させることができる。 能動免疫の変法として、免疫を受動性とすることもできる。すなわち、PrtR-P rtKに対する抗体を含有する精製イムノグロブリンの投与を含む免疫である。 本発明はさらに、PrtR-PrtK複合体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列、 および単離した遺伝子から導かれるアミノ酸配列を提供する。本発明の１態様に したがって、組換えＤＮＡ技術を使用し、PrtR-PrtK複合体をコードする遺伝子 をある発現ベクター中に組み込み、その組換えベクターを適当な宿主細胞中に導 入し、それによってその特定の宿主細胞中でこれらの配列の発現を導く。宿主細 胞に導入する組換えベクターを含む発現系を以下のように使用することができる （ａ）PrtR-PrtK複合体を製造し、精製してワクチン製剤の免疫原として使用す る；（ｂ）PrtR-PrtK複合体を製造し、診断用イムノアッセイのための抗原とし て使用するかまたは治療および／もしくは診断用の価値のあるP.gingivalis特異 性抗血清の産生のための抗原として使用する；（ｃ）あるいは、組換え発現ベク ターがワクシニアウイルスなどの生ウイルスの場合、ベクター自体をPrtR-PrtK 複合体の発現のために宿主細胞に導入する生または不活化ワクチン調製品として 使用することもできる；（ｄ）生弱毒化細菌細胞または遺伝子加工した共生口内 細菌中に導入し、個体に免疫を与えるためにこれを使用してPrtR-PrtK複合体を 発現させる；（ｅ）あるいは、直接個体に導入して、コードされ発現したPrtR-P rtK複合体に対して免疫感作させる。ワクチンが動物の歯周病を予防するもので ある場合、特に組換え細菌ワクチンはヒト口腔または動物の共生常在菌を基礎と することができる。口腔、歯肉上または歯肉下プラークに移入するのに、不活性 化PrtR-PrtKを発現する組換え細菌ワクチンを使用することができる。歯周炎の 患者から口内細菌を単離し、不活性化PrtR-PrtK複合体を発現するように遺伝子 加工することができる。口腔内での不活性化PrtR-PrtKの生成は口内粘膜組織に 対して毒性とはならない。しかし、不活性化PrtR-PRtKは粘膜に連結するリンパ 組織（MALT）を刺激して、P.gingivalisのPrtR-PrtKを中和する特異的抗体を生 成させる。 タンパク質またはペプチドの発現を成功させるためには、遺伝子もしくは遺伝 子断片を含む挿入物、またはベクター自体のいずれかが、発現のために使用する 特定の宿主系と適合し、これによって認識される転写および翻訳に必要な要素を 含有していることが要求される。PrtR-PrtKを発現させるために各種の宿主系を 使用することができる。限定するわけではないが、この中に、バクテリオファー ジベクター、プラスミドベクター、またはコスミドＤＮＡで形質転換した細菌； 酵母ベクターを含有する酵母；真菌ベクターを含有する真菌；ウイルス（例えば バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；およびプラスミドもしくはウイル ス発現ベクターでトランスフェクトするか、または組換えウイルス（例えばワク シニアウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス、レトロウイルス、そ の他）を感染させた哺乳類細胞系、が含まれる。 分子生物学の既知の方法を使用して、ベクターまたはPrtR-PrtKをコードする ＤＮＡ配列中に各種のプロモーターおよびエンハンサーを組み込んで、PrtR-Prt Kアミノ酸配列の発現を増強させることができる。ただしこれは使用した特定の 宿主細胞系にそのアミノ酸配列の増強された発現が適合する（例えば毒性でない などの）場合である。さらに、ＤＮＡを別の細菌外膜タンパク質、または別の細 菌、真菌、寄生虫もしくはウイルスの抗原などの別の抗原をコードするＤＮＡと 融合させて、遺伝子融合した（共通のペプチド骨格を共有した）多能性(multiva lent)抗原を形成させ、改良されたワクチン組成物として使用することができる 。 プロモーターの選択は使用する発現系によって決まる。プロモーターは強度、 すなわち転写を促進する能力を変更させる。一般的に、クローン化遺伝子を発現 させる目的では、高度の遺伝子の転写および遺伝子産物の発現を得るため、強力 なプロモーターを使用するのが望ましい。PrtR-PrtKをコードする挿入ＤＮＡ配 列の転写を提供するためには、例えば、E.coliを含む宿主細胞系中で高度の転写 が観察された当業界で既知の細菌、ファージ、またはプラスミドプロモーターと して、lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームＲＮ Ａプロモーター、PRおよびPLプロモーター、lacUV5、ompF、bla、lppなどが含ま れる。 その他、PrtR-PrtKタンパク質が宿主細胞に対して致死性または障害性である 場合は、特異的に誘導されるまではプロモーターの作用が阻害されるよう、宿主 細胞株／系および発現ベクターを選択することができる。例えば、あるオペロン 中では、挿入したＤＮＡの有効な転写のために、特定の誘導物質(inducer)が必 要である(例えば、ラクトースまたはイソプロピルチオ−ベータ-D-ガラクトシド の添加によってlacオペロンが誘導される)。trpオペロンなどの各種のオペロン は異なった制御機構の下にある。trpオペロンは増殖培地中にトリプトファンが 不在のとき誘導される。PLプロモーターは温度感受性ラムダリプレッサーを含有 する宿主細胞の温度の上昇によって誘導することができる。このようにして、プ ロモーターが誘発する転写の95％以上が未誘導細胞中で阻害される。こうして、 挿入したPrtR-PrtKアミノ酸配列をコードするＤＮＡからの発現を制御するプロ モーターが誘導されないような条件下で、形質転換またはトランスフェクトされ た細胞を培養し、細胞が増殖培地中で好適な密度に達したときに、挿入されたＤ ＮＡからの発現のためにプロモーターが誘導されることによって、組換えPrtR-P rtKタンパク質の発現を制御することができる。 有効な遺伝子転写またはメッセージの翻訳のためのその他の制御要素として、 エンハンサーおよび調節シグナルが含まれる。エンハンサー配列は、近辺の遺伝 子に対する位置および方向とは比較的無関係に転写効果を増大させることが明ら かなＤＮＡ要素である。こうして、使用する宿主細胞発現ベクター系如何によっ て、転写効率を増大させるため、挿入したPrtR-PrtKアミノ酸配列をコードする ＤＮＡ配列の上流または下流のいずれかにエンハンサーを置くことができる。。 PrtR-PrtKをコードする遺伝子の発現を調節するために、これらをまたは転写も しくは翻訳開始シグナルなどの調節部位を使用することができる。これらの調節 要素は、ＤＮＡ配列の挿入についてここに記載した組換えＤＮＡ法を使用して、 PrtR-PrtKアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列または近辺のベクターＤＮＡ配 列中に挿入することができる。 したがって、PrtR-PrtKをコードする領域を含有するP.gingivalisヌクレオチ ド配列を、ある発現ベクター中のベクターのプロモーター、制御および調節要素 との関連上特異的部位に連結させて、組換えベクターが宿主細胞中に導入された ときに、その宿主細胞中でP.gingivalis特異的ＤＮＡ配列を発現することができ るようにすることができる。例えば、それ自身の調節要素を含有するPrtR- PrtK特異的ＤＮＡ配列を、PrtRおよびPrtKを共発現させるような、ベクターのプ ロモーターおよび制御要素と関連する位置または方向で、ある発現ベクター中に 連結することができる。次に、組換えベクターを適当な宿主細胞中に導入し、宿 主細胞を選別し、組換えベクターの含有についてこれらの細胞をスクリーニング する。選別およびスクリーニングは、プラスミド中に存在するマーカー遺伝子（ 例えば薬剤耐性マーカー）の検出、PrtR-PrtK特異的エピトープに対して産生さ れた抗血清を使用するPrtR-PrtK特異的エピトープの生成のイムノスクリーニン グ、およびここに記載した１以上のオリゴヌクレオチドおよび方法を使用するPr tR-PrtK特異的ヌクレオチド配列についての宿主細胞のＤＮＡのプローブ、を含 む、当業界で既知の方法によって実施する。 コードされたPrtR-PrtKタンパク質の特性決定、修飾および／または応用のた めに、遺伝子操作技術を使用することもできる。例えば、PrtR-PrtKのプロテア ーゼドメインを不活性化し、保護ドメイン外の領域でタンパク質を修飾するため の部位特異的変異が、安全性および溶解性を増加させるのに望ましいことがある 。 特に、PrtR-PrtK遺伝子および構築物を含有するベクターのための宿主細胞は 口腔の共生常在菌；例えば、歯肉内プラーク、歯肉上プラークの常在菌、または 口内粘膜に関係する細菌とすることができる。共生口内細菌の例は、Streptococ cus種およびActinomyces種、例えばStreptococcus salivarius,Streptococcus s anguis,Actinomyces naeslundiiである。これらの生物を歯周炎患者から単離し 、その後不活性化PrtR-PrtKを発現するように遺伝子加工する。これらの共生口 内細菌の細胞外タンパク質のリーダー配列をコードするＤＮＡにPrtR-PrtKをコ ードするＤＮＡを連結してもよい。細胞外タンパク質をコードするＤＮＡにPrtR -PrtKをコードするＤＮＡを連結または挿入して、分泌融合タンパク質を生成さ せることもできる。不活性化PrtR-PrtKを有する融合タンパク質を生成させるた めに使用することができる細胞外タンパク質の例は、グルコシルトランスフェラ ーゼ（GTF）またはフルクトシルトランスフェラーゼ（FTF）である。次に、この 組換え生物を患者の口腔に再導入し、口内粘膜または歯に移入されると、不活性 化PrtR-PrtKを発現して、粘膜に連結するリンパ 組織を刺激し、中和抗体を生成させる。 PrtR-PrtKをコードする遺伝子の保存性によって、本発明の核酸配列をP.gingi valisの遺伝物質の検出のための分子診断アッセイに使用することができる。特 に、PrtR-PrtK配列特異的オリゴヌクレオチドを合成して、P.gingivalisからの 核酸の増幅および検出のためのプライマーおよび／またはプローブとして使用す ることができる。分子生物学における最近の進歩によって、核酸配列の酵素によ る増幅についていくつかの方法が提供されている。現在最も普通に使用される方 法、ＰＣＲ^TM（ポリメラーゼ連鎖反応Cetus Corporation）には、プライマーと して既知の配列、Taq Polymeraseの使用、および複製するデオキシリボ核酸（Ｄ ＮＡ）鎖を分離し、目的の遺伝子を指数的に増幅させる加熱サイクルが関与する 。現在開発中の別の増幅方法として以下のものが含まれる；ＤＮＡリガーゼ、お よび増幅するＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ切片の半分の２つからなるプローブを 使用するＬＣＲ^TM（リガーゼ連鎖反応、Bio Technica International）；酵素、 QBレプリカーゼ（Gene-Trak Systems）および相補的ＲＮＡの指数的製造のため のＤＮＡ鋳型を作製するのに使用する、複製するＤＮＡに相補的なプローブに接 続したリボ核酸（ＲＮＡ）配列の鋳型；ならびに増幅する核酸配列としてＲＮＡ またはＤＮＡ上で実施することができるＮＡＳＢＡ^TM(核酸配列を基礎とする増 幅、Cangene Corporation)。 生物試料中の特定の病原体を試料あたり10³-10⁴生物に近い感度レベルで検出 するために、特定の遺伝子配列とハイブリダイズすることができる核酸プローブ を使用して成功した(1990,Gene Probes for Bacteria,eds．Macario and deMaca rio,academic press)。特定の標的ＤＮＡ配列を増幅させる方法と連結させるこ とによって、種特異的核酸プローブが、臨床試料中で生物を検出する際の感度を 大きく増大させることができる。これらのプローブを使用することによって、前 培養および／または従来の生化学的同定技術に依存せずに、直接検出することが できる。本発明のこの態様は、P.gingivalisのPrtR-PrtKをコードする遺伝子の 種特異的配列を増幅するプライマー、およびこれらの増幅されたＤＮＡ断片と特 異的にハイブリダイズするプローブを目的とするものである。本発明の核酸配列 を使用し、本発明の方法に従うことによって、10ug/mlの外来ＤＮＡ が存在すれば、P.gingivalisのわずか１生体でも検出することができる。 当業界で既知の方法を使用して、P.gingivalisを含有すると考えられる臨床試 料からＤＮＡを抽出してもよい。例えば、試料中に含まれる細胞をTE緩衝液で洗 浄し、遠心分離によってペレット化する。次にこの細胞を界面活性剤およびプロ テイナーゼＫを含有する増幅反応緩衝液100ulに再懸濁させてもよい。ポリメラ ーゼ連鎖反応を使用したとき、生成サンプルは10mM Tris pH8.3，50mM KCl，1.5 mM MgCl₂，0.01％ゼラチン，0.45％ＮＰ40^TM，0.045％Tween20^TMおよび60ug/ml プロテイナーゼＫ中で細胞を構成することができる。サンプルを55℃の水浴中で １時間インキュベートする。インキュベート後、サンプルを95℃で10分インキュ ベートして、プロテイナーゼＫを熱不活性化する。つぎに、標準的ＰＣＲプロト コルにしたがって、サンプルを増幅させる。 以下の例は本発明の性質をさらに説明するものであるが、本発明はこれらに限 定されるものではないと理解されるべきである。ここに記載するすべての量およ び割合は特に示さないかぎり、重量である。 実施例１ （１）抗原の調製 Ａ．アニオン交換およびアフィニティークロマトグラフィー P.gingivalis W50を溶解ウマ血液アガー上および１μｇ/ｍｌヘミンを含有す る改変ＢＭ培地中、37℃で嫌気的に増殖させた。細菌を定期的継代培養（＜10継 代）によって溶菌ウマ血液プレート上に維持し、これを使用してバッチ培養物に 接種した。分光光度計（295E,Perkin-Elmer）を使用して、650ｎｍで、脳心臓浸 出物培地中でのバッチ培養物の増殖をモニターした。グラム染色、顕微鏡試験、 および各種の生化学的試験を使用して、培養物の純度を定期的にチェックした。 原液を凍結乾燥培養物として維持した。P.gingivalisの培養物を後期対数期まで 増殖させ、遠心分離（5,000×g,20分，4℃）によって細胞を回収し、次に50ｍＭ NaClを含有するＴＣ緩衝液（20ｍＭ Tris-HCl（pH7.4）および５ｍＭ CaCl₂）1 60ｍｌ中に再懸濁させ、Branson Sonifier 250を使用し、出力調節3、50％デュ ーティーサイクルとして、4℃で15分穏やかな音波処理をした。この音波処理物 を遠心分離（100,000×g,30分，4℃）し、アニオン交換ＦＰＬＣの前に、上清を 濾過（0.22μｍ）した。この音波処理物を、50mlスーパ ーループ（Pharmacia-LKB）を使用する多重注入で、４℃に冷却したアニオン交 換カラム（Hiload XK 16/10 Ｑ-17ファロース、Pharmacia-LKB）に適用した。0- 100％緩衝液Ｂのリニアーグラジエントを使用し、流速2.0ｍｌ ｍｉｎ^-1で90分 かけて、サンプルを溶離させた。溶出液を280ｎｍでモニターし、Frac100フラク ションコレクター（Pharmacia-LKB）を使用して、６ｍｌ画分ずつ回収した。緩 衝液Ａは50ｍＭ NaClを含有するＴＣ緩衝液であり、緩衝液Ｂは500ｍＭ NaClを 含有するＴＣ緩衝液である。アゾカゼイン(Ａ-2765,Sigma Chemical Co.St Loui s,ＭＯ)、ベンゾイル-L-Arg-p-ニトロアニリド（Bz-L-Arg-pNa,Sigma）およびベ ンジルオキシカルボニル-L-Lys-p-ニトロアニリド（Z-L-Lys-pNa,Calbiochem,Me lbourne,Australia）を使用して、画分のタンパク質分解およびアミド分解活性 を分析した（下記参照）。タンパク質分解／アミド分解活性の大部分を有するア ニオン交換画分を集め、洗浄し、次にCentricon 10マイクロコンセントレーター （Amicon）を使用して、150ｍＭ NaClを含有するＴＣ緩衝液中で濃縮した。次に 、サンプルを４アリコートに分け、150ｍＭ NaClを含有するＴＣ緩衝液を使用し て、流速0.3ｍｌ ｍｉｎ^-1でそれぞれを個別にゲル濾過カラム（Superose 12,Ｈ Ｒ 10/30,Pharmacia-LKB）に適用した。溶出液を280ｎｍでモニターし、Frac 10 0フラクションコレクターを使用してピークを回収した。分子量ゲル濾過標準（P harmacia-LKB）を使用して、溶出ピークのＭ_r値を測定した。Centricon 10マイ クロコンセントレーターを使用して、タンパク質分解／アミド分解活性の大部分 を有するピークを濃縮し、次に流速0.1ｍｌ ｍｉｎ^-1でArg-セファロースカラム （アルギニン−セファロース４Ｂビーズ5ｍｌ,ＨＲ5/5カラム,Pharmacia-LKB） に適用し、非結合物質を回収した。カラムを500ｍＭ NaClで洗浄し、50ｍＭNaCl を含有するＴＣ緩衝液で再平衡化した。カラムを最初に50ｍＭ NaClを含有する ＴＣ緩衝液中の２００ｍＭリジン-HCl(pH7.4)を用いて流速0.1ｍｌ ｍｉｎ^-1で 溶離させた。続いて、同一の緩衝液中の750ｍＭリジン-HCl(pH7.4)で繰り返した 。次に、カラムを50ｍＭ NaClを含有するＴＣ緩衝液で再平衡化し、その後50ｍ Ｍ NaClを含有するＴＣ緩衝液中の200ｍＭアルギニン-HCl(pH7.4)で流速0.1ｍｌ ｍｉｎ^-1で溶離させた。回収した非結合物質を次にArg-セファロースカラムに 再適用し、溶離ステップを繰り返した。タンパク質分解活性の全部がカラムに結 合するまで、この一連の操作を繰り返した。溶出液を28０ｎｍでモニターし、Fr ac 100フラク ションコレクターを使用してピークを回収した。200ｍＭリジンおよび200ｍＭア ルギニンによってArg-セファロースから溶出したピークを50ｍＭ NaClおよび1.0 ％オクチル−β-D-グルコピラノシドを含有するＴＣ緩衝液で平衡化し、次にMon o Ｑ(ＨＲ 5/5)アニオン交換カラムに適用し、0-100％緩衝液Ｂのリニアーグラ ジエントを使用し、流速1.0ｍｌ ｍｉｎ^-1で溶離させた。緩衝液Ａは50ｍＭ NaC lおよび0.1％オクチル-β-Ｄ-グルコピラノシドを含有するＴＣ緩衝液であり、 緩衝液Ｂは500ｍＭ NaClおよび0.1％オクチル-β-D-グルコピラノシドを含有す るＴＣ緩衝液である。溶出液を280ｎｍでモニターし、Frac 100フラクションコ レクターを使用して溶出ピークを回収した。 アゾカゼイン、Bz-L-Arg-pNaおよびZ-L-lys-pNaを使用して、タンパク質分解 およびアミド分解活性についてＦＰＬＣ画分を定期的にアッセイした。各画分（ 20-200:1）のサンプルを150ｍＭ NaClおよび10ｍＭシステインを含有するＴＣ緩 衝液（pH8.0）中のアゾカゼイン（最終濃度５ｍｇ/ｍｌ）とともに37℃でインキ ュベートした。4℃で30％トリクロロ酢酸の添加によって、アゾカゼインとの反 応を停止させた。サンプルを遠心分離し、分光光度計（Perkin Elmer,552型）を 使用して、上清のＡ₄₄₀を測定した。 合成染色性基質については、クロマトグラフィー画分（5-50:1）のサンプルを 150ｍＭ NaCl、10ｍＭシステインおよび５ｍＭ CaCl₂を含有する100ｍＭTris-HC l（pH8.0）緩衝液中のBz-L-Arg-pNaまたはZ-L-lys-pNa（最終濃度1.0ｍｇ/ｍｌ ）とともに、総容積350:1、37℃でインキュベートした。150ｍＭNaClを含有する 100ｍＭ Tris-HCl(pH8.0)緩衝液中の精製酵素に阻害剤および活性化剤を添加し た。Hewlett Packard 8452A Diode Array分光光度計で410ｎｍでの吸光度を測定 し、アミド分解活性をＵで表現した(Ｕ＝37℃で１分間あたりに変換された基質 μｍｏｌ)。標準としてトリプシン（E.C.3.4.21.4，T8253 Sigma）を使用した。 標準としてＢＳＡでのBradfordタンパク質アッセイ（Biorad）を使用して、ＦＰ ＬＣ画分および精製サンプルのタンパク質濃度を測定した。 主要なタンパク質分解およびアミド分解活性を示すゲル濾過クロマトグラフィ ー画分のサンブル（20μｌ）を、150ｍＭ NaClおよび50ｍＭ 2-メルカプトエタ ノールを含有するＴＣ緩衝液(pH8.0)中に溶解した純α_S1−カゼイン10ｍｇ/ｍｌ とともに37℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプ ルをMilli Ｑ水に溶解した0.1％(v/v)ＴＦＡ（緩衝液Ａ）中で平衡化した。次に サンプルをＨＰＬＣ逆相分析カラム（C8，7μｍ，4.6ｍｍ×220ｍｍ，Applied B iosystems Inc.[Brownlee AquaporeRP 300）に適用し、0-100％緩衝液Ｂのリニ アーグラジエントを使用し、流速１ｍｌ ｍｉｎ^-1で40分かけてペプチドを溶離 させた(140Ａ溶媒搬送システム)。緩衝液ＢはMilli Ｑ水中0.1％(v/v)ＴＦＡ中8 0％(v/v)アセトニトリルである。1000Ｓダイオードアレイ検出器（Applied Bios ystems）を使用して214ｎｍで溶出液をモニターした。ピークを手動で回収し、 前記のようにアミノ酸組成と配列分析を組み合わせてペプチドを同定した。 Mini proteanII電気泳動システム（Biorad）を使用し、12％(w/v)，１ｍｍ分 離用ゲルに5％濃縮用ゲルを重層して、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを実施した（Laemmli,19 70）[Nature 277:680-685]。各サンプルの２容量を緩衝液［0.5 M Tris-HCl(pH6 .8)，5％(v/v)2-メルカプトエタノール，10.0％(w/v)ＳＤＳ，0.05％(w/v)ブロ モフェノールブルー(75％(v/v))およびグリセロール(25％(v/v))］１容量と混合 し、別に記載しない限り４分間100℃まで加熱した。電流30-50ｍＡおよび電位差 ≦200Ｖを使用して、室温でＳＤＳ-ＰＡＧＥを実施した。銀染色のために、ゲル をメタノール／水／酢酸（45/45/10，v/v/v)中に固定し、Milli Ｑ水で洗浄し、 5μｇ/ｍｌジチオトレイトールで還元し、その後Milli Ｑ水で洗浄した。各工程 を30分間行った。次に、ゲルを0.1％(w/v)AgNO₃で20分間染色し、0.1％(v/v)ホ ルムアルデヒドを含有する3％(w/v)炭酸ナトリウムで現像し、氷酢酸で現像を停 止させた。クーマシーブルー染色のため、ゲルを12％ＴＣＡ中に固定し、２％(w /v)リン酸、６％(w/v)硫酸アンモニウム中の0.1％(w/v)精製クーマシーブリリア ントブルーＧ250を使用して一晩染色した。メタノール／水／酢酸（50/40/10,v/ v/v）でゲルの染料を除去した。トランスブロット(transblot)細胞（Biorad）を 使用した配列分析のため、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Problott,Applied Biosyst ems Inc.(ＡＢＩ)）上に移した。ＰＶＤＦ膜を100％メタノールで浸潤し、転移 用緩衝液（10ｍＭ ＣＡＰＳ／10％メタノール、pH 11.5）に浸漬した。電位差60 Ｖ（30ｍＡ）で90分間転移を実施した。メタノール／水／酢酸（5/5/1,v/v/v） 中の0.1％(w/v)クーマシーブリリアントブルーＲ250を使用して膜を短時間染色 した。タンパク質バンドを切り出し、50％メタノール中で10-30秒間染料を除去 し、次にブロットカートリッジに固定したHewlett Packard 10005Ａタンパク質 シクエンサーまたは改変ＡＢＩ 471-02Ａタンパク質シクエンサ ーを使用して、Ｎ-末端配列を決定した。 P.gingivalis W50の細胞結合Arg-およびLys-特異的タンパク質分解活性の放出 には超音波処理が有効で、最大の放出活性を得るのに15分を要した。P.gingival is Ｗ50細胞の音波処理物は0.30ｍｇ ｍｌ^-1タンパク質を含有し、そして37℃で 、基質である1.0ｍＭ Bz-L-Arg-pNAおよびZ-L-Lys-pNAについてそれぞれ2.6およ び2.3μｍｏｌ ｍｉｎ^-1ｍｇタンパク質^-1の活性を含有していた。粗音波処理物 をＱセファロースアニオン交換ＦＰＬＣにかけた。これを示すクロマトグラムが 図１である。246-320ｍＭ NaCl（図１）間の１つの主要ピークとして溶出したタ ンパク質分解／アミド分解活性を回収し、Centricon-10（amicon）を使用して濃 縮し、次にSuperose 12ゲル濾過カラムに適用した（図２）。分子量ゲル濾過標 準を使用して、得られたピークのＭ_rを測定したところ、主要なピークは300kDa に相当し、主要なタンパク質分解／アミド分解活性を示した(図２)。タンパク質 分解／アミド分解活性はゲル濾過カラムから溶出した高分子量物質（0.6-＞2.0 ｘ 10⁶Da）にも関係していた。300kDaゲル濾過ピークはＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析の おける48，45，44，39，27，17および15kDaの７バンドを含有していた(図３)。 この７バンドをトランスブロットして、Ｎ-末端配列分析を実施した（表１）。 この分析によって44kDaバンドは２つのタンパク質を含有することが明らかにな り、さらに精製した後、これらの２つの44kDaタンパク質のＮ-末端配列を決定し た。44kDaタンパク質の１つのＮ-末端配列は17 kDaタンパク質のものと同一であ り、39kDaおよび27kDaタンパク質もまた同一のＮ-末端配列を有していた(表１) 。 表１ SDS-PAGEによって分離された300kDa複合体中のタンパク質のN-末端配列 ^*200mMリジンによってArg-セファロースから溶出したタンパク質^†200mMアルギニンによってArg-セファロースから溶出したタンパク質 Ｑセファロース精製物質または粗音波処理物を反復してゲル濾過分析したとこ ろ、主要なタンパク質分解／アミド分解活性は、ＳＤＳ中で煮沸してＳＤＳ-Ｐ ＡＧＥ分析にかけたとき、48，45，44，39，27，17および15kDaの同一の７バン ド（図３）を含有する、300kDaおよびそれ以上の分子量（0.6-＞2×10⁶Da）の物 質に相当するピークに関係することが示された。 この300kDaゲル濾過タンパク質複合体をα_S1−カゼインとともにインキュベー トした。300kDa複合体のタンパク質分解活性の作用によって放出されたα_S1−カ ゼインペプチドをＲＰ-ＨＰＬＣによって精製し、アミノ酸組成および配列分析 によって同定した。300kDa複合体の物質によるα_S1−カゼインの切断部位はアル ギニンおよびリジン残基のカルボキシル側のみであった(図４)。Ｎ-末 端Argお よびSer(Ｐ)クラスター配列に隣接するLys残基を除いて、α_S1−カゼインの全部 のアルギニンおよびリジン残基が切断された（高陰性荷電密度によるものと推定 される）(図４)。次に300kDa複合体をArg-セファロースカラムに適用し、500ｍ Ｍ NaClを含有するＴＣ緩衝液で洗浄した(図５)。このArg-セファロースを最初 にＴＣ緩衝液中の200ｍＭリジンで溶離させた(図５)。これによってＳＤＳ-ＰＡ ＧＥで示されるように、300kDa複合体の48kDa，44kDa，39kDaおよび15kDaタンパ ク質が少量溶出した(図６および表１)。こ れらのトランスブロットされたタンパク質のＮ-末端配列分析によって、300kDa 複合体の44kDaタンパク質の１つのみが200ｍＭリジンによって溶出することが明 らかになった(表１)。Arg-セファロースから200ｍＭリジンで溶離させたこの画 分はLys-特異的タンパク質分解／アミド分解活性のみを含有していた。次に、Ar g-セファロースカラムを750ｍＭリジンで溶離させた(図５)。これによって、Ｓ ＤＳ-ＰＡＧＥ分析が示す（図７）ように、７バンド（８タンパク質）の全部を 含有する非解離300kDa複合体として結合しているタンパク質の大部分が除去され た。この750ｍＭリジン溶出液は300kDa複合体に特徴的なArg-およびLys-特異的 タンパク質分解／アミド分解活性の両方を示した。次に、Ａrg-セファロースカ ラムをＴＣ緩衝液中の200ｍＭアルギニンで溶離させた(図５)。この200ｍＭアル ギニン溶出液はＳＤＳ-ＰＡＧＥで示されるように、45,44,27，17および15kDaタ ンパク質を少量含有していた(図７)。この画分はArg-特異的タンパク質分解／ア ミド分解活性のみを示した。200ｍＭアルギニンで溶離させた、これらのトラン スブロットタンパク質のＮ-末端配列分析によって、300kDa複合体の44kDaタンパ ク質の１つのみが200ｍＭアルギニンによって溶離し、この44kDaタンパク質は20 0ｍＭリジンで溶離させた44kDaタンパク質とは異なることが明らかになった(表 １)。 Arg-セファロースカラムから200ｍＭリジンおよび200ｍＭアルギニンで溶離さ せたタンパク質を洗浄し、濃縮し、50ｍＭ NaClおよび1.0％オクチル-β-Ｄ-グ ルコピラノシドを含有するＴＣ緩衝液で平衡化し、別々にMono Ｑアニオン交換 カラムに適用した。Mono ＱカラムからのNaClグラジエントによる溶離は、最初 の粗音波処理物の25倍の精製度を有する45kDaタンパク質によるArg-特異的タン パク質分解活性に関係した(表２、図７)。Bz-L-Arg-pNAは切断するがZ-L-Lys-pN Aは切断しない酵素によって、アルギニン残基に対する45kDaプロテイナーゼの特 異性を確認した。このArg-特異性45kDa酵素はチオール（特にシステイン）によ って活性化され、ＰＭＳＦまたはＡＥＢＳＦによって阻害されないが、スルフィ ドリル特異的試薬、ロイペプチンおよびＥＤＴＡによって阻害された(表３)。Ｅ ＤＴＡによる阻害はＣａ²⁺の添加によって可逆性であった。(表３)。この酵素の 最適pHは7.5-8.0で、pHが7.0より低下すると、活性が劇的に低下した。これらの 結果は45kDa酵素がカルシウム安定化Arg-特異的システインエンドペプチダーゼ であることを意味する。基質Z-L-Lys-pN Aを使用してLys-特異的活性を特性決定したところ、200ｍＭリジン溶出液からMo no Q FPLCによって精製された48kDaタンパク質と関連していた。このLys-特異的 酵素もチオールによって活性化され、スルフィドリル特異的試薬によって阻害さ れたが、ロイペプチンまたはＥＤＴＡによっては阻害されなかった。300kDa複合 体を煮沸せずに行った非還元性ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって、およそ300，150，104 ，88，76および66kDaの相対分子量に相当するバンドが生成した。 表２ 45kDa Arg-特異的プロテイナーゼPrtR 45の精製 ^*1.0mM Bz-L-Arg-pNAを使用したアミド分解活性； 1unit=37℃でのμmol min^-1。 表３ 45kDa Arg-特異的プロテイナーゼの活性に対する各種の活性化剤／阻害 剤の影響 ^*PCMB，p-クロロメルクリ安息香酸；PMSF，フェニルメチルスルホニルフル オライド；AEBSF，［4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオライド ］ ^†これらのインキュベーションは1.OmM 2-メルカプトエタノールをも含有さ せた。 300kDa複合体の45，27，17および15kDa並びに44kDaの一方のタンパク質成分は 図８ａの図式で示す遺伝子、PrtRによってコードされる。PrtRの完全ヌクレオチ ド配列およびこれから推定したアミノ酸配列を図８ｂに示す。各PrtR成分はアル ギニンまたはリジン残基の後ろに位置し(図８ａ，ｂ)、このポリタンパク質がト リプシン様タンパク質分解特異性によってプロセシングされることが示される。 我々は300kDa複合体のこれらの成分部分に、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで決定されたそれ らの相対分子量によって、PrtR45，PrtR44，PrtR27，PrtR17およびPrtR15と命名 した。これらは推定されたPrtRアミノ酸配列から予測したサイズとよく一致する (それぞれ53.9，44.8，29.5，17.5および14.3kDa)。44kDaタンパク質、PrtR44は 以前の研究者によって培養液赤血球凝集素／アドヘシン（adhesin）として開示 されている（Pikeら、1994）[J Biol Chem 269:406-411]。このPrtR44はこの多 重タンパク質複合体の別の非プロテイナーゼ成分と相同性があり、プロテアーゼ との相互作用および／または凝集作用もしくは接着作用におけるPrtR27，PrtR17 およびPrtR15についての同様の役割を示唆している。PrtR複合体のPrtR45 Arg- 特異的エンドペプチダーゼ成分は、Chenら(1992)［J Biol Chem 267:18896-1890 1］によってP.gingivalis H66の培養上清中に同定され、Arg-gingipainと命名さ れた50kDaのArg-特異的プロテイナーゼと同一の特徴およびＮ-末端配列を有して いる。 300kDa複合体のその他のタンパク質、48kDa Lys-特異的プロテイナーゼ、もう 一方の44kDaタンパク質ならびに39kDaおよび15kDaタンパク質は図９ａに図式で 示す単一遺伝子、prtKにコードされている。完全ヌクレオチド配列およびこれが ら推定されるPrtKのアミノ酸配列を図９ｂに示す。prtKは、推定上のリーダー配 列、プロ配列にプロテイナーゼドメインが続き、これにprtRのＣ-末端アドヘシ ンと高い相同性を有する配列関連アドヘシンがさらに続く配列をコードする点で 、prtRと類似している。我々はＳＤＳ-ＰＡＧＥによって測定したサイズを基礎 として、この48kDa Lys-特異的プロテイナーゼをPrtK48と命名し、そしてこれに 関連するアドヘシンをPrtK39，PrtK15およびPrtK44（図９ａ，ｂ）と命名した。 これらは推定されたPrtKアミノ酸配列から予測したサイズとがなりよく一致する (それぞれ55.9，44.8，14.3および47.9kDa)。PrtK48はFujimuraら(1993)［Infec t Immun 55:716-720］によってP.gingivalis 33277の培養上清から精製された48 kDaプロテイナーゼと同一の酵素 特性を有している。PrtK48はまた、Pikeら(1994)［J Biol Chem 269:406-411］ によってP.gingivalis H66の培養液から既に精製されており、Lys-gingipainと 命名された、60kDa Lys-特異的エンドペプチダーゼと同一のＮ-末端配列および 酵素特性を有している。PrtK39，PrtK15およびPrtK44はすべてPrtＲ赤血球凝集 素／アドヘシンの配列と関連があり、高い相同性を有しており、特に15kDaタン パク質は両方の遺伝子産物が同一であるので、これらのタンパク質もまた赤血球 凝集素／アドヘシンであることを示唆している。 300kDaプロテイナーゼ−アドヘシン複合体およびこれより高分子量の形態のも のは２つの遺伝子、prtRおよびprtKに由来するタンパク質で構成されているので 、これらをPrtR-PrtK複合体と命名してもよいと考えられる。推定される成熟Prt Rの分子量は160kDa(図９ａ，ｂ)、成熟PrtKは163kDa（図９ｂ）であるので、Prt R-PrtKヘテロに量体の質量は323kDaということになり、これはゲル濾過および非 煮沸ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって決定されたＭ_rとよく一致する。サンプルの煮沸後 のＳＤＳ-ＰＡＧＥは２つの遺伝子産物、PrtRおよびPrtKのドメインに対応する4 8，45，44，39，27，17および15kDaの７つのバンドを生成した。これらのドメイ ンは還元剤の存在下または不在下でサンプルを煮沸したときにのみ観察され、こ のことはタンパク質分解プロセシングの後、ドメインが緊密に非共有結合で結合 している状態であることを示唆している。細胞音波処理物またはクロマトグラフ ィー画分は還元剤不在下ではタンパク質分解活性が最少であるか、または全くな かったので、クロマトグラフィー精製中には最少の酵素活性となることが確実で ある。２つの遺伝子、prtRおよびprtKのプロセシングされたドメインで構成され た状態にある300kDa細胞結合複合体の特性決定によって、分泌された成熟PrtRお よびPrtKタンパク質が結合し、その後多分自己分解的にプロセシングされること が示唆される。独立したグループによる培養上清中のPrtRおよびPrtKのいくつか のドメインの同定は、これらのポリタンパク質のタンパク質分解（自己分解性） プロセシングと一致している。 プロセシングされたPrtR-PrtK複合体の相対分子量はおそらく1PrtK48＋1PrtR4 5＋1PrtR44＋PrtK39＋1PrtK44＋1PrtR27＋1PrtR17＋1PrtK15＋PrtR15＝294-323k Da（Ｃ-末端の切除に依存する）の組成に帰する、すなわち、300kDa複合体はprt R遺伝子産物の５ドメインおよびprtK遺伝子産物の４ドメイ ンを含有すると考えられる(図８および９)。ゲル濾過（図２）上の高Ｍ_r物質（0 .6-＞2×10⁶Da）もまた７PrtR-PrtKバンドで構成されていたので、このことから 300kDa PrtR-PrtK複合体はさらに結合してより大きな細胞結合凝集体を形成して いることが示唆される。PrtR44，PrtK39，PrtK44，PrtR27，PrtR17、並びにPrtR およびPrtKの両方の15kDaタンパク質間の高度のアミノ酸配列相同性は、これら のアドヘシンがPrtR-PrtK複合体の成分間およびさらに大きい凝集体中の複合体 自体間の非共有結合凝集性相互作用に対応することを示唆している。Arg-セファ ロース上でのアフィニティークロマトグラフィー中に300kDa PrtR-PrtK複合体の ある程度の解離が生じ、一方、750ｍＭリジンでは大部分のタンパク質が非解離 複合体として溶出することに注目することは興味深い。基質に結合する時の複合 体の部分的解離は、複合体が特定の宿主巨大分子および細胞を標的とし、結合時 にその標的とする部位でプロテイナーゼ／アドヘシンドメインを放出する機構の １つであると考えられる。 この実施例は、２つの遺伝子、prtRおよびprtKによってコードされる、Arg-特 異性およびLys-特異性プロテイナーゼならびに配列関連アドヘシンの新規細胞結 合複合体の精製について記載する。 Ｂ．限外濾過およびダイアフィルトレーション P.gingivalis W50を溶解ウマ血液アガー上および１μｇ/ｍｌヘミンを含有す る改変ＢＭ培地中、37℃で嫌気的に増殖させた。細菌を定期的継代培養（＜10継 代）によって溶解ウマ血液プレート上に維持し、これを使用してバッチ培養物に 接種した。分光光度計（295E,Perkin-Elmer）を使用して、650ｎｍで、脳心臓浸 出物培地中でのバッチ培養物の増殖をモニターした。グラム染色、顕微鏡試験、 および各種の生化学的試験を使用して、培養物の純度を定期的にチェックした。 原液を凍結乾燥培養物として維持した。P.gingivalisの培養物を後期対数期まで 増殖させ、遠心分離（5,000×ｇ,20分，４℃）によって細胞を回収した。細胞ペ レットにクロロホルムを添加し、緩やかに撹拌した後、懸濁液を室温で15分放置 した。クロロホルム処理の後、50ｍＭ NaClを含有する20ｍＭ Tris-HCl(pH8.0) 緩衝液を添加し、緩やかに撹拌した。その後、この混合物を遠心分離（100,000 ×ｇ，30分，４℃)し、上清を５容量の蒸留水とともに100,000 Ｍ_rカットオフ膜 （Amicon）によるダイアフィルトレーションにかけた。これによって294-323 kD aPrtR-PrtKが精製されるとともに酸化によって不活性化さ れ、これを凍結乾燥して免疫原として使用した。ダイアフィルトレーションによ って精製されたPrtR-PrtKはＳＤＳ-ＰＡＧＥ（図10）に示されるように、48，45 ,44，39，27，17および15kDa成分で構成されていた。 （２）抗体の調製 Ｏ₂-不活性化PrtR-PrtKを皮下に免疫感作させることによって、ウサギ中にPrt R-PrtKに対するポリクローナル抗血清を形成させた。ウサギを、０日目に不完全 フロイントアジュバント中のタンパク質40μｇで、14日目に不完全フロイントア ジュバント中のタンパク質90μｇで、さらに28日目に不完全フロイントアジュバ ント中のタンパク質60μｇで免疫した。標準的手法を使用して免疫感作を実施し た。P.gingivalisに対して高力価のポリクローナル抗血清が得られた。所望なら ば、標準的手法を使用して、P.gingivalisに対して特異的な抗体を得ることがで きる。 実施例２ PrtR-PrtKに関連するワクチン製剤のための方法および化合物 本発明のこの態様は、P.gingivalisが原囚となる感染症を予防または治療する ための能動免疫用の予防および／または治療ワクチンにおける免疫原として使用 する、PrtR-PrtKタンパク質を提供する。ワクチンの目的のためには、細菌タン パク質を含むP.gingivalisの抗原が免疫原となって、完全な細菌上の表面に露出 している１以上のエピトープ(ここで、エピトープ（類）はP.gingivalis株間で 保存されている)に対する機能的抗体を誘導するものでなければならない。 ワクチンの抗原として望ましい性質を有するPrtR-PrtKタンパク質の１例にお いて、実施例１に記載した方法を使用してP.gingivalisからこのタンパク質を精 製した。アジュバント（ＱＳ21 20ug）を含む精製した不活性化PrtR-PrtＫタン パク質（25ug）でマウスを４週間間隔で２回免疫した。精製したPrtR-PrtKを空 気酸化によって不活性化した。免疫したマウスから最後の免疫後32日目に血液を とり、免疫血清をプールした。固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、プ ールした免疫血清を細菌全体（P.gingivalis W50株）に対してアッセイした。全 細胞ＥＬＩＳＡのためには、細菌の一晩培養物を綿棒で回収し、600ｎｍでの吸 光度が0.1になるようにＰＢＳ中に懸濁させた。細菌懸濁液のアリコート（100ul ）を96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加し、室温で一晩乾燥した 。プレートをＰＢＳ中0.1％(w/v)ゼラチン100ulでブロックし た。他に特定する以外は、この操作およびその他の全インキュベーションを室温 で１時間とした。ブロック溶液を除去し、0.1％(w/v)ゼラチンを含有するＰＢＳ 中に希釈した免疫血清100ulをウェルに添加し、インキュベートした。ＰＢＳで ３回洗浄した後、組換えタンパク質Ｇと複合体化したアルカリホスファターゼ（ 0.1％(w/v)ゼラチンを含有するＰＢＳ中1:1500）100ulとインキュベートするこ とによって、結合抗体を検出した。プレートを洗浄し、p-ニトロフェニルホスフ ェート（ジエタノールアミン中２ｍｇ/ｍｌ）100ul/ウェルを添加することによ って、発色機能を与えた。30分後、３ M NaOH 50ulの添加によって反応を停止さ せた。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して492nmでの吸光度を読み取った。吸光度が ブランクウェルより大きくなる希釈率の逆数として、最終の力価を決定した。こ の結果によると、不活化PrtR-PrtKでの免疫は完全なp.gingivalis上の１以上の 表面露出エピトープに結合することができる抗体を誘発することが証明された。 PrtR-PrtKタンパク質の免疫原性を支持するその他の証拠としては、P.gingiva lisのPrtR-PrtKに対するヒトの免疫応答の研究があり、これによれば成人歯周炎 患者43名の86％がその血清中にPrtR-PrtKに対して特異的なIgGを有していた。 望ましいワクチン抗原の別の例は、Ｏ₂-不活性化PrtR-PrtKである。細胞表面P rtR-PrtKは、この不活性化タンパク質での免疫感作によって産生される殺細菌性 抗体の標的となることが証明された。不活性化PrtR-PrtKでの皮下免疫感作によ って、ウサギ中にPrtR-PrtKに対するポリクローナル抗血清を形成させた。ウサ ギを、０日目に不完全フロイントアジュバント中のタンパク質40μｇで、14日目 に不完全フロイントアジュバント中のタンパク質90μｇで、さらに28日目に不完 全フロイントアジュバント中のタンパク質60μｇで免疫した。形成された抗血清 をP.gingivalis W50菌株に対する殺細菌活性について試験した。細菌を脳心臓浸 出物（ＢＨＩ）ブロス中で対数期まで増殖させた。細菌培養物の１アリコートを 平衡塩類溶液中の10％ウシ血清アルブミン中に5×10⁴コロニー形成単位（ＣＦＵ ）／ｍｌまで希釈した。殺細菌アッセイの反応液には、細菌、不活性化PrtR-Prt Kタンパク質に対するポリクローナル抗血清、抗体を除去するためにタンパク質 Ｇに吸着させた正常ヒト血清からなる補体源(complementsource)、および平衡塩 類溶液を含有させた。すべての試薬を反応液に添加して、 容積を２５０μｌにした。０時および60分後に、反応液の25μｌアリコートを取 り出して、プレートのＢＨＩアガー上に３組ずつ添加した。プレートをインキュ ベートし、翌日コロニーを計数した。２つの時間について３組の３つの数値の平 均を使用して、殺菌率を計算した。殺細菌アッセイによって得られたデータの代 表的な例を表４に示す。その結果、不活性化PrtR-PrtKに対して形成されたポリ クローナル抗血清はP.gingivalisに対して殺菌性であることが示された。表４に よって説明されるように、対照によって、補体が不在のときは抗血清が細菌を殺 さないこと、および抗血清が不在のときは補体源が細菌を殺さないことが示され 、これは殺細菌活性が抗体特異性および補体仲介性であることを意味している。 表４ 抗-(PrtR-PrtK)抗体の殺細菌活性 PrtR-PrtKタンパク質がワクチン抗原として望ましい性質を保有していること をさらに説明するため、プールしたＷ50株に対して形成された免疫血清が異型菌 株と交差反応性であることが示された。上記のようにしてPrtR-PrtKタンパク質 に対して調製され、プールした免疫血清を、各臨床および各地起源の９種のP.gi ngivalisとの交差反応性について試験した。各培養物からの細菌を綿棒で回収し 、600ｎｍでの吸光度が0.1になるようにＰＢＳ中に懸濁させた。各懸濁物１μｌ をニトロセルロース膜にとり、乾燥させた。膜をＰＢＳ中5％乾燥脱脂乳溶液中 で、室温で１時間インキュベートして、膜の残存結合部位をブロックした。膜を ＰＢＳで２回洗浄し、その後1:1000に希釈した免疫血清を含有するブロック溶液 中に浸漬した。穏やかに振盪しながら46℃で一晩、膜を抗体とともにインキュベ ートした。膜をＰＢＳで３回洗浄し、その後組換えタンパク質 Ｇと複合体化したアルカリホスファターゼ（5％乾燥脱脂乳を含むＰＢＳ中1:150 0）とともに室温で２時間インキュベートした。膜をＰＢＳで３回洗浄し、基質 の添加によって、結合した抗体を検出した。免疫血清はＷ50株と同程度またはそ れ以上に強くすべての菌株と反応した。こうして、Ｗ50株から単離されたPrtR-P rtKタンパク質の免疫感作によって誘発された抗体は試験したすべての異型菌株 と交差反応した。 ワクチンの開発のため、PrtR-PrtKを発現する組換えベクターを含有する宿主 からPrtR-PrtKを精製することができる。こうした宿主としては、これらに限定 するわけではないが、PrtR-PrtKをコードするベクターで感染またはトランスフ ェクトさせた細菌形質転換体、酵母形質転換体、糸状菌形質転換体、および培養 細胞が挙げられる。接種するヒトまたは動物にワクチン製剤を導入するためには 多くの方法が知られている。これらとしては、これらに限定するわけではないが 、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼内、鼻内および経口投与が挙げられ る。ワクチンはさらに溶液、ポリマーまたはリポソームなどの生理的担体；およ びアジュバント、ならびにそれらの組合せを含むこともできる。 実施例３ 動物モデルにおけるPrtR-PrtK複合体での免疫感作の防御効力 マウス膿瘍モデルにおいて、精製p.gingivalisタンパク質の各種調製物を試験 した。このモデルは大体においてKesavaluら(1992)［Infect Immun 60:1455-146 4］によって記載された方法を基礎としている。典型的な実験を以下に概説する 。簡単に述べると、ＢＡＬＢ/ｃマウスをＡＲＣ（Perth,Australia）から入手し 、生P.gingivalis W50株でチャレンジする前に、表５の調製物および用量で首筋 の皮下に免疫感作させた。これは10週令で実施した。チャレンジの４および１週 間前にワクチン２用量をマウスに与えた。0.5％(vol/vol)緩衝化ホルマール食塩 水中、４℃で一晩、細胞の１アリコートをインキュベートすることによって、ホ ルマリン殺菌p.gingivalis W50細胞を調製した。実施例２に詳説したようにして P.gingivalisのクロロホルム抽出物を調製した。実施例１に詳説したようにして 、PrtR-PrtK複合体の精製を実施した。PrtR-PrtK複合体をとり、50ｍＭ 2-メル カプトエタノールの存在下で、４℃で８時間インキュベートすることによって、 PrtR-PrtKドメインを調製した。この結果、実施例１と同様に実施したゲル濾過F PLCおよびSDS-PAGEで示されるように、PrtR-Prt K複合体が15-115kDaタンパク質のドメインに分解した。 すべての調製物を注射前に同容量のフロイント不完全アジュバント（FIA;Sigm a）で乳化した。 免疫感作計画の前および１週間後に動物から採血した。吸着抗原としてp.ging ivalis音波処理物（実施例１と同様に調製）を使用するＥＬＩＳＡによって、血 清をスクリーニングした。精製PrtR-PrtK複合体の免疫原性を図11に示す。 表５ 免疫感作計画 ¹ＦＩＡ＝フロイント不完全アジュバント 細菌チャレンジ物の調製のため、嫌気室(Mark 3 Anaerobic Workstation,Don Whitley Scientific Limited；8％ Ｈ₂，12％ ＣＯ₂，80％Ｎ₂の混合空気を 使用)、37℃、溶解ウマ血液アガー（ＨＢＡ）上でP.gingivalis細胞を３または ４日目まで増殖させ、その後標準インキュベーター中37℃で24時間、0.5ｇ/Ｌシ ステインおよび１ｍｇ/Ｌヘミンを補充した脳心臓浸出物ブロス（ＢＨＩＢ；Oxo iｄ）20ｍｌ中で継代培養した。最後に、この培養物３ｍｌをＢＨＩＢ-システイ ン培地400ｍｌに添加し、650ｎｍの光学密度が0.18になるまで、標準インキュベ ーター中37℃で約15時間インキュベートした。その後、Beckman High Speed遠心 分離器中ＪＡ10ローターを使用して、10,000ｇで30分遠心分離して、細胞をペレ ット化し、次に、これらの実験で使用したＷ50菌株についてあらかじめ作成して おいた増殖曲線にしたがって、ＢＨＩＢ-システイン培地中、最終希釈率が3×10¹⁰ 細胞／ｍｌとなるように懸濁させた。背中の中央部の一方の側にチャレンジ用 量を接種する前に、マウスに認識用の印をつけ、病変の測定が可能になるように 背中および胸部を剃毛し、重量測定した。１マウスについて３×10⁹細菌数にな る予測チャレンジ用量を表す0.1ｍｌを与えた。溶解ＨＢＡプレート上でチャレ ンジ用量の各種希釈物を培養し、７日後にコロニーの数を調べることによって、 接種用量を確定した。 チャレンジ後、マウスについて毎日身体上の病変の数およびサイズを調べた。 サイズは相当する大体の表面積をｍｍ²で測定することによって評価した。非免 疫感作マウスにおいては、背部または側部中に生細菌を接種後、マウスの腹部に 病変が発生することが以前の実験で示されている。弱った動物は選別しなかった 。観察を２週間実施し、これらの実験の１つを要約して下記表６に記載する。こ の実験において、１マウスについて３×10⁹細菌の用量が所望の細菌数とされた が、接種物をプレートから取り出して計数したところ、各マウスが実際に生P.gi ngivalis W50細菌株3.17×10⁹のチャレンジ用量を受け入れていた。 マウスを各種のP.gingivalis画分で免疫したとき、ＦＩＡを受けた動物（グル ープ５）の病変のサイズに比較して、完全ホルマリン殺菌P.gingivalis W50株細 胞(グループ１)、クロロホルム抽出タンパク質（グループ２）およびPrtR-PrtK 複合体（グループ３）での病変のサイズの著しい減少（ｐ＜0.05）が見られた( 表６)。分解PrtR-PrtK複合体のPrtR-PrtKドメイン（グループ４）は対照（グル ープ５）に比較して、病変サイズの有意な減少はなかった。この結果は、複合体 が免疫原として有効に作用するが、PrtR-PrtKドメイン（15-115kDaタンパク質） は作用しないことを明確に示している。視認し得る病変が全く なかった動物を多数（40％）有していた唯一のグループはPrtR-PrtK複合体グ ループ（グループ３）であった。ホルマリン殺菌細胞（グループ１）を含むその 他の全グループの全動物が視認し得る病変を示し、これはホルマリン殺菌細胞よ りもPrtR-PrtK複合体の方がよい免疫原であることを意味している。 表６ PrtR-PrtK複合体での免疫感作により、マウスをP.gingivaliSチャレン ジから保護できる _* グループ５とその他のグループを比較してMann Whitneyランク合計（rank sum）試験によって計算した確率。 ^†平均±SD 実施例４ prtRおよびprtK遺伝子のクローニングおよび配列分析 細菌株 10％ＣＯ₂，10％Ｈ₂および80％Ｎ₂雰囲気中、37℃で、１μｇ/ｍｌヘミンを補 充した改変ＢＭ培地中でP.gingivalis W50を増殖させた。大腸菌ＪＭ109および 大腸菌ＬＥ392を37℃でＬＢ培地中で増殖させた。pUC18プラスミドを保有する大 腸菌の菌株を100μｇ/ｍｌアンピシリンを補充したＬＢ培地中、37℃で増殖させ た。 ゲノムライブラリー構築 細胞を後期対数期培養物500ｍｌからペレット化した以外はSmithら［Oral Mic robiol.Immunol.4:47-51(1989)］の記載にしたがって、P.gingivalis W50から染 色体ＤＮＡを単離した。dGTPおよびdATPを部分的に添加し、Lamb daGEM（登録商標）-12 XhoIハーフサイトアーム（Promega）中に連結し、Packag ene（登録商標）(Promega)を使用してパッケージングした、BamHIで部分的に消 化したＷ50ＤＮＡから、ゲノムライブラリーを構築した。 prtR遺伝子の特性決定：精製PrtR45のＮ-末端配列情報から誘導した縮重合成 オリゴヌクレオチドを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングした。オ リゴヌクレオチドプローブはアミノ酸配列ＹＥＧＤＩＫＤ（アンチセンス）およ びＫＤＦＶＤＷＫＮＱ（センス）を基礎とし、γ³²Ｐ ＡＴＰおよびＴ4ポリヌク レオチドキナーゼによって5'末端標識した。Nylon膜フィルター上に置くことに よって約1.5×10⁴ファージをスクリーニングし、ハイブリダイゼーション緩衝液 ：6×ＳＳＣ(ＳＳＣは15ｍＭクエン酸ナトリウム、150ｍＭ NaCl(pH8.0))、0.25 ％SDS,5×Denhardt溶液および100μｇ/ｍｌサーモン精子ＤＮＡ中、44℃で一晩 、放射性標識オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。フィルターを44℃で 0.01％ＳＤＳ(w/v)を含有する5×ＳＳＣ溶液中で十分洗浄した。陽性ハイブリダ イズプラークを精製した。オリゴヌクレオチドの末端標識およびスクリーニング 操作の標準的プロトコルは基本的にSambrookら(1989)［Molecular Cloning：A L aboratory Manual；第２版.,Cold Spring Harbour Laboratory Press］の記載に したがった。挿入サイズが約15kbのλクローン４を選択したが、この断片は完全 prtR遺伝子を含有していた。15kb断片を適当な制限酵素4で切断し、産生した断 片をpUC18中にサブクローン化した。エレクトロポレーションを使用して大腸菌 ＪＭ109を組換えプラスミドで形質転換させた。 prtK遺伝子の特性決定：上記と同一のゲノムライブラリーからPrtKをコードす る遺伝子の5'部分を単離した。精製PrtK48のＮ-末端配列情報から誘導した縮重 合成オリゴヌクレオチドを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングした 。オリゴヌクレオチドプローブはアミノ酸配列ＤＶＹＴＤＨＧＤに対するセンス とし、上記のように放射性標識した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は 、温度を48℃とし、フィルターを0.01％ＳＤＳ(w/v)を含有する3×ＳＳＣ溶液中 で十分洗浄した以外は、上記のとおりである。挿入サイズが約15kbのλクローン 12を選択し、BamHIで消化し、3.3kb断片をプラスミドBamHI-BAP pUC18中に連結 し、前記のように大腸菌ＪＭ109をこの組換えプラスミドで形質転換させた。prt K内の内部BamHI部位によって、3.3kb BamHI断片はλ12クローンの末端を構成す るprtKの5'部分を含有していた。3.3kb BamHI 断片の配列の特性決定から、PrtK48をコードするＤＮＡ配列は内部EcoRI部位を 含有していることが示された。次に、prtKの3'末端をクローン化するために好適 な戦略を決定するため、PrtK48内にあることがわかっている配列ＴＨＩＧＡＨに 特異的な第２のオリゴヌクレオチドプローブ（lysur）を産生させた。ゲノムＤ ＮＡのサザンブロット分析によって、7.5kb EcoRI断片がprtKの完全3'末端部分 を含有することが示された。prtK遺伝子の3'末端を特性決定するため、第２のゲ ノムライブラリーを調製した。EcoRIで消化した6-8kbのＤＮＡ断片をアガロース ゲルから精製し、続いてEcoRIで消化したλZap II-仔ウシ腸ホスファターゼ処理 ベクター（Stratagene）に連結した。GigapackIII Goldパッケージエキストラク ト（Stratagene）を使用し、製造者の指示にしたがって、6-8kb P.gingivalis E coRI断片が富化されたゲノムライブラリーをパッケージした。ハイブリダイゼー ション温度を42℃とし、フィルターを0.01％ＳＤＳ(w/v)を含有する3×ＳＳＣ溶 液中、42℃で洗浄した以外は、前記のように、オリゴヌクレオチドlysurを使用 してライブラリーをスクリーニングした。λZAPII陽性ゲノムクローンのin vivo 切除を実施（Stratagene指示書）して、pBlue scriptファージミドを切除し、続 いて配列決定して、prtK遺伝子の3'末端に対応する配列情報を得た。 ＤＮＡ配列決定：LiおよびSchweizer［Focus 15:19-20(1993)］の操作法にし たがって調製した二本鎖プラスミド鋳型ＤＮＡを、ジデオキシ末端終結法[Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463-5467(1977)]に従い、United States Biochemical sから購入したSequenaseバージョン2.0ヌクレオチド配列決定キットを使用して 、ＤＮＡ配列から誘導した合成オリゴヌクレオチドを使用して両方向に配列決定 した。Australian National Genomic Information Service（ＡＮＧＩＳ）によ ってアクセスされたプログラムセットを使用して、ヌクレオチドおよびタンパク 質の配列データを分析した。 実施例５ 以下は提案する抗-(PrtR-PrtK)抗体を含有する歯磨きペースト製剤の１例であ る。 成分 ％w/w リン酸二カルシウム二水和物 50.0 グリセロール 20.0 カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ラウリル硫酸ナトリウム 1.5 ナトリウムラウロイルサルコニゼート 0.5 香味料 1.0 サッカリンナトリウム 0.1 クロルヘキシジングルコネート 0.01 デキストラナーゼ 0.01 抗-(PrtR-PrtK)含有ヤギ血清 0.2 水 残量 実施例６ 以下は提案する歯磨きペースト製剤の１例である。 成分 ％w/w リン酸二カルシウム二水和物 50.0 ソルビトール 10.0 グリセロール 10.0 カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ラウリル硫酸ナトリウム 1.5 ナトリウムラウロイルサルコニゼート 0.5 香味料 1.0 サッカリンナトリウム 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 クロルヘキシジングルコネート 0.01 デキストラナーゼ 0.01 抗-(PrtR-PrtK)含有ウシ血清 0.2 水 残量 実施例７ 以下は提案する歯磨きペースト製剤の１例である。成分 ％w/w リン酸二カルシウム二水和物 50.0 ソルビトール 10.0 グリセロール 10.0 カルボキシメチルセルロースナトリウム 1.0 ラウロイルジエタノールアミド 1.0 スクロースモノラウレート 2.0 香味料 1.0 サッカリンナトリウム 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 クロルヘキシジングルコネート 0.01 デキストラナーゼ 0.01 抗-(PrtR-PrtK)含有ウシミルクIg 0.1 水 残量 実施例８ 以下は提案する歯磨きペースト製剤の１例である。 成分 ％w/w ソルビトール 22.0 トチャカ（Irish moss） 1.0 水酸化ナトリウム（50％） 1.0 ガントレッツ（Gantrez） 19.0 水（脱イオン） 2.69 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.76 サッカリンナトリウム 0.3 ピロリン酸塩 2.0 水和アルミナ 48.0 香味料オイル 0.95 抗-(PrtR-PrtK)マウスモノクローナル 0.3 ラウリル硫酸ナトリウム 2.00 実施例９ 以下は提案する液体歯磨きペースト製剤の１例である。成分 ％w/w ポリアクリル酸ナトリウム物 50.0 ソルビトール 10.0 グリセロール 20.0 香味料 1.0 サッカリンナトリウム 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 クロルヘキシジングルコネート 0.01 エタノール 3.0 抗-(PrtR-PrtK)含有ウマIg 0.2 リノール酸 0.05 水 残量 実施例10 以下は提案するうがい薬ペースト製剤の１例である。 成分 ％w/w エタノール 20.0 香味料 1.0 サッカリンナトリウム 0.1 モノフルオロリン酸ナトリウム 0.3 クロルヘキシジングルコネート 0.01 ラウロイルジエタノールアミド 0.3 抗-(PrtR-PrtK)含有ウサギIg 0.2 水 残量 当業者は、ここに概括した発明の精神または範囲から離れることなく、特定の 実施態様で示した本発明に対して多数の変更および／または改変をすることがで きると判断するはずである。したがって、ここに示した実施態様はすべての点で 例示のためであって、限定するものではないことを考慮されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｒ Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ０７Ｋ 16/12 Ｃ１２Ｎ 9/76 Ｃ１２Ｎ 9/76 (72)発明者 レイノルズ，エリック，チャールズ オーストラリア国 3104 ヴィクトリア 州，ノース バルウィン，ヒル ストリー ト 104 (72)発明者 ボーガル，ピーター，シン オーストラリア国 3225 ヴィクトリア 州，ポイント ロンスデール，ノーマン クレセント 30 (72)発明者 スラケスキー，ナダ オーストラリア国 3102 ヴィクトリア 州，イースト ケウ，ベルフォード ロー ド 15

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Porphyromonas gingivalisに対する抗体応答を生起させるのに使用するため の、実質的に精製された抗原複合体であって、該複合体が、それぞれが１以上の アドヘシンドメインを含有するアルギニン特異性およびリジン特異性チオールエ ンドペプチダーゼの多量体タンパク質複合体を１以上含み、分子量が約200kDaよ り大きい複合体。 ２．前記多量体タンパク質複合体がPorphyromonas gingivalisの毒性菌株と結合 している、請求項１に記載の実質的に精製された抗原複合体。 ３．多量体タンパク質複合体の分子量が約294から約323kDである、請求項１また は２に記載の実質的に精製された抗原複合体。 ４．多量体タンパク質複合体が９タンパク質で構成される、請求項１−３のいず れか１項に記載の実質的に精製された抗原複合体。 ５．９タンパク質が以下のN-末端配列： を有する、請求項４に記載の実質的に精製された抗原複合体。 ６．９タンパク質がPrtK48,PrtR45,PrtR44,PrtK39,PrtK44,PrtR27,PrtR17,PrtK1 5およびPrtR15である、請求項５に記載の実質的に精製された抗原複合体。 ７．チオールニンドペプチダーゼが不活性化されている、請求項１に記載の実質 的に精製された抗原複合体。 ８．前記チオールエンドペプチダーゼが酸化によって不活性化されている、請求 項７に記載の実質的に精製された抗原複合体。 ９．チオールエンドペプチダーゼが変異によって不活性化されている、請求項７ に記載の実質的に精製された抗原複合体。 10．多量体タンパク質複合体が図８Ｂおよび図９Ｂに示すＤＮＡ配列によってコ ードされる、請求項１に記載の実質的に精製された抗原複合体。 11．請求項１−10のいずれか１項に記載の複合体の有効量ならびに好適なアジュ バントおよび／または許容可能な担体を含む、Porphyromonas gingivalisに対す る免疫応答を誘発するのに使用する組成物。 12．請求項１−10のいずれか１項に記載の複合体に対して特異的な抗体を含む抗 体調製品。 13．前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項12に記載の抗体調製品。 14．抗体がモノクローナル抗体である、請求項12に記載の抗体調製品。 15．Porphyromonas gingivalisのPrtR-PrtK複合体を少なくとも部分的に中和す るのに有効な量の請求項12−14のいずれか１項に記載の抗体調製品を患者に投与 することを含む、Porphyromonas gingivalis感染症患者の治療方法。 16．抗体調製品をうがい剤または歯磨き剤として投与する、請求項15に記載の方 法。 17．個体にP.gingivalisに対する免疫応答を誘導するのに有効な量の請求項11に 記載の組成物を個体に投与することを含む、個体におけるP.gingivalis感染の危 険性および／または疾病の程度を軽減する方法。 18．PrtR-PrtKをコードし、適当な条件下で宿主細胞がPrtR-PrtKを発現するよう に制御配列に機能的に連結されたＤＮＡ配列（群）で形質転換された、組換え宿 主細胞。 19．前記宿主細胞が口内共生性である、請求項18に記載の組換え宿主細胞。 20．宿主細胞が図８ｂおよび図９ｂに示すＤＮＡ配列で形質転換された、請求項 18または19に記載の組換え宿主細胞。