ES2255082T3

ES2255082T3 - Diagnostico y tratamiento de la enfermedad periodontal.

Info

Publication number: ES2255082T3
Application number: ES96934198T
Authority: ES
Inventors: Eric Charles Reynolds; Peter Singh Bhogal; Nada Slakeski
Original assignee: VICTORIAN DAIRY IND; Victorian Dairy Industry Authority; University of Melbourne
Current assignee: VICTORIAN DAIRY IND; Victorian Dairy Industry Authority; University of Melbourne
Priority date: 1995-10-30
Filing date: 1996-10-30
Publication date: 2006-06-16
Anticipated expiration: 2016-10-30
Also published as: DE69635582T2; DK0858504T3; KR19990067167A; ATE312909T1; US20110213129A1; EP0858504A4; US6511666B1; AUPN627595A0; JP4117026B2; US20070189982A1; KR100286055B1; JP2000510817A; WO1997016542A1; EP0858504B1; DE69635582D1; EP0858504A1; AU715456B2; AU7267396A; ZA969130B; NZ320015A

Abstract

ESTA INVENCION TRATA DE LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR PRTR - PRTK DE PORPHYROMONAS GINGIVALIS, Y EN PARTICULAR DE UN COMPLEJO PROTEICO ASOCIADO CON CELULAS MULTIMERICAS QUE INCLUYE LAS PROTEINAS PRTR Y PRTK. POR CONSIGUIENTE, LA INVENCION DESCRIBE UN COMPLEJO ANTIGENICO SUSTANCIALMENTE PURIFICADO PARA SU UTILIZACION EN LA PRODUCCION DE UNA RESPUESTA DE ANTICUERPOS DIRIGIDA CONTRA PORPHYROMONAS GINGIVALIS. EL COMPLEJO INCLUYE AL MENOS UN COMPLEJO DE PROTEINAS MULTIMERICAS DE TIOL ENDOPEPTIDASAS ESPECIFICAS PARA ARGININA Y ESPECIFICAS PARA LISINA, QUE CONTIENEN CADA UNA AL MENOS UN DOMINIO DE ADHESINA, PRESENTANDO EL COMPLEJO UN PESO MOLECULAR MAYOR QUE APROXIMADAMENTE 200 KDA. LA INVENCION TAMBIEN TRATA DE COMPOSICIONES FARMACEUTICAS Y AGENTES ASOCIADOS BASADOS EN DICHO COMPLEJO PARA LA DETECCION, LA PREVENCION Y EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD PERIODONTAL ASOCIADA CON P. GINGIVALIS.

Description

Diagnóstico y tratamiento de la enfermedad periodontal.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la proteína de superficie celular PrtR-PrtK de Porphyromonas gingivalis y, en particular, a un complejo proteico multimérico asociado a la célula, que comprende las proteínas PrtR y PrtK. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y agentes asociados basados en dicho complejo para la detección, prevención y tratamiento de la enfermedad periodontal asociada con P. gingivalis.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas a bacterias de los tejidos de soporte de los dientes y abarcan desde la forma relativamente leve de la gingivitis, la inflamación reversible no específica de tejido gingival, a las formas más agresivas de periodontitis, que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis está asociada con una infección subgingival de un consorcio de bacterias gram-negativas específicas que conduce a la destrucción del periodonto y es un gran problema de salud pública. Una bacteria que ha atraído un interés considerable es P. gingivalis, ya que la recuperación de este microorganismo a partir de lesiones de periodontitis de adultos puede ser de hasta un 50% de la flora subgingival cultivable de manera anaerobia, mientras que P. gingivalis se recupera rara vez a partir de sitios sanos y, desde luego, en números bajos. Un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival se ha asociado con un aumento de la gravedad de la periodontitis, y la erradicación del microorganismo en la población microbiana subgingival cultivable va acompañada de la resolución de la enfermedad. Se ha demostrado la progresión de las lesiones de periodontitis en primates no humanos con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos hallazgos tanto en animales como en seres humanos sugieren un papel importante de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis de adultos.

P. gingivalis es un bacilo proteolítico, no sacarolítico, anaerobio gram-negativo con pigmentos negros que obtiene energía del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo tiene una absoluta necesidad de hierro para su crecimiento, preferentemente en la forma hemo o en su producto de oxidación de Fe(III) hemina y cuando crece en condiciones de hemina en exceso es altamente virulento en los animales de experimentación. Varios factores de virulencia se han implicado en la patogenicidad de P. gingivalis incluyendo la cápsula, adhesinas, citotoxinas y enzimas hidrolíticas extracelulares. En particular, las proteasas han recibido un gran trato de atención por su capacidad para degradar una amplia gama de proteínas huésped, incluyendo proteínas estructurales y otras implicadas en la defensa. Las proteínas que han mostrado que son sustratos para la actividad proteolítica de P. gingivalis incluyen los tipos I y IV de colágeno, fibronectina, fibrinógeno, laminina, proteínas de la cascada de coagulación plasmática y del complemento, \alpha_{1}-antitripsina, \alpha_{2}-macroglobulina, antiquimotripsina, antitrombina III, antiplasmina, cistatina C, IgG e IgA. Las principales actividades proteolíticas asociadas con este microorganismo se han definido según la especificidad por el sustrato y son de "tipo tripsina", es decir, la escisión en el lado carboxílico de los residuos arginilo y lisilo, y colagenolíticas, aunque se han notificado otras actividades menores.

Se ha demostrado que la actividad proteolítica de tipo tripsina de P. gingivalis degrada el complemento, generándose C5a biológicamente activo, perjudica la función fagocítica y otras funciones de los neutrófilos mediante la modificación de los receptores de superficie, suprime el potencial de coagulación del fibrinógeno prolongando el tiempo de coagulación plasmática. La actividad proteolítica de tipo tripsina de P. gingivalis también genera fragmentos Fc de la IgG1 humana estimulando la liberación de citocinas proinflamatorias desde las células mononucleares, y está asociada con la disfunción vascular y el aumento de la permeabilidad vascular a través de la activación de la cascada de calicreína-cinina. Mutantes espontáneos de P. gingivalis con actividad de tipo tripsina reducida así como las células de tipo natural tratadas con el inhibidor de la proteasa de tipo tripsina N-p-tosil-L-lisina clorometil cetona son no virulentos en los modelos animales. Además, se ha demostrado que P. gingivalis cultivado en condiciones controladas de exceso de hemina, expresó más actividad de tipo tripsina y menos actividad colagenolítica, y fue más virulenta en ratas con respecto a células cultivadas bajo condiciones limitadas de hemina pero por lo demás en idénticas condiciones. El aumento de la expresión de la actividad de tipo tripsina por P. gingivalis más virulento ha conducido a la especulación de que la actividad proteolítica de tipo tripsina puede ser el gran factor determinante para la infección o enfermedad. No obstante, las actividades proteolíticas de tipo tripsina asociadas a la célula de P. gingivalis no se han caracterizado hasta la fecha.

Ha habido un considerable empeño por purificar y caracterizar las proteasas de tipo tripsina de P. gingivalis a partir de fluidos de cultivo libres de células. Chen et al, (1992) [J Biol Chem 267:18896-18901] han purificado y caracterizado una tiol proteasa específica de arginina de 50 kDa procedente de un fluido de cultivo de P. gingivalis H66 designada como Arg-gingipaína. Una tiol proteasa específica de arginina similar se ha descrito en el documento JP 07135973 y la secuencia de aminoácidos se ha descrito en el documento WO 9507286 y en Kirszbaum et al, 1995 [Biochem Biophys Res Comm 207:424-431]. Pike et al (1994) [J Biol Chem 269:406-411] han caracterizado una cisteína proteinasa específica de lisina de 60 kDa procedente del fluido de cultivo de P. gingivalis H66 designada como Lys-gingipaína y la secuencia génica parcial de esta enzima se describió en el documento WO 9511298 y se describió completamente en el documento WO 9617936. No obstante, antes del desarrollo de la presente invención se desconocía que en la superficie celular de P. gingivalis existe un complejo de 300 kDa de proteasas específicas de arginina y específicas de lisina que contienen ambas dominios de adhesina. El complejo de 300 kDa se ha designado como el complejo PrtR-PrtK. La presencia del complejo de superficie celular PrtR-PrtK, que muestra actividad proteolítica específica de arginina y específica de lisina junto con actividad adhesina era desconocido antes. Además, el nuevo complejo PrtR-PrtK de la presente invención se expresa en la superficie celular, es un factor asociada a gran virulencia y contiene epítopos únicos que no se manifiestan en los dominios individuales. Las tiol proteasas específicas de arginina y específicas de lisina descritas anteriormente, tal como se ha tratado, no muestran ninguna de estas características y se ha comprobado que tienen una aplicación limitada hasta la fecha. No obstante, las características anteriormente mencionadas han hecho que el complejo PrtR-PrtK de la invención resulte ideal para el desarrollo de productos de diagnóstico e inmunoprofilácticos. El complejo de superficie celular PrtR-PrtK es, en consecuencia, de especial interés para el diagnóstico y la neutralización mediante inmunidad pasiva a través de composiciones orales que contienen anticuerpos neutralizantes, y mediante el desarrollo de vacunas. En particular, para el desarrollo de una vacuna bacteriana recombinante intraoral, en la que la bacteria recombinante que expresa un complejo PrtR-PrtK inactivado es un habitante comensal modificado mediante ingeniería genética de la cavidad
oral.

Sumario de la invención

En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invención consiste en un complejo antigénico sustancialmente purificado para su uso en la producción de una respuesta de anticuerpos dirigida contra Porphyromonas gingivalis, comprendiendo el complejo al menos un complejo proteico multimérico de tiol endopeptidasas específicas de arginina y específicas de lisina, conteniendo cada uno al menos un dominio de adhesina, teniendo el complejo un peso molecular superior a aproximadamente 200 kDa.

En el contexto de esta descripción, los términos "adhesina" y "hemaglutinina" puede considerarse que son sinónimos.

En una forma preferida de la presente invención, el complejo proteico multimérico se asocia con cepas virulentas de Porphyromonas gingivalis, tiene preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 294 a aproximadamente 323 kDa, y se deriva preferiblemente de P. gingivalis W50.

El complejo proteico multimérico se compone de 9 proteínas. Estas 9 proteínas tienen las siguientes secuencias N-terminal:

DVYTDHGDLYNTPVRML,

YTPVEEKQNGRMIVIVAKKYEGD,

SGQAEIVLEAHDVWNDGSGYQILLDADHDQYGQVIPSDTHFL,

PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR,

ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDA,

PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR,

ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA,

y

ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA,

Actualmente se prefiere que las 9 proteínas sean PrtK48, PrtR45, PrtR44, PrtK39, PrtK44, PrtR27, PrtR17, PrtK15 y PrtR15, tal como se describe en el presente documento.

Como el complejo antigénico purificado normalmente tiene actividad enzimática, se prefiere en varios usos que las tiol endopeptidasas se hagan inactivas. Esto puede conseguirse de varias maneras, por ejemplo mediante oxidación o mediante mutación. Actualmente se prefiere que la inactivación sea mediante oxidación.

Aún en otra realización preferida de la presente invención, el complejo proteico multimérico está codificado por la secuencia de ADN que se muestra en las figuras 8b y 9b.

En un segundo aspecto, la presente invención consiste en una composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra Porphyromonas gingivalis, comprendiendo la composición una cantidad eficaz del complejo del primer aspecto de la presente invención y un adyuvante adecuado y/o vehículo aceptable.

En un tercer aspecto, la presente invención consiste en un método para reducir la posibilidad de infección por P. gingivalis en un individuo y/o la gravedad de la enfermedad, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad de la composición del segundo aspecto de la presente invención eficaz para inducir una respuesta inmunitaria en el individuo dirigida contra P. gingivalis.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de diagnóstico para determinar la presencia de P. gingivalis caracterizado por el uso de un antígeno, tal como se definió anteriormente en el presente documento, que comprende la aplicación de técnicas conocidas que incluyen por ejemplo ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.

La invención también proporciona kits de diagnóstico que comprenden anticuerpos, antígenos y/o sondas de ácido nucleico, tal como se definió anteriormente en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. FPLC (Cromatografía líquida rápida de proteínas) de intercambio iónico de un producto sonicado de P. gingivalis W50. El producto sonicado en tampón TC que contenía NaCl 50 mM se aplicó a una columna Hiload XK 16/10 Q-Sepharose y se eluyó usando un gradiente lineal de disolución tampón B desde 0 hasta 100% durante 90 minutos a una velocidad de flujo de 2,0 ml min^{-1}. Las fracciones (6 ml) se sometieron a ensayo para determinar la actividad amidolítica y proteolítica usando azocaseína, Bz-L-Arg-pNA y Z-L-Lys-pNA. La actividad amidolítica de cada fracción de 6 ml con Bz-L-Arg-pNA se muestra en el histograma.

Figura 2. FPLC de filtración en gel de las fracciones reunidas y concentradas de la FPLC de intercambio iónico en Q-Sepharose que contenían actividad proteolítica/amidolítica. Las fracciones del intercambio iónico que contenían el pico principal de actividad proteolítica/amidolítica se reunieron, se equilibraron en tampón TC que contenía NaCl 150 mM, se concentraron y se dividieron en cuatro alícuotas, y se aplicó independientemente cada una de ellas a una columna de filtración en gel (Superose 12 HR 10/30) y se eluyó usando el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,3 ml min^{-1}. Las fracciones (0,5 ml) se sometieron a ensayo para determinar la actividad amidolítica y proteolítica. La actividad amidolítica con Bz-L-Arg-pNA se muestra en el histograma. Vo y Vt indican los volúmenes inicial y total de la columna, respectivamente. Se marcan los volúmenes de elución de las proteínas patrón tiroglobulina de 667 kDa, catalasa de 232 kDa y aldolasa de 158 kDa.

Figura 3. SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) (en condiciones de ebullición/reducidas) del pico de 300 kDa procedente de FPLC de filtración en gel (Superose 12 HR 10/30). Carril 1, patrones de masa molecular de Pharmacia (M_{r} se muestra en kDa). Carril 2, pico de 300 kDa de FPLC de filtración en gel. Gel teñido con azul de Coomassie.

Figura 4. Sitios de escisión específicos (marcados con flechas) de la \alpha_{s1}-caseína mediante el pico proteolítico/amidolítico procedente de FPLC de filtración en gel que corresponde a 300 kDa. La proteína \alpha_{s1}-caseína se escindió en el lado del extremo carboxilo de los residuos arginilo y lisilo solamente.

Figura 5. FPLC de arginina-Sepharose del pico de la filtración en gel de 300 kDa que muestra actividad proteolítica específica de Arg y Lys. Las fracciones de la filtración en gel que contenían el pico principal de actividad proteolítica (300 kDa) se reunieron y se aplicaron a una columna de arginina-Sepharose (5 ml de arginina-Sepharose 4B) y se lavaron con tampón TC que contenía NaCl 50 mM a 0,1 ml min^{-1} hasta que la línea base volvió a cero. La columna se lavó entonces adicionalmente con NaCl 500 mM y luego se volvió a equilibrar con tampón TC que contenía NaCl 50 mM. La columna se eluyó primero con lisina 200 mM en un tampón TC que contenía NaCl 50 mM, seguido de lisina 750 mM en el mismo tampón. La columna se volvió a equilibrar entonces y se eluyó con arginina 200 mM en el mismo tampón a una velocidad de flujo de 0,1 ml min^{-1}. Los picos se recogieron y se sometieron a ensayo para determinar la actividad amidolítica y proteolítica. La actividad amidolítica de Bz-L-Arg-pNA se muestra en el histograma y las flechas indican el comienzo de cada gradiente escalonado.

Figura 6. SDS-PAGE (en condiciones de ebullición/reducidas) de eluyente de lisina 200 mM procedente de FPLC de arginina-Sepharose. Carril 1, patrones de masa molecular de Pharmacia (M_{r} se muestra en kDa). Carril 2, eluyente de lisina 200 mM procedente de FPLC de arginina-Sepharose. Gel teñido con plata.

Figura 7. SDS-PAGE (en condiciones de ebullición/reducidas) de los eluyentes de lisina 750 mM y de arginina 200 mM procedentes de FPLC de arginina-Sepharose y de la endopeptidasa específica de Arg de 45 kDa purificada. Carril 1, eluyente de lisina 750 mM. Carril 2, eluyente de arginina 200 mM. Carril 3, endopeptidasa específica de Arg de 45 kDa purificada. Carril 4, patrones de masa molecular de Pharmacia (M_{r} se muestra en kDa). Gel teñido con azul de Coomassie.

Figura 8a. Representación esquemática del gen prtR. La poliproteína naciente PrtR se compone de una secuencia líder, una prosecuencia seguida de la proteinasa de cisteína específica de Arg PrtR45, y las adhesinas PrtR44, PrtR15, PrtR17 y PrtR27, todas precedidas de un residuo arginilo o lisilo.

Figura 8b. Secuencia de nucleótidos de prtR.

Figura 9a. Representación esquemática del gen prtK. La poliproteína naciente PrtK se compone de una secuencia líder, una prosecuencia seguida de la proteinasa de cisteína específica de Lys PrtK48, y las adhesinas PrtK39, PrtK15 y PrtK44, todas precedidas de un residuo arginilo o lisilo.

Figura 9b. Secuencia de nucleótidos de prtK.

Figura 10. SDS-PAGE del complejo PrtR-PrtK purificado mediante diafiltración. El carril 1 muestra los marcadores de masa molecular. El carril 2 muestra los componentes de la PrtR-PrtK purificada mediante diafiltración.

Figura 11. Valoración ELISA de los sueros procedentes de 5 ratas inmunizadas dos veces con el complejo PrtR-PrtK emulsionado en adyuvante incompleto de Freund. Los sueros de prueba (TS 32 - 36) y los sueros preinmunitarios (PIS 32 - 36) se seleccionaron usando el producto sonicado de P. gingivalis W50 como el antígeno adsorbido. Se usaron disoluciones de anticuerpo primarias de 1/100, 1/500, 1/2500 y 1/12500. El anticuerpo unido se determinó usando anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina. El producto de reacción se cuantificó espectroscópicamente usando un filtro de interferencia de 450 nm en un lector de placas y se registró como lecturas de densidad óptica (D.O.).

Descripción detallada de la invención

Ahora se describirá la invención con más detalle en referencia a los métodos usados y aplicados en el desarrollo de la invención, y en referencia a ejemplos particulares que proporcionan los mejores métodos conocidos para realizar la invención.

La bacteria intraoral Porphyromonas gingivalis tiene en su superficie celular importantes proteinasas de tipo tripsina tales como un complejo proteico heterodimérico de 294 - 323 kDa de tiol endopeptidasas específicas de Arg y específicas de Lys con hemaglutininas (adhesinas) designado en el presente documento como complejo PrtR-PrtK. El complejo PrtR-PrtK puede purificarse a partir de las células de P. gingivalis mediante ultrasonicación o extracción con cloroformo seguida de diafiltración o cromatografía de intercambio iónico y Lys-Sepharose o Arg-Sepharose. El complejo PrtR-PrtK purificado se usa entonces para generar anticuerpos usando técnicas convencionales. Los animales usados para la generación de anticuerpos pueden ser conejos, cabras, pollos, ovejas, caballos, vacas, etc. Cuando se detecta por inmunoanálisis un título alto de anticuerpos contra el complejo PrtR-PrtK, se extrae sangre de los animales o se recogen los huevos o la leche y se prepara el suero y/o se purifican los anticuerpos usando técnicas convencionales o se producen anticuerpos monoclonales mediante la fusión de células de bazo con células de mieloma usando técnicas convencionales. El anticuerpo (fracción de inmunoglobulinas) puede separarse del cultivo o fluido ascítico, suero, leche o huevo mediante precipitación salina ("salting out"), filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y/o de afinidad y similares, prefiriéndose la precipitación salina. En el método de precipitación salina, el antisuero o la leche se satura con sulfato amónico para producir un precipitado, seguido de la diálisis del precipitado frente a solución salina fisiológica para obtener la fracción de inmunoglobulinas purificada con el anti-(PrtR-PrtK) específico. El anticuerpo preferido se obtiene del antisuero equino y del antisuero bovino y de la leche. En esta invención, el anticuerpo contenido en el antisuero y en la leche obtenido mediante inmunización del animal con el PrtR-PrtK inactivado puede combinarse con la composición oral. En este caso, pueden usarse el antisuero y la leche así como el anticuerpo separado y purificado a partir del antisuero o la leche. Cada uno de estos materiales puede usarse solo o en combinación con dos o más. Se pueden usar anticuerpos contra el PrtR-PrtK en composiciones orales tales como la pasta de dientes y el enjuague bucal para neutralizar el PrtR-PrtK y así prevenir la enfermedad. También se pueden usar los anticuerpos anti-(PrtR-PrtK) para la detección temprana de P. gingivalis en las muestras de placa subgingival mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) en consulta.

Para composiciones orales, se prefiere que la cantidad administrada de los anticuerpos anteriores sea de 0,0001 - 50 g/kg/día y que el contenido de los anticuerpos anteriores sea del 0,0002 - 10% en peso, preferiblemente del 0,002 - 5% en peso de la composición. La composición oral de esta invención que contiene el anticuerpo del suero o de la leche anteriormente mencionado puede prepararse y usarse en diversas formas aplicables a la boca, tales como dentífricos incluyendo pastas de dientes, polvos para los dientes y dentífricos líquidos, enjuagues bucales, trociscos, dispositivos de irrigación de bolsa periodontales, chicles, pastas dentales, cremas de masaje gingival, comprimidos para hacer gárgaras, productos lácteos y otros productos alimenticios. La composición oral según esta invención puede incluir adicionalmente componentes bien conocidos adicionales dependiendo del tipo y la forma de una composición oral particular.

En ciertas formas altamente preferidas de la invención, la composición oral puede tener un carácter sustancialmente líquido, tal como un enjuague bucal o elixir. En tal preparación, el vehículo es normalmente una mezcla de agua-alcohol que incluye deseablemente un humectante tal como se describe más adelante. Generalmente, la razón en peso de agua con respecto a alcohol está en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 20:1. La cantidad total de mezcla agua-alcohol en este tipo de preparación está normalmente en el intervalo de desde aproximadamente un 70 hasta aproximadamente un 99,9% en peso de la preparación. El alcohol es normalmente etanol o isopropanol. Se prefiere etanol.

El pH de tal líquido y de otras preparaciones de la invención está generalmente en el intervalo de desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 9, y normalmente desde aproximadamente 5,5 hasta 8. El pH está preferiblemente en el intervalo de desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8,0, preferiblemente 7,4. El pH puede controlarse con ácido (por ejemplo, ácido cítrico o ácido benzoico) o base (por ejemplo, hidróxido de sodio) o puede tamponarse (tal como con citrato, benzoato, carbonato o bicarbonato de sodio, hidrogenofosfato de disodio, dihidrogenofosfato de sodio, etc.).

Otras formas deseables de esta invención, la composición oral puede tener carácter sustancialmente sólido o pastoso, tal como polvo para los dientes, una comprimido dental o un dentífrico, es decir, una pasta de dientes (crema dental) o un dentífrico en gel. El vehículo de tales preparaciones orales sólidas o pastosas generalmente contiene material abrillantador aceptable de manera dental. Ejemplos de materiales abrillantadores son metafosfato de sodio, metafosfato de potasio, fosfato de tricalcio, fosfato de calcio dihidratado, fosfato dicálcico anhidro, pirofosfato de calcio, ortofosfato de magnesio, fosfato de trimagnesio, carbonato de calcio, alúmina hidratada, alúmina calcinada, silicato de aluminio, silicato de zirconio, sílice, bentonita insolubles en agua y mezclas de los mismos. Otro material abrillantador apropiado incluye las resinas termoestables particuladas tales como de melamina-formaldehídos, formaldehídos fenólicos y urea-formaldehídos, y poliepóxidos y poliésteres reticulados. Los materiales abrillantadores preferidos incluyen sílice cristalina que tiene un tamaño de partícula de hasta aproximadamente 5 micras, un tamaño medio de partícula de hasta aproximadamente 1,1 micras, y un área superficial de hasta aproximadamente 50.000 cm^{2}/g, gel de sílice o sílice coloidal, y aluminosilicato de metales alcalinos amorfo complejo.

Cuando se emplean geles visualmente transparentes, un agente abrillantador de sílice coloidal, tales como aquellos vendidos bajo la marca registrada SYLOID como Syloid 72 y Syloid 74 o bajo la marca registrada SANTOCEL como Santocel 100, los complejos de aluminosilicato de metales alcalinos son particularmente útiles ya que tienen índices de refracción cercanos a los índices de refracción de los sistemas de agente gelificante-líquido (incluyendo agua y/o humectante) usados normalmente en los dentífricos.

Muchos de los denominados materiales abrillantadores "insolubles en agua" tienen carácter aniónico y también incluyen pequeñas cantidades de material soluble. Así, el metafosfato de sodio insoluble puede formarse de cualquier manera apropiada, tal como se ilustra por el Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry, Volumen 9, 4ª Edición, págs. 510-511. Las formas de metafosfato de sodio insoluble conocidas como sal de Madrell y sal de Kurrol son ejemplos adicionales de materiales apropiados. Estas sales de metafosfato muestran sólo una mínima solubilidad en agua, y por lo tanto se denominan normalmente como metafosfatos insolubles (IMP). En ellos está presente una cantidad mínima de material de fosfato soluble como impurezas, normalmente un pequeño porcentaje tal como de hasta un 4% en peso. La cantidad de material de fosfato soluble, que se cree que incluye un trimetafosfato de sodio soluble en el caso de metafosfato insoluble, puede reducirse o eliminarse mediante lavado con agua si se desea. El metafosfato de metal alcalino insoluble se emplea normalmente en forma de polvo de un tamaño de partícula tal que no más de un 1% del material es más grande de 37 micras.

El material abrillantador se presenta generalmente en las composiciones sólidas o pastosas en concentraciones en peso de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 99%. Preferiblemente, está presente en cantidades de desde aproximadamente un 10% hasta aproximadamente un 75% en pasta de dientes, y de desde aproximadamente un 70% hasta aproximadamente un 99% en polvo para los dientes. En pastas de dientes, cuando el material abrillantador es de naturaleza silícea, está presente generalmente en una cantidad de aproximadamente un 10 - 30% en peso. Otros materiales abrillantadores están presentes normalmente en una cantidad de aproximadamente un 30 - 75% en peso.

En una pasta de dientes, el vehículo líquido debe comprender agua y humectante normalmente en una cantidad que oscila desde aproximadamente un 10% hasta aproximadamente un 80% en peso de la preparación. Glicerina, propilenglicol, sorbitol y polipropilenglicol se ponen como ejemplo de humectantes/vehículos apropiados. También son ventajosas las mezclas líquidas de agua, glicerina y sorbitol. En geles transparentes en los que el índice de refracción es una consideración importante, se emplea de manera preferible aproximadamente un 2,5 - 30% en p/p de agua, de un 0 a aproximadamente un 70% en p/p de glicerina y aproximadamente un 20 - 80% en p/p de sorbitol.

La pasta de dientes, cremas y geles contienen normalmente un espesante natural o sintético o un gelificante en proporciones de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 10, de manera preferible aproximadamente de un 0,5 a aproximadamente un 5% en p/p. Un espesante apropiado es la hectorita sintética, una arcilla compleja de silicato de magnesio-metal alcalino coloidal sintético disponible por ejemplo como Laponite (por ejemplo CP, SP 2002, D) comercializada por Laporte Industries Limited. Laponite D es aproximadamente en peso un 58,00% de SiO_{2}, un 25,40% de MgO, un 3,05% de Na_{2}O, un 0,98% de Li_{2}O, y cierta cantidad de agua y metales traza. Su verdadero peso específico es de 2,53 y tiene una densidad aparente de 1,0 g/ml a un 8% de humedad.

Otros espesantes apropiados incluyen el musgo irlandés, iota carragenina, goma tragacanto, almidón, polivinilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulosa, hidroxibutilmetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa (por ejemplo disponible como Natrosol), carboximetilcelulosa sódica, y sílice coloidal tal como Syloid (por ejemplo 244). También pueden incluirse agentes solubilizadores tales como polioles humectantes tales como propilenglicol, dipropilenglicol y hexilenglicol, cellosolves tales como metilcellosolve y etilcellosolve, aceites y ceras vegetales que contienen al menos aproximadamente 12 carbonos en una cadena lineal tales como aceite de oliva, aceite de ricino y vaselina y ésteres tales como acetato de amilo, acetato de etilo y benzoato de bencilo.

Se entenderá que, como es normal, las preparaciones orales tienen que venderse o si no distribuirse en envases etiquetados apropiados. Así, un bote de elixir bucal tendrá una etiqueta que lo describa, esencialmente, como un elixir bucal o enjuague bucal y que tenga instrucciones para su uso; y una pasta de dientes, crema o gel estará normalmente en un tubo plegable, normalmente de aluminio, plomo o plástico revestido, u otro dispensador de apretado, de bombeo o presurizado para administrar el contenido, que tenga una etiqueta que lo describa, esencialmente, como una pasta de dientes, gel o crema dental.

Se usan agentes tensioactivos orgánicos en las composiciones de la presente invención para lograr un aumento de la acción profiláctica, ayudar a lograr la perfecta y completa dispersión del agente activo a través de la cavidad oral, y para que las presentes composiciones se vuelvan más aceptables cosméticamente. El material tensioactivo orgánico es de naturaleza preferiblemente aniónica, no iónica o anfolítica, que no desnaturalice el anticuerpo de la invención, y se prefiere emplear como agente tensioactivo un material detersivo que imparte a la composición propiedades detersivas y espumantes mientras que no desnaturaliza el anticuerpo. Ejemplos apropiados de tensioactivos aniónicos son sales solubles en agua de monosulfatos de monoglicéridos de ácidos grasos superiores, tales como la sal de sodio del monoglicérido monosulfatado de ácidos grasos de aceite de coco hidrogenado, alquilsulfatos superiores tales como laurilsulfato de sodio, alquilarilsulfonatos tales como dodecilbencenosulfonato de sodio, alquilsulfoacetatos superiores, ésteres de ácidos grasos superiores de 1,2-dihidroxipropanosulfonato, y acilamidas alifáticas superiores sustancialmente saturadas de compuestos de ácidos aminocarboxílicos alifáticos inferiores, tales como aquellos que tienen de 12 a 16 carbonos en los radicales de ácido graso, alquilo o acilo, y similares. Ejemplos de las últimas amidas mencionadas son N-lauroilsarcosina, y las sales de sodio, potasio y etanolamina de N-lauroil, N-miristoil, o N-palmitoilsarcosina que deben estar sustancialmente libres de jabón o material ácido graso superior similar. El uso de estos compuestos de sarconita en las composiciones orales de la presente invención es particularmente ventajoso ya que estos materiales muestran un marcado efecto prolongado en la inhibición de la formación de ácido en la cavidad oral debida a la rotura de hidratos de carbono además de ejercer cierta reducción en la solubilidad del esmalte del diente en soluciones ácidas. Ejemplos de tensioactivos no iónicos solubles en agua para su uso con anticuerpos son productos de condensación de óxido de etileno con diversos compuestos que contienen hidrógeno reactivo, reactivos con ellos que tienen largas cadenas hidrófobas (por ejemplo cadenas alifáticas de aproximadamente 12 a 20 átomos de carbono), productos de condensación ("etoxámeros") que contienen restos de polioxietileno hidrófilos, tales como productos de condensación de poli(óxido de etileno) con ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, alcoholes polihidroxilados (por ejemplo monoestearato de sorbitano) y poli(óxido de propileno) (por ejemplo materiales Pluronic).

El agente tensioactivo está normalmente presente en una cantidad de aproximadamente un 0,1 - 5% en peso. Es notable que el agente tensioactivo debe ayudar en la disolución del anticuerpo de la invención y de ese modo disminuir la cantidad de humectante solubilizador necesario.

Pueden incorporarse otros materiales diversos en las preparaciones orales de esta invención tales como agentes blanqueantes, conservantes, siliconas, compuestos de clorofila y/o material amoniatado tal como urea, fosfato de diamonio, y mezclas de los mismos. Estos adyuvantes, cuando están presentes, se incorporan a las preparaciones en cantidades que no afectan sustancialmente de manera adversa a las propiedades y características deseadas.

También puede emplearse cualquier material aromatizante o edulcorante. Ejemplos de constituyentes aromatizantes adecuados son aceites aromatizantes, por ejemplo aceite de menta verde, menta, gaulteria, sasafrás, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limón, y naranja, y salicilato de metilo. Agentes edulcorantes apropiados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, sorbitol, xilitol, ciclamato de sodio, perillartina, AMP (éster metílico de aspartil-fenilalanina), sacarina, y similares. Adecuadamente, los agentes aromatizantes y edulcorantes pueden cada uno o juntos comprender desde un 0,1% hasta un 5% más de la preparación.

En la práctica preferida de esta invención, una composición oral según esta invención tal como un enjuague bucal o dentífrico que contiene la composición de la presente invención se aplica preferiblemente de manera regular a las encías y los dientes, tal como cada día o cada dos o tres días o preferiblemente desde 1 a 3 veces al día, a un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9, de manera general a aproximadamente de 5,5 a aproximadamente 8, preferiblemente a aproximadamente de 6 a 8, durante al menos 2 semanas hasta 8 semanas o más hasta durante toda la vida.

Las composiciones de esta invención pueden incorporarse en pastillas, o en chicle u otros productos, por ejemplo mediante agitación dentro de una base de goma caliente o recubrimiento de la superficie exterior de una base de goma, pudiéndose mencionar como ilustrativos de los cuales jelutong, látex de caucho, resinas de vinilita, etc., deseablemente con plastificantes o suavizantes convencionales, azúcar u otros edulcorantes o tales como glucosa, sorbitol y similares.

La composición de esta invención también incluye vehículos de administración dirigida tales como dispositivos de irrigación de bolsa periodontales, colágeno, elastina o esponjas, membranas o fibras sintéticas colocadas en la bolsa periodontal o utilizadas como una membrana de barrera o aplicadas directamente a la raíz del diente.

Otra forma importante de la invención es una composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra Porphyromonas gingivalis basada en el complejo PtrR-PtrK y un adyuvante adecuado administrado mediante aerosol nasal, por vía oral o mediante inyección para producir una respuesta inmunitaria específica contra el complejo PtrR-PtrK, reduciendo así la colonización de P. gingivalis y neutralizando el PtrR-PtrK previniendo de ese modo la enfermedad. Debido a la potente actividad enzimática del complejo, normalmente el complejo se inactivará. También puede basarse una vacuna en un componente recombinante del PtrR-PtrK incorporado en un vector apropiado y expresarse en un huésped transformado adecuado (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, células COS, células CHO y células HeLa) que contiene el vector. A diferencia de las células completas de P. gingivalis u otros antígenos preparados previamente basados en las franjas o la cápsula, el complejo PtrR-PtrK es un antígeno seguro y eficaz para la preparación de una composición para su uso en la prevención de la enfermedad periodontal asociada a P. gingivalis. El complejo PtrR-PtrK puede producirse utilizando métodos de ADN recombinante tal como se ilustra en el presente documento, o puede sintetizarse químicamente a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en la presente invención. Adicionalmente, según la presente invención, el complejo PtrR-PtrK puede utilizarse para generar antisueros útiles para la inmunización pasiva frente a la enfermedad periodontal y las infecciones producidas por P. gingivalis.

Se utilizan diversos adyuvantes junto con las formulaciones de vacuna. Los adyuvantes ayudan modulando la respuesta inmunitaria y en la obtención de un nivel superior y más duradero de inmunidad utilizando cantidades más pequeñas de antígeno de la vacuna o dosis inferiores que si el antígeno de la vacuna se administrase solo. Los ejemplos de adyuvantes incluyen adyuvante incompleto de Freund (AIF), adyuvante 65 (que contiene aceite de cacahuete, monooleato de dianhidromanitol y monoestearato de aluminio), emulsiones en aceite, adyuvante de Ribi, los polioles Pluronic, poliaminas, avridina, Quil A, saponina, MPL, QS-21 y geles minerales tales como sales de aluminio. Otros ejemplos incluyen emulsiones de aceite en agua tales como SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720 y otros adyuvantes particulados tales como ISCOM y matriz de ISCOM. Una lista extensa pero no exhaustiva de otros ejemplos de adyuvantes se enumeran en Cox y Coulter 1992 [En: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112]. Además del adyuvante, la vacuna puede incluir vehículos, excipientes, cargas, tampones o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, según sea apropiado. Puede administrarse una o más dosis de la vacuna que contiene el adyuvante de manera profiláctica para prevenir la periodontitis o de manera terapéutica para tratar la periodontitis ya presente.

En otra composición preferida, la preparación se combina con un adyuvante de la mucosa y se administra a través de la vía oral. Ejemplos de adyuvantes de la mucosa son la toxina del cólera y la toxina termolábil de E. coli, las subunidades B no tóxicas de estas toxinas, mutantes genéticos de estas toxinas que tienen una toxicidad reducida. Otros métodos que pueden utilizarse para administrar el complejo PtrR-PrtK por vía oral incluyen la incorporación de la proteasa en partículas de polímeros biodegradables (tales como acrilatos o poliésteres) mediante microencapsulación para ayudar en la captación de las microesferas desde el tracto gastrointestinal y para proteger la degradación de las proteínas. Los liposomas, ISCOM, hidrogeles son ejemplos de otros métodos potenciales que pueden potenciarse adicionalmente mediante la incorporación de moléculas de selección de objetivo tales como LTB, CTB o lectinas para la administración del complejo PtrR-PtrK al sistema inmunitario de la mucosa. Además de la vacuna y el adyuvante de la mucosa o sistema de administración, la vacuna puede incluir vehículos, excipientes, cargas, recubrimientos, medios de dispersión, agentes antibacterianos y antifúngicos, tampones o diluyentes farmacéuticamente aceptables convencionales, según sea apropiado.

Otro modo de esta realización proporciona o bien una vacuna viral recombinante viva, una vacuna bacteriana recombinante, una vacuna bacteriana atenuada recombinante o bien una vacuna viral recombinante inactivada que se utiliza para proteger frente a infecciones producidas por P. gingivalis. El virus vaccinia es el mejor ejemplo conocido, en la técnica, de un virus infeccioso que se modifica mediante ingeniería para expresar antígenos de la vacuna derivados de otros microorganismos. El virus vaccinia vivo recombinante, que se atenúa o se trata de otra manera, de modo que no produce enfermedad por sí mismo, se utiliza para inmunizar el huésped. La replicación posterior del virus recombinante dentro del huésped proporciona una estimulación continua del sistema inmunitario con los antígenos de la vacuna tales como el complejo PtrR-PtrK, proporcionando así una inmunidad de larga acción.

Otros vectores de vacuna vivos incluyen: adenovirus, citomegalovirus, y preferiblemente poxvirus tales como vaccinia (Paoletti y Panicalli, patente de los EE.UU. número 4.603.112) y cepas de Salmonella atenuadas (Stocker et al., patentes de los EE.UU. números 5.210.035; 4.837.151; y 4.735.801; y Curtis et al., 1988, Vaccine 6:155-160). Las vacunas vivas son particularmente ventajosas porque estimulan continuamente el sistema inmunitario que puede conferir una inmunidad sustancialmente de larga acción. Cuado la respuesta inmunitaria es protectora frente a la posterior infección por P. gingivalis, la propia vacuna viva puede utilizarse en una vacuna preventiva frente a P. gingivalis. En particular, la vacuna viva puede basarse en una bacteria que es un habitante comensal de la cavidad oral. Esta bacteria puede transformarse con un vector que porta un PtrR-PtrK inactivado recombinante y luego utilizarse para colonizar la cavidad oral, en particular la mucosa oral. Una vez colonizada la mucosa oral, la expresión de la proteína recombinante estimulará el tejido linfoide asociado a la mucosa para producir anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, utilizando técnicas de biología molecular, pueden insertarse los genes que codifican para el PtrR-PtrK en el ADN genómico del virus vaccinia en un sitio que permita la expresión de epítopos pero que no afecte negativamente al crecimiento o replicación del vector del virus vaccinia. El virus recombinante resultante puede utilizarse como el inmunógeno en una formulación de vacuna. Pueden utilizarse los mismos métodos para construir una formulación de vacuna viral recombinante inactivada excepto porque el virus recombinante se inactiva, tal como mediante medios químicos conocidos en la técnica, antes de su uso como inmunógeno y sin afectar sustancialmente a la inmunogenicidad del inmunógeno expresado.

En otra variación de la realización, se utiliza material genético directamente como la formulación de vacuna. Puede introducirse directamente un ácido nucleico (ADN o ARN) que contiene secuencias que codifican para el complejo proteico PtrR-PtrK operativamente unidas a uno o más elementos reguladores, para vacunar al individuo ("transferencia génica directa") frente a las cepas patógenas de P. gingivalis. La transferencia génica directa en un individuo vacunado, que da como resultado la expresión del material genético mediante las células de individuo vacunado, tales como las células endoteliales vasculares así como el tejido de los órganos principales, se ha demostrado mediante técnicas de la técnica tales como inyectando por vía intravenosa un complejo de plásmido de expresión:liposoma catiónico (Zhu et al., 1993, Science 261:209-211). Se conocen en la técnica otros métodos eficaces para suministrar el ADN del vector en una célula diana. En un ejemplo, se ha utilizado ADN de plásmido recombinante purificado que contiene genes virales para inocular (ya sea por vía parental, por vía mucosa o a través de inmunización con pistola génica) vacunas, para inducir una respuesta inmunitaria protectora (Fynan et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:11478-11482). En otro ejemplo, pueden transfectarse células extraídas de un individuo o someterse a electroporación mediante procedimientos habituales conocidos en la técnica, que dan como resultado la introducción del ADN del vector recombinante en la célula diana. Las células que contienen el ADN del vector recombinante pueden entonces seleccionarse utilizando métodos conocidos en la técnica tales como a través de un marcador de selección expresado en el vector, y las células seleccionadas pueden entonces reintroducirse en el individuo para expresar el complejo PtrR-PtrK.

Como alternativa a la inmunización activa, la inmunización puede ser pasiva, es decir, la inmunización comprende la administración de inmunoglobulina purificada que contiene anticuerpo contra PtrR-PtrK.

La presente invención proporciona además la secuencia de nucleótidos de los genes que codifican para el complejo PtrR-PtrK, así como la secuencia de aminoácidos deducida a partir de los genes aislados. Según una realización de la presente invención, utilizando técnicas de ADN recombinante los genes que codifican para el complejo PtrR-PrtK se incorporan en un vector de expresión y el vector recombinante se introduce en una célula huésped apropiada dirigiendo así la expresión de estas secuencias en esa célula huésped particular. El sistema de expresión, que comprende el vector recombinante introducido en la célula huésped, puede utilizarse (a) para producir el complejo PtrR-PtrK que puede purificarse para su uso como inmunógeno en formulaciones de vacuna; (b) para producir el complejo PtrR-PtrK que va a usarse como antígeno para inmunoensayos de diagnóstico o para generar antisueros específicos de P. gingivalis de valor terapéutico y/o de diagnóstico; (c) o si el vector de expresión recombinante es un virus vivo tal como un virus vaccinia, el propio vector puede utilizarse como una preparación de vacuna viva o inactivada que va a introducirse en las células del huésped para la expresión del complejo PtrR-PtrK; (d) para la introducción en células bacterianas atenuadas vivas o bacterias intraorales comensales modificadas mediante ingeniería genética que se utilizan para expresar el complejo PtrR-PtrK para vacunar individuos; (e) o para la introducción directamente en un individuo para inmunizar frente al complejo PtrR-PtrK codificado y expresado. En particular, la vacuna bacteriana recombinante puede basarse en un habitante comensal de la cavidad oral humana o el animal si la vacuna es para prevenir la enfermedad periodontal en animales. La vacuna bacteriana recombinante que expresa PtrR-PtrK inactivado puede utilizarse para colonizar la cavidad oral, la placa supragingival o la placa gingival. La bacteria intraoral puede aislarse del paciente con periodontitis y modificarse mediante ingeniería genética para expresar el complejo PtrR-PtrK inactivado. La producción de PtrR-PtrK inactivado dentro de la cavidad oral no será tóxica para los tejidos de la mucosa oral. Sin embargo, el PtrR-PtrK inactivado estimulará los tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALT) para producir el anticuerpo específico y neutralizar el PtrR-PtrK de P. gingivalis.

La expresión satisfactoria de una proteína o péptido requiere que o bien el inserto que comprende el gen o fragmento génico, o el propio vector, contiene los elementos necesarios para la transcripción y la traducción que es compatible con, y reconocido por el sistema de huésped particular utilizado para la expresión. Puede utilizarse una variedad de sistemas de huésped para expresar el PtrR-PtrK, que incluyen, pero no se limitan a bacterias transformadas con un vector de bacteriófago, vector de plásmido o ADN cósmido; levaduras que contienen vectores de levadura; hongos que contienen vectores fúngicos; líneas celulares de insecto infectadas por virus (por ejemplo, baculovirus); y líneas de células de mamífero transfectadas con vectores de expresión de plásmido o virales, o infectadas por virus recombinantes (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, virus asociados con adenovirus, retrovirus, etc.).

Utilizando métodos conocidos en la técnica de la biología molecular, pueden incorporarse diversos promotores y potenciadores en el vector o la secuencia de ADN que codifica para PtrR-PtrK, para aumentar la expresión de las secuencias de aminoácidos de PtrR-PtrK, siempre que el aumento de la expresión de las secuencias de aminoácidos sea compatible con (por ejemplo, no tóxico para) el sistema de célula huésped particular utilizado. Además, el ADN puede fusionarse a ADN que codifica para otros antígenos, tales como otras proteínas de membrana externa bacteriana, u otros antígenos bacterianos, fúngicos, parásitos o virales para crear un antígeno multivalente fusionado genéticamente (que comparten una estructura peptídica común) para su uso como una composición de vacuna mejorada.

La selección del promotor dependerá del sistema de expresión utilizado. Los promotores varían en fuerza, es decir, capacidad para facilitar la transcripción. Generalmente, para el fin de expresar un gen clonado, se desea utilizar un promotor fuerte con el fin de obtener un alto nivel de transcripción del gen y la expresión en el producto génico. Por ejemplo, promotores bacterianos, de fago o plásmido conocidos en la técnica a partir de los cuales se ha observado un alto nivel de transcripción en un sistema de célula huésped que comprende E. coli, incluyen promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor de ARN ribosómico, los promotores P_{R} y P_{L}, lacUV5, ompF, bla, lpp y similares, pueden utilizarse para proporcionar la transcripción de la secuencia de ADN insertada que codifica para PtrR-PtrK.

Adicionalmente, si una proteína PtrR-PtrK puede ser letal o perjudicial para las células huésped, la cepa/línea de células huésped y los vectores de expresión pueden elegirse de tal manera que la acción del promotor se inhiba hasta que se induzca específicamente. Por ejemplo, en ciertos operones, es necesaria la adición de inductores específicos para la transcripción eficaz del ADN insertado (por ejemplo, el operón lac se induce mediante la adición de lactosa o isopropiltio-beta-D-galactósido). Una variedad de operones, tales como el operón trp, están bajo diferentes mecanismos de control. El operón trp se induce cuando está ausente triptófano en los medios de crecimiento. El promotor p_{L} puede inducirse mediante un aumento de temperatura de las células huésped que contienen un represor lambda sensible a la temperatura. De esta manera, puede inhibirse más del 95% de la transcripción dirigida por el promotor en células no inducidas. Por tanto, la expresión de la proteína PtrR-PtrK recombinante puede controlarse mediante el cultivo de células transformadas o transfectadas en condiciones tales que no se induce el promotor que controla la expresión a partir del ADN insertado que codifica para las secuencias de aminoácidos de PtrR-PtrK, y cuando las células alcanzan una densidad adecuada en el medio de crecimiento, el promotor puede inducirse para la expresión a partir del ADN insertado.

Otros elementos para la transcripción génica eficiente o la traducción del mensaje incluyen potenciadores y señales reguladoras. Las secuencias potenciadoras son elementos de ADN que parecen aumentar la eficacia transcripcional de una manera relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a un gen cercano. Por tanto, dependiendo del sistema de vector de expresión de célula huésped utilizado, puede situarse un potenciador o bien en sentido 5' o bien en sentido 3' desde la secuencias de ADN insertadas que codifican para las secuencias de aminoácidos de PtrR-PtrK, para aumentar la eficacia transcripcional. Estos u otros sitios reguladores, tales como señales de iniciación de la transcripción o la traducción, pueden utilizarse para regular la expresión del gen que codifica para PtrR-PtrK. Tales elementos reguladores pueden insertarse en secuencias de ADN que codifican para las secuencias de aminoácidos de PtrR-PtrK o cerca de las secuencias de ADN de vector utilizando métodos de ADN recombinante descritos en el presente documento para la inserción de secuencias de ADN.

En consecuencia, las secuencias de nucleótidos de P. gingivalis que contienen regiones que codifican para PtrR-PtrK, pueden ligarse en un vector de expresión en un sitio específico en relación con el promotor del vector, elementos de control y reguladores de modo que cuando el vector recombinante se introduce en la célula huésped, las secuencias de ADN específicas de P. gingivalis pueden expresarse en la célula huésped. Por ejemplo, las secuencias de ADN específicas de PtrR-PtrK que contienen sus propios elementos reguladores pueden ligarse en un vector de expresión en relación u orientación con el promotor del vector y los elementos de control que permitirán la coexpresión de PtrR y PtrK. El vector recombinante se introduce entonces en las células huésped apropiadas, y las células huésped se seleccionan, y se detectan para determinar aquellas células que contienen el vector recombinante. La selección y detección puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen la detección de la expresión de un gen marcador (por ejemplo, marcador de resistencia a fármacos) presente en el plásmido, inmunodetección para la producción de epítopos específicos de PtrR-PrtK utilizando antisueros generados para epítopos específicos de PtrR-PrtK y detección con sonda del ADN de las células huésped para secuencias de nucleótidos específicas de PtrR-PrtK utilizando uno o más oligonucleótidos y los métodos descritos en el presente documento.

También pueden utilizarse las técnicas de ingeniería genética para caracterizar, modificar y/o adaptar la proteína PtrR-PtrK codificada. Por ejemplo, puede ser deseable la mutagénesis dirigida al sitio para inactivar los dominios de proteasa del PrtR-PtrK y para modificar la proteína en regiones fuera de los dominios protectores, para aumentar la seguridad y la solubilidad.

En particular, el microorganismo huésped para el vector que contiene los genes y constructos de PrtR-PtrK puede ser un habitante comensal de la cavidad oral; por ejemplo un habitante de la placa subgingival, supragingival o una bacteria asociada con la mucosa oral. Ejemplos de bacterias intraorales comensales serían especies de Streptococcus y especies de Actinomyces, por ejemplo, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Actinomyces naeslundii. Estos microorganismos pueden aislarse del paciente con periodontitis y luego modificarse mediante ingeniería genética para expresar el PrtR-PtrK inactivado. El ADN que codifica para el PrtR-PtrK podría unirse con ADN que codifica para secuencias líder de proteínas extracelulares de estas bacterias intraorales comensales. El ADN que codifica para PrtR-PtrK también podría unirse con, o insertarse en, el ADN que codifica para proteínas extracelulares para producir proteínas de fusión secretadas. Ejemplos de proteínas extracelulares que podrían utilizarse para producir proteínas de fusión con el PrtR-PtrK inactivado podrían ser las glucosiltransferasas (GTF) o fructosiltransferasas (FTF). El microorganismo recombinante se volvería a introducir entonces en la cavidad oral de los pacientes y una vez colonizada la mucosa oral o los dientes, expresaría el PrtR-PtrK inactivado para estimular el tejido linfoide asociado con la mucosa para producir anticuerpos neutralizantes.

Debido a la conservación de los genes que codifican para PrtR-PtrK, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden utilizarse en ensayos de diagnóstico molecular para detectar material genético de P. gingivalis. En particular, pueden sintetizarse oligonucleótidos específicos de la secuencia de PrtR-PtrK para su uso como cebadores y/o sondas en la amplificación y detección de ácidos nucleicos amplificados de P. gingivalis. Los avances recientes en biología molecular han proporcionado varios medios para la amplificación enzimática de las secuencias de ácido nucleico. Actualmente, el método utilizado más comúnmente, PCR^{MR} (reacción en cadena de la polimerasa, Cetus Corporation) suponía el uso de Taq polimerasa, secuencias conocidas como cebadores y ciclos de calentamiento que separan las hebras de ácido desoxirribonucleico (ADN) que replican y amplifican exponencialmente un gen de interés. Otros métodos de amplificación actualmente en desarrollo incluyen LCR^{MR} (reacción en cadena de la ligasa, BioTechnica International) que utiliza ADN ligasa y una sonda que consiste en las dos mitades de un segmento de ADN que es complementario a la secuencia de ADN que va a amplificarse; enzima QB replicasa (Gene-Trak Systems) y un molde de secuencia de ácido ribonucleico (ARN) unido a una sonda complementaria al ADN que va a copiarse que se utiliza para preparar un molde de ADN para la producción exponencial de ARN complementario; y NASBA^{MR} (amplificación basada en una secuencia de ácido nucleico, Cangene Corporation) que puede realizarse con ARN o ADN como la secuencia de ácido nucleico que va a amplificarse.

Se han utilizado satisfactoriamente sondas de ácido nucleico que pueden dar hibridación con secuencias génicas específicas para detectar patógenos específicos en muestras biológicas a niveles de sensibilidad que se aproximan a 10^{3} - 10^{4} microorganismos por muestra (1990, Gene Probes for bacteria, eds. Macario y deMacario, Academic Press). Acopladas con un método que permite la amplificación de secuencias de ADN diana específicas, las sondas de ácido nucleico específicas de la especie pueden aumentar enormemente el nivel de sensibilidad en la detección de microorganismos en una muestra clínica. El uso de estas sondas puede permitir la detección directa sin basarse en un cultivo previo y/o técnicas de identificación bioquímicas convencionales. Esta realización de la presente invención se refiere a cebadores que amplifican secuencias específicas de la especie de los genes que codifican para PtrR-PtrK de P. gingivalis, y a sondas que se hibridan específicamente con estos fragmentos de ADN amplificados. Utilizando las secuencias de ácido nucleico de la presente invención y según los métodos de la presente invención, puede detectarse tan sólo un microorganismo de P. gingivalis en presencia de 10 \mug/ml de ADN
exógeno.

Puede extraerse ADN de muestras clínicas que pueden contener P. gingivalis utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células contenidas en la muestra pueden lavarse con tampón TE y sedimentarse mediante centrifugación. Las células pueden entonces resuspenderse en 100 \mul de tampón de reacción de amplificación que contiene detergentes y proteinasa K. Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, la muestra resultante puede componerse de las células en Tris 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,01% de gelatina, 0,45% de NP40^{MR}, 0,045% de Tween 20^{MR} y proteinasa K 60 \mug/ml. La muestra se incuba en un baño de agua a 55ºC durante 1 hora. Tras la incubación, la muestra se incuba a 95ºC durante 10 minutos para inactivar por calor la proteinasa K. La muestra puede amplificarse entonces según protocolos de PCR habituales.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos adicionalmente de la naturaleza de la presente invención, pero se entiende que la invención no se limita a los mismos. Todas las cantidades y proporciones referidas en el presente documento son en peso a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1 (1) Preparación de antígeno A. Cromatografía de intercambio aniónico y afinidad

Se hizo crecer P. gingivalis W50 aneróbicamente a 37ºC en agar sangre de caballo lisado y en medio BM modificado que contenía 1 \mug/ml de hemina. Se mantuvieron las bacterias en placas con agar sangre de caballo lisado mediante pases rutinarios (< 10 pases) y se usaron para inocular cultivos discontinuos. El crecimiento en cultivo discontinuo en medio de infusión cerebro-corazón se monitorizó a 650 nm usando un espectrofotómetro (295E, Perkin-Elmer). Se comprobó la pureza del cultivo de manera rutinaria mediante tinción de Gram, examen microscópico y mediante el uso de una variedad de pruebas bioquímicas. Las reservas se mantuvieron como cultivos liofilizados. Se hizo crecer un cultivo de P. gingivalis hasta su fase logarítmica final y las células se recogieron mediante centrifugación (5.000 x g, 20 min, 4ºC) y entonces se resuspendieron en 160 ml de tampón TC (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 y CaCl_{2} 5 mM) que contiene NaCl 50 mM y se sometieron a sonicación suave usando un sonicador Branson 250 con un control de salida de 3 y un 50% de ciclo de trabajo durante 15 min a 4ºC. Se centrifugó el producto sonicado (100.000 x g, 30 min, 4ºC) y se filtró el sobrenadante (0,22 \mum) antes de la FPLC de intercambio aniónico. Se aplicó el producto sonicado a una columna de intercambio aniónico (Hiload XK 16/10 Q Sepharose, Pharmacia- LKB) enfriada a 4ºC, en inyecciones múltiples usando un superbucle de 50 ml (Pharmacia-LKB). Se eluyó la muestra usando un gradiente lineal de tampón B a desde el 0 - 100% durante 90 min a una velocidad de flujo de 2,0 ml min-1. Se monitorizó el eluyente a 280 nm y se recogió en fracciones de 6 ml usando un colector de fracciones Frac 100 (Pharmacia-LKB). El tampón A era tampón TC que contenía NaCl 50 mM y el tampón B era tampón TC que contenía NaCl 500 mM. Se analizaron las fracciones para determinar la actividad proteolítica y amidolítica usando azocaseína (A-2765, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), benzoil-L-Arg-p-nitroanilida (Bz-L-Arg-pNa, Sigma) y benciloxicarbonil-L-Lys-p-nitroanilida (Z-L-Lys-pNa, Calbiochem, Melbourne, Australia), véase más adelante. Las fracciones de intercambio aniónico que contenían la mayor parte de la actividad proteolítica/amidolítica se combinaron, se lavaron y después se concentraron en tampón TC que contenía NaCl 150 mM usando un microconcentrador centricon 10 (Amicon). Entonces se dividió la muestra en cuatro alícuotas y se aplicó cada una independientemente a una columna de filtración en gel (Superose 12, HR 10/30, Pharmacia-LKB) usando un tampón TC que contenía NaCl 150 mM a una velocidad de flujo de 0,3 ml min^{-1}. Se monitorizó el eluyente a 280 nm y se recogieron los picos usando un colector de fracciones Frac 100. Se determinaron los valores M_{r} de los picos eluyentes usando patrones de filtración en gel de masa molecular (Pharmacia-LKB). Se concentró el pico que contenía la mayor parte de la actividad proteolítica/amidolítica usando un microconcentrador centricon 10 y se aplicó entonces a una velocidad de flujo de 0,1 ml min-1 a una columna de Arg-sepharose (5 ml de arginina-Sepharose de perlas 4B, columna HR 5/5, Pharmacia-LKB) y se recogió el material no unido. Se lavó la columna con NaCl 500 mM y se volvió a equilibrar con tampón TC que contenía NaCl 50 mM. En primer lugar, se eluyó la columna con lisina-HCl 200 mM pH 7,4 en tampón TC que contenía NaCl 150 mM a una velocidad de flujo de 0,1 ml min-1. Esto se siguió de lisina-HCl 750 mM pH 7,4 en el mismo tampón. La columna se volvió a equilibrar entonces con tampón TC que contenía NaCl 50 mM y se eluyó entonces con arginina-HCl 200 mM pH 7,4 en tampón TC que contenía NaCl 50 mM a una velocidad de flujo de 0,1 ml min^{-1}. Se volvió a aplicar el material no unido recogido a la columna de Arg-sepharose y se repitieron las etapas de elución. Esta secuencia se repitió hasta que toda la actividad proteolítica se unió a la columna. Se monitorizó el eluyente a 280 nm y se recogieron los picos usando un colector de fracciones Frac 100. Se equilibraron los picos eluidos de la Arg-sepharose mediante lisina 200 mM y arginina 200 mM con tampón TC que contenía NaCl 50 mM y octil-\beta-D-glucopiranósido al 1,0% y se aplicaron entonces a una columna de intercambio aniónico Mono Q (HR 5/5) y se eluyeron usando un gradiente lineal de tampón B a del 0-100% M a una velocidad de flujo de 1,0 ml min-1. El tampón A era tampón TC que contenía NaCl 50 mM y octil-\beta-D-glucopiranósido al 0,1% y el tampón B era tampón TC que contenía NaCl 500 mM y octil-\beta-D-glucopiranósido al 0,1%. Se monitorizó el eluyente a 280 nm y se recogieron los picos de eluyente usando un colector de fracciones Frac 100.

Se usaron azocaseína, Bz-L-Arg-pNa y z-L-Lys-pNa para someter a ensayo de manera rutinaria fracciones FPLC para determinar la actividad proteolítica y amidolítica. Se incubó una muestra de cada fracción (20 - 200:1) a 37ºC con azocaseína (concentración final de 5 mg/ml) en tampón TC pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM y cisteína 10 mM. Para la azocaseína la reacción se paró mediante la adición de ácido tricloroacético al 30% a 4ºC. Se centrifugaron las muestras y se midió la A_{440} del sobrenadante usando un espectrofotómetro (Perkin Elmer, modelo 552).

Para los sustratos cromogénicos sintéticos se incubaron muestras de cada fracción cromatográfica (5 - 50 :1) a 37ºC con Bz-L-Arg-pNa o z-L-Lys-pNa (concentración final de 1,0 mM) en un volumen total de 350:1 de tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM, cisteína 10 mM y CaCl_{2} 5 mM. Se añadieron inhibidores y activadores a las enzimas purificadas en tampón Tris-HCl 100 mM pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM. Se midió la absorbancia a 410 nm en un espectrofotómetro de red de diodo Hewlett Packard 8452A y se expresó la actividad amidolítica en U, en la que U = \mumol de sustrato convertido min^{-1} a 37ºC. Se usó tripsina (E.C.3.4.21.4, T 8253 Sigma) como patrón. Se determinó la concentración de proteínas de las fracciones FPLC y de las muestras purificadas usando el ensayo para la determinación de proteínas Bradford (Biorad) con BSA como patrón.

Se incubó una muestra de la fracción cromatográfica de filtración en gel (20 \mul) que mostraba la actividad proteolítica y amidolítica principal durante 4 h a 37ºC con 10 mg/ml de \alpha_{s1}-caseína disuelta en tampón TC pH 8,0 que contenía NaCl 150 mM y 2-mercaptoetanol 50 mM. Tras la incubación, se equilibró la muestra en TFA al 0,1% (v/v) disuelta en agua Milli Q (tampón A). Se aplicó entonces la muestra a una columna analítica de HPLC en fase inversa (C8, 7 \mum, 4,6 mm x 220 mm, Applied Biosystems Inc. Brownlee Aquapore RP 300) y se eluyeron los péptidos usando un gradiente lineal de tampón B a desde el 0-100% durante 40 min a una velocidad de flujo de 1 ml min^{-1} (sistema de administración de disolvente 140A). El tampón B era acetonitrilo al 80% (v/v) en TFA al 0,1% (v/v) en agua Milli Q. Se monitorizó el eluyente a 214 nm usando un detector de red de diodo 1000S (Applied Biosystems). Se recogieron los picos manualmente y se identificaron los péptidos usando una combinación de una composición de aminoácidos y análisis de secuencias tales como los descritos anteriormente.

Se realizó una SDS-PAGE usando un sistema de electroforesis Mini protean II (Biorad) con el 12% (p/v), geles separadores de 1 mm, recubiertos con geles de apilamiento al 5% (Laemmli, 1970) [Nature 277:680-685]. Se mezclaron dos volúmenes de cada muestra con un volumen de tampón [Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8, 2-mercaptoetanol al 5% v/v, SDS al 10,0% p/v, azul de bromofenol al 0,05% p/v (75% v/v) y glicerol (25% v/v)] y se calentaron hasta 100ºC durante 4 min a menos que se indique lo contrario. Se realizó la SDS-PAGE a temperatura ambiente usando una corriente de 30 - 50 mA y una diferencia de potencial \leq 200 V. Para la tinción con plata, se fijaron los geles en metanol/agua/ácido acético (45/45/10, v/v/v), se lavaron con agua Milli Q, se redujeron con ditiotreitol 5 \mug/ml y se lavaron entonces con agua Milli Q, todo en periodos de 30 min. Los geles se tiñeron entonces durante 20 min con AgNO_{3} al 0,1% p/v y se revelaron con carbonato de sodio al 3% p/v que contenía formaldehído al 0,1% v/v y se paró el revelado con ácido acético glacial. Para la tinción con azul de Coomassie, se fijaron los geles en TCA al 12% y se tiñeron durante la noche usando azul brillante de Coomassie purificado G250 al 0,1% (p/v) en ácido fosfórico al 2% (p/v), sulfato de amonio al 6% (p/v). Se destiñeron los geles con metanol/agua/ácido acético (50/40/10, v/v/v). Se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF (Problott, Applied Biosystems Inc. (ABI)) para el análisis de secuencia usando una celda de transblot (electroforesis y transferencia a membrana) (Biorad). Se humectó la membrana de PVDF en metanol al 100% y se empapó en tampón de transferencia (CAPS 10 mM/metanol al 10%, pH 11,5). Se realizó la transferencia usando una diferencia de potencial de 60 V (300 mA) durante 90 min. Se tiñeron brevemente las membranas usando azul brillante de Coomassie R 250 al 0,1% (p/v) en con metanol/agua/ácido acético (5/5/1, v/v/v). Se cortaron las bandas de proteína, se destiñeron durante 10 - 30 s en metanol al 50% y entonces se determinó la secuencia N-terminal usando un secuenciador de proteínas Hewlett Packard 10005A o un secuenciador de proteínas modificado ABI 471-02A equipado con un cartucho de inmunotransferencia.

El procedimiento de ultrasonicación resultó efectivo en la liberación de la actividad proteolítica específica de Arg y Lys asociada a la célula de P. gingivalis W50 y se necesitaron 15 min. para la liberación máxima de actividad. El producto sonicado de células de P. gingivalis W50 contenía una actividad de 0,30 mg ml^{-1} de proteína y 2,6 y 2,3 \mumol min^{-1} mg de proteína ^{-1} con Bz-L-Arg-pNA y z-L-Lys-pNA 1,0 mM como sustratos respectivamente a 37ºC. Se sometió el producto sonicado en bruto a una FPLC de intercambio aniónico en Q-sepharose y se presenta un cromatograma representativo en la figura 1. La actividad proteolítica/amidolítica eluyó como un pico principal en NaCl entre 246 - 320 mM (figura 1) que se recogió, se concentró usando un centricon-10 (Amicon) y se aplicó entonces a la columna de filtración en gel de Superose 12 (figura 2). Se usaron los patrones de filtración en gel de masa molecular para determinar la M_{r} de los picos obtenidos y el pico principal, que también mostró la principal actividad proteolítica/amidolítica, correspondió a 300 kDa (figura 2). La actividad proteolítica/amidolítica también se asoció con el material de masa molecular elevada (0,6 -> 2,0 x 10^{6} Da) eluido de la columna de filtración en gel. El pico de filtración en gel de 300 kDa contenía siete bandas en 48, 45, 44, 39, 27, 17 y 15 kDa en el análisis de SDS-PAGE (figura 3). Se realizó un transblot de las siete bandas y se sometieron a análisis de secuencia N-terminal (tabla 1). Este análisis reveló que la banda de 44 kDa contenía dos proteínas y las secuencias N-terminales de estas dos proteínas de 44 kDa se asignaron tras purificación adicional. La secuencia N-terminal de una de las proteínas de 44 kDa era idéntica a la de la proteína de 17 kDa y las proteínas de 39 kDa y 27 kDa también presentaron extremos N-terminales idénticos (tabla 1).

TABLA 1 Secuencias N-terminal de proteínas en el complejo de 300 kDa separadas mediante SDS-PAGE

Banda	Secuencia N-terminal (kDa)
48^{\bullet}	DVYTDHGDLYNTPVRML
45^{\dagger}	YTPVEEKQNGRMIVIVAKKYEGD
44^{\dagger}	SGQAEIVLEAHDVWNDGSGYQILLDADHDQYGQVIPSDTHFL
44^{\bullet}	PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR
39^{\bullet}	ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDA
27^{\dagger}	ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDA
17^{\dagger}	PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR
15^{\bullet \dagger}	ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA
^{\bullet} Proteínas eluídas de Arg-sepharose mediante lisina 200 mM
^{\dagger} Proteínas eluídas de Arg-sepharose mediante arginina 200 mM

Los análisis de filtración en gel repetidos del material purificado de la Q-sepharose o los productos sonicados en bruto indicaron que la actividad proteolítica/amidolítica principal estaba asociada con un pico correspondiente a 300 kDa y el material de masa molecular más elevada (0,6 -> 2 x 10^{6} Da) que cuando se sometió a ebullición en SDS y se sometió a análisis de SDS-PAGE contenía las mismas siete bandas en 48, 45, 44, 39, 27, 17 y 15 kDa (figura 3).

Se incubó el complejo de proteínas de 300 kDa de filtración en gel con \alpha_{s1}-caseína. Se purificaron los péptidos \alpha_{s1}-caseína liberados mediante la acción de la actividad proteolítica del complejo de 300 kDa mediante RP-HPLC y se identificaron mediante análisis de secuencias y composición de aminoácidos. Los sitios de escisión de la \alpha_{s1}-caseína mediante el material del complejo de 300 kDa fueron el sitio carboxilo de sólo los residuos de arginilo y lisilo (figura 4). Se escindieron todos los residuos arginilo y lisilo de la \alpha_{s1}-caseína excepto la Arg N-terminal y los residuos de lis que flanqueaban la secuencia de agrupamiento Ser (P), presumiblemente debido a la alta densidad de carga negativa (figura 4). Entonces se aplicó el complejo de 300 kDa a una columna de Arg-sepharose y se lavó con tampón TC que contenía NaCl 500 mM (figura 5). En primer lugar se eluyó la Arg-sepharose con lisina 200 mM en tampón TC (figura 5) que eluyó una pequeña cantidad de las proteínas de 48 kDa, 44 kDa, 39 kDa y 15 kDa del complejo de 300 kDa tal como se muestra mediante SDS-PAGE (figura 6 y tabla 1). El análisis de la secuencia N-terminal de estas proteínas sometidas a transblot reveló que sólo una de las proteínas de 44 kDa del complejo de 300 kDa eluyó con lisina 200 mM (tabla 1). Esta fracción eluida de la Arg-sepharose con lisina 200 mM contenía sólo actividad proteolítica/amidolítica específica de lis. Después se eluyó la columna Arg-sepharose con lisina 750 mM (figura 5) que retiró la mayor parte de la proteína unida tal como el complejo de 300 kDa no disociado que contenía las siete bandas (ocho proteínas) tal como se muestra mediante el análisis de SDS-PAGE (figura 7). El eluato de lisina 750 mM mostró actividad proteolítica/amidolítica específica tanto de Lys como de Arg característica del complejo de 300 kDa. Entonces se eluyó la columna Arg-sepharose con arginina 200 mM en tampón TC (figura 5). El eluato de arginina 200 mM contenía pequeñas cantidades de las proteínas de 45, 44, 27, 17 y 15 kDa tal como se mostró mediante SDS-PAGE (figura 7). Esta fracción mostró sólo actividad proteolítica/amidolítica específica de arginina. El análisis de la secuencia N-terminal de estas proteínas sometidas a transblot eluidas con arginina 200 mM reveló que sólo una de las proteínas de 44 kDa del complejo de 300 kDa eluyó con arginina 200 mM y esta proteína de 44 kDa era diferente a la proteína de 44 kDa eluida con lisina 200 mM (tabla 1).

Se lavaron las proteínas eluidas de la columna de Arg-sepharose con lisina 200 mM y arginina 200 mM, se concentraron y se equilibraron con tampón TC que contenía NaCl 50 mM y octil-\beta-D-glucopiranósido al 1,0% y se aplicaron independientemente a una columna de intercambio aniónico Mono Q. La elución desde la columna Mono Q con un gradiente de NaCl asoció la actividad proteolítica específica de Arg con la proteína de 45 kDa con una purificación de 25 veces sobre el producto sonicado en bruto original (tabla 2, figura 7). Se confirmó la especificidad de la proteinasa de 45 kDa por los residuos arginilo mediante la escisión enzimática Bz-L-Arg-pNA pero no de z-L-Lys-pNA. Se activó la enzima de 45 kDa específica de Arg mediante tioles (particularmente cisteína), no se inhibió por PMSF o AEBSF pero se inhibió por reactivos dirigidos a sulfhidrilo, leupeptina y EDTA (tabla 3). La inhibición mediante EDTA podría invertirse mediante la adición de Ca^{2+} (tabla 3). EL pH óptimo de la enzima era de 7,5 - 8,0 y la actividad disminuyó drásticamente cuando se disminuyó el pH por debajo de 7,0. Estos resultados indican que la enzima de 45 kDa es una endopeptidasa de cisteína específica de Arg, estabilizada mediante calcio. Se caracterizó la actividad específica de Lys usando el sustrato Z-L-Lys-pNA y se asoció con la proteína purificada de 48 kDa purificada del eluyente de lisina 200 mM mediante la FPLC Mono Q. También se activó la enzima específica de Lys mediante tioles y se inhibió mediante reactivos dirigidos a sulfhídrico pero no se inhibió mediante leupeptina o EDTA. La SDS-PAGE no reductora sin someter a ebullición del complejo de 300 kDa produjo bandas que correspondían a las masas moleculares relativas de aproximadamente 300, 150, 104, 88, 76 y 66 kDa.

TABLA 2 Purificación de la proteinasa PrtR45 específica de Arg de 45kDa

	Proteína	Actividad	Actividad	Veces de	Rendimiento
Etapa	(mg)	proteolítica (U*)	específica U mg^{-1}	purificación	(%)
Producto sonicado	48,0	124	2,6	1	100

FPLC de intercambio aniónico
FPLC (Q- Sepharose)	8,2	64	7,8	3	52

Filtración en gel
(Superose 12)	3,9	46	11,8	5	37

FPLC de afinidad
(Arg-Sepharose)	0,7	17	24,3	9	14

FPLC de intercambio aniónico
(Mono Q)	0,2	13	65,0	25	11
* Actividad amidolítica usando 1,0 mM Bz-L-Arg-pNA; 1 unidad = \mumol min^{-1} a 37ºC.

TABLA 3 Efectos de diversos activadores/inhibidores sobre la actividad de la proteinasa específica de Arg de 45 kDa

Compuesto	Concentración (mM)	Actividad (%)
	1,0	100
2-mercaptoetanol	10,0	158
	50,0	189
Ditiotreitol	1,0	109
	10,0	174
	0,1	183
L-cisteína	1,0	320
	10,0	487
PMSF*^{\dagger}	1,0	100
	10,0	90
AEBSF*^{\dagger}	1,0	93
	10,0	80
Ácido yodoacético^{\dagger}	1,0	82
	10,0	19
PCMB*^{\dagger}	1,0	100
	10,0	14
Leupeptina ^{\dagger}	0,1	0
	1,0	100
EDTA^{\dagger}	10,0	4
	50,0	0
+Ca^{2+}	50,0	97
o-fenantrolina^{\dagger}	10,0	100

*PCMB, ácido p-cloromercuribenzoico; PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo;
AEBSF, [4-(2-aminoetil)- bencenosulfonilfluoruro]
\dagger Estas incubaciones contienen también 1,0 mM de 2-mercaptoetanol

Los componentes proteicos de 45, 27, 17, 15 kDa y uno de los de 44 kDa del complejo de 300 kDa se codifican mediante el gen PrtR tal como se presenta esquemáticamente en la figura 8a. La secuencia de nucleótidos completa y la secuencia de aminoácidos deducida de PrtR se muestra en la figura 8b. Cada componente PrtR está precedido de un residuo de arginilo o lisilo (figura 8a, b) lo que indica que la poliproteína se procesa mediante especificidad proteolítica similar a tripsina. Se han designado estas partes componentes del complejo de 300 kDa, mediante sus masas moleculares relativas tal como se determinó mediante SDS-PAGE, como el PrtR45, PrtR44, PrtR27, PrtR17 y PrtR15 que encajan bien con los tamaños predichos a partir de la secuencia de aminoácidos de PrtR deducida (53,9, 44,8, 29,5, 17,5 y 14,3 kDa respectivamente). Se ha descrito la proteína de 44 kDa, la PrtR44, por anteriores trabajadores como hemaglutinina/adhesina de caldo de cultivo (Pike et al., 1994) [J Biol Chem 269:406-411]. La PrtR44 presenta homología con los otros componentes de tipo no proteinasa del complejo de multiproteico sugiriendo un papel similar para PrtR27, PrtR17 y PrtR15 en la interacción con la proteasa y/o en la hemaglutinación o la adhesión. El componente endopeptidasa específico de Arg PrtR45 del complejo de PrtR tiene las mismas características y secuencia N-terminal a la proteinasa específica de Arg de 50 kDa identificada en el sobrenadante del cultivo de P. gingivalis H66 por Chen et al. (1992)[J Biol Chem 267:18896-18901] designada Arg-gingipaína.

Las otras proteínas del complejo de 300 kDa, la proteinasa específica de Lys de 48 kDa, la otra proteína de 44 kDa y las proteínas de 39 kDa y 15 Da están codificadas por un sólo gen, el prtK presentado esquemáticamente en la figura 9a. La secuencia de nucleótidos completa y la secuencia de aminoácidos deducida del PrtK se muestra en la figura 9b. El prtK es similar al prtR en que codifica para una secuencia líder supuesta, una prosecuencia seguida de un dominio de proteinasa que se sigue entonces de adhesinas relacionadas por secuencia que presentan una alta homología con las adhesinas C-terminales del prtR. Se ha designado la proteinasa específica de Lys de 48 kDa como PrtK48 y sus adhesinas asociadas la PrtK39, PrtK15 y PrtK44 (figura 9a, b) basándose en los tamaños medidos mediante SDS-PAGE que se ajustan razonablemente bien con los tamaños predichos a partir de la secuencia de aminoácidos de PrtK (55,9, 44,8, 14,3 y 47,9 kDa respectivamente). La PrtK48 tiene las mismas características enzimáticas que la proteinasa de 48 kDa purificada a partir del sobrenadante del cultivo de P. gingivalis 33277 por Fujimura et al. (1993) [Infect Immun 55:716-720]. La PrtK48 tiene también la misma secuencia N-terminal y características enzimáticas que la endopeptidasa específica de Lys de 60 kDa purificada previamente a partir del caldo de cultivo de P. gingivalis H66 by Pike et al. (1994) [J Biol Chem 269:406-411] y designada Lis-gingipaína. Las PrtK39, PrtK15 y PrtK44 están todas relacionadas por secuencia y presentan alta homología con las hemaglutininas/adhesinas PrtR, particularmente la proteína de 15 kDa que es idéntica en ambos productos génicos sugiriendo que estas proteínas son también hemaglutinina/adhesinas.

Dado que el complejo proteinasa-adhesina de 300 kDa y formas de masa molecular más elevada están compuestos de proteínas a partir de los dos genes, el prtR y el prtK, se sugiere que se designen complejos PrtR-PrtK. La masa molecular deducida del PrtR maduro es de 160 kDa (figura 9a, b) y la del PtrK maduro es de 163 kDa (figura 9b) de manera que la masa del heterodímero PrtR-PrtK sería de 323 kDa que está en buena concordancia con la M_{r} determinada mediante filtración en gel y SDS-PAGE sin ebullición. La SDS-PAGE de la muestra tras ebullición produjo las siete bandas de 48, 45, 44, 39, 27, 17 y 15 kDa que corresponden a los dominios de los dos productos génicos, el PrtR y el PrtK. Estos dominios se observaron sólo cuando se sometió la muestra a ebullición, con o sin agente reductor, sugiriendo que los dominios permanecen asociados fuertemente de manera no covalente tras el procesamiento proteolítico. El producto sonicado celular y las fracciones cromatográficas tuvieron una actividad proteolítica mínima o nula en ausencia de agentes reductores garantizando así una actividad enzimática mínima durante las purificaciones cromatográficas. La caracterización del complejo asociado a célula de 300 kDa al estar compuesto de dominios procesados de los dos genes prtR y prtK sugiere que las proteínas PrtR y PrtK maduras secretadas se asocian y entonces se procesan, quizás autolíticamente. La identificación de varios de los dominios de PrtR y PrtK en el sobrenadante del cultivo mediante grupos independientes concuerda con el procesamiento proteolíticos (autolítico) de estas poliproteínas.

La masa molecular relativa de complejo PrtR-PrtK procesado se atribuye probablemente a la composición de 1 PrtK48 + 1 PrtR45 + 1 PrtR44 + 1 PrtK39 + 1 PrtK44 + 1 PrtR27 + 1 PrtR17 + 1 PrtK15 + 1 PrtR15 = 294-323 kDa dependiendo del truncamiento C-terminal, es decir que el complejo de 300 kDa contendría los productos génicos de los cinco dominios del prtR y de los cuatro dominios del prtK (figuras 8 y 9). Como el material de M_{r} elevado (0,6 -> 2 x 10^{6} Da) en filtración en gel (figura 2) también estaba compuesto de siete bandas PrtR-PrtK, esto sugiere entonces que los complejos de PrtR-PrtK de 300 kDa pueden asociarse adicionalmente para formar agregados asociados a células mayores. La alta homología de secuencia de aminoácidos entre las PrtR44, PrtK39, PrtK44, PrtR27, PrtR17 y la proteína de 15 kDa tanto de PrtR como de PrtK sugiere que estas adhesinas son responsables de las interacciones cohesivas no covalentes entre los componentes de los complejos PrtR-PrtK y entre los propios complejos en los agregados mayores. Es interesante observar que tuvo lugar alguna disociación del complejo PrtR-PrtK de 300 kDa durante la cromatografía de afinidad en Arg-sepharose, aunque la mayor parte de la proteína eluyó como el complejo no disociado con lisina 750 mM. La disociación parcial del complejo en la unión al sustrato puede ser un mecanismo mediante el que el complejo selecciona como diana macromoléculas y células huésped específicas liberando los dominios proteinasa/adhesina en el sitio diana en la unión.

Este ejemplo describe la purificación de un complejo asociado a célula novedoso de proteinasas específicas de Arg y específicas de Lys y adhesinas relacionadas por secuencia codificadas por los dos genes, el prtR y prtK.

B. Ultrafiltración y diafiltración

Se hizo crecer P. gingivalis W50 aneróbicamente a 37ºC en agar sangre de caballo lisado y en medio BM modificado que contenía 1 \mug/ml de hemina. Se mantuvieron las bacterias en placas de agar sangre de caballo lisado mediante pases rutinarios (< 10 pases) y se usaron para inocular cultivos discontinuos. Se monitorizó el crecimiento en cultivo discontinuo en medio de infusión cerebro-corazón a 650 nm usando un espectrofotómetro (295E, Perkin-Elmer). Se comprobó la pureza del cultivo de manera rutinaria mediante tinción de Gram, examen microscópico y mediante el uso de una variedad de pruebas bioquímicas. Se mantuvieron las reservas como cultivos liofilizados. Se hizo crecer un cultivo de P. gingivalis hasta su fase logarítmica final y las células se recogieron mediante centrifugación (5.000 x g, 20 min, 4ºC). Se añadió cloroformo al sedimento celular, tras mezclado suave se dejó la suspensión durante 15 min a temperatura ambiente. Tras el tratamiento con cloroformo, se añadió y se mezcló suavemente tampón Tris-HCl 20 mM pH 8,0 que contenía NaCl 50 mM. Entonces se centrifugó esta mezcla (100,000 x g, 30 min, 4ºC) y se diafiltró el sobrenadante a través una membrana de 100,000 M_{r} de corte (Amicon) con cinco volúmenes de agua destilada. Esto purifica e inactiva mediante oxidación el PrtR-PrtK de 294-323 kDa que se liofiliza y se utiliza como inmunógeno. El PrtR-PrtK purificado mediante diafiltración estaba compuesto de componentes de 48, 45, 44, 39, 27, 17 y 15 kDa tal como se muestra mediante SDS-PAGE (figura 10).

(2) Preparación de anticuerpos

Se produjo antisuero policlonal de PrtR-PrtK en un conejo mediante inmunización con PrtR-PrtK inactivado por O_{2} por vía subcutánea. Se inmunizó el conejo el día 0 con 40 \mug de proteína en adyuvante de Freund incompleto, el día 14 con 90 \mug de proteína en adyuvante de Freund incompleto, y el día 28 con 60 \mug de proteína en adyuvante de Freund incompleto. Se llevaron a cabo las inmunizaciones usando procedimientos convencionales. Se obtuvieron antisueros policlonales que tenían un título elevado frente a P. gingivalis. Si se desea pueden obtenerse los anticuerpos dirigidos específicamente contra P. gingivalis usando procedimientos convencionales.

Ejemplo 2 Métodos y compuestos para formulaciones de vacunas relacionados con PrtR-PrtK

Esta realización de la presente invención sirve para proporcionar la proteína PrtR-PrtK para usarse tal como inmunógeno en una vacuna profiláctica y/o terapéutica para inmunización activa para proteger frente a o tratar infecciones provocadas por P. gingivalis. Con el fin de desarrollar una vacuna, un antígeno de P. gingivalis que comprende una proteína bacteriana puede ser inmunogénico, e inducir anticuerpos funcionales dirigidos frente a uno o más epítopos expuestos en superficie en bacterias intactas, en las que el(los) epítopo(s) está(n) conservado(s) entre cepas de P. gingivalis.

En una ilustración de la proteína PrtR-PrtK que tiene las propiedades deseables para un antígeno de vacuna, se purificó la proteína a partir de P. gingivalis usando el método descrito en el presente documento en el ejemplo 1. Se inmunizaron los ratones con la proteína PrtR-PrtK inactivada purificada (25 \mug) con adyuvante (20 \mug de QS21) dos veces en intervalos de cuatro semanas. Se inactivó el PrtR-PrtK mediante oxidación por aire. Se extrajo sangre de los ratones inmunizados 32 días después de la última inmunización y se reunieron los sueros inmunitarios. Se sometieron a ensayo los sueros inmunitarios reunidos frente a bacterias completas (P. gingivalis cepa W50) mediante un ensayo de inmunoabsorción unido a enzima (ELISA). Para el ELISA de células completas, se recogieron cultivos dejados crecer durante la noche de bacterias mediante un bastoncillo y se suspendieron en PBS hasta una absorbancia de 0,1 a 600 nm. Se añadieron alícuotas (100 \mul) de la suspensión bacteriana a los pocillos de una placa de microvaloración de 96 pocillos y se secaron durante la noche a temperatura ambiente. Se bloquearon las placas con 100 \mul de gelatina al 0,1% (p/v) en PBS. Ésta, y todas las incubaciones restantes, se realizaron durante una hora a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Se retiró la solución de bloqueo y se añadieron 100 ml de los sueros inmunitarios, diluidos en PBS con gelatina al 0,1% (p/v) a los pocillos y se incubó. Tras lavarla tres veces con PBS, se detectaron los anticuerpos unidos mediante incubación con 100 ml de proteína G recombinante conjugada con fosfatasa alcalina (1:1500 en PBS con gelatina 0,1% (p/v)). Se lavaron las placas y se facilitó el desarrollo de color mediante la adición de 100 \mul/pocillo de fosfato de p-nitrofenilo (2 mg/ml en dietanolamina). Tras 30 minutos, se paró la reacción añadiendo 50 \mul de NaOH 3 M. Se leyó la absorbancia a 492 nm usando un lector ELISA. Se determinaron los títulos de punto final como el recíproco de la dilución a la que la absorbancia fue superior a la de los pocillos blancos. Los resultados demostraron que la inmunización con PrtR-PrtK logra anticuerpos que pueden unirse a uno o más epítopos expuestos en superficie en P. gingivalis intacta.

Las evidencias adicionales que apoyan la inmunogenicidad de la proteína PrtR-PrtK provienen de un estudio de la respuesta inmunitaria humana al PrtR-PrtK de P. gingivalis en el que el 86% de los 43 pacientes con periodontitis adulta tenía IgG específica en sus sueros para el PrtR-PrtK.

Otra ilustración de un antígeno de vacuna deseable es el PrtR-PrtK inactivado por O_{2}. Se ha demostrado que el PrtR-PrtK de superficie celular es la diana de los anticuerpos bactericidas generados a partir de inmunización con la proteína inactivada. Se produjo antisuero policlonal para PrtR-PrtK en un conejo mediante inmunización con PrtR-PrtK inactivado por vía subcutánea. Se inmunizó a un conejo el día 0 con 40 \mug de proteína en adyuvante de Freund incompleto, el día 14 con 90 \mug de proteína en adyuvante de Freund incompleto, y el día 28 con 60 \mug de proteína en adyuvante de Freund incompleto. Se probó el antisuero resultante para determinar su actividad bactericida frente a la cepa W50 de P. gingivalis. Se hicieron crecer las bacterias hasta su fase logarítmica en caldo de infusión de cerebro-corazón (BHI). Se diluyó una alícuota del cultivo bacteriano hasta 5 x 10^{4} unidades formadoras de colonias (UFC) por ml en albúmina de suero bovino al 10% en una solución salina equilibrada. La reacción de ensayo bactericida contenía bacterias, antisuero policlonal para proteína PrtR-PrtK inactivada, una fuente de complemento que consiste en suero humano normal que se absorbió con proteína G para retirar anticuerpos, y la solución salina equilibrada. Se añadieron todos los reactivos a la reacción para producir un volumen de 250 \mul. Se retiraron alícuotas de 25 \mul de la reacción y se colocaron en placas por triplicado en agar BHI en los tiempos 0 y 60 minutos. Se incubaron las placas y se contaron las colonias al día siguiente. Se calculó el porcentaje de muerte usando la media de los tres valores por triplicado en 2 tiempos. Un ejemplo representativo de los datos generados mediante los ensayos bactericidas se muestra en la tabla 4. Los resultados indican que el antisuero policlonal producido por el PrtR-PrtK inactivado es bactericida para P. gingivalis. Tal como se ilustra mediante la tabla 4, los controles muestran que el antisuero no destruye bacterias en ausencia de complemento, y que la fuente de complemento no mata las bacterias en ausencia del antisuero, indicando que la actividad bactericida está dirigida contra anticuerpo y mediada por el complemento.

TABLA 4 Actividad bactericida del anticuerpo anti-(PrtR-PrtK)

Muestra	Antisuero	Complemento	UFC al	UFC al	Porcentaje de muerte
			tiempo 0	tiempo 60
1	10 \mul	22 \mul	225	0	100%
2	10 \mul	0	227	390	0%
3	0	22 \mul	254	286	0%

Para ilustrar adicionalmente que la proteína PrtR-PrtK posee propiedades deseables de un antígeno de vacuna, se mostró que los sueros inmunitarios reunidos producidos frente a la cepa W50 tenían reactividad cruzada con cepas heterólogas. Los sueros inmunitarios reunidos, preparados frente a proteína PrtR-PrtK tal como se describió anteriormente, se examinaron para determinar reactividad cruzada con nueve cepas de P. gingivalis de diversas fuentes clínicas y geográficas. Se recogieron bacterias de cada cultivo mediante bastoncillos y se suspendieron en PBS hasta una absorbancia óptica de 1,0 a 600 nm. Se aplicó un microlitro de cada suspensión a una membrana de nitrocelulosa y se le dejó secar. Se incubó la membrana una hora a temperatura ambiente en una solución de leche desnatada en polvo al 5% en PBS para bloquear los sitios de unión residuales de la membrana. Se lavó la membrana dos veces con PBS, y entonces se sumergió en la solución de bloqueo que contenía los sueros inmunitarios diluidos hasta 1:1000. Se incubó la membrana con el anticuerpo durante la noche a 46ºC con agitación suave. Se lavó la membrana tres veces con PBS y entonces se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con proteína G recombinante conjugada con fosfatasa alcalina (1:1500 en PBS con leche desnatada en polvo al 5%). Se lavó la membrana tres veces con PBS y se detectó la unión de anticuerpo mediante la adición de sustrato. Los sueros inmunitarios reaccionaron con todas las cepas con la misma fuerza, o con mayor grado, que con la cepa W50. Así, los anticuerpos logrados mediante inmunización de la proteína PrtR-PrtK aislada de la cepa W50 reaccionaron de manera cruzada con todas las cepas heterólogas
probadas.

Para el desarrollo de vacunas, puede purificarse PrtR-PrtK a partir de un huésped que contenga un vector recombinante que exprese PrtR-PrtK. Tales huéspedes incluyen, pero sin limitarse a, transformantes de bacterias, transformantes de levadura, transformantes fúngicos filamentosos, y células cultivadas que o bien se han infectado o bien se han transfectado con un vector que codifica para PrtR-PrtK. Se conocen métodos para la introducción de una formulación de vacuna en el ser humano o animal a vacunar. Éstos incluyen, pero sin limitarse a, administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, ocular, intranasal y oral. La vacuna puede comprender adicionalmente un vehículo fisiológico tal como una solución, un polímero o liposomas; y un adyuvante, o una combinación de los mismos.

Ejemplo 3 Eficacia protectora de la inmunización con el complejo PrtR-PrtK en un modelo animal

Se analizaron diversas preparaciones de proteínas de P. gingivalis purificadas en el modelo de absceso de ratón. Este modelo se basa aproximadamente en los métodos descritos por Kesavalu et al (1992) [Infect Immun 60:1455 - 1464]. Un experimento habitual se explica resumidamente más adelante. Brevemente, se obtuvieron ratones BALB/c de ARC (Perth, Australia) y se inmunizaron subcutáneamente en el cuello con las preparaciones y dosis según la tabla 5 antes de la exposición con la cepa W50 viva de P. gingivalis, que se administró a las 10 semanas de vida. Se les administró a los ratones 2 dosis de vacuna a las 4 y 1 semanas antes de la exposición. Se prepararon células de W50 de P. gingivalis destruidas con formalina mediante incubación de una alícuota de células en un 0,5% (vol/vol) en una solución salina con formal tamponada durante la noche a 4ºC. Se preparó el extracto de cloroformo de P. gingivalis como se detalla en el ejemplo 2. Se realizó la purificación del complejo PrtR-PrtK como se detalla en el ejemplo 1. Se prepararon los dominios de PrtR-PrtK tomando el complejo PrtR-PrtK e incubándolo en presencia de 2-mercaptoetanol 50 mM durante 8 h a 4ºC. Esto dio como resultado la ruptura del complejo PrtR-PrtK en dominios que eran proteínas de 15 - 115 kDa, como se muestra mediante FPLC de filtración en gel y SDS-PAGE, tal como se realizó en el ejemplo 1.

Se emulsionaron todos los preparados con un volumen idéntico de adyuvante incompleto de Freund (FIA; Sigma) antes de la inyección.

Se sangraron los animales antes y una 1 semana después del programa de inmunización. Se examinaron los sueros mediante ELISA utilizando un producto sonicado de P. gingivalis (preparado tal como en el ejemplo 1) como el antígeno adsorbido. En la figura 11 se muestra la inmunogenicidad del complejo PrtR-PrtK purificado.

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TABLA 5 Programa de inmunización

Grupo	Nº de dosis	Tratamiento	n

1	2	1 x 10^{9} de células de P. gingivalis destruidas con formalina en FIA^{1}	11
2	2	Proteínas de P. gingivalis extraídas con cloroformo en FIA	10
3	2	Complejo PrtR-PrtK de P. gingivalis purificado de afinidad en FIA	5
4	2	Dominios PrtR-PrtK en FIA	10
5	2	Tampón de tris-cisteína en FIA	10
6	2	Tampón de tris-cisteína	10
^{1} FIA = adyuvante incompleto de Freund

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Para la preparación de la exposición bacteriana, se hicieron crecer células de P. gingivalis a 37ºC sobre placas de agar sangre de caballo lisado (HBA) hasta el día 3 o 4 en una cámara anaerobia (Mark 3 Anaerobic Workstation, Don Whitley Scientific Limited; con una mezcla de aire de un 8% de H_{2}, un 12% de CO_{2}, un 80% de N_{2}), luego se hicieron pasar a 20 ml de caldo infusión cerebro corazón (BHIB; Oxoid) complementado con 0,5 g/l de cisteína y 1 mg/l de hemina durante 24 horas en una incubadora convencional a 37ºC. Finalmente, se añadieron 3 ml de este cultivo a 400 ml de los medios de BHIB-cisteína y se incubó durante aproximadamente 15 horas en una incubadora convencional a 37ºC, hasta que la densidad óptica a 650 nm alcanzó 0,18. Entonces se sedimentaron las células mediante centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos utilizando un rotor JA10 en una centrífuga de alta velocidad Beckman, y luego se resuspendieron hasta una dilución final de 3x10^{10} células por ml en medios de BHIB-cisteína según curvas de crecimiento previamente establecidas para la cepa W50 utilizada en estos experimentos. Se marcaron los ratones para su identificación, se afeitaron sus lomos y tórax para obtener la medida de posibles lesiones, luego se pesaron antes de la inoculación con la dosis de exposición en un sitio sencillo en la mitad del lomo. Se administró una dosis de 0,1 ml que representa una dosis de exposición pronosticada de 3x10^{9} bacterias por ratón. Se confirmó la dosis de inóculo cultivando diversas diluciones de la dosis de exposición sobre placas de HBA lisado y examinando el número de colonias 7 días más tarde.

Se examinaron diariamente los ratones de exposición siguientes para determinar el número y tamaño de las lesiones en su cuerpo y se calculó su tamaño midiendo el área superficial aproximada en mm^{2} implicada. Experimentos previos han demostrado que en ratones no inmunizados, se desarrollaron lesiones en la panza de los ratones tras la inoculación con bacterias vivas en el lomo o el costado. Se sacrificaron de forma selectiva todos los animales afectados. Se realizaron observaciones durante dos semanas y un resumen de un experimento tal se resume más adelante en la tabla 6. En este experimento, mientras que una dosis de 3x10^{9} bacterias por ratón era el número de bacterias deseado, después de que se recogiera de las placas el inóculo se calculó que cada ratón recibió en realidad una dosis de exposición de 3,17x10^{9} bacterias vivas de la cepa W50 de P. gingivalis.

Cuando los ratones se inmunizaron con las diversas fracciones de P. gingivalis se vieron reducciones importantes (p < 0,05) en el tamaño de las lesiones con las células de la cepa W50 de P. gingivalis completamente destruidas con formalina (grupo 1), con las proteínas extraídas con cloroformo (grupo 2) y con el complejo PrtR-PrtK (grupo 3), cuando se comparó con el tamaño de lesión de los animales que recibían FIA (grupo 5) (tabla 6). Los dominios de PrtR-PrtK (grupo 4) del complejo PrtR-PrtK separado no redujeron significativamente el tamaño de lesión, comparado con el control (grupo 5). Estos resultados muestran claramente que el complejo funciona eficazmente como un inmunógeno mientras que los dominios de PrtR-PrtK (proteínas de 15 - 115 kDa) no lo hacen. El único grupo de animales que tenía un número de animales (un 40%) que no mostraban lesiones visibles en absoluto fue el grupo del complejo PrtR-PrtK (grupo 3). Todos los otros grupos, incluyendo las células destruidas con formalina (grupo 1), tenían todos animales que mostraban lesiones visibles indicando que el complejo PrtR-PrtK era un inmunógeno mejor que las células destruidas con formalina.

TABLA 6 La inmunización con el complejo PrtR-PrtK puede proteger a los ratones de la exposición con P. gingivalis

Tamaño de lesión
Grupo	Tamaño medio de lesión máxima mm^{2}	p*
1	30,2 \pm 28,4'	0,0008
2	39,0 \pm 33,2	0,009
3	30,0 \pm 36,0	0,0028
4	88,3 \pm 32,2	NS
5	86,8 \pm 41,1	-
6	201,7 \pm 125,8	0,012
* \begin{minipage}[t]{155mm} probabilidad calculada mediante la prueba de suma de rangos de Mann Whitney comparando el grupo 5 con otros \end{minipage}
' media \pm DE

Ejemplo 4 Clonación y análisis de la secuencia de los genes prtR y prtK Cepas bacterianas

Se hizo crecer W50 de P. gingivalis en un medio BM modificado complementado con 1 \mug/ml de hemina en una atmósfera de un 10% de CO_{2}, un 10% de H_{2} y un 80% de N_{2} a 37ºC. Se hicieron crecer Escherichia coli JM109 y Escherichia coli LE392 en un medio LB a 37ºC. Se hicieron crecer cepas de Escherichia coli que albergan plásmidos pUC18 en medio LB complementado con 100 \mug/ml de ampicilina a 37ºC.

Construcción de la biblioteca genómica

Se aisló ADN cromosómico a partir de W50 de P. gingivalis como se describe por Smith et al., [Oral Microbiol. Immunol. 4:47 - 51 (1989)], excepto que las células se depositaron a partir de 500 ml de un cultivo tardío-exponencial. Se construyó la biblioteca genómica a partir de ADN de W50 parcialmente digerido por BamHI, el cual está parcialmente relleno con dGTP y dATP y está ligado en los brazos de la mitad del sitio XhoI de LambdaGEM^{MR} - 12 (Promega) y está empaquetado utilizando Packagene^{MR} (Promega).

Caracterización del gen prtR: se examinó la biblioteca genómica utilizando oligonucleótidos sintéticos degenerados derivados de la información de la secuencia N-terminal de PrtR45 purificada. Las sondas de oligonucleótido se basaron en la secuencia de aminoácidos YEGDIKD (antisentido) y KDFVDWKNQ (sentido) y se marcó en el extremo 5' utilizando \gamma^{32}P ATP y polinucleótido cinasa de T4. Se examinaron aproximadamente 1,5 x 10^{4} fagos mediante extracción sobre filtros de membrana de Nylon y se hibridaron con oligonucleótidos radiomarcados durante la noche en un tampón de hibridación: 6 x SSC (SSC es citrato de sodio 15 mM, NaCl 150 mM a pH 8,0), un 0,25% de SDS, 5 x solución de Denhardt y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón a 44ºC. Se lavaron los filtros exhaustivamente en una solución de 5 x SSC que contiene un 0,01% de SDS (p/v) a 44ºC. Se purificaron las placas que hibridan positivamente. Los protocolos convencionales para el marcado en el extremo de los oligonucleótidos y los procedimientos de examen fueron esencialmente como se describe en Sambrook et al. (1989) [Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2ª Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press]. Se seleccionó el clon lambda cuatro con un tamaño de inserto de aproximadamente 15 kb y este fragmento contenía el gen prtR entero. Se cortó el fragmento de 15 kb con enzimas de restricción apropiadas y los fragmentos generados se subclonaron en pUC18. Se transformó JM109 de Escherichia coli con los plásmidos recombinantes utilizando electroporación.

Caracterización del gen prtK: se aisló la parte 5' del gen que codifica para PrtK a partir de la misma biblioteca genómica descrita anteriormente. Se seleccionó la biblioteca genómica utilizando un oligonucleótido sintético degenerado derivado de la información de la secuencia N-terminal del PrtK48 purificado. Las sondas de oligonucleótido eran sentido para la secuencia de aminoácidos DVYTDHGD y se radiomarcaron tal como se describió anteriormente. Las condiciones de hibridación y lavado fueron tal como se describió anteriormente excepto que la temperatura fue 48ºC y los filtros se lavaron exhaustivamente con una solución de 3 x SSC que contiene un 0,01% de SDS (p/v) a 48ºC. Se seleccionó el clon lambda 12 con un tamaño de inserto de aproximadamente 15 kb y se digirió con BamHI y se ligó un fragmento de 3,3 kb en el plásmido BamHI-BAP pUC18 y se transformó JM109 de Escherichia coli con el plásmido recombinante tal como se describió previamente. Debido a un sitio de BamHI interno dentro de prtK, el fragmento de BamHI de 3,3 kb contenía la parte 5' de prtK, la cual constituía el extremo del clon lambda 12. La caracterización de secuencia del fragmento de BamHI de 3,3 kb mostró que la secuencia de ADN que codifica para PrtK48 contiene un sitio EcoRI interno. Posteriormente, se generó una segunda sonda de oligonucleótido (lysur) específica de la secuencia THIGAH, la cual se encuentra dentro de PrtK48 para determinar una estrategia apropiada para clonar el extremo 3' de prtK. El análisis de Southern blot de ADN genómico indicó que un fragmento de EcoRI de 7,5 kb contenía la parte 3' entera de prtK. Con el fin de caracterizar el extremo 3' del gen prtK se preparó una segunda biblioteca genómica. Se purificaron fragmentos de ADN digeridos con EcoRI de 6 - 8 kb a partir de un gel de agarosa y posteriormente se ligaron a un vector tratado con fosfatasa de intestino de ternero lambda Zap II digerido con EcoRI (Stratagene). Se empaquetó la biblioteca genómica enriquecida para fragmentos EcoRI de P. gingivalis de 6 - 8 kb utilizando el extracto de empaquetamiento Gigapack III Gold (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Se seleccionó la biblioteca tal como se describió anteriormente, utilizando el oligonucleótido lysur excepto que las temperaturas de hibridación fueron de 42ºC y los filtros se lavaron con 3 x SSC que contiene un 0,01% de SDS (p/v) a 42ºC. Se realizó la escisión in vivo del clon genómico positivo para Zap II lambda (manual de instrucciones Stratagene) para eliminar el fagémido pBluescript, el cual se secuenció posteriormente para generar la información de secuencia que corresponde al extremo 3' del gen prtK.

Secuenciación de ADN. Se secuenció en ambas direcciones ADN molde de plásmido bicatenario preparado siguiendo el procedimiento de Li y Schweizer [Focus 15:19 - 20 (1993)] utilizando oligonucleótidos sintéticos derivados de la secuencia de ADN, siguiendo el método de terminación didesoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463 - 5467 (1977)], utilizando el kit de secuenciación de nucleótidos Sequenase versión 2.0 adquirido de United States Biochemicals. Se analizaron los datos de secuencia de nucleótidos y proteínas utilizando paquetes de programas obtenidos del Australian Nacional Genomic Information Service (ANGIS).

Ejemplo 5

El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes propuesta que contiene anticuerpos anti-(PrtR-PrtK).

Componente	% p/p
Fosfato de dicalcio dihidratado	50,0
Glicerol	20,0
Carboximetilcelulosa sódica	1,0
Laurilsulfato de sodio	1,5
Lauroilsarconisato de sodio	0,5
Aromatizante	1,0
Sacarina sódica	0,1
Gluconato de clorhexidina	0,01
Dextranasa	0,01
Suero de cabra que contiene anti-(PrtR-PrtK)	0,2
Agua	Resto

Ejemplo 6

El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes propuesta.

Componente	% p/p
Fosfato de dicalcio dihidratado	50,0
Sorbitol	10,0
Glicerol	10,0
Carboximetilcelulosa sódica	1,0
Laurilsulfato de sodio	1,5
Lauroilsarconisato de sodio	0,5
Aromatizante	1,0
Sacarina sódica	0,1
Monofluorofosfato de sodio	0,3
Gluconato de clorhexidina	0,01
Dextranasa	0,01
Suero bovino que contiene anti-(PrtR-PrtK)	0,2
Agua	Resto

Ejemplo 7

El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes propuesta.

Componente	% p/p
Fosfato de dicalcio dihidratado	50,0
Sorbitol	10,0
Glicerol	10,0
Carboximetilcelulosa sódica	1,0
Lauroildietanolamida	1,0
Monolaureato de sacarosa	2,0
Aromatizante	1,0
Sacarina sódica	0,1
Monofluorofosfato de sodio	0,3
Gluconato de clorhexidina	0,01
Dextranasa	0,01
Ig de leche bovina que contiene anti-(PrtR-PrtK)	0,1
Agua	Resto

Ejemplo 8

El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes propuesta.

Componente	% p/p
Sorbitol	22,0
Musgo irlandés	1,0
Hidróxido sódico (50%)	1,0
Gantrez	19,0
Agua (desionizada)	2,69
Monofluorofosfato de sodio	0,76
Sacarina sódica	0,3
Pirofosfato	2,0
Alúmina hidratada	48,0
Aceite aromatizante	0,95
anti-(PrtR-PrtK) de ratón monoclonal	0,3
Laurilsulfato de sodio	2,00

Ejemplo 9

El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes propuesta.

Componente	% p/p
Poliacrilato de sodio	50,0
Sorbitol	10,0
Glicerol	20,0
Aromatizante	1,0
Sacarina sódica	0,1
Monofluorofosfato de sodio	0,3
Gluconato de clorhexidina	0,01
Etanol	3,0
Ig de equino que contiene anti-(PrtR-PrtK)	0,2
Ácido linólico	0,05
Agua	Resto

Ejemplo 10

El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes propuesta.

Componente	% p/p
Etanol	20,0
Aromatizante	1,0
Sacarina sódica	0,1
Monofluorofosfato de sodio	0,3
Gluconato de clorhexidina	0,01
Lauroildietanolamida	0,3
Ig de conejo que contiene anti-(PrtR-PrtK)	0,2
Agua	Resto

Claims

1. Complejo antigénico purificado para su uso en la producción de una respuesta de anticuerpos dirigida contra Porphyromonas gingivalis, comprendiendo el complejo al menos un complejo proteico multimérico de tiol endopeptidasas específicas de arginina y específicas de lisina, y dominios de adhesina, teniendo el complejo un peso molecular superior a 200 kDa, en el que el complejo proteico multimérico se compone de 9 proteínas que tienen las siguientes secuencias N-terminal:

DVYTDHGDLYNTPVRML,

YTPVEEKQNGRMIVIVAKKYEGD,

SGQAEIVLEAHDVWNDGSGYQILLDADHDQYGQVIPSDTHFL,

PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR,

ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDA,

PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR,

ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA,

y

ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA,

2. Complejo antigénico purificado que comprende al menos un complejo proteico multimérico de tiol endopeptidasas específicas de arginina y específicas de lisina, y dominios de adhesina, teniendo el complejo un peso molecular superior a 200 kDa, en el que el complejo proteico multimérico se compone de 9 proteínas que tienen las siguientes secuencias N-terminal:

DVYTDHGDLYNTPVRML,

YTPVEEKQNGRMIVIVAKKYEGD,

SGQAEIVLEAHDVWNDGSGYQILLDADHDQYGQVIPSDTHFL,

PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR,

ANEAKVVLAADNVWGDNTGYQFLLDA,

PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFR,

ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA,

y

ADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDA,

3. Complejo antigénico purificado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el complejo proteico multimérico se aísla de cepas virulentas de Porphyromonas gingivalis.

4. Complejo antigénico purificado según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el complejo proteico multimérico tiene un peso molecular de 294 a 323 kDa.

5. Complejo antigénico purificado según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que las tiol endopeptidasas se hacen inactivas, por ejemplo mediante oxidación o mediante mutación.

6. Complejo antigénico purificado según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el cual el complejo proteico multimérico está codificado por la secuencia de ADN mostrada en las figuras 8b y 9b.

7. Composición para la detección, prevención y tratamiento de enfermedades periodontales asociadas con Porphyromonas gingivalis, que comprende el complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un adyuvante adecuado y/o vehículo aceptable.

8. Composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra Porphyromonas gingivalis, comprendiendo la composición el complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un adyuvante adecuado y/o vehículo aceptable.

9. Uso de la composición según la reivindicación 7 o la reivindicación 8 en la preparación de un medicamento para reducir la posibilidad de infección por P. gingivalis en un individuo y/o la gravedad de la enfermedad, en el que la cantidad de la composición es eficaz para inducir una respuesta inmunitaria en el individuo dirigida contra P. gingivalis.