MX2011001949A - Prevencion, tratamiento y diagnostico de infeccion por p. gingivalis. - Google Patents

Prevencion, tratamiento y diagnostico de infeccion por p. gingivalis.

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MX2011001949A
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Neil Martin O'brien Simpson
Nada Slakeski
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Abstract

La invención se relaciona con la generación y uso de las respuestas celular y humoral para la prevención y tratamiento de enfermedades y condiciones relacionadas con P. gingivalis.

Description

PREVENCION, TRATAMIENTO Y DIAGNOSTICO DE INFECCION POR P. GINGIVALIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con los péptidos y proteínas de fusión o quiméricas y el uso de éstas proteínas para obtener respuestas celular y humoral para la prevención y tratamiento de enfermedades y condiciones relacionadas con P. gingivalis .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La periodontitis crónica es una enfermedad inflamatoria de los tejidos que soportan los dientes que conduce a la reabsorción de tejido alveolar y a la eventual pérdida del diente. La enfermedad es un importante problema de salud pública en todas las sociedades y se estima que afecta hasta el 15% de la población adulta con formas severas que afectan el 5-6%.
El desarrollo y progresión de la periodontitis crónica ha estado asociado con bacterias Gram-negativas específicas presentes en la placa sub-gingival . La presencia de Porfiromonas gingivalis en la placa sub-gingival ha estado fuertemente asociada con la enfermedad.
La persistencia de P. gingivalis en la placa sub-gingival de los pacientes con periodontitis después del tratamiento (descamación y aplanamiento de la raíz) se ha reportado estar asociado significativamente con la pérdida progresiva de hueso alveolar. Además, un incremento en el número de células de P. gingivalis en la placa sub-gingival ha demostrado estar correlacionado con la severidad de la enfermedad determinada por la pérdida asociada, la profundidad de la cavidad periodontal y el sangrado durante el sondeo.
La infección oral con P. gingivalis ha mostrado que induce a la pérdida de hueso periodontal en ratones, ratas y en primates no humanos. Adicionalmente , se ha incrementado la relación de la enfermedad periodontal y la infección con P. gingivalis con enfermedades cardiovasculares y ciertos tipos de cáncer.
Se ha reportado un número de factores de virulencia que contribuyen a la patogenicidad de P. gingivalis tales como; LPS, fimbria, hemaglutinina, hemolisina, y enzimas hidrolíticas extracelulares (especialmente las proteinasas específicas Arg-X y Lis-X) también conocidas como "triptinasas de P. gingivalis".
La magnitud del problema de salud pública es tal que es necesario un antisuero, particularmente anticuerpos específicos que proporcionen una fuerte respuesta de protección contra la infección con P. gingivalis y los medios para administrarlos.
Ha sido un problema el que no está claro como obtener una fuerte respuesta de protección para la infección con P. gingivalis cuando hay gran variedad de factores de virulencia de donde seleccionar.
La inmunogenicidad relativa de los prototipos entre los factores de virulencia no está bien entendida, ni la inmunogenicidad relativa de tales prototipos en un factor dado, en particular cuando no está claro si los prototipos resultantes de una respuesta inmune quedan por ser identificados .
Ha sido un problema particular el que muchos factores de virulencia se forman de múltiples dominios y son difíciles de expresar así como presentar una conformación aprovechando la encontrada en P. gingivalis. Posteriormente, cuando estos dominios sean expresados como unidades discretas, por ejemplo, en el aislamiento de otros dominios de factores de virulencia, estos tenderán a replegarse en una conformación que se distingue de la hallada. en P. gingivalis.
Posteriormente, de las muchas opciones diferentes para modificar la inmunogenicidad de un factor de virulencia no está claro cuál podría ser el más común para proporcionar una respuesta inmune protectora.
En el trabajo que conduce a la presente invención, los inventores han identificado péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es igual o que comparte homología con una secuencia de aminoácidos que forma una región de la triptinasa de P. gingivalis, dicha región definida como un sitio en dicha enzima para el rompimiento de la unión del péptido localizada en el C-terminal para Lis o Arg en el péptido que contiene Lis o Arg e incorporada tal como un péptido en la proteína de fusión o quimérica la cual, cuando se use como vacuna, proporcione una mejor protección contra la destrucción del tejido periodontal, que el complejo adhesina-proteinasa formado a partir de la triptinasa de P. gingivalis ó de las células enteras muertas.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención propone una proteína de fusión o quimérica para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína, que incluye un primer péptido unido directamente ó a través de un enlace a un segundo péptido, se caracteriza porque: (A) el primer péptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No: 1; Ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 2; y (B) el segundo péptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína incluye un péptido unido directamente o a través de un enlace a un polipéptido, caracterizada porque: (A) el péptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID NÓ: 1; Ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en n SEQ ID No: 2; y (B) el polipéptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis, ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
En otro aspecto, la invención proporciona un péptido para inducir una respuesta inmune a P. gingivalis. El péptido tiene una secuencia: (i) que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No: 64 a 66; y (ii) que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No: 67 a 68.
En otro aspecto, el péptido tiene una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No: 64 a 68 y puede ser administrada en forma de una proteína de fusión o quimérica, en la cual, el péptido está unido directamente o a través de un enlace a un segundo péptido, caracterizada porque el segundo péptido incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
En otro aspecto posterior, la invención proporciona una composición, como una composición antigénica, particularmente una vacuna, que incluye una proteína quimérica o de fusión ó péptido como se describe arriba, opcionalmente en asociación con un adyuvante .
En este aspecto, la invención también proporciona un método para prevenir o reducir la incidencia ó severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que comprende la administración al sujeto de una proteína quimérica o de fusión o una composición como se describe arriba.
En este aspecto, la invención igualmente proporciona el uso de una proteína quimérica o de fusión o una composición como se describe arriba, o en la manufactura de un medicamento para prevenir o reducir la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal, creado a través de una proteina quimérica o de fusión como es ampliamente descrito arriba.
En este aspecto, ' la invención también proporciona un método para prevenir o. reducir la severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que comprende la administración al sujeto de un anticuerpo como se describe arriba.
En este aspecto, la invención proporciona de igual manera, el uso de un anticuerpo, como es descrito arriba, o en la manufactura de un medicamento para prevenir o reducir la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto.
En otro aspecto posterior, la invención también proporciona una molécula de ácido nucléico que incluye una secuencia nucleótida que contiene una proteína quimérica o de fusión como es ampliamente descrito arriba, opcionalmente enlazada operativamente por lo menos a un elemento regulador.
En este aspecto, la invención proporciona, de igual manera, un vector que incluye una molécula de ácido nucleico, así como también una célula procariotica o eucariótica que incluye una molécula de ácido nucleico.
En este aspecto, la invención también proporciona un método para prevenir o reducir la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que comprende la administración al sujeto de una molécula de ácido nucleico, un vector, o una célula eucariótica o procariotica como se describe arriba.
En este aspecto, la invención, de igual manera, proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector, o una célula procariotica o eucariótica como se descrito arriba, o en la manufactura de un medicamento para prevenir o reducir la severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para el diagnóstico o monitoreo de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis, método que comprende el uso de una proteína de fusión quimérica como es descrito arriba para detectar anticuerpos anti-P. gingivalis en una muestra biológica proveniente del sujeto mencionado.
En este aspecto, la invención proporciona el uso de una proteína de fusión o quimérica como es descrito arriba, para detectar anticuerpos anti-P. gingivalis en una muestra biológica proveniente del sujeto mencionado.
En otro aspecto posterior, la invención proporciona un método para el diagnóstico o monitoreo de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, dicho método comprende el uso de un anticuerpo, como se describe arriba, para detectar la presencia de P. gingivalis en una muestra biológica proveniente del sujeto mencionado.
En este aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo como es descrito arriba, para detectar la presencia de P. gingivalis en una muestra biológica proveniente de un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un péptido que tiene una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a una secuencia de una Lis-X-proteinasa ó Arg-X-proteinasa de P. gingivalis, o el péptido mencionado que contiene ácido nucleico para la manufactura de una proteína de fusión o quimérica para inducir una respuesta inmune a P. gingivalis. En este aspecto el péptido puede tener una secuencia como la mostrada en SEQ ID No. 17, 18, 25 ó 26.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una tinción con azul de Coomassie del gel SDS-PAGE de las proteínas recombinantes Kgp, Ruta 1=KAS2-KLA1, Ruta 2=KLA1, Ruta 3=KsAl, Ruta 4=KASl-KsAl. LOS marcadores de pesos moleculares están indicados como kDa.
La figura 2 muestra el reconocimiento del anticuerpo del péptido KAS2 y las células W50 de P. gingivalis destruidas con formalina. (A) el péptido KAS2 fue probado, mediante el método ELISA, con un antisuero incrementado para las células W50 (FK-W50) de P. gingivalis destruidas con formalina, las proteínas recombinantes KASl-KsAl, KAS2-KLA1 y el conjugado sintético de KAS2-DT y PBS . (B) las células W50 de P. gingivalis destruidas con formalina fueron probadas, mediante el método ELISA, con un antisuero incrementado para las células W50 (FK-W50) de P . gingivalis destruidas con formalina, las proteínas recombinantes KASl-KsAl, KAS2-KLA1 y KLA1 y PBS. Las respuestas de los anticuerpos están expresadas como el titulo ELISA OD4i5 obtenido menos el doble del nivel precedente, con cada título se representa el promedio + la desviación estándar de los tres valores.
La figura 3 muestra el horizonte de la pérdida de hueso inducida por P. gingivalis en los molares maxilares de ratón inmunizado con las proteínas recombinantes, proteínas quiméricas recombinantes, P. gingivalis destruido con formalina y adyuvante solo (PBS. IFA) o ratón no- infectado oralmente (no-retado)'. En ésta figura, KAS2-KLA1 son mostradas como AS2-LA1, KLA1 se muestra como LA1, KASl-KsAl se muestra como ASl-sAl y KsAl es mostrada como sAl . La medición de la pérdida de hueso es el promedio del área medida en milímetros elevada al cuadrado (mm2) obtenida de la interfase cemento-esmalte (ICE) de la cresta alveolar del hueso (CAH) del lado bucal de cada molar maxilar de ambos lados (izquierdo y derecho) . Los datos fueron procesados mediante una distribución normal de acuerdo con la medición de la homogeneidad de varianza de Levene y son presentados como el promedio (n=12) en mm2 y fueron analizados usando el análisis de varianza de Un-Sentido y la prueba de Dunnett T3. *, indica el grupo que tiene significativamente (P<0.001) más pérdida de hueso que el grupo de control (infectado). † , indica el grupo que tiene significativamente (P<0.001) más pérdida de hueso que el grupo AS2-LA1.
La figura 4 muestra la respuesta de una sub-clase de anticuerpos séricos de ratón inmunizado en el modelo de periodontitis . El suero del ratón; A (inoculación pre-oral) y B (inoculación post-oral) , inmunizado con proteínas recombinantes (KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1) y células de la cepa W50 de P. gingivalis destruidas con formalina fueron usadas en la prueba ELISA con las células de la cepa W50 de P. gingivalis destruidas con formalina como antígeno adsorbido. La respuesta de los anticuerpos IgG (barras negras) , IgGl (barras grises) , IgG2a (barras blancas) , IgG2b (barras con trazo horizontal) e IgG3 (barras con trazo diagonal) , están expresadas como el titulo ELISA (log2) obtenido menos el nivel precedente, con cada título que representa el promedio ± la desviación estándar de los tres valores .
La figura 5 muestra un análisis PEPSCA de la reactividad del anticuerpo péptido-específico para sobreponerse a los péptidos que representan la secuencia 433-468 del péptido KAS2. (A) Péptidos KAS2 sobreponiéndose (1 neutralizado, 7 sobrepuestos) probados con antisuero KAS1-KsAl (barras blancas) y KS2-KLA1 (barras negras) . (B) péptidos KS2 sobreponiéndose (neutralizado, 7 sobrepuestos) probados con antisuero conjugado KAS2-DT. Cada barra exhibe la reactividad del anticuerpo (densidad óptica [OD] a 415 nm) .
La figura 6 muestra que la quimera AS2-LA1 induce una respuesta de anticuerpos en un ratón sin cruza que reconoce las células completas de P. gingivalis y el complejo RgpA-Kgp. Los ratones sin cruza CD1 fueron inmunizados con la quimera AS2-LA1 (50 mg/ratón) y el suero recolectado se utilizó mediante ELISA' con; (A) AS2-LA1, (B) cepa W50 de P. gingivalis destruida con formalina y (C) complejo RgpA-Kgp como antígenos adsorbidos. En ésta figura, KAS2-KLA1 se muestra como AS2-LA1. Se determinó el titulo para cada isotipo de inmunoglobulina correspondiente a cada antígeno y los datos obtenidos son expresados como titulo ELISA (?000) menos el doble del nivel precedente, con cada título se representa el promedio ± la desviación estándar de los tres valores .
La figura 7 muestra el modelo protéico de la proteinasa Kgp, (A) KAS2 [Asn433-Lis468] , (B) KAS4 [Asp388-Val395] , (C) KAS5 [Asn510-Asp516] y (D) KAS6 [Ile570-Tir580] .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se entenderá que la invención descubierta y definida en esta especificación se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de las características individuales mencionadas o manifestadas en el texto o dibujos. Todas estas diferentes combinaciones constituyen varios aspectos alternativos de la invención.
Los inventores han encontrado que las regiones de las enzimas tipo tripsina de P. gingivalis que rodean o, de otro modo, definen un sitio catalítico o activo para el rompimiento de un . enlace peptídico son altamente inmunogénicos y de hecho, suficientes para proporcionar una respuesta humoral a una infección causada por P. gingivalis. Particularmente, se ha encontrado que una proteína de fusión o quimérica que incluye una o más de estas regiones genera protección contra la perdida de hueso alveolar, la cual, es mayor que la observada en los antisueros obtenidos contra células completas y otros inmunógenos . El hallazgo es particularmente sorprendente como para citarlo, se ha encontrado que el dominio catalítico de las enzimas tipo tripsina de P. gingivalis es inmunogénicamente débil.
En un aspecto, la presente invención proporciona una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína que incluye un primer péptido unido directamente ó mediante un enlace a un segundo péptido, es caracterizada porque: (A) el primer péptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2; y (B) el segundo péptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
Como es usado aquí, el término "péptido" se refiere a una secuencia de aminoácidos superior a 40 aminoácidos aproximadamente, de preferencia de 5 a 40 aminoácidos.
En un ejemplo típico, se usa un polipéptido en lugar de, o en otras palabras, a cambio de un "segundo péptido" . El término "polipéptido" se usa para referirse a una secuencia de aminoácidos de por lo menos 40 aminoácidos.
Así, en otro aspecto, se proporciona una proteína de fusión o quimérica para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína, que incluye un péptido unido directamente o mediante un enlace con un polipéptido, se caracteriza porque: (A) el péptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID Np. 2; y (B) el polipéptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; 6 (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
En otro aspecto, la invención proporciona un péptido para inducir la respuesta inmune para P. gingivalis seleccionado del grupo que consiste de: (i) una secuencia que es igual u homóloga a la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 64 al 66; y (ii) una secuencia que es igual u homóloga a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 67 ó 68.
En un aspecto de la invención, donde el péptido tiene una secuencia de SEQ ID No. 64 al 68, el péptido puede proporcionarse en forma de una proteína de fusión o quimérica en la cual el péptido está unido directamente o a través de un enlace a un segundo péptido. En un ejemplo típico, el segundo péptido de la proteína de fusión o quimérica incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
En el ejemplo típico descrito anteriormente, un polipéptido es usado en lugar de, o en otras palabras, a cambio del segundo péptido. Así, en otro aspecto, se proporciona una proteína de fusión o quimérica para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína que incluye un péptido unido directamente o a través de un enlace a un polipéptido, se caracteriza porque: (A) el péptido mencionado incluye: (i) una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 64 al 66; Ó (ii) una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 67 ó 68; y (B) el polipéptido mencionado incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
Como es usado aquí, la referencia a un "homólogo" de un péptido ó polipéptido es una referencia al péptido 6 polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte homología o que es homólogo, o que presenta una identidad con la secuencia de aminoácidos del primer péptido ó polipéptido mencionados de por lo menos 90% 2 O preferentemente, más preferible de por lo menos 95% y más preferible aún de por lo menos 98% de identificación cuando la comparación es llevada a cabo mediante un algoritmo BLAST el cual se caracteriza porque los parámetros del algoritmo son seleccionados para dar el mayor número de coincidencias entre las respectivas secuencias, de prueba y de referencia. La identidad de secuencias se refiere a las coincidencias exactas entre los aminoácidos de las dos secuencias las cuales están siendo comparadas. Tal homólogo puede derivarse de una variante ocurrente o puede ser aislado de la Lis-X-proteinasa ó Arg-X-proteinasa de P. gingivalis. Alternativamente, puede ser una "substitución-conservativa" variante, del péptido o polipéptido de la Lis-X-proteinasa ó Arg-X-proteinasa de P. gingivalis en la cual uno o más de los aminoácidos ha sidó cambiado sin alterar por completo la conformación y función del péptido o polipéptido, incluyendo, mas no limitando, el reemplazo de un aminoácido con uno que tiene propiedades similares. Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en el medio. Por ejemplo, los aminoácidos polares/hidrofílieos los cuales pueden ser intercambiables incluyen la asparagina, glutamina, serina, cisteína, treonina, lisina, arginina, histidina, ácidos aspártico y glutámico; los aminoácidos no-polares/hidrofóbicos los cuales pueden ser intercambiables incluyen la glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos acídicos los cuales pueden ser intercambiables incluyen los ácidos aspártico y glutámico y los aminoácidos básicos que pueden ser intercambiables incluyen la histidina, lisina y arginina. Preferentemente, tales variantes de substitución-conservativa tienen menos de 20, de preferencia menos de 15, más preferentemente menos de 10 y más preferentemente aún menos de 5 cambios de aminoácidos.
Una región de la enzima tipo tripsina de P. gingivalis, especialmente una Lis-X-proteinasa (Kgp) ó Arg-X-proteinasa (RgpA) , que define un sitio en una enzima para el rompimiento del enlace de un péptido, puede determinarse siguiendo lo que se enseña en ésta especificación, particularmente en relación con la Figura 7 y el Ejemplo 9, los cuales ejemplifican el proceso para predecir la conformación tridimensional del sitio catalítico como aparece en P. gingivalis para Lis-X-proteinasa. El ejemplo 10 proporciona la metodología para el modelaje de la ¦ conformación tridimensional de Arg-X-proteinasa.
En ciertos ejemplos típicos, puede formarse una proteína de fusión o quimérica, o el primero o segundo componente peptídico, a partir de un peptidomimético. Un peptidomimético es una molécula que mimetiza una o más características de un péptido dado, por ejemplo la conformación, y que consiste en unidades de aminoácidos, algunos de los cuales no se presentan de forma natural. Habiendo identificado las regiones inmunogénicas del sitio catalítico, los inventores han determinado la secuencia de varios inmunógenos peptídicos contra los cuales puede obtenerse una respuesta humoral. En particular seis regiones que rodean o, de otra forma, definen el sitio catalítico han sido definidos como sigue: KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 y KAS6 (ver tabla 1) . Con ésta información, los inventores han sido capaces de interrogar las bases de datos de secuencias de proteínas para determinar los péptidos que comparten homología con secuencias de aminoácidos que forman regiones que rodean un sitio catalítico y por lo tanto representan el prototipo inmunogénico hallado en P. gingivalis. Las secuencias de estos péptidos son identificadas mediante la siguiente fórmula estructural.
Tabla 1. Sec u e nci as q ue flanq uea n el s itio activo d e Kg p y Rg pA Los inventores han encontrado que las proteínas quiméricas incluyendo estos péptidos tienen un número de utilidades. Por ejemplo, como se describió aquí, algunos producen una respuesta humoral que es altamente protectora para el tratamiento o prevención de la pérdida de hueso observada en la periodontitis crónica. Los péptidos también pueden ser usados en un ensayo de diagnóstico caracterizado porque ellos pueden detectar o monitorear especificidades en el suero de un individuo, indicando, por ello, si un individuo está o no infectado y si, por lo tanto, requiere tratamiento o si, éste es proporcionado, ha sido efectivo.
Se entenderá que la región de una enzima tipo tripsina de P. gingivalis qúe define un sitio en ésta para el rompimiento de un enlace peptídico localizado en el C-terminal para Lis ó Arg, no comprende una secuencia completa de la Lis-X-proteinasa o la Arg-X-proteinasa .
Como es usado aquí, los términos "proteína heteróloga" o "proteína de fusión o quimérica" son usados para referirse a una proteína que está compuesta de unidades funcionales, dominios, secuencias o regiones de aminoácidos derivados de diferentes fuentes ó que son derivados de la misma fuente y que han sido ensamblados como para tener una organización que se distingue de aquella observada en una molécula de la cual la unidad, secuencia o región se deriva o se relaciona. Una característica común de las proteínas de fusión o quiméricas de la invención es que éstas contienen por lo menos un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma o que comparte homología con la secuencia de una enzima tipo tripsina de P. gingivalis que define un sitio catalítico para el rompimiento de un enlace peptídico.
En un ejemplo típ'ico preferido, donde el primer péptido comprende un péptido proveniente de la región Kg [432-468] , es preferible (i) un péptido el cual consiste en una secuencia seleccionada de VSFANYT y VGFANYT, más preferible una secuencia seleccionada de GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA y VGFANYTA; o (ii) un péptido el cual consiste en una secuencia seleccionada de ETAWAD, ETS AD, TA ADP y TSWADP, de preferencia una secuencia seleccionada de SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL y TSWADPL, más preferible una secuencia seleccionada de GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP , SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL Y TSWADPLL. Más preferible, éste péptido es seleccionado de los péptidos KAS1 [432-454] , KAS2 [433 -468] y KAS3 [436-455] mostrados en la Tabla 1. Alternativamente, el primer péptido puede ser el péptido PAS1K [432-453] también conocido como PAS1(K48) manifestado en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/AU98/00311 (WO 98/049192) . Los identificadores de secuencia correspondientes a estos péptidos son mostrados en la Tabla 3.
De manera similar, en otro ejemplo típico preferido, donde el primer péptido consiste en un péptido proveniente de la región RgpA [426-462] , éste péptido es seleccionado preferentemente de los ' péptidos RAS1 [426-448] , RAS2 [427-462] y RAS3 [430-449] mostrados en la Tabla 1. Alternativamente, el primer péptido puede ser el péptido PAS1R [426-446] también conocido como PAS1(R45), manifestado en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/AU98/00311 (WO 98/049192) .
En la proteína de fusión o quimérica de la invención, el segundo péptido puede ser un péptido proveniente de un dominio de adhesina de una enzima tipo tripsina de P. gingivalis tal como Lis-X-proteinasa (Kgp) ó Arg-X-proteinasa (RgpA) ó HagA (ver Tabla 2) . Estos dominios también son conocidos algunas veces como hemaglutininas . Enla Lis-X-proteinasa, los dominios preferidos son KA1, KA2 , KA3 , KA4 , KA5 identificados así en la Tabla 2. En la Arg-X-proteinasa, los dominios preferidos son RAI, RA2, RA3 y RA4 identificados así en la Tabla 2. En HagA, los dominios preferidos son HagAl, HagAl* y HagAl**.
Tabla 2. Dominios de adhesina de las proteinasas Kgp y RgpA Adicionalraente, para el mejoramiento de la respuesta humoral para un péptido de la invención tal como KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 y KAS6 ó RAS1, RAS2 y RAS3 , RAS4 y RAS5 cuando es incluido como tal en una proteína de fusión o quimérica, el dominio de adhesina también contiene prototipos inmunogénicos , conduciendo así a la producción de múltiples especificidades para obtener una respuesta inmunogénica protectora. El hallazgo de que los prototipos inmunogénicos del dominio de adhesina son retenidos en forma de aproximación en una enzima tipo tripsina de P. gingivalis cuando es suministrada en la proteína de fusión o quimérica de la invención no es anticipado.
Se entenderá que en estas incorporaciones de la invención, la proteína de fusión o quimérica puede contener uno o más de los péptidos seleccionados de KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 y KAS6/RAS6 junto con uno o más dominios de adhesina de una enzima tipo tripsina de P. gingivalis , en particular con uno o más de los dominios de adhesina de Lis-X-proteinasa (KA1, KA2 , KA3 , KA4 , y KA5) ó dominios de adhesina de Arg-X-proteinasa (RAI, RA2, RA3 y RA4) ó dominios de HagA como HagAl, HagAl* y HagAl**.
También se entenderá que no es necesario para los dominios de adhesina ser un dominio completo como se observó en una enzima tipo tripsina de P. gingivalis. Por ejemplo, el dominio de adhesina puede ser un fragmento de tal dominio, en particular, los fragmentos de dominio preferidos son KsAl y KLA1 del dominio Al de la Lis-X-proteinasa (ver Tabla 2) . Donde el dominio es un fragmento de un dominio de adhesina generalmente contiene uno o más prototipos específicos del dominio de adhesina.
Los identificadores de secuencia correspondientes a los péptidos de adhesina relacionados se muestran en la Tabla 3.
En un ejemplo típico, el segundo péptido o polipéptido incluye una secuencia mostrada en una o más de las secuencias SEQ ID No. 69 a 79. ó una o más de la 83 a 85.
La proteína de fusión o quimérica de la presente invención también puede incluir uno o más de los péptidos seleccionados de la región Kgp [432-468] de la Lis-X-proteinasa y/o uno o más péptidos adicionales seleccionados de la región RgpA [426-462] de la Arg-X-proteinasa .
En ejemplos típicos preferidos de la presente invención, la proteína de fusión o quimérica incluye uno o más de KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 Y KAS6 ó uno o más de RAS1, RAS2 , RAS3 , RAS4 Y RAS5 , junto con KsAl o KLA1.
Así, en ciertas incorporaciones, la proteína de fusión o quimérica puede incluir por lo menos un péptido posterior caracterizado porque éste incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 1; ó (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2; Ó (iii) una parte o el total de una secuencia que es 3 O igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (iv) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; 6 (v) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de una HagA de P. gingivalis.
Otros ejemplos de dominios, unidades, secuencias o regiones que pueden ser incluidos en una proteína de fusión o quimérica como los descritos aquí incluyen dominios para la unión a receptores o ligandos tales como las regiones de unión Fe ó receptores Fe, los dominios para el mejoramiento de la vida media tales como la albúmina ó dominios para facilitar la expresión ó purificación de la proteína de fusión o quimérica.
En las proteínas de fusión o quiméricas de la presente invención, el residuo C-terminal del primer péptido puede estar enlazado covalentemente al residuo N-terminal de un polipép ido de dominio de adhesina o el residuo N-terminal del primer péptido puede estar enlazado covalentemente al residuo C-terminal del polipéptido de un dominio de adhesina.
En este arreglo, el primer péptido y el polipéptido del dominio de adhesina se dice que están enlazados directamente o que son adyacentes .
En otros ejemplos típicos, la proteína de fusión o quimérica incluye un enlazante para unir el primer péptido a un polipéptido del dominio de adhesina. El enlazante puede ser cualquiera capaz de unir un péptido a un polipéptido, incluyendo ambos tipos de enlazantes, aminoácidos y no-aminoácidos .
De preferencia, el enlazante es no- inmunogénico . Los enlazantes adecuados pueden tener hasta 15 aminoácidos de longitud aunque se prefiere que tengan menos de cinco aminoácidos. El enlazante puede funcionar provocando el arreglo, en un espacio más corto, del primer péptido y el polipéptido del dominio de adhesina, del que se observa normalmente en una enzima tipo tripsina de P. gingivalis. Alternativamente, puede apartar espacialmente el primer péptido y el polipéptido del dominio de adhesina.
Las proteínas de fusión o quiméricas de la invención pueden ser producidas mediante sistemas de expresión recombinante (tales como la tecnología de DNA recombinante) o por síntesis química (tal como la síntesis de péptidos en fase sólida) . Estas técnicas son bien conocidas en el medio.
El heterólogo o proteína quimérica es particularmente ventajoso debido a que mejora la respuesta humoral obtenida en comparación con la obtenida al usar el primero o segundo péptido componentes de la proteína de fusión o quimérica simple .
Los inventores han encontrado que las proteínas quiméricas que incluyen éstos péptidos tienen un número de aplicaciones. Por ejemplo, como se describió aquí, algunas producen una respuesta humoral que es altamente protectora para el tratamiento o prevención de la pérdida de hueso observada en la periodontitis crónica. Los péptidos pueden ser usados en un ensayo diagnóstico que se caracteriza porque éstos pueden detectar o monitorear especificidades en el suero de un individuo y de ésta manera indicar si el individuo está infectado y por lo tanto requiere tratamiento o si el tratamiento indicado ha sido efectivo.
En un ejemplo típico, la proteína de fusión o quimérica induce una respuesta inmune protectora, de manera típica una respuesta que por lo menos minimice o limite el daño al tejido conectivo asociado con la infección por P. gingivalis. En un ejemplo típico, la respuesta protectora por lo menos minimiza o limita la pérdida de hueso inducida por P. gingivalis. Aquí se discute un sistema modelo para la medición de la pérdida de hueso mediada por la infección con P. gingivalis. Típicamente la respuesta inmune protectora es predominantemente una respuesta humoral. En ciertos casos la respuesta inmune protectora también incluye una respuesta celular .
La presente . invención también proporciona una composición que incluye una proteína de fusión o quimérica como se describió ampliamente con anterioridad. Típicamente la composición es antigénica o inmunogénica . Más particularmente, la invención proporciona una composición adecuada para la obtención de una respuesta inmune protectora ó terapéutica contra la infección por P. gingivalis que incluye la proteína de fusión o quimérica opcionalmente en asociación con un adyuvante. Tal composición también puede incluir otro componente para la modulación o potenciación de la respuesta inmune. En un ejemplo típico, la composición toma la forma de una vacuna.
Se conocen varios adyuvantes para ser usados en composiciones de vacuna. Los adyuvantes ayudan a modular la respuesta inmune y a conseguir un nivel de inmunidad más alto y estable usando cantidades más pequeñas de antígeno en la vacuna ó menos dosis de las que se usarían si el antígeno de la vacuna se administrara sólo. Como ejemplo de adyuvantes se incluyen el adyuvante de Freund incompleto (AFI) , Adyuvante 65 (que contiene aceite de maní, mono-oleato de mañosa y monoestearato de aluminio), emulsiones oleosas, adyuvante de Ribi , adyuvantes plurónicos, poliaminas, Avridina, Quil A, saponina, MPL, QS-21, geles minerales tales como las sales de aluminio y calcio, nanopartículas tales como la hidroxiapatita, fosfato de calcio, sales de aluminio, oligómeros de azúcares y polímeros tales como la mañosa y quitosan. Otros ejemplos incluyen emulsiones de aceite en agua, tales como SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720 y otros adyuvantes particulados tales como lSCOMsMR e ISCOM matrixMR. En el trabajo de Cox y Coulter de 1992 [En: Wong WK (ed.), Control de parásitos en animales utilizando la tecnología, Bocea Ratón; CRC press, 1992; 49-112] aparece una extensa lista no-exhaustiva de' otros ejemplos de adyuvantes. Además del adyuvante, la vacuna puede incluir acarreadores convencionales farmacéuticamente aceptables, excipientes, rellenos, amortiguadores o diluyentes según sea apropiado. Se puede administrar una o más dosis de la vacuna de manera profiláctica para prevenir la periodontitis ó terapéuticamente para tratar la periodontitis que ya está presente .
En una composición preferida, la proteína de fusión o quimérica se combina ' con un adyuvante mucoidal y se administra por vía oral, bucal o ruta nasal. Como ejemplos de adyuvantes mucoidales están las nanopartículas, toxina de cólera y toxina de E. coli termolábil, las sub-unidades no- tóxicas de éstas toxinas, mutantes genéticos de éstas toxinas los cuales han reducido su toxicidad. Otros métodos que pueden ser utilizados para la liberación controlada de proteína antigénica de manera oral/bucal/nasal incluyen la incorporación de partículas de polímero biodegradable (como los acrilatos ó poliésteres) ó nanopartículas (como la hidroxiapatita) mediante la micro-encapsulación para ayudar a conducir las micro-esferas a través del tracto gastrointestinal u otras superficies mucosas y a proteger de la degradación a las proteínas. Los liposomas, ISCOMsMR e hidrogeles son ejemplos de otros métodos potenciales cuyo uso puede ser posteriormente intensificado mediante la incorporación de moléculas conductoras tales como LTB, CTB ó lectinas para la liberación de la proteína antigénica en el sistema inmune mucoidal. Además de la proteína antigénica y el adyuvante mucoidal ó sistema de liberación, la vacuna puede incluir acarreadores convencionales farmacéuticamente aceptables, excipientes, rellenos, recubrimientos, medios de dispersión, agentes anti-bacterianos o anti-fúngicos y soluciones amortiguadoras o diluyentes según sea apropiado.
En éste aspecto, la invención también proporciona un método de prevención o reducción de la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que consiste en la administración de una proteína de fusión o quimérica como se describió con anterioridad o una vacuna como se describió arriba .
El sujeto puede ser un humano u otro animal, es preferible un humano.
Típicamente, la enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis es la periodontitis crónica, sin embargo, también puede ser la pérdida de hueso, especialmente la pérdida de hueso alveolar ó una enfermedad de la arteria coronaria .
Se conocen muchos métodos para la administración de vacunas a sujetos humanos ó animales, éstos incluyen pero no se limitan a la administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, intranasal, sublingual, bucal y oral. Estas rutas de administración son particularmente útiles para la vacunación.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo, de preferencia un anticuerpo monoclonal, incrementado contra una proteína de fusión o quimérica como se describió ampliamente con anterioridad.
Estos anticuerpos pueden obtenerse mediante técnicas estándar y pueden ser usados en la inmunización pasiva de un sujeto. En concordancia, en éste aspecto, la invención también proporciona un método para prevenir o reducir la severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis, dicho método consiste en la administración a un sujeto de un anticuerpo como se describió anteriormente.
En un aspecto posterior, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifican una proteína de fusión o quimérica como se ha descrito ampliamente con anterioridad, opcionalmente enlazada operativamente, con por lo menos un elemento regulador. En un ejemplo típico, el ácido nucleico se proporciona en forma aislada o substancialmente purificada.
La molécula de ácido nucleico puede, por ejemplo, ser insertada en un vector de expresión adecuado para la producción de proteína quimérica como una proteína recombinante mediante la inserción del vector de expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica. La expresión exitosa de la proteína recombinante requiere que el vector de expresión contenga los elementos reguladores necesarios, para la transcripción y translación, los cuales sean compatibles y reconocidos por el sistema particular de células huésped usado para la expresión. Puede usarse una variedad de sistemas de células huésped para expresar la proteína recombinante, entre los cuales se incluye, más no se limita a,- bacterias transformadas con un bacteriófago vector, hongos que contienen vectores fúngicos, líneas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) y líneas celulares de mamíferos transfectadas con plásmidos o vectores de expresión virales o infectadas con virus recombinantes (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, adenovirus asociados, retrovirus, etc..) .
Usando métodos conocidos en el campo de la biología molecular, pueden incorporarse al vector de expresión varios promotores e intensificadores para incrementar la expresión de la proteína recombinante , procurando que la expresión incrementada de las secuencias de aminoácidos sea compatible (por ejemplo, no-tóxico) con el sistema particular de células huésped utilizado.
La selección del promotor dependerá del sistema de expresión usado. Los promotores varían en fuerza (por ejemplo, habilidad para^ facilitar la transcripción) . Generalmente, ' es deseable usar un promotor potente con la finalidad de obtener un alto nivel de transcripción de la secuencia de nucleótidos codificada y su expresión como proteína recombinante. Por ejemplo, se conoce en el medio que los promotores bacterianos, fagos ó plásmidos en los cuales se ha observado un alto nivel de transcripción en un sistema de células huésped incluyendo E. coli, incluyen el promotor lac, promotor trp, promotor recA, promotor R A ribosomal, los promotores PR y PL, lac UV5, ompF, bla, lpp y similares pueden ser usados para facilitar la transcripción de la secuencia de nucleótidos insertada que codifica las secuencias de aminoácidos .
Otros elementos de control que hacen más eficiente la transcripción ó translación incluyen intensificadores y marcadores reguladores. Las secuencias intensificadoras son elementos del DNA que parecen incrementar la eficiencia transcripcional de manera relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a una secuencia codificadora cercana. Así, dependiendo del sistema vector de expresión de células huésped empleado, puede ser colocado un intensificador ya sea al principio ó al final de las secuencias codificadoras insertadas para incrementar la eficiencia transcripcional. Otros sitios reguladores tales como los marcadores de iniciación de transcripción o translación pueden usarse para regular la expresión de la secuencia codificadora.
En otro ejemplo típico, el vector puede ser una vacuna bacteriana o viral utilizado para obtener una vacuna viral recombinante , una vacuna bacteriana recombinante, una vacuna bacteriana atenuada recombinante o una vacuna viral atenuada recombinante. Los virus vaccinia o virus de la vacuna, son el ejemplo mejor conocido en el medio, se trata de un virus infeccioso que es manipulado mediante ingeniería genética para la expresión de antígenos de la vacuna derivados de otros organismos. El virus de la vacuna recombinante vivo el cual es atenuado ó, en otras palabras, tratado de manera que no cause enfermedad por si mismo, es usado para inmunizar al huésped. La replicación subsecuente del virus recombinante dentro del huésped, provoca una estimulación continua del sistema inmune con los antígenos de la vacuna proporcionando así una inmunidad de larga duración.
Otros vectores de vacuna viva incluyen: adenovirus, citomegalovirus y de preferencia los poxvirus tales como el virus de la vacuna [Paoletti y Panicali, Patente de los Estados Unidos No. 4,603,112] y cepas de Salmonella atenuadas [Stocker y colaboradores,. Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,210,035: 4, 837, 151. y 4,735,801; y Curtiss y colaboradores, 1988, Vacuna .6:155-160]. Las vacunas vivas son particularmente ventajosas debido a que estimulan constantemente al sistema inmune el cual puede conferir substancialmente una inmunidad de larga duración. Cuando la respuesta inmune es protectora contra una subsecuente infección con P. gingivalis, la vacuna viva puede, por si misma, ser usada como una vacuna preventiva contra P. gingivalis. En particular, la vacuna viva puede basarse en una bacteria que sea un habitante comensal de la cavidad oral. Esta bacteria puede ser transformada con un vector que acarreé una proteína quimérica recombinante y entonces ser usada para colonizar la cavidad oral, en particular, la mucosa oral. Una vez colonizada la mucosa oral, la expresión de la proteína recombinante estimulará al tejido linfoide asociado para producir anticuerpos neutralizantes. Para ilustrar más adelante éste ejemplo, usando técnicas de biología molecular bien conocidas en el medio, las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína quimérica de ésta invención, pueden insertarse en el DNA genómico del virus de la vacuna en el sitio que permita la expresión de prototipos pero que no afecte negativamente el crecimiento ó replicación del virus de la vacuna usado como vector. El virus recombinante resultante puede usarse como inmunógeno en la formulación de una vacuna. Los mismos métodos pueden usarse para construir una vacuna viral recombinante inactivada con la excepción de que el virus recombinante es inactivado por medios químicos conocidos en el medio antes de ser usado como inmunógeno y sin afectar substancialmente la inmunogenicidad del inmunógeno expresado. La vacuna recombinante inactivada puede formularse con un adyuvante adecuado con el propósito de intensificar la respuesta inmunológica para los antígenos de la vacuna .
La invención también propone el uso de una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión o quimérica directamente como vacuna. Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas quiméricas, operativamente enlazadas a uno ó más elementos reguladores, pueden ser inducidas directamente para vacunar a un individuo ("transferencia directa de genes") contra cepas patológicas de P. gingivalis. La transferencia directa de genes en un individuo vacunado, resulta en la expresión del material genético por las células del individuo vacunado tales como las células endoteliales vasculares así como también del tejido de órganos mayores, se ha demostrado mediante técnicas en éste campo tales como la inyección intravenosa de un liposoma, la expresión de un complejo plásmido-catiónico [Zhu y colaboradores, 1993, Science 261:209-211] . También se conocen en el medio otros métodos efectivos para la liberación de DNA vector en una célula objetivo. En un ejemplo, un plásmido purificado de DNA recombinante que contiene genes virales ha sido usado para inocular (ya sea parenteralmente , mediante una mucosa ó por la vía de inmunización genegun) vacunas para inducir una respuesta inmune protectora [Fynan y colaboradores, 1993, Proc Nat Acad Sci USA 90:11478-11482]. En otro ejemplo, las células removidas de un individuo pueden ser transferidas ó electro-permeabilizadas mediante procedimientos estándar conocidos en el medio dando como resultado la introducción del vector de DNA recombinante en una célula objetivo. Las células que contienen el vector de DNA recombinante pueden entonces seleccionarse mediante métodos conocidos en el medio tales como el uso de un marcador de selección expresado en el vector, las células seleccionadas pueden ser entonces re-introducidas en el individuo para expresar la proteína recombinante .
En éste aspecto, la invención propone más adelante, un método de prevención o reducción de la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis, la cual, consiste en la administración al sujeto de una molécula de ácido nucleico, un vector ó una célula procariótica o eucariótica, como fue descrito con anterioridad .
En otros ejemplos típicos, se propone una composición farmacéutica que incluye una proteína de fusión o quimérica o un anticuerpo como se describió anteriormente. La composición puede, más adelante, incluir un diluyente, un excipiente o un agente acarreador o quimioterapéutico para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis y puede adaptarse para administración oral. Las composiciones de ésta invención pueden ser incorporadas en caramelos, gomas de mascar u otros productos, por ejemplo, mezclando con agitación con una base de goma tibia o recubriendo la superficie externa de una base de goma, son ejemplos ilustrativos de ésta el jelulong, hule látex, resinas de vinilite, etc., deseablemente con plastificantes o suavizantes convencionales, azúcar u otros endulzantes tales como la glucosa, sorbitol y similares.
Una composición oral de ésta invención la cual contiene la composición farmacéutica arriba mencionada, puede prepararse y usarse en varias formas aplicables para la boca tales como dentífricos que incluyen pastas de dientes, polvos de dientes y dentífricos líquidos, enjuagues bucales, tabletas medicadas, gomas de mascar, pastas dentales, cremas para masaje gingival, tabletas para gárgaras, productos lácteos y otros alimentos. Una composición oral, en concordancia con ésta invención, puede incluir posteriormente de forma adicional ingredientes bien conocidos dependiendo del tipo y forma de una composición oral particular.
En ciertas formas preferidas de la invención, la composición oral puede ser substancialmente de carácter líquido como las soluciones para lavado y enjuague bucal, en tales preparaciones el vehículo es típicamente una mezcla de agua-alcohol que incluye, deseablemente, un humectante como el descrito a continuación. Generalmente, la proporción en peso del agua y alcohol está en el rango aproximado de 1:1 a 20:1. La cantidad total de mezcla de agua-alcohol en +este tipo de preparación está típicamente en el rango aproximado de 70 a 99.9% por peso de la preparación. El alcohol es típicamente etanol ó isopropanol. Es preferible el etanol.
El pH de tal líquido y otras preparaciones de la invención generalmente está en el rango aproximado de 5 a 9 y típicamente de 5.0 a 7.0. El pH puede controlarse con ácido (por ejemplo, ácido cítrico o ácido benzoico) ó base (por ejemplo, hidróxido de sodio) ó amortiguado (con citrato de sodio, benzoato, carbonato o bicarbonato, fosfato disódico de hidrógeno, fosfato dihidrogenado de sodio, etc.).
En otras formas deseables de ésta invención, la composición farmacéutica puede ser substancialmente de carácter sólido ó pasta como polvo para dientes, tableta dental o una pasta de dientes (crema dental) o gel dentífrico. En vehículo de tales preparaciones orales sólidas o en pasta generalmente contienen material de pulido dentalmente aceptables.
En una pasta de dientes, el vehículo puede contener agua y humectante típicamente en una cantidad que oscila entre el 10 a 80% por peso de la preparación. La glicerina, propilen glicol, sorbitol y polipropilen glicol ejemplifican a los acarreadores/humectantes adecuados. También son ventajosas las mezclas líquidas de agua, glicerina y sorbitol. En geles claros donde el índice de refracción es una consideración importante, se emplean de preferencia a concentraciones aproximadas de 2.5 a 30% p/p de agua, 0 a 70% p/p de glicerina y 20 a 80% p/p de sorbitol.
La pasta dental, cremas y geles contienen típicamente un agente espesante o gelificante natural o artificial en proporciones aproximadas de 0.1 a 10, preferentemente de 0.5 a 5% p/p. Un espesante adecuado es la hectorita sintética, una arcilla sintética compleja de silicato de magnesio coloidal disponible, por ejemplo, como Laponita (por ejemplo, CP, SP 2002, D) comercializada por Laporte Industries Ltd.. La Laponita D consta de 58.00% de Si02, 25.40% de MgO, 3.05% de Na20, 0.98% de Li20 y algo de agua y trazas de metales. Su verdadera gravedad específica es 2.53 y tiene una densidad aparente de 1.0 g/ml a una humedad de 8%.
Otros espesantes 1 adecuados incluyen musgo irlandés, carragenina iota, goma de tragacanto, almidón, polovinilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulosa, hydroxibutil metil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxietil celulosa (disponible como Natrosol) , carboximetil celulosa sódica y sílice coloidal tal como la tierra fina Syloid (por ejemplo, 244). También pueden incluirse agentes solubilizantes como los polioles humectantes tales como propilen glicol, dipfopilen glicol y hexilen glicol; ésteres de celulosa tales como el CellosolveMR, metil cellosolve , y etil cellosolve; aceites vegetales i ceras que contienen por lo menos 12 carbones en una cadena recta tales como el aceite de olivo, aceite de castor y petrolato y ésteres tales como el acetato de amilo, acetato de etilo y benzoato de bencilo.
Se entenderá que, como es convencional, las preparaciones orales serán vendidas ó, en otras palabras, distribuidas en empaques etiquetados adecuados. Así, una botella de enjuague bucal tendrá una etiqueta que lo describe, en substancia, como un enjuague o lavado bucal así como las direcciones para su uso; una pasta dental, crema o gel usualmente estarán en un tubo colapsable típicamente de aluminio, plomo laminado ó plástico u otro dispensador comprimible, de bomba ó presurizado que mide el contenido dispensado, que tiene una etiqueta describiéndolo, en substancia, como una pasta de dientes, gel o crema dental.
Pueden usarse agentes tensioactivos de superficie orgánicos en las composiciones de la presente invención para obtener una acción profiláctica aumentada y colaborar en la obtención de una profunda y completa dispersión del agente activo por toda la cavidad bucal y hacer las composiciones cosméticamente más aceptables. El material tensioactivo de superficie orgánico es, de preferencia, de naturaleza aniónico, no-iónico o anfolítico y preferentemente no interactúa con él agente activo. Se prefiere usar como agente tensioactivo de superficie material detergente el cual imparte a la composición propiedades detergentes y espumantes. Como ejemplos adecuados de surfactantes aniónicos están las sales hidrosolubles de la mayoría de monosulfatos monoglicéricos de ácidos grasos tales como la sal sódica del monoglicerido monosulfatado de ácidos grasos de aceite de coco hidrogenado, la mayoría de alquil sulfatos tales como el lauril sulfato de sodio, alquil aril sulfonatos tales como el dodecil vencen sulfonato de sodio, la mayoría de alquil sulfo-acetatos , la mayoría de los ésteres de ácidos grasos del 1, 2-dihidroxi propano sulfonato y, substancialmente saturadas, la mayoría de las acil amidas de pocos compuestos aminocarboxílicos ácidos alifáticos tales como aquellos que tienen de 12 a 16 carbones en el ácido graso, radicales alquilo y acilo y similares. Como ejemplos de las últimas amidas mencionadas están N-lauroil sarcosina y las sales sódicas, potásicas y etanolamínicas del N-lauroil, N-miristoil ó N-palmitoil sarcosina el cual debe estar substancialmente libre de jabón o de la mayoría del material ácido graso. Como ejemplo de surfactantes hidrosolubles no-iónicos adecuados para su uso están los productos de condensación del óxido de etileno con varios compuestos que contienen hidrógeno reactivo y largas cadenas hidrofóbicas (por ejemplo cadenas alifáticas de 12 a 20 átomos de carbón) , cuyos productos de condensación (etoxámeros) contienen grupos funcionales de polioxietileno hidrofílicos tales como los productos de condensación del polióxido de etileno con ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, alcoholes polihídricos (por ejemplo, monoestearato de sorbitán) y óxido de polipropileno (por ejemplo, materiales Plurónicos) .
El agente tensioactivo de superficie está presente típicamente en cantidades aproximadas de 0.1 a 5% por peso. Es de notar que el agente tensioactivo de superficie puede contribuir en la disolución del agente activo de la invención y disminuir así la cantidad de humectante solubilizador necesaria .
Varios materiales más pueden ser incorporados en las preparaciones orales de ésta invención tales como agentes blanqueadores, conservadores, silicones, compuestos de clorofila y/o material amoniacal como la urea, difosfato de amonio y mezclas de éstos. Estos adyuvantes, cuando están presentes, se incorporan en las preparaciones en cantidades que no afecten adversamente las propiedades y características deseadas.
También puede emplearse cualquier material saborizante y endulzante adecuado. Como ejemplo de constituyentes saborizantes adecuados están los aceites saborizantes , por ejemplo, el aceite esencial de menta verde, yerbabuena. 5 O gaulteria, sasafrás, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limón, naranja y salicilato de metilo. Los agentes endulzantes adecuados incluyen sucrosa, lactosa, maltosa, sorbitol, xilitol, ciclamato de sodio, perilartina, MAF (metil éster de aspartil fenil-alanina) , sacarina y los más comunes. Adecuadamente, los agentes saborizantes y endulzantes pueden comprender, juntos o cada uno, de aproximadamente 0.1 a 5% más de la preparación.
Las preparaciones destinadas para uso oral pueden prepararse en concordancia con cualquier método conocido en el medio para la manufactura de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en; endulzantes, saborizantes, colorantes y conservadores con el propósito de proporcionar preparaciones farmacéuticas de buen aspecto y apetecibles. Las tabletas contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes no-tóxicos farmacéuticamente aceptables los cuales son adecuados para la manufactura de tabletas. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes para granulación y desintegración, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido algínico; agentes de cohesión, por ejemplo, almidón, gelatina o acacia y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden ser sin recubrimiento o pueden ser recubiertas mediante técnicas conocidas para retardar su desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal ó en el saco periodontal y por lo tanto, proporcionar una acción sostenida por un periodo largo. Por ejemplo, puede emplearse gliceril monoestearato o gliceril diestearato como material retardante.
Las formulaciones para uso oral también pueden ser presentadas como; cápsulas de gelatina dura, caracterizadas porque el ingrediente activo está mezclado con un diluyente inerte sólido, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín ó como cápsulas de gelatina blanda caracterizadas porque el ingrediente activo está mezclado con agua o con un medio oleoso, por ejemplo, aceite de maní, parafina líquida o aceite de olivo.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la manufactura de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes para suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropil metilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser fosfátidos naturales, por ejemplo la lecitina o los productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo, el estearato de polioxietileno o los productos de condensación del óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo, el heptadecaetilenooxicetanol o los productos de condensación del óxido de etileno con esteres parciales derivados de los ácidos grasos y un hexitol tales como el monooleato de polioxietilen sorbitol o los productos de condensación del óxido de etileno con ésteres parciales derivados de los ácidos grasos y anhídridos de hexitol por ejemplo, el monooleato de polietilen sorbitol.
Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores o agentes antimicrobianos, por ejemplo los benzoatos tales como el etil o n-propil p-hidroxibenzoato, otro ejemplo es el gluconato de clorhexidina; uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes y uno o más agentes endulzantes tales como la sacarosa ó sacarina.
Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo; aceite de maní, aceite de olivo, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como la parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo la cera de abejas, parafina sólida o alcohol cetílico. Los agentes endulzantes tales como los listados arriba y los saborizantes, pueden adicionarse para obtener preparaciones orales apetecibles. Estas composiciones pueden ser preservadas mediante la adición de un anti-oxidante como el ácido ascórbico.
En un aspecto posterior, la presente invención propone un método para el diagnóstico ó monitoreo de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, dicho método consiste en el uso de una proteína de fusión o quimérica como la descrita · anteriormente para detectar anticuerpos anti-P. gingivalis en una muestra biológica proveniente de dicho sujeto.
Ya en otro aspecto, la invención propone un método para el diagnóstico ó monitoreo de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, dicho método consiste en el uso de' un anticuerpo, como se describió con anterioridad, para detectar la presencia de P. gingivalis en una muestra biológica proveniente de dicho sujeto.
En otro aspecto, la invención propone un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 17, 18, 25 y 26.
En otro aspecto, la invención propone el uso de un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No . 17, 18, 25 y 26, ó un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 17, 18, 25 y 26, para la manufactura de una proteína de fusión o quimérica para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis.
En otro aspecto, la invención propone el uso de un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No . 17, 18, 25 y 26, ó un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 17, 18, 25 y 26, para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis. En un ejemplo típico, el péptido se administra simultáneamente ó secuencialmente con un segundo péptido que incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (ü) una parte o el total de una secuencia que igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; ó (üi) una parte o el total de una secuencia que igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de una HagA de P. gingivalis.
SETAWAD SETSWAD ETAWADP ETSWADP TAWADPL TSWADPL GSETAWAD GSETSWAD SETAWADP SETSWADP ETAWADPL ETSWADPL TAWADPLL TSWADPLL LNTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L] KAS1 NTGV[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][LA/]T[A/T][T/S KAS2 ]Q[V/L]KALTNK[D/N]K V[G/S]FANYTAHGSET[S/A]WADP[S/L][UV] KAS3 LNTGVSFANYTAHGSETAWADP PAS1 K FNGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSH RAS1 NGGISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHFGTTHVKQLTNSNQ RAS2 ISL[V/A]NYTGHGSETAWGTSHF RAS3 FNGGISLANYTGHGSETAWGT PAS1 R ANEAKWLAADNVWGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPATG KA1 PLFTGTASSNLYSANFEYLIPANADPWTTQNIIVTGQGEV VIPGGVYDYCITNPEPASGK WIAGDGGNQPARYDDFTF EAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRD GTKIKEGLTATTFEEDGVAAGNHEYCVEV YTAGVSPKV CKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPNGTP NPNPNPNPNPGTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGHGW KPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNYLITPA LDLPNGGKLT FWVC AQ D AN YAS E H YAVYASSTG N DAS N FTNALLEETITA FLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTASSNLYSANFEYLIPAN KsA1 ADPWTTQNIIVTGQGEWIPGGVYDYCITNPEPASGKMW IAGDGGNQPARYDDFTFEAG KYTFTMRRAGMGDGTDM EVEDDSPASYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVAAGN 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GTKIKEGLTETTYRDAGMSAQSHEYCVEVKYTAGVSPKV CVDYIPDGVADVTAQKPYTLTWG TITVTCQGEAMIYDM NGRRLAAGRNTWYTAQGGYYAV VWDGKSYVEKLAI K SEQ Secuencia de nucléotidos ID NO: 47 GACCATGGCTCATCACCATCACCATCACAATACCGG KAS2- AGTCAGC I I I GCA FOR 48 GACTCGAGTTATTTGTCCTTATTAGTGAGTGCTTTC KAS2- REV 49 G AC C ATG G CTTG G GG AG AC AATACG G GTTAC KLA1- FOR 50 GACTCGAGACCTCCGTTAGGCAAATCC KLA1- REV 51 CCGTATTGTCTCCCCATTTGTCCTTATTAGTGAGTGC KAS2- TTTC KLA1- REV 52 C ACTAATAAG G AC AAATG GGG AG AC AATAC G G GTTA KAS2- C KLA1 - FOR 53 CATGGATCTGAGACCGCATGGGCTGATCCACTTTTC KAS1 - TTGTTGGATGGCGAT KsA1- FOR1 54 CCATGGCTTTGAATACCGGAGTCAGCTTTGCAAACT AS1 - ATACAGCGCATGGATCTGAGACCGCA KsA1- FOR2 5 CTC GAGGAATGATTCGG AAAGTGTT KAS1 - KsA1- REV 6 CCATGGCTGATTATAGCTGGAATTCCCAGGTAGTCA multi- GCTTTGCAAACTATACA FOR1 7 CTTTGCAAACTATACAGCGCATGGATCTGAGACCGC multi- ATGGGCTGATCCACTT FOR2 8 ATGGGCTGATCCACTTCTGAATTCTTATTGGGGCGA multi- GATCGGCAATATTACC FOR3 59 GATCGGCAATATTACCCATATTGGTGCTCATTACGC multi- TTGGGGAGACAATACG FOR4 60 CTCGAGACCTCCGTTAGGCAAATCCAATGCCGGTGT multi-REV TATCAGATAGTTGTCA SEQ Amino acid sequence Longitud ID NO: Total 61 MKNLNKFVSIALCSSLLGGMAFAQQTELGRNPNVRLI.ES RgpA TQQSVTKVQFRMDNLKFTEVQTPKGIGQVPTYTEGVNL SEKGMPTLPILSRSLAVSDTREMKVEWSSKFIEKKNVLI APSKGMIMRNEDPKKIPYVYGKTYSQNKFFPGEIATLDD PFILRDVRGQWNFAPLQYNPVTKTLRIYTEITVAVSETSE QGKNILNKKGTFAGFEDTYKRMFMNYEPGRYTPVEEKQ NGRMIVIVAKKYEGDIKDFVDWKNQRGLRTEVKVAEDIA SPVTANAIQQFVKQEYEKEGNDLTYVLLIGDHKDIPAKITP GIKSDQVYGQIVGNDHYNEVFIGRFSCESKEDLKTQIDRT IHYERNITTEDKWLGQALCIASAEGGPSADNGESDIQHE NVIANLLTQYGYTKIIKCYDPGVTPKNIIDAFNGGISLANYT GHGSETAWGTSHFGTTHVKQLTNSNQLPFIFDVACVNG DFLFSMPCFAEALMRAQKDGKPTGTVAIIASTINQSWAS PMRGQDEMNEILCEKHPNNIKRTFGGVTMNGMFAMVEK YKKDGEKMLDTWTVFGDPSLLVRTLVPTKMQVTAPAQI NLTDASVNVSCDYNGAIATISANGKMFGSAWENGTATI NLTGLTNESTLTLTWGYNKETVIKTINTNGEPNPYQPVS NLTATTQGQKVTLKWDAPSTKTNATTNTARSVDGIRELV LLSVSDAPELLRSGQAEIVLEAHDVWNDGSGYQILLDAD HDQYGQVIPSDTHTLWPNCSVPANLFAPFEYTVPENAD PSCSPTNMIMDGTASVNIPAGTYDFAIAAPQANAKIWIAG QGPTKEDDYVFEAGKKYHFLMKKMGSGDGTELTISEGG GSDYTYTVYRDGTKIKEGLTATTFEEDGVATGNHEYCVE VKYTAG VS P KVC K D VTVEGS N E FAP VQ N LTG S AVGQ KV TLKWDAPNGTPNPNPNPNPNPNPGTTTLSESFENGIPA SWKTIDADGDGHGWKPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFG LGGIGVLTPDNYLITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYAS EHYAVYASSTGNDASNFTNALLEETITAKGVRSPEA RG RIQGTWRQKTVDLPAGTKYVAFRHFQSTDMFYIDLDEVE IKANGKRADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQGW LCLSSGQLDWLTAHGGTNWSSFSWNGMALNPDNYLIS KDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDF TWFEETPNGINKGGARFGLSTEADGAKPQSVWIERTVD LPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDY TYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYT AGVSPKKCVNVTVNSTQFNPVKNLKAQPDGGDWLKW EAPSAKKTEGSREVKRIGDGLFVTIEPANDVRANEAKW LAADNNA/VGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPATGPLFTGTA SSDLYSANFESLIPANADPWTTQNIIVTGQGEWIPGGV YDYClTNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDDFTFEAGKK YTFT RRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTVYRDGTKIK EG LTETT Y R DAGMS AQ S H E YC VE VKYTAGVS P KVC VD Y IPDGVADVTAQKPYTLTWGKTITVTCQGEAMIYDMNGR RLAAGRN VYTAQGGYYAVMVWDGKSYVEKLAI MRKLLLLIAASLLGVGLYAQSAKIKLDAPTTRTTCTNNSF Kgp KQFDASFSFNEVELTKVETKGGTFASVSIPGAFPTGEVG SPEVPAVRKLIAVPVGATPWRVKSFTEQVYSLNQYGSE KL PHQPSMSKSDDPEKVPFVYNAAAYARKGFVGQELT QVE LGTMRGVRIAALTINPVQYDWANQLKVRNNIEIEV SFQGADEVATQRLYDASFSPYFETAYKQLFNRDVYTDH GDLYNTPVRMLWAGAKFKEALKPWLTWKAQKGFYLDV HYTDEAEVGTTNASIKAFIH YNDGLAASAAPVFLALVG DTDVISGEKGKKTKKVTDLYYSAVDGDYFPE YTFRMS ASSPEELTNIIDKVLMYEKATMPDKSYLE VLLIAGADYS WNSQVGQPTIKYGMQYYYNQEHGYTDVYNYLKAPYTG CYSHLNTGVSFANYTAHGSETAWADPLLTTSQLKALTNK DKYFLAIGNCCITAQFDYVQPCFGEVITRVKEKGAYAYIG SSPNSYWGEDYYWSVGANAVFGVQPTFEGTSMGSYDA TFLEDSYNTVNSIMWAGNLAATHAGNIGNITHIGAHYYW EAYHVLGDGSVMPYRA PKTNTYTLPASLPQNQASYSI QASAGSYVAISKDGVLYGTGVANASGVATVSMTKQITEN GNYDWITRSNYLPVIKQIQVGEPSPYQPVSNLTATTQG QKVTLKWEAPSAK AEGSREVKRIGDGLFVTIEPANDVR ANEAKWLAADNVWGDNTGYQFLLDADHNTFGSVIPAT GPLFTGTASSNLYSANFEYLIPANADPWTTQNIIVTGQG EWIPGGVYDYCITNPEPASGKMWIAGDGGNQPARYDD FTFEAGKKYTFTMRRAGMGDGTDMEVEDDSPASYTYTV YRDGTKI EGLTATTFEEDGVAAGNHEYCVEVKYTAGVS PKVCKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPN GTPNPNPNPNPNPGTTLSESFENGIPASWKTIDADGDG HGWKPGNAPGIAGYNSNGCVYSESFGLGGIGVLTPDNY LITPALDLPNGGKLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGN DASNFTNALLEETITAKGVRSPKAIRGRIQGTWRQ TVDL PAGTKYVAFRHFQSTDMFYIDLDEVEIKANGKRADFTET FESSTHGEAPAEWTTIDADGDGQGWLCLSSGQLDWLT AHGGSNWSSFSWNGMALNPDNYLISKDVTGAT VKYY YAVNDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTWFEETPNGINK GGARFGLSTEANGAKPQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRH YNCSDLNYILLDDIQFT GGSPTPTDYTY7VYRDGTKIKE GLTETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKKCVNVT VNSTQFNPVQNLTAEQAPNSMDAILKWNAPASKRAEVL NEDFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGSSFAGH NSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPGGGTLTF WVCAQ DAN YASEH YAVYASSTGN DASN FANALLEEVLT AKTVVTAPEAIRGTRAQGTVVYQKTVQLPAGTKYVAFRH FGCTDFFWINLDDWITSGNAPSYTYTIYRNNTQIASGVT ETTYRDPDLATGFYTYGVKWYPNGESAIETATLNITSLA DVTAQKPYTLTWGKTITVTCQGEAMIYDMNGRRLAAGR NTWYTAQGGHYAVMVWDGKSYVEKLAVK MRKLNSLFSLAVLLSLLCWGQTAAAQGGPKTAPSVTHQ HagA AVQKGIRTSKAKDLRDPIPAGMARIILEAHDVWEDGTGY QMLWDADHNQYGASIPEESFWFANGTIPAGLYDPFEYK VPVNADASFSPTNFVLDGTASADIPAGTYDYVIINPNPGII YIVG EGVS KG N D YWEAGKTYH FTVQ RQG PG DAASVW TGEGGNEFAPVQNLQWSVSGQTVTLTWQAPASDKRTY VLNESFDTQTLPNGWTMIDADGDGHNWLSTINVYNTAT HTGDGAMFSKSWTASSGAKIDLSPDNYLVTPKFTVPEN GKLSYWVSSQEPWTNEHYGVFLSTTGNEAANFTIKLLEE TLGSGKPAPMNLVKSEGVKAPAPYQERTIDLSAYAGQQ VYLAFRHFGCTGIFRLYLDDVAVSGEGSSNDYTYTVYRD NWIAQNLTATTFNQENVAPGQYNYCVEVKYTAGVSPKV CKDVTVEGSNEFAPVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNGTP NPNPGTTTLSESFENGIPASWKTIDADGDGNNWTTTPPP GGSSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSL PNGGTLTFWVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFA NALLEÉVLTAKTWTAPEAIRGTRVQGTWYQKTVQLPAG TKYVAFRHFGCTDFFWINLDDVEIKANGKRADFTETFES STHGEAPÁEWTTIDADGDGQGWLCLSSGQLGWLTAHG GTNWASFSWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAV NDGFPGDHYAVMISKTGTNAGDFTWFEETPNGINKGG ARFGLSTEANGAKPQSNA/VIERTVDLPAGTKYVAFRHYN CSDLNYILLDDIQFTMGGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGL TETTFEEDGVATGNHEYCVEVKYTAGVSPKECVNVTVD P VQ F N P VQ N LTGSAVG Q KVTLKWDAP N GTP N P N PGTTT LSESFENGIPASWKTIDADGDGNN TTTPPPGGTSFAG HNSAICVSSASYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPNGGTLTF WVCAQDANYASEHYAVYASSTGNDASNFANALLEEVLT AKTWTAPEAIRGTRVQGTWYQKTVQLPAGT YVAFRH FGCTDFFWINLDDVÉIKANGKRADFTETFESSTHGEAPA EWTTIDÁDGDGQG LCLSSGQLDWLTAHGGTNWASF SWNGMALNPDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDH YAVMISKTGTNAGDFTWFEETPNGINKGGARFGLSTEA NGAKPQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLD DIQFT GGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDG VATG N H E YC VE VKYTAGVS P KEC VN VTVDP VQ F N P VQ N LTGSAVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPGTTTLSESFENGIP ASWKTIDADGDGNNWTTTPPPGGTSFAGHNSAICVSSA SYINFEGPQNPDNYLVTPELSLPNGGTLTFWVCAQDAN YASEHYAVYASSJGNDASNFANALLEEVLTAKTWTAPE AIRGTRVQGTWYQKTVQLPAGTKYVAFRHFGCTDFFWI NLDDVEIKANGKRADFTETFESSTHGEAPAEWTTIDADG DGQGWLCLSSGQLGWLTAHGGTNWASFSWNGMALN PDNYLISKDVTGATKVKYYYAVNDGFPGDHYAVMISKTG TNAGDFTWFEETPNGINKGGARFGLSTEANGAKPQSV WIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFTMGG SPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGNHEY CVEVKYTAGVSP ECVNVTINPTQFNPVQNLTAEQAPNS DAILKWNAPASKRAEVLNEDFENGIPASWKTIDADGDG NNWTTTPPPGGSSFAGHNSAICVSSASYINFEGPQNPD NYLVTPELSLPGGGTLTFWVCAQDANYASEHYAVYASS TGNDASNFANALLEEVLTAKTWTAPEAIRGTRVQGTWY Q TVQLPAGTKYVAFRHFGCTDFFWINLDDWITSGNAP SYTYTIYRNNTQIASGVTETTYRDPDLATGFYTYGVKWY PNGESAIETATLNITSLADVTAQKPYTLTWGKTITVTCQG EAMIYDMNGRRLAAGRNTWYTAQGGHYAVMWVDGK SYVEKLAVK SEQ Secuencia de aminoácidos Fragmento ID NO: 64 D[S/Y][Y/S]WNIP/S][K/Q][IA/1 KAS4 65 NSYWGED KAS5 66 IGN[V/I]THIGAHY KAS6 67 EGGPSADN RAS4 68 [N/D]Q[S/Y]WA[S/P]P RAS 5 69 P VS N LTATTQ GQ KVTLKWDAPST ABM1 - RgpAcat 70 P VS N LTATTQ GQ KVTLKWEAPSA ABM1- Kgpcat 71 PVQNLTGSSVGQKVTLKWDAPST ABM1- KgpA1 72 PVQNLTGSAVGQKVTLKWDAPNG ABM1 - RgpA1 & RgpAA3 73 PVKNLKAQPDGGDWLKWEAPSA AB 1 - HagAAI V ** 74 PVQNLTAEQAPNS DAILKWNAP AB 1 - KgpA3 & HagAA3 75 P VQ N LTQWSVSGQTVTLTWQ APAS ABM2 - HagAAI 76 YTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVA AB 2 - ABM2 - RgpAA4 77 YTYTVYRDNWIAQNLTATTFNQENVA ABM2 - HagAr 78 YTYTVYRDGTKIKEGLTA/ETTFEEDGVA ABM2 Todas las demás adhesinas 79 PNGTP(NP)^GTT(T)LSESF ABM3- Todas las adhesinas 80 GGPKTAPSVTHQAVQKGIRTSKAKDLRDPIPAGMARIILE HagA1 AHDVWEDGTGYQMLWDADHNQYGASIPEESFWFANGTI [26-351] PAGLYDPFEYKVPVNADASFSPTNFVLDGTASADIPAGTY DYVIINPNPGIIYIVGEGVSKGNDYWEAG TYHFTVQRQ GPGDAASWVTGEGGNEFAPVQNLQWSVSGQTVTL7 QAPASDKRTYVLNESFDTQTLPNGWTMIDADGDGHNWL ST I VY N TATHTG DGAM FS KS WTAS S G AK I D LS P D N Y L VT PKFTVPENGKLSYWVSSQEPWTNEHYGVFLSTTGNEAA NFTIKLLEETLGSG APAPYQERTIDLSAYAGQQVYLAFRHFGCTGIFRLYLDDV HagA1* AVSGEGSSNDYTYTWRDNWIAQNLTATTFNQENVAPG [366-625] Q Y N YC VEVK YTAGVS P KVC KD VTVEG S N E F AP VQ N LTG SAVGQKVTLKWDAPNGTPNPNPG I I I LSESFENGIPASW KTIDADGDGNNWTTTPPPGGSSFAGHNSAICVSSASYIN FEGPQNPDNYLVTPELSLPNGGTLTFWVCAQDANYASE HYAVYASSTGNDASNFANALLEEVLTA PQSVWIERTVDLPAGTKYVAFRHYNCSDLNYILLDDIQFT HagA1** GGSPTPTDYTYTVYRDGTKIKEGLTETTFEEDGVATGN [820-HE YC VEVKYTAGVS PKECVNVTVDPVQ F N PVQ N LTGSA 1077] or VGQKVTLKWDAPNGTPNPNPG I I I LSESFENGIPASWKT HagA1** IDADGDGNNWTTTPPPGGTSFAGHNSAICVSSASYINFE [1272-GPQNPDNYLVTPELSLPNGGTLTFWVCAQDANYASEHY 1529] AVY AS STGNDASN F AN A L L E E V LT A PYQPVSNLTATTQGQ ABM1 [436 -450] EGLTATTFEEDGVAA ABM2 [672-686] GTPNPNPNPNPNPNPGT ABM3 [455-471] La invención es ilustrada mediante los siguientes ejemplos los cuales se incluyen a manera de ejemplificación y no limitación de la invención.
Ejemplo 1 Métodos y Materiales Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento. Los cultivos liofilizados de Porfiromonas gingivalis W50 se desarrollaron anaeróbicamente a 37 °C en placas de agar sangre lisada de caballo enriquecidas con 5 g/ml de hemina y 0.5 g/ml de cisteína (agar SC, DIO pases) . Después de 3 a 4 días, las colonias fueron usadas para inocular medio de infusión cerebro corazón que contiene 5 g/ml de hemina y 0.5pg/ml de cisteína (1) . Los cultivos a granel se desarrollaron anaeróbicamente en una Estación de Trabajo Anaeróbica MK3 (Don Whitley Scientific Ltd. , Adelaida, Australia) . Las células se cosecharon durante la fase de crecimiento exponencial por centrifugación (7500 g, 30 min, 4°C) y se lavaron dos veces con solución amortiguadora PG(50mM de Tris-HC1, 150mM de NaCl, 5mM de CaCl2 y 5mM de cisteína-HCl , pH 8.0) en la estación de trabajo anaeróbica. El crecimiento de los cultivos a granel fue monitoreado a 650 nm utilizando un espectrofotómetro (Perkin-Elmer modelo 295E) . La pureza de los cultivos se verificó rutinariamente mediante la tinción de Gram, examen microscópico y mediante el uso de una variedad de pruebas bioquímicas en concordancia con los protocolos (2) .
Construcción de la estructura pET28 que contiene secuencias de adhesina y secuencias de adhesina con adición de N-terminal de secuencias de Kgp proteinasa. Los fragmentos de Kgp que representan péptidos y péptidos quiméricos del sitio activo (SA) y los dominios de adhesina KgpAl (Al) , fueron sobre-expresados en E. coli como proteínas recombinantes (r) con etiquetas hexa-His usando vectores de expresión pET (Novagen) . Las r-proteínas expresadas fueron rKAS2 y rKLAl y las proteínas r-quiméricas fueron rKAS2-KLAl, rKASl-KsAl y rKAS4-KAS3-KAS5-KAS6-KLAl (también referidas como multiKAS-KLA1) . Las secuencias de aminoácidos que representan a los diferentes dominios Al y AS están descritas en las Tablas 1 y 2.
Los diferentes dominios KAS y KA1 del gen kgp fueron amplificados a partir de pNS (fragmento 3.5 kb BamHl lis en pUC18) ó DNA genómico de P. gingivalis usando oligonucleótidos iniciadores listados en la Tabla 4, Taq DNA polimerasa (Invitrogen) y un termociclador PC-960 (Corbett Research Technologies) . Se usaron los pares de iniciadores KAS2-FOR, KAS2-REV y KLA1-FOR, KLA1-REV para generar fragmentos PCR que codifican a KAS2 y KLA1 respectivamente bajo las siguientes condiciones de reacción: 94 °C, 3 minutos seguido por 28 ciclos de 94 °C, 45 segundos (desnaturalización); 62°C, 40 segundos (apareamiento) y 72°C, 20 segundos (extensión) seguido por un ciclo final de 72°C, 5 minutos .
El producto PCR quimérico KAS2-KLA1 fue elaborado mediante fusión genética por extensión sobrepuesta (FGES) como sigue: Los productos PCR fueron elaborados usando pares iniciadores KAS2-FOR, KAS2-KLA1-quimera-REV y KAS2-KLA1-quimera-FOR, KLA1-REV bajo las condiciones descritas anteriormente. Entonces, los productos PCR fueron apareados y el PCR final fue ejecutado con iniciadores KAS2-FOR y KLA1-REV (94°C, 2 minutos, seguido por 28 ciclos de 94 °C, 30 segundos; 50 °C, 30 segundos y 72 °C, 40 segundos seguidos por un ciclo final de 72°C, 5 minutos) .
Para la preparación del producto PCR KASl-KsAl, se llevaron a 'cabo 2 PCR' s sucesivos usando el iniciador AS1-KsAl-REV con cada uno' de los iniciadores 1 y 2 en sucesión (condiciones de reacción 94 °C por 2 minutos seguido por 35 ciclos de 94 °C, 15 segundos; 63°C, 30 segundos y 72°C, 2 minutos) para producir el producto PCR KASl-KsAl. Los iniciadores KASl-KsAl-FORl y KASl-KsAl-FOR2 contienen una extensión 3' sobrepuesta a la 5 ' del PCR previo.
Para la preparación del fragmento de PCR multiKAS-KLAl, se llevaron a cabo cuatro PCR's usando el iniciador multi-REV con cada uno de los iniciadores multi-FOR 1, 2, 3, y 4 en sucesión (condiciones de reacción 95 °C por 2 minutos seguido por 35 ciclos de 95°C, 20 segundos; 68°C, 1.5 minutos) para producir el PCR multiKAS-KLAl . Cada iniciador multi-FOR contiene una extensión 3' que se sobrepone a la 5' del PCR previo.
Todos los fragmentos PCR que codifican a KAS2, KLA1, KAS2-KLA1, KASl-KsAl y multiKAS-KLAl fueron purificados usando columnas de purificación PCR (Qiagen) , ligados a un vector de clonación TA, pGem-T-Easy (Promega) y transformados en E. coli JM109 siguiendo el protocolo del fabricante. La estructura recombinante purificada pGemT-Easy fue digerida con Ncol y Xhol y direccionalmente clonada en Ncol/Xhol pET28b (Novagen) y transformada en el huésped sin expresión E. coli JM109 [DH5 ] . La estructura recombinante pET28 fue purificada y transformada en el huésped de expresión E. coli, BL21 (DE3) [HMS174 (DE3) ] (Novagen) y seleccionada en LB que contiene 50 pg de kanamicina siguiendo las instrucciones del fabricante. La integridad de cada inserto fue confirmada mediante análisis de secuencia de DNA..
Los oligonucleótidos iniciadores (Tabla 4) han sido diseñados para incorporar sitios de restricción de enzimas y detener codones y etiquetas hexa-His cuando sea necesario. Los iniciadores usados para rKAS2, rKLAl y rKAS2-KLAl fueron diseñados para limitar la inclusión de secuencias de códigos extrañas a no más de tres aminoácidos más la etiqueta hexa-His en r-proteínas. La rKASl y la rKLAl fueron diseñadas para contener una etiqueta hexa-His en los extremos N-terminal y C-terminal respectivamente de tal manera que puedan ser comparadas directamente con la rKAS2 -KLAl la cual tiene una etiqueta hexa-His en ambos extremos N- y C-terminal. En rKASl-KsAl y muítiKAS-KLAl las etiquetas His se encontraron en el C-terminal.
Tabla 4 Oligonucieótidos iniciadores usados para la amplificación de las secuencias de nucleótidos que codifican varios fragmentos y quimeras de Kgp A1 y AS Proteínas Oli Secuencia (5'-3') Características* (5'-3') recombinan -tes (r) rKAS2 KAS2- GACCATGGCTCATCACCATCAC C GA amort-Ncol (incluye ATG FOR ATCACAATACCGGAGTCAGCTTT ¡nicio)-CT-(His)e-AS GCA (nt 1992-2012) (SEQ ID NO: 47) KAS2- GACTCGAGTTATTTGTCCTTATTA GA arxxt-Xhol-TTA fin^KASI REV GTGAGTGCTTTC (nt 2099-2075) (SEQ ID NO: 48) rKLA1 KLA1- GACCATGGCTTGGGGAGACAATA GA amort-Ncol (incluye ATG FOR CGGGTTAC (SEQ ID NO: 49) ¡nic¡o>CT-A1 (nt 2946-2966) KLA1- GACTCGAGACCTCCGTTAGGCAA GA amort-Xhol-A1 (nt 3863- REV ATCC (SEQ ID NO: 50) 3845) rKAS2-KLA1 KAS2- CCGTATTGTCTCCCCATTTGTCCT A1 (nt 2961-2946)-KAS1 (nt KLA1- TATTAGTGAGTGCTTTC 2099-2075) REV (SEQ ID NO: 51) KAS2- CACTAATAAGGACAAATGGGGAG KAS1 (nt 2084-2099)-A1 (nt KLA1- ACAATACGGGTTAC 2946-2966) FOR (SEQ ID NO: 52) rKAS1-KsA1 KAS1- CATGGATCTGAGACCGCATGGG AS (nt 2025-2057)-A1 (nt 2970- KsA1- CTGATCCACTTTTCTTGTTGGATG 2987)- F0R1 CCGAT (SEQ ID NO: 53) AS1- CCATGGCTTTGAATACCGGAGTC Ncol-CT-AS (nt 1989-2042) KsA1- AGCTTTGCAAACTATACAGCGCA FOR2 TGGATCTGAGACCGCA SEQ ID NO: 54) KAS1- CTCGAGGAATGATTCGGAAAGTG Xhol-A1 (nt 3663-3644) KsA1- TT (SEQ ID NO: 55) REV rmultiKAS- multi- CCÁTGGCTGATTATAGCTGGAAT Ncol-CT-KAS4 (nt 1857-1880)- KLA1 FOR1 TCCCAGGTAGTCAGCTTTGCAAA KAS3 (nt 2001-2021) CTATACA (SEQ ID NO: 56) multl- CTTTGCAAACTATACAGCGCATG KAS3 (nt 2006-2057) FOR2 GATCTGAGACCGCATGGGCTGAT CCACTT (SEQ ID NO: 57) multi- ATGGGCTGATCCACTTCTGAATT KAS3 (nt 2042-2060)-KAS5 (nt FOR3 CTTATTGGGGCGAGATCGGCAAT 2223-2240)-KAS6 (nt 2403- ATTACC (SEQ ID NO: 5B) 2417) multi- GATCGGCAATATTACCCATATTG G-KAS6 (nt 2403-2435)-GCT FOR4 GTGCTCATTACGCTTGGGGAGAC (espaciador Ala)-A1 AATACG (nt 2946-2960) (SEQ ID NO: 59) multi- CTCGAGACCTCCGTTAGGCAAAT Xho-A1 (nt 3863-3818) RE CCAATGCCGGTGTTATCAGATAG TTGTCA (SEQ ID NO: 60) *números de secuencia de nucleótidos (nt) procedentes del gene lisina-cisteína específica proteinasa, secuencia de accesión número U75366.
Expresión y purificación de proteínas recombinantes . Las proteínas recombinantes fueron expresadas a partir de pET28: KLA1 ( KAS2 , KAS2-LA1, ^ASI-SAI y multiKAS-KLAl) construidas por inducción con. isopropil ß-D-tiogalactosidasa (IPTG) .
Todas las proteínas recombinantes fueron producidas como proteínas de fusión etiqueta 6-His y purificadas con el sistema de purificación NI-NTA (Invitrogen) bajo condiciones de desnaturalización. Brevemente, se usaron colonias transformantes simples de E. coli (DE3) para inocular 20 mi de caldo de Luria-Bertani (LB) que contiene 50 pg/ml de kanamicina incubando a 37 °C en un agitador orbital por toda una noche. El inoculo fue usado entonces para inocular 1 lt de LB que contiene 50 pg/ml de kanamicina. Se permitió que la D06oo de éste cultivo llegase a 0.5-0.7 (fase log media) antes de inducir la expresión de proteínas con isopropil IPTG a 0.1 mM por 2 horas a 37°C con agitación de 200 rpm. Las células fueron cosechadas (7,500 g) y re-suspendidas en una solución amortiguadora desnaturalizante de enlaces (Urea 8M, 20 mM de Fosfato de Sodio pH 8.0 y 500 mM de NaCl), sonicadas en hielo por 3 descargas de 15 s a intervalos de 30 segundos usando un desintegrador celular Branson Sonifer 250 (Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, CT) con una micro-punta calibre 3, entonces se centrifugaron a 39,000 g por 30 min a 4°C. Las proteínas recombinantes fueron purificadas a partir del sobrenadante transfiriéndolas a una columna pre-equilibrada de Ni-NTA Agarosa lavándolas con una solución amortiguadora desnaturalizante de enlaces (Urea 8M, 20 mM de Fosfato de Sodio pH 6.0 y 500 mM de NaCl) para eluir las proteínas no-enlazadas. La columna entonces fue lavada usando 10 volúmenes de solución amortiguadora enlazante B y la proteína recombinante '. fue eluída con solución amortiguadora desnaturalizante para elución (Urea 8M, 20 mM de Fosfato de Sodio pH 6.0 y 500 mM de NaCl e Imidazol 0.5M) . La proteína purificada fue dializada contra Urea 2M-PBS y almacenada a -80°C.
Las muestras de proteína recombinante fueron analizadas mediante SDS-PAGE y su masa molecular se determinó usando ProtParam en línea (http : //au . expasy . org/tools/protparam . html) . La concentración de proteína de todas las muestras se determinó mediante el Bio-Rad Protein Assay usando BSA como estándar.
Inmunización y el modelo de periodontitis en ratón. Se llevaron a cabo experimentos de periodontitis en ratón como fue descrito previamente (3) y fueron aprobados por el Comité de Ética para Experimentación Animal de la Universidad de Melbourne. Se ' inmunizaron ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad (12 ratones por grupo) alojados en micro-aisladores con 50 pg de una de las proteínas recombinantes ó complejo RgpA-Kgp ó 2 x 109 células muertas con formalina de la cepa 50 de P. gingivalis ó PBS; cada antígeno fue emulsificado con adyuvante incompleto de Freund (AIF) . Después de 30 días, los ratones fueron estimulados con antígeno (inyección sub- cutánea, emulsificada con AIF) y entonces sangrados del plexo retrobulbar 12 días más tarde. Cuatro días después de la segunda inmunización, se le administró kanamicina (Sigma-Aldrich, Nueva Gales del Sur, Australia) a los ratones, una dosis de 1 mg/ml en agua de-ionizada ad libitum por 7 días. Tres días después del tratamiento con antibiótico (2 días después del sangrado) , los ratones fueron inoculados oralmente cuatro veces, una vez cada 2 días, con 1 x 1010 células vivas de P. gingivalis 50 (25 µ?) en solución amortiguadora PG (50 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl , 5 mM de CaCl2 y 5 mM de cisteína-HCl , pH 8.0) que contiene 2% (peso/vol) de carboximetil celulosa (CMC; Sigma-Aldrich, Nueva Gales del Sur, Australia) , un grupo de control fue falsamente infectado con solución amortiguadora PG que contiene 2% (peso/vol) de CMC solamente. El inoculo fue preparado en la cámara anaeróbica e inmediatamente aplicado en el margen gingival de los dientes molares maxilares. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron otras cuatro dosis, una cada 2 días, de 1 x 1010 células vivas de P. gingivalis W50 (25 µ?) en solución amortiguadora PG que contiene 2% (peso/vol) de CMC. En número de bacterias viables en cada inoculo fue verificada por conteo en agar sangre. Los ratones se alimentaron con una dieta suave en polvo (Barastock, Australia) y se alojaron en jaulas acondicionadas con piso de malla elevado para prevenir el acceso al lecho. Cuatro semanas después de la última dosis, los ratones fueron sangrados del plexo retro-bulbar y después sacrificados, el maxilar fue removido y cortado en mitades, la mitad derecha se usó para la medición de pérdida de hueso alveolar y la mitad izquierda para la PCR en tiempo real.
Las mitades derechas se hirvieron 1 minuto en agua de-ionizada, se descarnaron mecánicamente y fueron sumergidas en hidróxido de potasio al 2% (peso/vol) durante 16 horas a 25 °C, posteriormente se lavaron dos veces con agua de-ionizada y fueron inmersas en peróxido de hidrógeno al 3% (peso/vol) durante 6 horas a 25"C. Después se lavaron dos veces con agua de- ionizada y fueron teñidas con azul de metileno acuoso al 0.1% (peso/vol), se capturó una imagen digital del aspecto bucal de cada mitad maxilar con una cámara digital Olympus DP12 montada en un microscopio de disección usando el software OLYSIA BioReport versión 3.2 (Olympus Australia Pty Ltd. , Nueva Gales del Sur, Australia) para evaluar la pérdida horizontal de hueso. La pérdida horizontal de hueso es aquella que se presenta en un plano horizontal, perpendicular a la cresta del hueso alveolar (CHA) y que resulta en una reducción de la altura de la cresta. Cada mitad maxilar fue alineada de manera que las puntas molares, lingual y bucal, de cada del diente, fueran superpuestas, la imagen fue capturada con una escala micrométrica en el marco para que las mediciones pudieran ser estandarizadas para cada imagen. El área de la interfase cemento-esmalte de la CHA de cada diente molar fue medida usando el software OLYSIA BioReport para proceso de imágenes versión 3.2. Las mediciones de la pérdida de hueso se determinaron dos veces por un simple examinador usando un protocolo ciego y aleatorio.
Determinación de la subclase de anticuerpo mediante ELISA.
Para determinar las respuestas de la subclase de anticuerpos del suero del ratón, se efectuó el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) por triplicado usando una solución amortiguadora salina de fosfatos (PBS) (Na2HP04 0.01M, 1.5 mM de KH2P04 y NaCl 0.15M) con 5pg/ml de células de P. gingivalis W50 muertas con formalina, pH 7.0 y que contiene 0.1% (peso/vol) de Tween 20 (PBST) para recubrir los pozos de las placas para micro-titulación de polivinilo de fondo plano (Dynatéch Laboratories, McLean, VA). Después de eliminar la solución de recubrimiento, se adicionó PBST que contiene 2% (peso/vol) de leche descremada a los pozos para bloquear el plástico sin recubrimiento durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar los pozos cuatro veces con PBST, se adicionaron diluciones seriadas del suero de ratón en PBST que contiene 0.5% (peso/vol) de polvo leche desgrasada (PBST-LD) a cada pozo y se incubó por 16 horas a temperatura ambiente. Después de que los pozos fueran lavados seis veces con PBST, se adicionó una dilución 1:2000 en PBST-LD de IgG de cabra para IgM, IgA, IgGl, IgG2a, IgG2b ó IgG3 de ratón (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) y se permitió reaccionar por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas seis veces con PBST y se adicionó una dilución 1:5000 en PBST-LD de Horseradish conjugado con peroxidasa e inmunoglobulina de conejo anti-cabra (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) a cada pozo y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron seis veces con PBST, los anticuerpos ligados fueron detectados mediante la adición a cada pozo de 100 µ? de substrato ABTS [0.9 mM de 2 , 2 ' -azino-bis ( 3 -etilbenzo-tiazolina-6) ácido sulfónico en 80 mM de ácido cítrico que contiene 0.005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH .0] . Se midió la densidad óptica a 415 nm usando un lector de microplacas (BioRad modelo 450) .
Gel para electroforesis SDS-PAGE y Western Blott. Las proteínas recombinantes (10 g) fueron analizadas utilizando el sistema de electroforesis XCell surelock Mini-Cell. Las proteínas recombinantes fueron mezcladas en 20 µ? de solución amortiguadora para reducción de muestras (10% [peso/vol] de SDS, 0.05% [peso/vol] de azul de bromofenol, 25% [vol/vol] de glicerol y 0.05% [vol/vol] de 2-mercaptoetanol) . El H se ajustó a 8.0 con Tris-HCl 1.5M, entonces, la solución fue calentada a 100°C. Las proteínas recombinantes (10pg/línea) fueron cargadas en mini geles Novex pre- fabricados con Tris-glicina al 12% (peso/vol) y se efectuó la electroforesis usando una corriente de 30 a 50 mA y una diferencia de potencial de 125 V utilizando un sistema de electroforesis Novex (Novex, San Diego, California) . Las proteínas fueron visualizadas empleando Azul Coomassie R250 al 0.25% (peso/vol) .
Análisis de prototipos de la secuencia (KAS-2) del péptido del sitio activo de la proteinasa Kgp. Los sitios de unión de anticuerpos para el péptido KAS2 del sitio activo de la proteinasa Lis-específica (SEQ ID No. 28, 433-468) fueron determinados sintetizando ocho fragmentos peptídicos N-terminalmente bio-reducidos sobrepuestos (neutralizado por uno y sobrepuestos por siete fragmentos) en un sistema de síntesis de péptidos multi-contacto (Chiron Technologies, elbourne, Australia) utilizando protocolos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida por química Fmoc . Los péptidos bio-reducidos (5 g/ml) en PBS 0.1M, pH 7.4 fueron unidos a placas cubiertas con estrepavidina durante una noche a 4°C (Nunc, NSW, Australia). Después, los pozos se lavaron cuatro veces con PBST, el mapeo de prototipos de los péptidos unidos a la placa se llevó a cabo mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones de Chiron Technologies usando suero de ratón a una dilución 1:1000 en polvo de leche desgrasada en PBS 0.1M, pH 7.4 que contiene 0.1% vol/vol de Tween 20 (PBST-LD) . Los pozos se lavaron después seis veces con PBST, se adicionó una dilución 1:2000 de IgG de cabra para IgG de ratón (Sigma, NSW, Australia) en PBST-LD y se permitió la unión por 2 horas a temperatura ambiente . Las placas se lavaron seis veces con PBST y se adicionó una dilución 1:5000 en PBST-LD de Horseradish conjugado con peroxidasa e inmunoglobulina de conejo anti-cabra (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) a cada pozo y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron seis veces con PBST, los anticuerpos ligados fueron detectados mediante la adición a cada pozo de 100 µ? de substrato ABTS [0.9 mM de 2,2'-azino-bis (3-etilbenzo-tiazolina-6) ácido sulfónico en 80 mM de ácido cítrico que contiene 0.005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4.0] . Se midió la densidad óptica a 415 nm usando un lector de microplacas (BioRad modelo 450) .
Análisis estadístico. Los datos de pérdida de hueso se analizaron estadísticamente usando el análisis de varianza de un sentido (ANOVA) y la prueba T3 de Dunnett (SPSS para Windows, versión 12) . Los títulos de anticuerposnlgA, IgM y la sub-clase IgG fueron analizados estadísticamente utilizando la prueba t de Student aplicando el software SPSS (SPSS para Windows, versión 12) .
Ejemplo 2 Caracterización y purificación de las proteínas recombinantes (KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1) . Con el propósito de caracterizar la habilidad de los fragmentos Kgp del dominio de adhesina Al y de los fragmentos de la proteinasa quimérica Kgp del dominio de adhesina Al para proteger contra la infección de P. gingivalis, expresamos y purificamos las proteínas recombinantes KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1. Las proteínas recombinantes (KsAl y KLA1) y las proteínas quiméricas recombinantes (KASl-KsAl y KAS2-KLA1) fueron purificadas a partir de cuerpos de inclusión utilizando cromatografía de afinidad de quelato de níquel y las proteínas purificadas fueron analizadas mediante SDS-PAGE (Fig. 1) Cada una de las proteínas recombinantes consistió de una banda de proteína mayor con pesos moleculares de 40, 36, 31 y 32 kDa que corresponden a KAS2-KLA1, KLA1, KsAl y KASl-KsAl y cuyos pesos correspondieron a las masas moleculares calculadas de las proteínas recombinantes con etiqueta His utilizando ProtParam. Para caracterizar la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1, éstas se usaron para inmunizar ratones y el suero se utilizó para probar en placas cubiertas con péptido KAS2 y en placas cubiertas con células de P. gingivalis W50 muertas con formalina (Fig. 2) . Se encontró que el antisuero de las proteínas quiméricas recombinantes KASl-KsAl y KAS2-KLA1 reconoce al péptido KAS2 (Fig. 2a) a un nivel similar al antisuero específico para KAS2 (toxoide conjugado KAS2-difteria) tan bien como para las células de P. gingivalis W50 muertas con formalina (Fig. 2B) . Sin embargo, el antisuero contra la proteína recombinante KLA1 solamente reconoció a las células de P. gingivalis W50 muertas con formalina (Fig. 2B) .
Ejemplo 3 Efecto de la inmunización con las proteínas recombinantes (KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1) en la pérdida de hueso alveolar inducido por P. gingivalis en un modelo de periodontitis en ratón. Las Proteínas recombinantes KsAl, KLA1, KASl-KsAl y KAS2-KLA1, las células de P. gingivalis cepa W50 muertas con formalina y el complejo RgpA-Kgp fueron usados para determinar y comparar la protección inducida contra la pérdida de hueso alveolar producida por P. gingivalis utilizando un modelo modificado en ratón de la pérdida de hueso periodontal basado en el que reportó Baker y colaboradores (4) . Los ratones fueron inmunizados (días 0 y 30) con cualquiera de las proteínas recombinantes KsAl, KLA1, KASl-KsAl ó KAS2-KLA1, complejo RgpA-Kgp ó células de P. gingivalis cepa 50 (FKW50) muertas con formalina ó adyuvante PBS sólo y fueron retados oralmente con células viables de P. gingivalis W50. La inmunización con todos los antígenos recombinantes, complejo RgpA-Kgp y células FK 50 protegió a los ratones BALB/c contra la pérdida de hueso alveolar inducida por P. gingivalis así también estos animales exhibieron significativamente (pDO.001) menos pérdida de hueso comparada con el grupo inmunizado con PBS (Fig. 3) . Sin embargo, los ratones inmunizados con KAS2-KLA1 tuvieron menos pérdida de hueso que los ratones inmunizados con KLA1 (pDO.Ol); KsAl (pDO.001); complejo RgpA-Kgp (pDO.001; células FKW50 (pDO.001) y ratones no-retados (pDO.001). No hubo diferencia significativa en la pérdida de hueso entre los ratones inmunizados con KAS2-KLA1 y KASl-KsAl. Además, los ratones inmunizados con KASl-KsAl exhibieron significativamente menos pérdida de hueso que los ratones no-retados (pDO.Ol) y qué los ratones retados con el complejo RgpA-Kgp (pDO.05) pero no hubo diferencia significativa de los ratones inmunizados con KsAl, KLA1 y FK-W50. No hubo diferencia significativa en pérdida de hueso entre los ratones inmunizados con KsAl, KLA1, complejo RgpA-Kgp y FKW50.
Ejemplo 4 Respuestas de subclases de anticuerpos inducidas por la inmunización con proteínas recombinantes (KsAl, KLA1, KAS1-KsAl y KAS2-KLA1) en los modelos de periodontitis en ratón.
Antes y después de retar por inmunización oral con células vivas de P. gingival s a los ratones, se obtuvieron muestras de sangre y el suero se recolectó por centrifugación. La Fig. 4 muestra la reactividad de las subclases de anticuerpos para las células de P. gingivalis W50 muertas con formalina para cada inmunógeno ((KsAl, KLA1, KASl-KsAl ó KAS2-KLA1 ó células de P. gingivalis cepa W50 [FK-W50] muertas con formalina) en el modelo de periodontitis en ratón. Todos los inmunógenos protectores indujeron un titulo alto de anticuerpos IgG para FK-W50. Además, la subclase de anticuerpo predominante inducido para cada inmunógeno protector fue IgGl con solo una débil inmunoreactividad de anticuerpos FK-W50-específicos IgG2a, IgG2b e IgG3 (Fig. 4) . La subclase de anticuerpo predominante inducido por cada inmunógeno tanto antes (Fig. 4A) como después (Fig. 4B) de la inoculación oral fue IgGl.
Ejemplo 5 Mapeo de prototipos de KAS2 (433-468) . Los ocho péptidos bio-reducidos sobrepuestos (neutralizado por uno, sobrepuesto por siete) para KAS2 (433-468) fueron sintetizados y usados para recubrir placas cubiertas con estreptavidina . Los anticuerpos ligados a los prototipos fueron entonces identificados usando antísuero de ratones inmunizados con KASl-KsAl, KAS2-KLA1 y con un toxoide conjugado de KAS2 -difteria (Fig. 5) . Un incremento de dos pliegues en la densidad óptica (415 nm) arriba del precedente fue considerado como una respuesta de anticuerpo positiva (umbral de DO) . El antisuero reconoció las siguientes secuencias de péptidos derivadas de la secuencia SEQ ID No. 28, esto es, KASl-KsAl reconoció los péptidos 435-442, 436-443, 445-452, 446-453 y 447-454 (umbral de DO = 0.07, Fig. 5A) . Esto sugiere el reconocimiento de un número mínimo de prototipos, esto es, el péptido 436-442 (VSFANYT y su variante VGFANYT) , el péptido 447-452 (ETAWAD y su variante ETSWAD) y el péptido 448-463 (TA ADP y su variante TSWADP) . Los péptidos, los cuales incluyen al péptido prototipo 436-442 incluyen GVSFA YT, GVGFANYT, VSFANYTA y VGFANYTA. Los péptidos los cuales incluyen el péptido 447-452 y/ó prototipos 448-453 incluyen SETAWAD , SETSWAD, ETAWADP , ETSWADP, TAWADPL Y TSWADPL, más particularmente GSETAWAD , GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL y TSWADPLL.
Ejemplo 6 Síntesis de péptidos KAS y RAS por conjugación para una proteína. Los péptidos fueron sintetizados manualmente ó usando un sintetizador de péptidos por micro-ondas CEM. Los protocolos estándar para la síntesis de péptidos en fase sólida para química Fmoc fueron usados en todo. Los péptidos fueron ensamblados en forma de carboxiamida utilizando el enlazante de Rink derivado de la resina A -sure (AAPPTEC, KY, USA) . El acoplamiento fue logrado con la activación HBTU/HOBt usando 4 equivalentes de Fmoc-aminoácido y 6 equivalentes de DIPEA. El grupo Fmoc fue removido con piperidina al 20% en HOBt/DMF 1M.
Las resinas que acarrean los péptidos KAS o RAS fueron tratadas con DMF y el grupo Fmoc N-terminal fue removido con DBU al 2% vol/vol en DMF que contiene piperidina al 2% vol/vol. El grupo amino N-terminal fue entonces separado con ácido S-Acetilmercaptoacético (SAMA) usando 5 equivalentes de SAMA-OPfp y 5 equivalentes de HOBt . La reacción fue monitoreada mediante la prueba de ácido trinitrobencen sulfónico (ATNBS) . Cuando la prueba ATNBS resulta negativa, la resina se regresa y se lava (5 x DMF, 3 x DCM y 3 x dietil éter) . La resina se seca bajo vacío. La separación de los péptidos de la resina de soporte se llevó a cabo utilizando una mezcla de separación TFA: fenol : TIPS : EDT : agua (92:2:2:2:2) durante 2.5 a 4 horas dependiendo del contenido de arginina en el péptido. Después de la separación, la resina fue removida por filtración y el filtrado se concentró a 1 mi aproximadamente bajó flujo de nitrógeno. Después, los péptidos producidos fueron precipitados en éter frío, se centrifugaron y lavaron tres veces. Los péptidos precipitados se disolvieron en 5 a 10 mi de agua que contiene TFA al 1% vol/vol y los residuos insolubles se eliminaron por centrifugación, los péptidos fueron purificados mediante RP-HPLC.
Puede usarse uri número de diferentes grupos químicos reactivos para la derivación de péptidos a proteínas de conjugación, tales como; haluros (bromo, cloro, iodo) , maleimido, succinimidil , hidrazinil, oxima y tiol, los cuales podrían usarse para conjugar los péptidos derivados a una proteína tal como KgpAl a través de sus residuos nativos de cisteína o han sido derivados con el grupo reactivo complementario que permite el enlace químico para proceder a formar un conjugado péptido-proteína .
Conjugación de Péptidos-SAMA a KA1. A una solución que contiene 10 mg/ml de KA1 recombinante u otro dominio de adhesina del complejo RgpA-Kgp en solución salina de fosfatos amortiguada (fosfato de sodio 0.1M, NaCl al 0.9%, pH 7.4) se le adicionó 0.1 mi de una solución al 1% p/v de éster de m-maleimido benzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) en DMF. Después de 30 minutos, el MBS sin reaccionar fue eliminado y el KA1 MBS -modificado fue recolectado mediante filtración en gel usando una columna PD10 (Pharmacia, NSW, Australia) equilibrado en solución amortiguadora para conjugación (fosfato de sodio 0.1M, 5mM de EDTA, pH 6.0). El péptido-SMA purificado (1.3 µt???ee) fue disuelto en 200 µ? de clorhidrato de guanidina 6M que contiene Tris 0.5M, 2 mM de EDTA, pH 6.0 y diluido con 800 µ? de agua MilliQ y desprotegido in-situ mediante la adición de 25 µ? de NH2OH (40 equiv) disueltos en agua MilliQ. El MBS-KA1 colectado fue hecho reaccionar inmediatamente con el péptido-SAMA desprotegido con agitación durante una hora a temperatura ambiente. El conjugado péptido-KAl fue separado del péptido sin reaccionar mediante filtración en gel usando una columna PD10 equilibrada en PBS pH 7.4 y liofilizado. La reacción fue monitoreada usando la prueba de Ellmans.
Ejemplo 7 Preparación de Anticuerpos. El antisuero policlonal para proteínas recombinantes fue preparado en ratones mediante la inmunización con las proteínas por vía subcutánea. Los ratones son inmunizados el día 0 y el día 30 con 25 µg de proteína en adyuvante incompleto de Freund. Las inmunizaciones son llevadas a cabo usando procedimientos estándar. Fue obtenido el antisuero policlonal que tiene un título alto contra las proteínas. Si se desea, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra las proteínas recombinantes usando procedimientos estándar .
Ejemplo 8 Inmunización para la generación de anticuerpos. Ratones BALB/c Ó CDl (ratones Swiss, cruza externa) de 6 a 8 semanas de edad (10 ratones por grupo) fueron inmunizados subcutáneamente (100 µ? s.c.) con 50 g de la quimera KAS2-LA1 o del antígeno emulsificado en adyuvante incompleto de Freund (AIF) . Después de 30 días los ratones fueron estimulados con antígeno (emulsificado en AIF, inyección s. c.) y 12 días más tarde se sacrificaron por sangría cardíaca para recolectar el suero.
Determinación de subclases de anticuerpos mediante ELISA.
Para determinar', las respuestas de subclases de anticuerpos del suero de ratón, se efectuaron ensayos de inmunosorbentes ligados a una enzima (ELISA) por triplicado usando 5 g/ml de una solución de quimera KAS2-LA1 ó células de P. gingivalis W50 muertas con formalina ó el complejo RgpA-Kgp en una solución amortiguadora salina de fosfatos (PBS) (Na2HP04 0.01M, 1.5 m de KH2P04 y NaCl 0.15M), pH 7.0 que contiene 0.1% (vol/vol) de Tween 20 (PBST) para recubrir los pozos de las placas para micro- titulación de polivinilo de fondo plano (Dynátech Laboratories, McLean, VA) . Después de eliminar la solución de recubrimiento, se adicionó PBST que contiene 2% (peso/vol) de polvo leche desgrasada a los pozos para bloquear el plástico sin recubrimiento durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar los pozos cuatro veces con PBST,. se adicionaron diluciones seriadas del suero de ratón en PBST que contiene 0.5% (peso/vol) de leche desgrasada (PBST-LD) a cada pozo y se incubó por 16 horas a temperatura ambiente. Después de que los pozos fueran lavados seis veces con PBST, se adicionó una dilución 1:2000 en PBST-LD de IgG de cabra para IgM, IgA, IgGl, IgG2a, IgG2b ó IgG3 de ratón (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) y se permitió reaccionar por 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas seis veces con PBST y se adicionó una dilución 1:5000 en PBST-LD de Horseradish conjugado con peroxidasa e inmunoglobulina de conejo anti-cabra (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) a cada pozo y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron seis veces con PBST, los anticuerpos ligados fueron detectados mediante la adición a cada pozo de 100 µ? de substrato ABTS [0.9 mM de 2 , 2 ' -azino-bis (3 -etilbenzo-tiazolina-6) ácido sulfónico en 80 mM de ácido cítrico que contiene 0.005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4.0] . Se midió la densidad óptica a 415 nm usando un lector de microplacas (BioRad modelo 450) .
Respuestas dé subclases de anticuerpos inducidas por inmunización con proteína recombinante KAS2-KLA1 en ratones de cruza externa (CD1, Swiss) . Los ratones CD1 (Swiss) fueron inmunizados con la quimera KAS2-LA1, se sangraron y el suero se recolectó por centrifugación. La Fig. 6 muestra la reactividad de las subclases de anticuerpos para la quimera KAS2-LA1, células de P. gingivalis W50 muertas con formalina y para el complejo RgpA-Kgp. La quimera KAS2-LA1 indujo una fuerte respuesta de anticuerpos IgG con una predominancia del anticuerpo IgGl que reconoció la quimera KAS2-LA1 y presentó una fuerte reacción cruzada con las células FK W50 de P. gingivalis y con el complejo RgpA-Kgp (Fig. 6) . Además, la quimera KAS2-LA1 solamente indujo una débil respuesta inmunoreactiva con los anticuerpos antígeno-específieos IgG2a, IgG2b e IgG3 (Fig. 6) .
Ejemplo 9 Desarrollo de un modelo estructural de una Kgp e Identificación de Secuencias Accesibles a la Superficie del Sitio Activo. Nuestro trabajo ha mostrado que los péptidos del sitio activo de la Kgp proteinasa son altamente inmunogénicos e inducen altos niveles de protección contra la pérdida de hueso inducida por P. gingivalis. En un intento para identificar más detalladamente los péptidos del sitio activo de la proteinasa candidatos como vacuna, fue desarrollado un modelo del dominio catalítico de Kgp mediante el uso de la serie de programas Orchestrar dentro de Sybyl 7.3 (Fig. 7) . El modelo está basado en la estructura PDB lcrv de la proteasa RgpB de P. gingivalis, las proteínas tienen un 23.58% de identidad de parejas y el puntaje Z es de 25.09 (un modelo de alta confianza) . El servidor de interacción de proteínas Meta-PPisp predice dos superficies de interacción proteína-proteína para Kgp; la superficie de enlace del substrato (como en RgpB) y una segunda superficie única para Kgp. Las mayores diferencias entre los modelos de RgpB y Kgp están en las vueltas que enmarcan la segunda superficie de interacción y un espacio de 19 residuos (Val 526 a Fen 545) que no pueden ser modelados en Kgp y que fallan dentro de la segunda superficie de interacción. La Fig. 7 muestra el modelo de Kgp con los cordones más gruesos que muestran las secuencias de superficie accesibles alrededor del sitio activo de la proteasa Kgp, se encontró que las secuencias de superficie accesibles son Asp388-Gln394, Leu421-Ala423 , Ala443-Glu447 con Ala451, Asn510 -Trp513 e Ile570-Gli577 con Tir580. Del modelo (Fig. 6) es evidente que junto con KAS2 (A) otras tres secuencias KAS4 (Asp388-Val395) (B) , KAS5 (Asn510-Asp516) (C) y KAS6 ( Ile570-Tir580 ) (D) son prominentes y de longitud suficiente para ser objetivos de vacunas. Así, puede ser producida una proteína quimérica recombinante que tiene cada uno de estos péptidos en secuencia y unidos al N-terminal de KLA1 para producir una multiKAS-KLAl que puede ser usada para inducir una respuesta inmune y, por consiguiente, proteger contra enfermedades o condiciones relacionadas con P. gingivalis.
Ejemplo 10 Proceso para el modelaje de Arg-X-proteinasa para identificar regiones inmunogénicas que rodean el sitio catalítico. La estructura tridimensional de la Arg-X-proteinasa se determinó en concordancia con los métodos de Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, edrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. Estructura cristalina de gingipain R; una cisteína proteinasa bacteriana Arg-específica con un pliegue tipo caspasa. EMBO J. 1999 Oct 15 ; 18 ( 20) : 5453 -62 Ejemplo 11 El siguiente es un ejemplo de la formulación de una pasta dental que contiene anticuerpos.
Ingrediente * p/p Fosfato dicálcico dihidratado 50.0 Glicerol 20.0 Carboximetil celulosa sódica 1.0 Lauril sulfato de sodio 1.5 Lauroil sarconisato de sodio 0.5 Saborizante 1.0 Sacarina de sodio 0.1 Gluconato de clorhexidina 0.01 Dextranasa 0.01 Suero de cabra que contiene anticuerpos específicos 0.2 Agua balance Ejemplo 12 El siguiente es el ejemplo de una formulación de pasta dental .
Ingrediente ¾ p/p Fosfato dicálcico dihidratado 50.0 Sorbitol 10.0 Glicerol 10.0 Carboximetil celulosa sódica 1.0 Lauril sulfato de sodio 1.5 Lauroil sarconisato de sodio 0.5 Saborizante 1.0 Sacarina de sodio 0.1 Monofluorofosfato de sodio 0.3 Gluconato de clorhexidina 0.01 Dextranasa 0.01 Suero bovino que contiene anticuerpos específicos 0.2 Agua balance Ejemplo 13 El siguiente es el ejemplo de una formulación de pasta dental .
Ingrediente ¾ p/p Fosfato dicálcico dihidratado 50.0 Sorbitol 10.0 Glicerol 10.0 Carboximetil celulosa sódica 1.0 Lauroil dietanolaraida Monolaurato de sucrosa 2.0 Saborizante 1.0 Sacarina de sodio 0.1 Monofluorofosfato de sodio 0.3 Gluconato de clorhexidina 0.01 Dextranasa 0.01 Ig de leche bovina que contiene anticuerpos específicos 0.1 Agua balance Ejemplo 14 El siguiente es el ejemplo de una formulación de pasta dental .
Ingrediente Sorbitol Musgo Irlandés Hidróxido de sodio (50%) Gantrez Agua (desionizada) Monof luorofosfato de sodio Sacarina de sodio Pirofosfato 2.0 Alumina hidratada 48.0 Aceite saborizante 0.95 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Lauril sulfato de sodio 2.0 Ejemplo 15 El siguiente es el ejemplo de una formulación líquida de pasta dental.
Ingrediente ¾ p/p Poliacrilato de sodio 50.0 Sorbitol 10.0 Glicerol 20.0 Saborizante 1.0 Sacarina de sodio 0.1 Monof luorofosfato de sodio 0.3 Gluconato de clorhexidina 0.01 Etanol 3.0 Ig equina que contiene anticuerpos específicos 0.2 Acido linólico 0.05 Agua balance Ejemplo 16 El siguiente es el ejemplo de una formulación de enjuague bucal .
Ingrediente ¾ p/p Etanol 20.0 Saborizante 1.0 Sacarina de sodio 0.1 Monofluorofosfato de sodio 0.3 Gluconato de clorhexidina 0.01 Lauroil dietanolamida 0.3 Ig de conejo que contiene anticuerpos específicos 0.2 Agua balance Ejemplo 17 El siguiente es el ejemplo de una formulación de enjuague bucal.
Ingrediente % p/p Gantrez S-97 2.5 Glicerina 10.0 Aceite saborizante 0.4 Monofluorofosfato de sodio 0.05 Gluconato de clorhexidina 0.01 Lauroil dietanolamida 0.2 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Agua balance Ejemplo 18 El siguiente es el ejemplo de una formulación de un caramelo, Ingrediente % p/p Azúcar 75-80 Jarabe de maíz 1-20 Aceite saborizante 1-2 NaF 0.01-0.05 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Estearato de magnesio 1-5 Agua balance Ejemplo 19 El siguiente es el ejemplo de la formulación de una crema para masaje gingival.
Ingrediente % p/p Petrolato blanco 8.0 Propilen glicol 4.0 Alcohol estearílico 8.0 Polietilen Glicol 4000 25.0 Polietilen Glicol 400 37.0 Monoestearato de sucrosa 0.5 Gluconato de clorhexidina 0.1 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Agua balance Ejemplo 20 El siguiente es el ejemplo de la formulación de una goma de mascar .
Ingrediente % p/p Goma base 30.0 Carbonato de calcio 2.0 Sorbitol cristalino 53.0 Glicerina 0.5 Aceite saborizante 0.1 Anticuerpos monoclonales de ratón 0.3 Agua balance Ejemplo 21 El siguiente es el ejemplo de una formulación farmacéutica.
Ingrediente % p/p Anticuerpos monoclonales específicos humanizados 10 Solución salina estéril amortiguada con fosfato 90 Ejemplo 22 El siguiente es el ejemplo de la formulación de un gel periodontal.
Ingrediente % p/p Pluronic F127 20.0 Alcohol estearílico 8.0 Anticuerpos específicos 3.0 Dióxido de silicio coloidal (Aerosil 200) 1.0 Gluconato de clorhexidina 0.1 Agua balance Debe entenderse que mientras la invención se ha descrito con detalles, los ejemplos se presentan para propósitos ilustrativos solamente. Otras modificaciones de los ejemplos típicos de la presente invención que son obvias para aquellos con habilidad en el campo de la biología molecular, diagnóstico dental y disciplinas relacionadas, son destinadas a estar dentro del campo de la invención.
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Claims (70)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES
1. Una proteíná de fusión o quimérica para la inducción de una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína, que incluye un primer péptido unido directamente o a través de un enlace a un segundo péptido, está caracterizada porque: (A) el primer péptido incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No .1; o (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2; y (B) el segundo péptido incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; o (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; o (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
2. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 3 o 4.
3. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No . 5 a 8.
4. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las ' secuencias SEQ ID No. 9 a 12.
5. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 13 a 18.
6. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 19 a 26.
7. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 27 a 30.
8. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 31 a 34.
9. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer péptido incluye una secuencia que es homologa a una de las secuencias SEQ ID No . 3 a 34.
10. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el segundo péptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 35 o, un fragmento de la misma que incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 36.
11. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el segundo péptido incluye la secuencia mostrada en las secuencias SEQ ID No. 36 o 37.
12. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 1, caracterizada porque: (a) el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 27 al 30; y (b) el segundo péptido incluye la secuencia mostrada en las secuencias SEQ ID No. 36 o 37.
13. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el segundo péptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma que incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
14. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 13, caracterizada porque el segundo péptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
15. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación I, caracterizada porque: (a) el primer péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 31 a 34; y (b) el segundo péptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
16. Una proteína de fusión o quimérica para la inducción de una respuesta inmune para P. gingivalis, la proteína, que incluye un péptido unido directamente o a través de un enlace a un polipéptido, está caracterizada porque: (A) el péptido incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No .1 ; o (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2; y (B) el polipéptido incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; o (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; o (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
17. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 16, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 3 o 4.
18. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No . 5 a 8.
19. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 9 a 12.
20. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 13 a 18.
21. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 19 a 26.
22. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 27 a 30.
23. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 16, caracterizada porque el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 31 a 34.
24. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 16, caracterizada porque el péptido incluye una secuencia que es homologa a una de las secuencias SEQ ID No. 3 a 34.
25. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizada porque el polipéptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 35 o un fragmento de la misma que incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 36.
26. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 25, caracterizada porque el polipéptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 36 ó 37.
27. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 16, caracterizada porque: (a) el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 27 a 30; y (b) el polipéptido incluye la secuencia mostrada en las secuencias SEQ ID No. 36 ó 37.
28. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24, caracterizada porque el polipéptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 38 o un fragmento de la misma que incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
29. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 28, caracterizada porque el polipéptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
30. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 16, caracterizada porque: (a) el péptido incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 31 a 34; y (b) el polipéptido incluye la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
31. Un péptido para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis caracterizado porque está seleccionado del grupo que consiste de: (i) una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No. 64 a 66; y (ii) una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en la SEQ ID No. 67 ó 68.
32. Una proteína de fusión o quimérica que comprende un primer péptido unido directamente, o a través de un enlace, a un segundo péptido, caracterizada porque el primer péptido es un péptido en concordancia con la reivindicación 31.
33. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 32, caracterizada porque el segundo péptido incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; o (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; o (iii) una parte o él total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de HagA de P. gingivalis.
34. Una proteína de fusión o- quimérica, en concordancia con la reivindicación 33, caracterizada porque el segundo péptido tiene una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 35, o un fragmento que tiene la secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 36.
35. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 33, caracterizada porque el segundo péptido tiene una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 36 ó 37.
36. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 33, caracterizada porque el segundo péptido tiene una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 38, o un fragmento que tiene la secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
37. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 36, caracterizada porque el segundo péptido tiene una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 39.
38. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 37, caracterizada porque el segundo péptido está presente en forma de un polipéptido.
39. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 38, que incluye por lo menos un péptido adicional caracterizada porque : (C) el péptido adicional incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No.1; O (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia mostrada en SEQ ID No. 2; o (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; o (iv) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; o (v) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P . · gingivalis .
40. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 39, caracterizada porque el residuo C-terminal del primer péptido está unido covalentemente de forma directa o mediante un enlace al residuo N- terminal del segundo péptido, o caracterizada porqué el residuo C-terminal del péptido está unido covalentemente en forma directa o mediante un enlace al residuo N- terminal de dicho polipéptido.
41. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 39, caracterizada porque el residuo N- terminal del primer péptido está unido covalentemente de forma directa o mediante un enlace al residuo C-terminal del segundo péptido, o caracterizada porque el residuo N-terminal del péptido está unido covalentemente en forma directa o mediante un enlace al residuo C-terminal de dicho polipéptido.
42. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 41, caracterizada porque el primer péptido está unido al segundo péptido mediante el enlace de hasta 15 aminoácidos de longitud, preferentemente menos de 5 aminoácidos de longitud, o caracterizada porque dicho péptido está unido al polipéptido mediante un enlace de hasta 15 aminoácidos de longitud, preferentemente menos de 5 aminoácidos de longitud.
43. Una composición que incluye una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42.
44. Una composición, en concordancia con la reivindicación 43, caracterizada porque incluye adicionalmente un adyuvante.
45. Un método de prevención o reducción de la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que incluye la administración al sujeto de una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42, o una composición en concordancia con la reivindicación 43 ó 44.
46. El uso de una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42, o una composición, en concordancia con la reivindicación 43 ó 44 en, o en la manufactura de un medicamento para la prevención o reducción de la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto.
47. Un anticuerpo formulado contra una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42.
48. Un anticuerpo, en concordancia con la reivindicación 47, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.
49. Un método de prevención o reducción de la severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que incluye la administración al sujeto de un anticuerpo, en concordancia con la reivindicación 47 ó 48.
50. El uso de un anticuerpo, en concordancia con la reivindicación 47 ó 48, en la manufactura de medicamento para prevenir o reducir la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un suj eto .
51. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque incluye una secuencia que codifica una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42.
52. Una molécula de ácido nucleico, en concordancia con la reivindicación 51, caracterizada porque dicha secuencia está enlazada operativamente a por lo menos un elemento regulador .
53. Un vector caracterizado porque incluye una molécula de ácido nucleico, en concordancia con la reivindicación 51 ó 52.
54. Un vector, en concordancia con la reivindicación 53 caracterizado porque es una vacuna bacteriana ó viral.
55. Una célula procariotica o eucariótica caracterizada porque incluye una molécula de ácido nucleico, en concordancia con la reivindicación 51 o 52, o un vector de conformidad con la reivindicación 53 ó 54.
56. Un método de prevención o reducción de la incidencia o severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, método que incluye la administración al sujeto de una molécula de ácido nucleico, en concordancia con la reivindicación 51 ó 52, un vector, en concordancia con la reivindicación 53 ó 54, o una célula procariotica o eucariótica, en concordancia con la reivindicación 55.
57. El uso de una molécula de ácido nucleico, en concordancia con la reivindicación 51 ó 52, un vector, en concordancia con la reivindicación 53 ó 54, o una célula procariotica o eucariótica, en concordancia con la reivindicación 55, en la manufactura de un medicamento para la prevención o reducción de la severidad de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto.
58. Un método para el diagnóstico o monitoreo de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, caracterizado porque incluye el uso de una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42, para detectar anticuerpos anti-P. gingivalis en una muestra biológica proveniente de dicho sujeto.
59. El uso de una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 ó 32 a 42, para detectar anticuerpos anti-P. gingivalis en una muestra biológica de un sujeto.
60. Un método para el diagnóstico o monitoreo de una enfermedad o condición relacionada con P. gingivalis en un sujeto, caracterizado porque incluye el uso de un anticuerpo, en concordancia con la reivindicación 47 ó 48, para detectar la presencia de P. gingivalis en una muestra biológica de dicho sujeto.
61. El uso de un anticuerpo, en concordancia con la reivindicación 47 ó 48, para detectar la presencia de P. gingivalis en una muestra biológica de un sujeto.
62. Un péptido para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis caracterizado porque incluye la secuencia mostrada en una de las secuencias SEQ ID No.17, 18, 25 y 26.
63. Un péptido, en concordancia con la reivindicación 62, caracterizado porqué tiene una secuencia que es homologa a una de las secuencias SEQ ID No. 17, 18, 25 y 26.
64. Un péptido, en concordancia con la reivindicación 62 ó 63, caracterizado porque tiene una longitud de 5 a 40 aminoácidos.
65. Un ácido nucleico que codifica un péptido, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64.
66. El uso de un péptido, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, o un ácido nucleico, en concordancia con la reivindicación 65, para la manufactura de una proteína de fusión o quimérica para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis.
67. El uso de un péptido, en concordancia con cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, para inducir una respuesta inmune para P. gingivalis.
68. El uso, en concordancia con la reivindicación 67, en donde dicho péptido es administrado simultáneamente o secuencialmente con un segundo péptido que incluye: (i) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lis-X-proteinasa de P. gingivalis; o (ii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivalis; o (iii) una parte o el total de una secuencia que es igual u homologa a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivalis.
69. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 1 ó 32, caracterizada porque el segundo péptido incluye o consiste de una secuencia mostrada en una o más de SEQ ID No. 69 a 79 ó una o más de 83 a 85.
70. Una proteína de fusión o quimérica, en concordancia con la reivindicación 69, caracterizada porque el primer péptido incluye o consiste de una secuencia mostrada en una o más de SEQ ID No. 3 a 26 ó una o más de 64 a 68.
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Class et al. Patent application title: SYNTHETIC PEPTIDE CONSTRUCTS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF PERIODONTIS ASSOCIATED WITH PORPHYROMONAS GINGIVALIS Inventors: Eric Charles Reynolds (Deepdene, AU) Neil Martin O'Brien-Simpson (Brunswick, AU) Nada Slakeski (Kew East, AU) Assignees: THE UNIVERSITY OF MELBOURNE

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