ES2633738T3

ES2633738T3 - Prevención, tratamiento y diagnóstico de la infección por p. gingivales

Info

Publication number: ES2633738T3
Application number: ES09809116.8T
Authority: ES
Inventors: Eric Charles Reynolds; Neil Martin O'brien Simpson; Keith J. CROSS; Nada Slakeski
Original assignee: Oral Health Australia Pty Ltd
Current assignee: Oral Health Australia Pty Ltd
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2017-09-25
Anticipated expiration: 2029-08-28
Also published as: CN102203121A; TWI473626B; RU2011108943A; JP2012500633A; PL2328914T3; CA2735171A1; DK2328914T3; KR20110061586A; US20150079095A1; US8871213B2; US20190194263A1; MX2011001949A; MY178905A; IL211394B; US20210079047A1; NZ591612A; US20110280880A1; EP2328914A4; EP2328914B1; US20230374081A1

Abstract

Una proteína quimérica o de fusión capaz de inducir una respuesta inmune a P. gingivalis, comprendiendo la proteína un primer péptido unido directamente o a través de un conector a un segundo polipéptido, en el que: (A) dicho primer péptido comprende una región de una enzima similar a tripsina P.gingivalesseleccionada del grupo que consiste en: (i) una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1; (ii) una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2; (iii) la secuencia mostrada en una de SEQ ID NOs: 27 a 30; y (iv) la secuencia mostrada en una de SEQ ID NOs: 31 a 34; (B) dicho segundo polipéptido comprende un dominio de adhesina de P. gingivalis, seleccionado del grupo que consiste en: 15 (i) una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35; y (ii) una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 36 o 37.

Description

Campo de la invención

[0001] La invención se refiere a péptidos y proteínas quiméricas o de fusión y al uso de estas proteínas para provocar respuestas celulares y humorales para la prevención y el tratamiento de P. gingivales-condiciones y enfermedades relacionadas.

Antecedentes de la invención

[0002] Periodontitis crónica es una enfermedad inflamatoria de los tejidos de soporte de los dientes que conducen a la resorción de hueso alveolar y la pérdida de dientes eventual. La enfermedad es un importante problema de salud pública en todas las sociedades y se estima que afecta hasta el 15% de la población adulta con formas graves que afectan al 5-6%.

[0003] El desarrollo y la progresión de la periodontitis crónica se han asociado con las bacterias Gram-negativas específicas en la placa subgingival. La presencia de Porphyromonasgingivalesen placa subgingival ha sido fuertemente asociada con la enfermedad.

[0004] La persistencia de P. gingivales en placa subgingival de pacientes con periodontitis después del tratamiento (raspado y alisado radicular) se ha informado de que se asociaron significativamente con la pérdida progresiva del hueso alveolar. Además un incremento en el número de células P.gingivalesen placa subgingival se ha demostrado que se correlaciona con la gravedad de la enfermedad, medida por la pérdida de inserción, profundidad de la bolsa periodontal y sangrado al sondaje.

[0005] La infección oral con P. gingivales se ha demostrado que induce la pérdida de hueso periodontal en ratones, ratas y primates no humanos. Además, ha habido una creciente vinculación de la enfermedad periodontal, y de infección P. gingivales, con las enfermedades cardiovasculares y ciertos cánceres.

[0006] Se ha descrito una serie de factores de virulencia para contribuir a la patogenicidad de P. gingivales incluyendo; LPS, fimbrias, hemaglutinina, hemolisina y las enzimas hidrolíticas extracelulares (especialmente proteinasas específicas Arg-X y Lys-X), también conocidas como "enzimas similares a la tripsina P. gingivales". [0007] La magnitud del problema de salud pública es tal que hay una necesidad de un antisuero, particularmente anticuerpos específicos que proporcionan una respuesta protectora fuerte para la infección P. gingivales y medios para proporcionar la misma.

[0008] Un problema ha sido que no está claro cómo obtener una respuesta protectora fuerte a la infección por P. gingivales, donde hay una gran cantidad de factores de virulencia de la que elegir.

[0009] La inmunogenicidad relativa de epítopos entre los factores de virulencia no se entiende bien, ni es la inmunogenicidad relativa de epítopos en un factor dado, en particular cuando no está claro en cuanto a si más epítopos aún no se han identificado.

[0010] Un problema particular ha sido que muchos factores de virulencia se forman a partir de múltiples dominios y son difíciles de expresar de manera que presente una conformación próxima a la encontrada en P.gingivalesAdemás, cuando estos dominios se expresan como unidades discretas es decir, en el aislamiento de otros dominios del factor de virulencia, tienden a plegarse en una conformación distinta de la que se encuentra en la

P. gingivalis. [0011] Además, de las muchas opciones diferentes para modificar la inmunogenicidad de un factor de virulencia que no está claro que sería más probable que proporcione una respuesta inmune protectora.

[0012] En el trabajo que condujo a la presente invención los inventores han identificado péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es la misma que, o que comparte homología con, una secuencia de aminoácidos que forma una región de una enzima de tripsina de P. gingivalis, definiendo dicha región un sitio en dicha enzima para la escisión de un terminal C situado en enlace peptídico a Lys o Arg en un péptido que contiene Lys o Arg, y se incorpora un péptido tal en una proteína quimérica o de fusión que, cuando se utiliza como una vacuna, proporciona una mejor protección contra la destrucción del tejido periodontal de complejo de proteinasa-adhesina purificada formada a partir de enzima nativa de tipo tripsina P.gingivaleso células enteras muertas.

Resumen de la invención y la descripción

[0013] La presente invención proporciona una proteína quimérica o de fusión capaz de inducir una respuesta inmune a P. gingivalis, comprendiendo la proteína un primer péptido unido directamente o a través de un conector a un

segundo polipéptido, en el que:

(A): dicho primer péptido comprende una región de una enzima similar a tripsina de P.gingivalesseleccionada del grupo que consiste en:

(i): una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1;

(ii): una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia mostrada en una de las SEQ ID Nos: 27 a 30; y

(iv) la secuencia mostrada en una de las SEQ ID Nos: 31 a 34;

(B): comprendiendo dicho segundo polipéptido un dominio de adhesión de P. gingivalis, seleccionado del grupo que consiste en:

(i): una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35; y

(ii): una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 36 ó 37.

[0014] Se da a conocer en el presente documento una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmune a P. gingivalis, incluyendo la proteína un primer péptido unido directamente o a través de un conector a un segundo péptido, en donde:

(A): dicho primer péptido incluye:

(i): parte o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1; o

(ii): una parte o la totalidad de una secuencia que es igual a, o homóloga a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(B): dicho segundo péptido incluye:

(i) una parte o la totalidad de una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina incluyendo un péptido unido directamente o a través de un enlazador a un polipéptido, en el que:

(A): dicho péptido incluye:

(i): una parte o la totalidad de una secuencia que es igual a, o homóloga a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1; o

(ii): una parte o la totalidad de una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(B): dicho polipéptido incluye:

(i): parte, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivales; o

(ii): parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivales; o

(iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivales.

[0015] También se describe aquí una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmune a P. gingivales, incluyendo la proteína un péptido unido directamente o a través de un enlazador a un polipéptido, en el que:

(A): dicho péptido incluye:

(i): parte de, o toda la secuencia que es igual a, o homóloga a la secuencia mostrada en SEQ ID No:1; o

(ii): Parte de, o toda la secuencia que es igual a, o homóloga a la secuencia mostrada en SEQ ID No:2; y

(B): dicho polipéptido incluye:

(i) parte de, o toda la secuencia que es igual a, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivales; o

(ii) parte de, o toda una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivales; o

(iii) una parte o la totalidad de una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivales.

[0016] También se describe aquí un péptido para inducir una respuesta inmune a P. gingivales, teniendo el péptido una secuencia:

(i): que es igual a, o homóloga a la secuencia mostrada en una de las SEQ ID NO: 64 a 66; y

(ii): que es igual a, o homóloga a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 67 ó 68.

[0017] El péptido que tiene una secuencia que es la misma que u homóloga a la secuencia mostrada en una de SEQ ID No: 64 a 68 pueden proporcionarse en la forma de una proteína quimérica o de fusión en la que el péptido se une directamente o a través de un enlazador a un segundo péptido, en el que el segundo péptido incluye:

(ii): una parte o la totalidad de una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina del Arg-X-proteinasa de P. gingivales; o

(iii) parte o la totalidad de una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. Gingivales

[0018] En aún otro aspecto, la invención proporciona una composición tal como una composición antigénica, en particular una composición de vacuna, incluyendo una proteína o péptido quimérico o de fusión como se describe ampliamente anteriormente, opcionalmente en asociación con un adyuvante.

[0019] En este aspecto, la invención también proporciona una proteína quimérica o de fusión o una composición para uso en un método para prevenir o reducir la incidencia o gravedad de una condición relacionada con P. gingivales o enfermedad relacionada en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una proteína quimérica o de fusión como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente.

[0020] En este aspecto, la invención proporciona además el uso de una proteína quimérica o de fusión como se describió anteriormente, o una composición como se ha descrito anteriormente, en, o en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la incidencia o gravedad de una condición relacionada con P. gingivales o enfermedad relacionada en un sujeto.

[0021] También se describe aquí un anticuerpo, particularmente un anticuerpo monoclonal, dirigido contra una proteína o péptido quimérico o de fusión como se describe ampliamente anteriormente.

[0022] También se describe aquí un método para prevenir o reducir la gravedad de P. gingivales relacionada con la enfermedad o afección en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo como se ha descrito anteriormente.

[0023] También se describe en el presente documento es el uso de un anticuerpo como se describió anteriormente en, o en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la incidencia o gravedad de una condición relacionada con P. gingivales o enfermedad relacionada en un sujeto.

[0024] En aún otro aspecto, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica o de fusión como se describe ampliamente anteriormente, opcionalmente unido operativamente a al menos un elemento regulador.

[0025] En este aspecto, la invención proporciona además un vector que incluye una molécula de ácido nucleico de este tipo, así como una célula procariota o eucariota que incluye una molécula de ácido nucleico.

[0026] En este aspecto, la invención también proporciona una molécula de ácido nucleico, un vector o una célula procariota o eucariota para su uso en un método para prevenir o reducir la incidencia o gravedad de una afección o enfermedad relacionada con P.gingivalesen un sujeto, que comprende administrar al sujeto una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, un vector como se ha descrito anteriormente, o una célula procariota o eucariótica como se ha descrito anteriormente.

[0027] En este aspecto, la invención proporciona además el uso de una molécula de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, un vector como se describe anteriormente, o una célula procariota o eucariota tal como se

describe anteriormente, en, o en la fabricación de un medicamento para prevenir o reducir la gravedad de P. gingivales relacionada con la enfermedad o afección en un sujeto.

[0028] En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para el diagnóstico o monitorización de condición relacionada con P. gingivales o enfermedad en un sujeto, que comprende el uso de una proteína quimérica o de fusión como se ha descrito arriba para detectar anticuerpos anti-P.gingivalesen una muestra biológica de dicho sujeto.

[0029] En este aspecto, la invención también proporciona el uso de una proteína quimérica o de fusión como se describió anteriormente, para detectar anticuerpos anti-P.gingivalesen una muestra biológica de un sujeto.

[0030] También se describe aquí un método para el diagnóstico o monitorización de una condición relacionada con

P. gingivales o enfermedad en un sujeto, que comprende el uso de un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, para detectar la presencia de P.gingivalesen una muestra biológica de dicho sujeto.

[0031] También se describe en el presente documento el uso de un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, para detectar la presencia de P.gingivalesen una muestra biológica de un sujeto.

[0032] También se describe aquí un uso de un péptido que tiene parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a una secuencia de una proteinasa de P. gingivales Lys-X o Arg-X, o un ácido nucleico que codifica dicho péptido, para la fabricación de una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmune a la P. gingivales. En este aspecto, el péptido puede tener una secuencia mostrada en una de las SEC ID Nº: 17, 18, 25 ó 26.

Breve descripción de los dibujos

[0033]

La Figura 1 muestra una tinción de azul de Coomassie del gel SDS-PAGE de Proteínas Kgp recombinantes. Carril 1 = KAS2-KLA1, Carril 2 = KLA1, Carril 3 = KsA1, Carril 4 = KAS1-KsA1. Los marcadores de peso molecular se indican como kDa.

La Figura 2 muestra el reconocimiento del anticuerpo del péptido KAS2 y células W50 de P.gingivalesmatadas por formalina. (A) Péptido KAS2 se sondó con antisuero elevado a células W50 de P.gingivales(FK-W50) matadas por formalina, proteínas recombinantes KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, y el conjugado KAS2-DT sintético y PBS en un ELISA. (B) células W50 de P.gingivalesmatadas por formalina se sondearon con antisueros a células W50 de P.gingivales(FK-W50) matadas por formalina, proteínas recombinantes KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, KLA1 y PBS en un ELISA. Las respuestas de anticuerpos se expresan como el título ELISA OD415 obtenido menos el doble del nivel de fondo, con cada título que representa la media 6 desviación estándar de tres valores.

La Figura 3 muestra P.gingivalesinducida por la pérdida de hueso horizontal de los molares maxilares de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes y proteínas de quimera recombinantes, P.gingivalesmatadas por formalina y adyuvante solo (PBS, IFA) o ratones no oralmente infectados (no retados). En esta figura KAS2-KLA1 se muestra como AS2-LA1, KLA1 se muestra como LA1, KAS1-KsA1 se muestra como AS1-sA1, KsA1 se muestra como sA1. La medición de la pérdida ósea es la media del área medida en milímetros al cuadrado (mm2) desde la unión cementoenamel (CEJ) hasta la cresta alveolar ósea (ABC) del lado bucal de cada molar superior de ambos maxilares izquierdo y derecho. Los datos se distribuyeron normalmente según la homogeneidad de varianza de Levene y se presentaron como media (n = 12) en mm2 y se analizaron utilizando el análisis de varianza de una vía y la prueba T3 de Dunnett. *, Indica que el grupo tiene una pérdida ósea significativamente menor (P <0,001) que el grupo control (infectado). t, indica que el grupo tiene significativamente (P <0,001) más pérdida ósea que el grupo AS2-LA1.

La Figura 4 muestra las respuestas de subclases de anticuerpos séricos de ratones inmunizados en el modelo de periodontitis. Los sueros de los ratones; A (inoculación pre-oral) y B (inoculación post-oral) inmunizados con proteínas recombinantes KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1 y a la cepa W50 de P.gingivalesmatada por formalina se utilizaron en el ELISA con la Cepa W50 P.gingivalesmatada por formalina como antígeno adsorbido. Las respuestas de anticuerpos IgG (barras negras), IgG1 (barras grises), IgG2a (barras blancas), IgG2b (barras de rayas horizontales), IgG3 (barras diagonales a rayas), se expresan como el título de ELISA (log2) obtenido menos el nivel de fondo, con cada título que representa la desviación estándar media ± de tres valores.

La Figura 5 muestra un análisis PEPSCAN de la reactividad de anticuerpos específicos de péptidos a péptidos superpuestos que representan la secuencia peptídica de KAS2 433-468. (A) Péptidos superpuestos con KAS2 (desplazamiento 1, solape 7) sondado con antisueros KAS1-KsA1 (barras blancas), KAS2-KLA1 (barras negras).

(B) péptidos que se solapan KAS2 (desplazamiento, solapamiento 7) sondados con antisueros conjugados con KAS2-DT. Cada barra muestra la reactividad del anticuerpo (densidad óptica [OD] a 415 nm).

La Figura 6. Quimera AS2-LA1 induce una respuesta de anticuerpos en ratones exógenos que reconoce células enteras de P.gingivales y el complejo RgpA-Kgp. Se inmunizaron ratones CD1 con la quimera AS2-LA1 (50 mg/ratón) y los sueros recogidos utilizados en ELISA con AS2-LA1 (A), cepa W50 de P gingivales matada por formalina y (B) el complejo de RgpA-Kgp (C) como los antígenos absorbidos. En esta figura KAS2-KLA1 se muestra como AS2-LA1. Se determinó el título para cada isotipo de inmunoglobulina para cada antígeno y los datos expresados como el título ELISA ('000) obtenido menos el doble del nivel de fondo, representando cada título la desviación estándar media + de tres valores.

Figura 7. Modelo proteico de la proteinasa Kgp. KAS2 [Asn433 -Lys468]. (A) KAS4 [Asp388 -Val395] (B), KAS5 [Asn510 -Asp516] (C) y KAS6 [Ile570 -Tyr580] (D).

Descripción detallada de las formas de realización

[0034] Los inventores han encontrado que las regiones de enzimas similares a tripsina P. gingivales que flanquean o de otra manera definen un sitio catalítico o activo para la escisión de un enlace peptídico son altamente inmunogénicas y de hecho suficientes para proporcionar una respuesta humoral a infección P. gingivales. En particular, se ha encontrado que una proteína quimérica o de fusión que incluye una o más de estas regiones proporciona protección contra pérdida de hueso alveolar que es mayor que la observada para los antisueros contra células enteras y otros inmunógenos. El hallazgo es particularmente sorprendente, ya que, hasta la fecha, el dominio catalítico de las enzimas similares a la tripsina de P. gingivales se ha encontrado para ser relativamente débilmente inmunogénica.

[0035] La presente invención proporciona una proteína quimérica o de fusión capaz de inducir una respuesta inmune a P. gingivales, comprendiendo la proteína un primer péptido unido directamente o a través de un conector a un segundo polipéptido, en el que:

(A): dicho primer péptido comprende una región de una enzima similar a tripsina P. gingivales seleccionada del grupo que consiste en:

(iii) la secuencia mostrada en una de las SEQ ID Nos: 27 a 30; y

(iv) la secuencia mostrada en una de las SEQ ID Nos: 31 a 34;

(B): comprendiendo dicho segundo polipéptido un dominio de adhesión de P. gingivales, seleccionado del grupo que consiste en:

[0036] Tal como se utiliza aquí, el término "péptido" se usa para referirse a una secuencia de aminoácidos de hasta aproximadamente 40 residuos de aminoácidos, preferiblemente de 5 a 40 residuos de aminoácidos.

[0037] En una realización, un polipéptido se utiliza en lugar de, o en otras palabras en lugar del "segundo péptido". El término "polipéptido" se usa para referirse a una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 40 residuos de aminoácidos.

[0038] Tal como se usa en este documento, una referencia a un "homólogo" de un péptido o polipéptido es una referencia a un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comparte homología o que es homólogo a, o que tiene identidad con la secuencia de aminoácidos del primer péptido o polipéptido mencionado, preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos 95% e incluso más preferiblemente al menos 98% de identidad de secuencia cuando la comparación se realiza mediante un algoritmo BLAST en el que se seleccionan los parámetros del algoritmo para dar la coincidencia más grande entre las respectivas secuencias en toda la longitud de las respectivas secuencias de referencia. La identidad de secuencia se refiere a coincidencias exactas entre los aminoácidos de dos secuencias que se comparan. Tal homólogo puede derivar de una variante natural o aislar la Lys-X-proteinasa o Arg-X-proteinasa de P. gingivales. Alternativamente, puede ser una variante de "sustitución conservadora" de un péptido o polipéptido a partir de la Lys-X-proteinasa o Arg-X-proteinasa de P.gingivalesen el que uno o más residuos de aminoácidos han sido cambiados sin alterar la conformación global y función del péptido o polipéptido; incluyendo, aunque de ninguna manera limitándose, a la sustitución de un aminoácido por uno que tenga propiedades similares. Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos polares/hidrófilos que pueden ser intercambiables incluyen asparagina, glutamina, serina, cisteína, treonina, lisina, arginina, histidina, ácido aspártico y ácido glutámico; aminoácidos no polares/hidrófobos que pueden ser intercambiables incluyen glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, tirosina, fenilalanina, triptófano y metionina; aminoácidos que pueden ser intercambiables incluyen ácido aspártico y ácido glutámico y aminoácidos básicos que pueden ser intercambiables incluyen histidina, lisina y arginina. Preferiblemente, tales variantes de sustitución conservativa tienen menos de 20, más

preferiblemente menos de 15, más preferiblemente menos de 10 y más preferiblemente menos de 5 cambios de aminoácidos.

[0039] Una región de una enzima similar a tripsina P. gingivales-especialmente Lys-X-proteinasa (Kgp) o Arg-X

5 proteinasa (rgpA) -que define un sitio de una enzima para la escisión de un enlace peptídico puede ser determinado siguiendo la enseñanza de la especificación en este documento, particularmente en relación a la Figura 7 y en el Ejemplo 9, que ejemplifican el procedimiento para la predicción de conformación tridimensional del sitio catalítico tal como aparece en P. gingivales para Lys-X-proteinasa. El Ejemplo 10 proporciona una metodología para modelar la conformación tridimensional de Arg-X-proteinasa.

[0040] En ciertas realizaciones, la proteína quimérica o de fusión, o componentes primero o segundo peptídicos de los mismos pueden estar formados a partir de un peptidomimético. Un peptidomimético es una molécula que imita una o más características de un péptido dado, por ejemplo conformación, y que consiste en residuos de aminoácidos, algunos de los cuales pueden no ser naturales.

15 [0041] Tras identificación de las regiones inmunogénicas de sitio catalítico, los inventores han determinado la secuencia de diversos inmunógenos del péptido contra los que una respuesta humoral puede ser elevada. En particular, las "seis" regiones que flanquean o definen de otro modo el sitio catalítico se han definido del siguiente modo: KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 y KAS6 (véase Tabla 1). Con esta información, los inventores han sido capaces de interrogar las bases de datos de secuencias de proteínas para determinar péptidos que comparten homología con secuencias de aminoácidos que forman las regiones que flanquean un sitio catalítico y por lo tanto que representan epítopos inmunogénicos que se encuentran en P. gingivales. La secuencia de estos péptidos se identifica mediante la siguiente fórmula estructural:

Tabla 1. Las secuencias que flanquean el sitio activo de Kgp y RgpA.

Región: Kgp Lys -X (numeración de acuerdo con SEQ ID No. 62) Kgp Lys -X Consenso RgpA Arg -X (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 61) RgpA Arg -X Consenso

PAS1K/ PAS1R: PAS1K (432453) LNTGVSFANYTAHGSETAWADP (SEQ ID NO: 30) PAS1R (426446) FNGGISLANYTGHGS ET AWGT (SEQ ID NO: 34)

KAS1/ RAS1: KAS1 (432454) LNTGV[G/S]FANYTAH GSET[S/A]WADP[S/L] (SEQ ID NO: 27) RAS1 (426448) FNGGISL[V/A]NYTGH G SETAWGTSH (SEQ ID NO: 31)

KAS2/ RAS2: KAS2 (433468) NTGV[G/S]FANYTAHG SET[S/A]WADP[S/L][L/ V]T[A/T][T/S]Q[V/L]KAL TNK[D/N]K (SEQ ID NO: 28) RAS2 (427462) NGGISL[V/A]NYTGHG S ETAWGTSHFGTTHVK Q LTNSNQ (SEQ ID NO: 32)

KAS3/RA S3: KAS3 (436 455) V [G/S] FANYTAHGSET [S/A] WAD P [S/L] [L/V] (SEQ ID NO: 29) RAS3 (430 449) ISL [V/A] NYTGHGSETA WGTSHF (SEQ ID NO: 33)

KAS4/RAS4: KAS4 (388 395) [S/Y] [S/S] WN [P/S] [K/Q] [I/V] RAS4 (379 386) EGGPSADN (SEQ ID NO: 67)

KAS5/RAS5: KAS5 (510 516) NSYWGED (SEQ ID NO: 65) RAS5 (508 514) [N/D] Q [S/Y] WA [S/P] P (SEQ ID NO: 68)

KAS6: KAS6 (570 580) IGN [V/I] THIGAHY (SEQ ID NO: 66)

[0042] Los inventores han encontrado que las proteínas quiméricas que incluyen estos péptidos tienen una serie de utilidades. Por ejemplo, tal como se describe en la presente memoria, algunos producen una respuesta humoral que es altamente protectora para el tratamiento o prevención de la pérdida ósea, como se observa en la periodonitis crónica. Los péptidos también se pueden usar en un ensayo de diagnóstico en el que pueden detectar o monitorizar especificidades en el suero de un individuo, indicando de este modo si el individuo está infectado o no y si es necesario, si se han requerido tratamientos o si han sido efectivos.

65 [0043] Se entenderá que la región de un enzima similar a tripsina P. gingivales que define un sitio de la enzima para la escisión de un C-terminal situado en el enlace peptídico a Lys o Arg, no comprende una secuencia completa de la

Lys-X-proteinasa o Arg-X-proteinasa.

[0044] Tal como se usa en el presente documento, los términos "proteína heteróloga" o "proteína quimérica o de fusión" se usan para referirse a una proteína que se compone de unidades funcionales, dominios, secuencias o 5 regiones de aminoácidos derivadas de diferentes fuentes, o que se derivan de la misma fuente y que han sido ensamblados para tener una organización que se distingue de la observada en una molécula de la cual se deriva o se relaciona la unidad, el dominio, la secuencia o la región. Una característica común de las proteínas quiméricas o de fusión de la invención es que contienen al menos un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es la misma que o que comparte homología con una secuencia de una enzima similar a tripsina P. gingivales que define

10 un sitio catalítico para la escisión de un enlace peptídico.

[0045] En una realización preferida, donde el primer péptido comprende un péptido de la región Kgp [432-468], es preferiblemente (i) un péptido que comprende una secuencia seleccionada del VSFANYT y VGFANYT, más preferiblemente una secuencia seleccionada del GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA y VGFANYTA; o (ii) un 15 péptido que comprende una secuencia seleccionada entre ETAWAD, ETSWAD, TAWADP y TSWADP, preferiblemente una secuencia seleccionada entre SETAWAD, SET SWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL y TSWADPL, más preferiblemente una secuencia seleccionada entre GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL y TSWADPLL. Más preferiblemente, este péptido se selecciona entre los péptidos KAS1 [432-454], KAS2 [433-468] y KAS3 [436-455] mostrados en la Tabla 1.

20 Alternativamente, el primer péptido puede ser el PAS1K [432-453], también conocido como PAS1 (K48), descrito en la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/AU98/00311 (WO 98/049192). Los identificadores de secuencia correspondientes a estos péptidos se muestran en la Tabla 3.

[0046] De manera similar, en otra realización preferida, donde el primer péptido comprende un péptido de la región

25 rgpA [426-462], este péptido se selecciona preferiblemente de los péptidos RAS1 [426-448], RAS2 [427-462] y RAS3 [430-449] mostrados en la Tabla 1. Alternativamente, el primer péptido puede ser el péptido PAS1R [426-446], también conocido como PAS1 (R45), descrito en la Solicitud de Patente Internacional Nº PCT/AU98/00311 (WO 98/049 -192).

30 [0047] En la proteína quimérica o de fusión de la invención, el segundo péptido puede ser un péptido de un dominio de adhesina de una enzima similar a tripsina P. gingivalis, tales como Lys-X-proteinasa (Kgp) o Arg-X-proteinasa (rgpA) o HagA (véase la Tabla 2). Estos dominios son a veces también conocidos como hemaglutinina. En la proteína X-proteinasa, los dominios preferidos son RA1, RA2, RA3 y RA4 como se identifica en la Tabla 2. En la proteasa de LX-X, los dominios preferidos son KA1, KA2, KA3, KA4, 2. En HagA, los dominios preferidos son

35 HagA1, HagA1 * y HagA1 **.

65 5

[0048] Además de la mejora de la respuesta humoral a un péptido de la invención tal como KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 y KAS6 o RAS1, RAS2 y RAS3, RAS4 y RAS5 cuando se incluye con un péptido tal en una proteína quimérica o de fusión, el dominio de adhesina también contiene epítopos inmunogénicos, lo que conduce a la producción de múltiples especificidades para provocar una respuesta inmunogénica protectora. El hallazgo de que los epítopos inmunogénicos de la adhesina de dominio son retenidos en una forma que se aproxima en una enzima de tipo tripsina P.gingivales cuando se proporciona en la proteína quimérica o de fusión de la invención es inesperada.

[0049] Se entenderá que, en estas realizaciones de la invención, la proteína quimérica o de fusión puede contener uno cualquiera o más de los péptidos seleccionados de KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 y KAS6/RAS6 junto con cualesquiera uno o más dominios de adhesina de una enzima similar a tripsina

P. gingivales, en particular con uno cualquiera o más de dominios de adhesina Lys-X-proteinasa (KA1, KA2, KA3, KA4 y KA5) o dominios de adhesina Arg-X-proteinasa (RA1, RA2, RA3 y RA4) o dominios HagA de HagA1, HagA1 * y HagA1 **.

[0050] También se entenderá que no es necesario que el dominio de adhesina sea un dominio completo como se observa en una enzima similar a tripsina P. gingivales. Por ejemplo, el dominio de adhesina puede ser un fragmento de tal dominio, en particular, los fragmentos preferidos son los fragmentos del dominio KsA1 y KLA1 del dominio Lys-X-proteinasa A1 (véase Tabla 2). Cuando el dominio es un fragmento de un dominio de adhesina, generalmente contiene uno o más epítopos específicos de dominio de adhesina. El documento WO 01/47961 describe KsA1 (SEQ ID NO: 36) y menciona la posibilidad de construir quimeras. Los identificadores de secuencia correspondientes a los péptidos relacionados con la adhesina se muestran en la Tabla 3.

[0051] En una realización, el segundo péptido o polipéptido incluye una secuencia mostrada en una o más de SEQ ID No: 69a 79o una omás de83 a85.

[0052] La proteína quimérica o de fusión de la presente invención también pueden incluir uno o más péptidos adicionales seleccionados del Kgp[432-468] región de la Lys-X-proteinasa y/o uno o más péptidos adicionales seleccionados de la región Rg-pA[426-462] de la Arg-X-proteinasa.

[0053] En formas de realización preferidas de la presente invención, la proteína quimérica o de fusión incluye una o más de KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 y KAS6, o una o más de RAS1, RAS2, RAS3, RAS4 y RAS5, junto con KsA1 o KLA1.

[0054] Así, en ciertas realizaciones, la proteína quimérica o de fusión puede incluir al menos un péptido adicional en que además dicho péptido incluye:

(ii): una parte o la totalidad de una secuencia que es igual o homóloga a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2; o

(iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivales; o

(iv): parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivales; o

(v): parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina HagA de P. gingivales

[0055] Otros ejemplos de dominios, unidades, secuencias o regiones que pueden incluirse en una proteína quimérica o de fusión como se describe en el presente documento incluyen dominios para la unión a receptores o ligandos tales como regiones Fc o receptores Fc, dominios de unión para mejorar la vida media tales como albúmina

o dominios para facilitar la expresión o purificación de la proteína quimérica o de fusión.

[0056] En las proteínas quiméricas o de fusión de la presente invención, el residuo C-terminal del primer péptido se puede unir covalentemente al residuo N-terminal de un polipéptido de dominio de adhesina, o el residuo N-terminal del primer péptido puede estar covalentemente unido al residuo C-terminal de un polipéptido de dominio de adhesina. En esta disposición, se dice que el primer péptido y el polipéptido del dominio de la adhesina están "directamente unidos" o "adyacentes".

[0057] En otras realizaciones, la proteína quimérica o de fusión incluye un enlazador para unir el primer péptido a un polipéptido de dominio de adhesina. El enlazador puede ser cualquier enlazador capaz de unirse a un péptido a un

polipéptido, incluyendo tanto aminoácidos como enlazadores que no son aminoácidos. Preferiblemente, el enlazador no es inmunogénico. Enlazadores adecuados pueden ser de hasta 15 aminoácidos de longitud, aunque se prefiere menos de cinco aminoácidos. El enlazador puede funcionar para llevar el primer polipéptido de dominio de péptido y adhesina en una disposición espacial más cerca de lo normalmente observado en una enzima similar a tripsina P. gingivales. Alternativamente, puede separar el primer péptido y el polipéptido de dominio de adhesina.

[0058] Las proteínas quiméricas o de fusión de la invención pueden ser producidas por sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo, tecnología de ADN recombinante) o por síntesis química (tales como síntesis de péptidos en fase sólida). Estas técnicas son bien conocidas en la técnica.

[0059] La proteína heteróloga o quimérica es particularmente ventajosa ya que mejora la respuesta humoral obtenida sobre la obtenida usando el primer o segundo componente peptídico de la proteína quimérica o de fusión sola.

[0060] Los inventores han encontrado que las proteínas quiméricas que incluyen estos péptidos tienen una serie de utilidades. Por ejemplo, como se describe en el presente documento, algunos producen una respuesta humoral que es altamente protectora para el tratamiento o la prevención de la pérdida de hueso como se observa en la periodontitis crónica. Los péptidos también se pueden utilizar en un ensayo de diagnóstico en el que se puede detectar o controlar especificidades en el suero de un individuo, indicando de este modo si el individuo está infectado y si es así, si se requieren tratamientos o si se proporcionan, si han sido eficaces.

[0061] En una realización, la proteína quimérica o de fusión induce una respuesta inmune protectora, por lo general una respuesta que al menos minimiza o limita el daño de tejido conectivo de otro modo asociado con la infección P. gingivales. En una realización, la respuesta protectora al menos minimiza o limita pérdida de hueso inducida P. gingivales. Un sistema de modelo para la medición de la pérdida ósea mediada por infección P. gingivales se discute en el presente documento. Típicamente, la respuesta inmune protectora es predominantemente una respuesta humoral. En ciertas realizaciones, la respuesta inmune protectora también incluye una respuesta celular.

[0062] La presente invención también proporciona una composición que incluye una proteína quimérica o de fusión como se describe ampliamente anteriormente. Típicamente, la composición es antigénica o inmunogénica. Más particularmente, la invención proporciona una composición adecuada para provocar una respuesta inmune protectora o terapéutica contra la infección P. gingivales, incluyendo la proteína quimérica o de fusión, opcionalmente en asociación con un adyuvante. Tal composición puede incluir también otro componente para modular o potenciar la respuesta inmune. Una forma de realización, la composición toma la forma de una vacuna.

[0063] Varios adyuvantes son conocidos para su uso en conjunción con las composiciones de vacuna. Los adyuvantes de ayuda mediante la modulación de la respuesta inmune y en la consecución de un nivel más duradero y superior de inmunidad usando pequeñas cantidades de antígeno de la vacuna o menos dosis que si el antígeno de la vacuna se administra solo. Los ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante incompleto de Freund (IFA), 65 (contiene aceite de cacahuete, monooleato de manida y monoestearato de aluminio) adyuvante, emulsiones de aceite, adyuvante de Ribi, los polioles plurónicos, poliaminas, Avridina, Quil A, saponina, MPL, QS-21, geles minerales tales como sales de aluminio y sales de calcio, nanopartículas, tales como hidroxiapatita, fosfato de calcio, sales de aluminio, oligómeros de azúcar y polímeros tales como manano, quitosano. Otros ejemplos incluyen emulsiones de aceite en agua, tales como SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720, y otros adyuvantes particulados tales como ISCOMTM e ISCOM matrizTM. Una lista extensa pero no exhaustiva de otros ejemplos de adyuvantes se enumeran en Cox y Coulter 1992 [En: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112]. Además del adyuvante, la composición de vacuna puede incluir portadores convencionales farmacéuticamente aceptables, excipientes, cargas, tampones o diluyentes, según proceda. Uno o más dosis de la composición de vacuna que contiene adyuvante se pueden administrar profilácticamente para prevenir la periodontitis o terapéuticamente para tratar periodontitis ya presente.

[0064] En una composición preferida, la proteína quimérica o de fusión se combina con un adyuvante de la mucosa y se administró por vía oral, bucal o nasal. Los ejemplos de adyuvantes de la mucosa son nanopartículas, la toxina del cólera y toxina de E. coli lábil al calor, las subunidades B no tóxicas de estas toxinas, mutantes genéticos de estas toxinas que tienen una toxicidad reducida. Otros métodos que se pueden utilizar para administrar la proteína antigénica por vía oral/bucal/nasal incluir la incorporación o la absorción de la proteína en o sobre partículas de polímero biodegradable (tales como acrilatos o poliésteres) o nanopartículas (tales como hidroxiapatita) por microencapsulación para ayudar a la absorción de las microesferas desde el tracto gastrointestinal u otras superficies mucosas y para proteger la degradación de las proteínas. Los liposomas, ISCOMsTM, los hidrogeles son ejemplos de otros métodos potenciales que pueden mejorarse adicionalmente por la incorporación de moléculas diana tales como LTB, CTB o lectinas para la entrega de la proteína antigénica para el sistema inmune de la mucosa. Además de la proteína antigénica y el sistema adyuvante de la mucosa o la administración, la composición de vacuna puede incluir portadores convencionales farmacéuticamente aceptables, excipientes, cargas, revestimientos, medios de dispersión, agentes antibacterianos o antifúngicos, y tampones o diluyentes, según proceda.

[0065] En este aspecto, la invención también proporciona una proteína quimérica o de fusión o una composición para uso en un método de prevenir o reducir la incidencia o severidad de una condición o enfermedad relacionada con P. gingivales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una proteína quimérica o de fusión como se ha descrito anteriormente, o una composición como la descrita anteriormente.

[0066] El sujeto puede ser un sujeto humano u otro animal, y es preferiblemente un ser humano.

[0067] Típicamente, la afección o enfermedad relacionada con P. gingivales es periodontitis crónica, sin embargo, también puede ser pérdida de hueso, especialmente la pérdida de hueso alveolar, o enfermedad de la arteria coronaria.

[0068] Se conocen muchos métodos para la administración de una composición de vacuna a un sujeto humano o animal, incluyendo, pero no limitado a, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, sublingual, bucal y administración oral. Estas vías de administración son particularmente útiles para la vacunación.

[0069] Se da a conocer en el presente documento un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, dirigido contra una proteína quimérica o de fusión como se describe ampliamente anteriormente.

[0070] Estos anticuerpos pueden producirse mediante técnicas estándar, y se pueden usar en la inmunización pasiva de un sujeto. Por consiguiente, también se describe un método para prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o afección relacionada con P. gingivales en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo como se ha descrito anteriormente.

[0071] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica o de fusión como se describe ampliamente anteriormente, opcionalmente unido operativamente a al menos un elemento regulador. En una realización se proporciona el ácido nucleico en forma aislada o sustancialmente purificada.

[0072] La molécula de ácido nucleico puede, por ejemplo, ser insertada en un vector de expresión adecuado para la producción de la proteína quimérica como una proteína recombinante mediante la inserción del vector de expresión en una célula huésped procariota o eucariota. La expresión con éxito de la proteína recombinante requiere que el vector de expresión contenga los elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción que son compatibles con, y reconocidos por el sistema de célula huésped particular utilizado para la expresión. Una variedad de sistemas de célula huésped se puede utilizar para expresar la proteína recombinante, que incluyen, pero no se limitan a bacterias transformadas con un vector de bacteriófago, plásmido vector, o ADN de cósmido; levaduras que contienen vectores de levadura; hongos que contienen vectores fúngicos; líneas celulares de insectos infectados con virus (por ejemplo baculovirus); y líneas celulares de mamífero transfectadas con el plásmido de expresión o vectores virales, o infectados con virus recombinante (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, virus adeno-asociado, retrovirus, etc).

[0073] El uso de métodos conocidos en la técnica de la biología molecular, diversos promotores y potenciadores se pueden incorporar en el vector de expresión, para aumentar la expresión de la proteína recombinante, a condición de que el aumento de la expresión de las secuencias de aminoácidos sea compatible con (por ejemplo, no tóxico a) el sistema de célula huésped particular utilizado.

[0074] La selección del promotor dependerá del sistema de expresión usado. Los promotores varían en resistencia, es decir, capacidad de facilitar la transcripción. Generalmente, es deseable utilizar un promotor fuerte con el fin de obtener un alto nivel de transcripción de la secuencia de nucleótidos de codificación y la expresión en la proteína recombinante. Por ejemplo, bacterianas, fagos, o promotores de plásmidos conocidos en la técnica de la que un alto nivel de transcripción se han observado en un sistema de células huésped, incluyendo E. coli incluyen el promotor lac, el promotor trp, promotor recA, promotor de ARN ribosomal, los promotores PR y PL, lacUV5, ompF, bla, lpp y similares, pueden ser usados para proporcionar la transcripción de la secuencia de nucleótidos insertada que codifica secuencias de aminoácidos.

[0075] Otros elementos de control para la transcripción eficaz o traducción incluyen potenciadores, y señales reguladoras. Secuencias potenciadoras son elementos de ADN que parecen incrementar la eficiencia transcripcional en una forma relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a una secuencia de nucleótidos codificante cercana. Por lo tanto, dependiendo del sistema de vector de expresión de célula huésped utilizada, un potenciador se puede colocar aguas arriba o aguas abajo de las secuencias de codificación insertadas para incrementar la eficiencia transcripcional. Otros sitios reguladores, tales como señales de transcripción o iniciación de la traducción, se pueden utilizar para regular la expresión de la secuencia codificante.

[0076] En otra realización, el vector puede ser un vector de vacuna viral o bacteriana, y se utiliza para proporcionar una vacuna recombinante viral, una vacuna bacteriana recombinante, una vacuna bacteriana atenuada recombinante, o una vacuna viral recombinante inactivada. El virus vaccinia es el ejemplo más conocido, en la

técnica, de un virus infeccioso que está diseñado para expresar antígenos de vacunas derivados de otros organismos. El virus vaccinia vivo recombinante, que se atenúa o se trata de otra manera de modo que no causa la enfermedad por sí misma, se utiliza para inmunizar al huésped. La replicación posterior del virus recombinante dentro del huésped proporciona una estimulación continua del sistema inmune con los antígenos de la vacuna proporcionando de este modo inmunidad de larga duración.

[0077] Otros vectores de vacunas in vivo incluyen: adenovirus, citomegalovirus, y preferiblemente los poxvirus tales como vaccinia [Paoletti y Panicali, Patente de Estados Unidos No. 4.603.112] y cepas atenuadas de Salmonella [Stocker et al, patente de EE.UU. nº 5.210.035;. 4.837.151; y 4.735.801; y Curtiss et al, 1988, Vaccine 6: 155-160]. Las vacunas vivas son particularmente beneficiosas porque estimulan continuamente el sistema inmune que puede conferir inmunidad sustancialmente de larga duración. Cuando la respuesta inmunitaria es protectora contra la infección subsiguiente P. gingivales, la propia vacuna viva puede ser utilizada en una vacuna preventiva contra P. gingivales. En particular, la vacuna viva se puede basar en una bacteria que es un habitante comensal de la cavidad oral. Esta bacteria puede transformarse con un vector que porta una proteína quimérica recombinante y luego se usa para colonizar la cavidad oral, en particular, la mucosa oral. Una vez colonizada en la mucosa oral, la expresión de la proteína recombinante estimulará el tejido linfoide asociado a mucosa para producir anticuerpos neutralizantes. Para ilustrar más esta forma de realización, usando técnicas de biología molecular bien conocidas en la técnica, las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas quiméricas de esta invención se pueden insertar en el ADN genómico del virus vaccinia en un sitio que permite la expresión de epítopos pero no afecta negativamente el crecimiento o replicación del vector de virus vaccinia. El virus recombinante resultante se puede utilizar como el inmunógeno en una formulación de vacuna. Los mismos métodos se pueden utilizar para construir una formulación de vacuna viral recombinante inactivada, excepto que el virus recombinante es inactivado, tal como por medios químicos conocidos en la técnica, antes de su uso como un inmunógeno y sin afectar substancialmente la inmunogenicidad del inmunógeno expresado. La vacuna recombinante inactivada puede formularse con un adyuvante adecuado con el fin de mejorar la respuesta inmunológica a los antígenos de la vacuna.

[0078] La invención también proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína quimérica o de fusión de esta invención directamente como la formulación de vacuna. Las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas quiméricas, unidas operativamente a uno o más elementos reguladores, se pueden introducir directamente para vacunar a un individuo ("transferencia directa de genes") contra cepas patógenas de P. gingivales. Transferencia directa de genes en un individuo vacunado, dando como resultado la expresión del material genético por las células del individuo vacunado tal como células endoteliales vasculares así como el tejido de los órganos principales, se ha demostrado mediante técnicas en la técnica tales como mediante la inyección por vía intravenosa de un plásmido de expresión: complejo de liposoma catiónico [Zhu et al, 1993, Science 261: 209-211]. Otros métodos efectivos para la administración de ADN del vector en una célula diana son conocidos en la técnica. En un ejemplo, ADN de plásmido recombinante purificado que contiene genes virales se ha utilizado para inocular (ya sea parenteralmente, mucosalmente, o por inmunización gen-gun) vacunas para inducir una respuesta inmunitaria protectora [Fynan et al. 1993, Proc Natl Acad Sci EE.UU.

90: 11478 a 11.482]. En otro ejemplo, células retiradas de un individuo se pueden transfectar o electroporación mediante procedimientos estándar conocidos en la técnica, lo que resulta en la introducción del vector de ADN recombinante de la célula diana. Las células que contienen el ADN del vector recombinante puede entonces seleccionarse para el uso de métodos conocidos en la técnica, tales como mediante el uso de un marcador de selección que se expresa en el vector, y las células seleccionadas pueden entonces ser re-introducidas en el individuo para expresar la proteína recombinante.

[0079] En este aspecto, la invención proporciona además una molécula de ácido nucleico, un vector o una célula procariota o eucariota para su uso en un método para prevenir o reducir la incidencia o gravedad de una afección o enfermedad relacionada con P.gingivalesen un sujeto, que comprende administrar al sujeto una molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente, un vector como se describe anteriormente, o una célula procariota o eucariota tal como se describe anteriormente.

[0080] En otras realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que incluye una proteína quimérica o de fusión o un anticuerpo como se describe anteriormente. La composición puede incluir además un diluyente, excipiente o portador o agente quimioterapéutico para el tratamiento de una condición o enfermedad relacionada con

P. gingivales y puede adaptarse para la administración oral. Las composiciones de esta invención se pueden incorporar en pastillas, o en goma u otros productos, por ejemplo mediante agitación en una base de goma caliente

o recubrimiento de la superficie exterior de una base de goma, por ejemplo jelutong, látex de caucho, resinas de vinilita, etc., deseablemente con plastificantes o suavizantes convencionales, azúcar u otros edulcorantes o tales como glucosa, sorbitol y similares.

[0081] Una composición oral de esta invención que contiene la composición farmacéutica mencionada anteriormente puede ser preparada y utilizada en varias formas aplicables a la boca tales como dentífrico, incluyendo pastas de dientes, polvos dentales y líquidos dentífricos, enjuagues bucales, trociscos, gomas de mascar, pastas dentales, cremas de masaje gingival, tabletas gárgaras, productos lácteos y otros productos alimenticios. Una composición oral según la presente invención puede incluir además ingredientes adicionales bien conocidos, dependiendo del tipo y la forma de una composición oral particular.

[0082] En ciertas formas preferidas de la invención, la composición oral puede ser sustancialmente de carácter líquido, tal como un colutorio o enjuague. En una tal preparación, el vehículo es típicamente una mezcla aguaalcohol deseablemente incluyendo un humectante como se describe a continuación. Generalmente, la relación en peso de agua a alcohol está en el intervalo de aproximadamente 1: 1 a aproximadamente 20: 1. La cantidad total de mezcla agua-alcohol en este tipo de preparación está típicamente en el intervalo de aproximadamente 70 a aproximadamente 99,9% en peso de la preparación. El alcohol es típicamente etanol o isopropanol. Se prefiere el etanol.

[0083] El pH de tales preparaciones líquidas y otras de la invención está generalmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 y típicamente de aproximadamente 5,0 a 7,0. El pH se puede controlar con ácido (por ejemplo ácido cítrico o ácido benzoico) o una base (por ejemplo hidróxido de sodio) o tamponado (como con citrato de sodio, benzoato, carbonato o bicarbonato, fosfato disódico de hidrógeno, fosfato de dihidrógeno de sodio, etc).

[0084] En otras formas deseables de esta invención, la composición farmacéutica puede ser sustancialmente sólida o pastosa en carácter, tales como polvo de dientes, una tableta dental o una pasta de dientes (crema dental) o dentífrico de gel. El vehículo de tales preparaciones orales sólidas o pastosas contiene generalmente el material abrillantador dentalmente aceptable.

[0085] En una pasta de dientes, el vehículo líquido puede comprender agua y humectante típicamente en una cantidad que varía de aproximadamente 10% a aproximadamente 80% en peso de la preparación. Glicerina, propilenglicol, sorbitol y polipropilenglicol ejemplifican humectantes/vehículos adecuados. También son ventajosas mezclas líquidas de agua, glicerina y sorbitol. En geles claros, donde el índice de refracción es una consideración importante, alrededor de 2,5 -30% en peso de agua, 0 a aproximadamente 70% en peso de glicerina y aproximadamente 20-80% en peso de sorbitol se emplean preferiblemente.

[0086] Pasta de dientes, cremas y geles contienen típicamente un agente espesante natural o sintético o gelificante en proporciones de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5% en peso. Un espesante adecuado es la hectorita sintética, una arcilla compleja de silicato de metal alcalino de magnesio coloidal sintético disponible por ejemplo como laponita (por ejemplo, CP, SP 2002, D) comercializada por Laporte Industries Limited. Laponita D es, aproximadamente, en peso 58,00% SiO2, 25,40% de MgO, 3,05% de Na2O, 0,98% Li2O, y algo de agua y trazas metálicas. Su gravedad específica verdadera es 2,53 y tiene una densidad aparente de 1,0 g/ml a 8% de humedad.

[0087] Otros espesantes adecuados incluyen musgo irlandés, carragenano iota, goma de tragacanto, almidón, polivinilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulosa, celulosa de metilo de hidroxibutilo, celulosa de metilo de hidroxipropilo, celulosa de hidroxietilo (por ejemplo, disponible como Natrosol), carboximetilcelulosa de sodio, y sílice coloidal tal como siloide finamente molido (por ejemplo 244). Agentes solubilizantes se pueden incluir también como humectantes polioles tales como propilenglicol, dipropilenglicol y hexilenglicol, cellosolves tales como cellosolve de metilo y cellosolve de etilo, aceites vegetales y ceras que contienen al menos aproximadamente 12 átomos de carbono en una cadena lineal, tales como aceite de oliva, aceite de ricino y vaselina y ésteres tales como acetato de amilo, acetato de etilo y benzoato de bencilo.

[0088] Se entenderá que, como es convencional, las preparaciones orales generalmente se venden o distribuyen de otra manera en paquetes etiquetados adecuados. Por lo tanto, una botella de enjuague bucal tendrá una etiqueta que lo describa, en sustancia, como un enjuague bucal o un enjuague bucal y que tiene las instrucciones para su uso; y una pasta de dientes, crema o gel estará usualmente en un tubo plegable, típicamente de aluminio, revestido de plomo o plástico, u otro apretón, bomba o dispensador a presión para dosificar el contenido, que tenga una etiqueta que lo describa, en sustancia, como una pasta de dientes, gel o crema dental.

[0089] Agentes de superficie orgánicos se pueden usar en las composiciones de la presente invención para conseguir una acción profiláctica incrementada, ayudar a conseguir una dispersión a fondo y completa del agente activo por toda la cavidad oral, y hacer las composiciones instantáneas más aceptables cosméticamente. El material tensioactivo orgánico es preferiblemente aniónico, no iónico o anfolítico en la naturaleza y preferiblemente no interactúa con el agente activo. Se prefiere emplear como agente tensioactivo un material detergente que imparte a la composición propiedades detersivas y de formación de espuma. Ejemplos adecuados de tensioactivos aniónicos son sales solubles en agua de monosulfatos más altos de monoglicéridos de ácidos grasos, tales como la sal de sodio del monoglicérido monosulfatado de ácidos grasos de aceite hidrogenado de coco, sulfatos de alquilo superiores tales como laurilsulfato de sodio, sulfonatos de alquilarilo tales como sulfonato de benceno de dodecilo sódico, alquilsulfo-acetatos mayores, ésteres de ácidos grasos superiores de 1,2-dihidroxi propano sulfonato, y las amidas de acilo alifáticas superiores sustancialmente saturadas de compuestos de ácidos aminocarboxílicos alifáticos inferiores, tales como los que tienen 12 a 16 carbonos en el ácido graso, alquilo o radicales de acilo, y similares. Ejemplos de las últimas amidas mencionadas son sarcosina de N-lauroílo, y las sales de sodio, potasio, y sales de etanolamina de sarcosina de N-lauroílo, N-miristoílo o N-palmitoílo que deben ser sustancialmente libres de jabón o material ácido graso superior similar. Ejemplos de tensioactivos no iónicos solubles en agua adecuados para su uso son productos de condensación de óxido de etileno con diversos compuestos que contienen reactivos

hidrógenos con los mismos reactivos que tienen cadenas hidrofóbicos largas (por ejemplo, cadenas alifáticas de aproximadamente 12 a 20 átomos de carbono), cuyos productos de condensación ("etoxámeros") contienen restos de polioxietileno hidrófilos, tales como productos de condensación de poli (óxido de etileno) con ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, alcoholes polihidroxilados (por ejemplo monoestearato de sorbitán) y óxido de polipropileno (por ejemplo, materiales plurónicos).

[0090] El agente tensioactivo está presente típicamente en una cantidad de aproximadamente 0,1-5% en peso. Es de destacar, que el agente activo de superficie puede ayudar en la disolución del agente activo de la invención y de ese modo disminuir la cantidad de humectante solubilizante necesario.

[0091] Varios otros materiales pueden ser incorporados en las preparaciones orales de esta invención tales como agentes blanqueantes, conservantes, siliconas, compuestos de clorofila y/o material amoniacal tal como urea, fosfato de diamonio, y sus mezclas. Estos adyuvantes, cuando están presentes, se incorporan en las preparaciones en cantidades que sustancialmente no afectan adversamente a las propiedades y características deseadas.

[0092] Cualesquiera aromatizantes adecuados o material edulcorante pueden también ser empleados. Ejemplos de constituyentes aromatizantes adecuados son aceites aromatizantes, por ejemplo aceite de menta verde, menta, gaulteria, sasafrás, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limón, y naranja, y salicilato de metilo. Agentes edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, sorbitol, xilitol, ciclamato de sodio, perillartina, AMP (alanina de fenilo de aspartilo, éster de metilo), sacarina, y similares. De forma adecuada, los agentes aromatizantes y edulcorantes pueden cada uno o juntos comprender de aproximadamente 0,1% a 5% más de la preparación.

[0093] Las composiciones destinadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmaceúticamente elegantes y de sabor agradable. Los comprimidos contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmaceúticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Estos excipientes pueden ser por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o acacia, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal o en el bolsillo periodontal y proporcionar así una acción sostenida durante un período más largo. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo temporal tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

[0094] Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas duras de gelatina donde el ingrediente activo está mezclado con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuete, parafina líquida o aceite de oliva.

[0095] Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidropropilo , alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes puede ser un fosfátido de origen natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tales como monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de sorbitán de polietileno.

[0096] Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes o agentes antimicrobianos, por ejemplo benzoatos, tales como etilo, o n-propilo p-hidroxibenzoato otro ejemplo es el gluconato de clorhexidina, uno

o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

[0097] Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Agentes edulcorantes tales como los expuestos anteriormente, y agentes aromatizantes pueden añadirse para proporcionar preparaciones orales agradables al paladar. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

[0098] En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para el diagnóstico o monitorización de una condición o enfermedad relacionada con P. gingivales de un sujeto, que comprende el uso de una proteína

quimérica o de fusión como se describió anteriormente para detectar anticuerpos anti-P.gingivalesen una muestra biológica de dicho sujeto.

[0099] Se describe aquí un método para el diagnóstico o el seguimiento de una condición o enfermedad relacionada 5 con P.gingivalesen un sujeto, que comprende el uso de un anticuerpo como se ha descrito anteriormente, para detectar la presencia de P. gingivales en una muestra biológica de dicho sujeto.

[0100] También se describe aquí un péptido para inducir una respuesta inmune a P. gingivales incluyendo la secuencia mostrada en una de SEQ ID No: 17, 18, 25 y 26. En una realización, el péptido tiene una secuencia que

10 es homóloga a una de las SEC ID No: 17, 18, 25 y 26. El péptido puede tener una longitud de 5 a 40 aminoácidos. [0101] También se describe aquí un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de SEQ ID No: 17, 18, 25 y 26. [0102] También se describe aquí un uso de un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de la SEC ID No: 17, 18, 25 y 26, o un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de SEQ ID

15 No: 17, 18, 25 y 26, para la fabricación de una proteína quimérica o de fusión para inducir una respuesta inmune a

P. gingivales.

[0103] También se describe aquí un uso de un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de SEQ ID No: 17, 18, 25 y 26, o un ácido nucleico que codifica un péptido que tiene una secuencia mostrada en una de SEQ ID No: 17, 18, 25 y 26, para inducir una respuesta inmune a la P. gingivales.

20 [0104] El péptido se puede administrar simultáneamente o secuencialmente con un segundo péptido que incluye:

(i) parte, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Lys-X-proteinasa de P. gingivales; o

25 (ii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de adhesina de la Arg-X-proteinasa de P. gingivales; o

(iii) parte de, o la totalidad de una secuencia que es la misma que, o homóloga a la secuencia de un dominio de

adhesina HagA de P. gingivales. 30 Tabla 3

55 25

[0105] La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos que se incluyen a modo de ejemplo y no como limitación de la invención.

Ejemplo 1

Métodos y materiales.

[0106] Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento. Cultivos liofilizados de PorphyromonasgingivalesW50 se cultivaron anaeróbicamente a 37°C en placas de agar de sangre de caballo lisada suplementadas con 5 µg/ml de hemina, 0,5 µg/ml de cisteína (HB agar, <10 pasajes). Después de 3-4 días, a colonias se utilizaron para inocular medio de infusión cerebro-corazón que contiene 5 µg/ml de hemina, 0,5 µg/ml de cisteína (1). Cultivos discontinuos se cultivaron en condiciones anaerobias en una estación de trabajo anaeróbico MK3 (Don Whitley Scientific Ltd., Adelaide, Australia). Las células se recogieron durante la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugación (7500 g, 30 min, 4°C) y se lavaron dos veces con tampón de PG (50 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 5 mM CaCl2, y 5 mM de cisteína-HCl, pH 8,0) en la estación de trabajo anaeróbica. El crecimiento de cultivos discontinuos se monitorizó a 650 nm utilizando un espectrofotómetro (modelo 295E, Perkin-Elmer). La pureza del cultivo se comprobó de forma rutinaria por la tinción de Gram, el examen microscópico y el uso de una variedad de ensayos bioquímicos de acuerdo con ranuras (2).

[0107] Construcción de constructos de pET28 que contienen secuencias de adhesina y secuencias de adhesina con la adición N-terminal de secuencias de proteinasa Kgp. Residuos Kgp que representan péptidos y péptidos quiméricos de sitio activo (AS) y dominios de adhesina KgpA1 (A1) se sobre-expresaron en E. coli como proteínas recombinantes (r) con etiquetas hexa-His usando vectores de expresión pET (Novagen). Las r-proteínas expresadas eran rKAS2, y rKLA1 y las proteínas r-quiméricas eran rKAS2-KLA1, rKAS1-KsA1 y rKAS4-KAS3-KAS5-KAS6-KLA1 (también denominadas multiKAS-KLA1). Las secuencias de aminoácidos que representan los diversos dominios A1 y AS se describen en las Tablas 1 y 2.

[0108] Los diversos dominios KAS y KA1 del gen kgp se amplificaron a partir de pNS1 (3,5 kb fragmento BamHI lys en pUC18) o ADN genómico de P. gingivales utilizando respectivamente cebadores enumerados en la Tabla 4, la ADN polimerasa Taq (Invitrogen) y un termociclador PC-960 (Corbett Research Technologies). Los pares de cebadores KAS2-FOR y KAS2-REV y KLA1-PARA y KLA1-REV se usaron para generar fragmentos de PCR que codifican KAS2 y KLA1 respectivamente usando las siguientes condiciones de reacción: 94°C, 3 minutos, seguido por 28 ciclos de 94°C, 45 sec (desnaturalización); 62°C, 40 segundos (hibridación) y 72°C, 20 segundos (extensión), seguido de un ciclo final de 72°C, 5 min.

[0109] El producto de PCR quimérico KAS2-KLA1 fue producido por corte y empalme de genes por extensión de solapamiento (SOEing) del siguiente modo: Los productos de PCR fueron producidos usando pares de cebadores KAS2-FOR y KAS2-KLA1-quimera-REV y KAS2-KLA1-quimera-PARA y KLA1-REV usando las condiciones descritas anteriormente. Los productos de PCR fueron luego recocidos y una PCR final se realizó con cebadores KAS2-FOR y KLA1-REV (94°C, 2 minutos, seguido de 28 ciclos de 94°C, 30 seg; 50°C, 30 segundos y 72°C, 40 segundos seguido de un ciclo final de 72°C, 5 min.

[0110] Para la preparación del producto KAS1-KsA1 PCR, dos PCR sucesivos se llevaron a cabo usando el cebador KAS1-KsA1-REV con cada uno de los cebadores 1 y 2 KAS1-KsA1-FOR, en sucesión (condiciones de reacción 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C, 15 segundos; 63°C, 30 segundos y 72°C, 2 minutos) para producir el producto KAS1-KsA1 PCR. Los cebadores KAS1-KsA1-FOR1 y KAS1-KsA1-FOR2 contienen una

5 extensión 3' que se superpone la 5' del producto de PCR anterior.

[0111] Para la preparación del fragmento de multiKAS-KLA1 PCR, cuatro PCR sucesivas se llevaron a cabo usando el cebador multi-REV con cada uno de los cebadores multi-FOR 1, 2, 3 y 4 en la serie (condiciones de reacción fueron 95°C, 2 minutos seguido por 35 ciclos de 95°C, 20 segundos; 68°C, 1,5 minutos) para producir el producto

10 multiKAS-KLA1 PCR. Cada cebador multi-FOR contiene una extensión 3' que se superpone a la 5' del producto de PCR anterior.

[0112] Todos los fragmentos de PCR que codifican KAS2, KLA1, KAS2-KLA1, KAS1-KsA1 y multiKAS-KLA1 se purificaron utilizando columnas de purificación de PCR (Qiagen), se ligó en el vector de clonación TA, pGemT-Easy 15 (Promega) y se transformó en E. coli JM109 siguiendo el protocolo del fabricante. Construcciones purificadas recombinantes pGemT-Easy se digirieron con NcoI y XhoI y direccionalmente se clonaron en pET28b digerido por NcoI/XhoI (Novagen) y se transformaron en el huésped no de expresión, E. coli JM109 [DH5α]. Las construcciones de pET28 recombinantes se purificaron y se transformaron en la huésped de expresión E. coli, BL21 (DE3) [HMS174 (DE3)] (Novagen) y se seleccionaron en LB que contenía 50 µg de kanamicina siguiendo las instrucciones del

20 fabricante. La integridad de cada inserto se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN.

[0113] Los cebadores de oligonucleótidos (Tabla 4) se han diseñado para incorporar sitios de enzimas de restricción, codones de parada y hexa-His cuando sea necesario. Los cebadores utilizados para la rKAS2, rKLA1 y rKAS2-KLA1 fueron diseñados para limitar la inclusión de la secuencia de codificación extraña a no más de tres

25 aminoácidos más la etiqueta hexa-his en r-proteínas. rKAS1 y rKLA1 fueron diseñados para contener una etiqueta hexa-His en los extremos N-terminal y C-terminal, respectivamente, de modo que puedan ser comparados directamente con el rKAS2-KLA1 que tiene una etiqueta hexa-his en N-terminales y C-terminales. En rKAS1-KsA1 y rmuItiKAS-KLA1 las etiquetas His se encuentran en el C-terminal.

30 Tabla 4 Los cebadores de oligonucleótidos usados para la amplificación de las secuencias de nucleótidos que codifican los diversos fragmentos y quimeras de Kgp A1 y AS

[0114] Expresión y purificación de proteínas recombinantes. Las proteínas recombinantes se expresan a partir de constructos pET28 :: KLA1 (KAS2, KAS2-LA1, KAS1-SA1, multiKAS-KLA1) por inducción con isopropilo β-Dtiogalactosi-dase (IPTG). Todas las proteínas recombinantes se produjeron como proteínas de fusión de la etiqueta 6-His y se purificaron con sistema de purificación NJ-NTA (Invitrogen) en condiciones desnaturalizantes. Brevemente, transformantes de colonias individuales E. coli (DE3) se utilizaron para inocular 20 ml de caldo Luria-Bertani (LB) que contenía 50 µg/ml de kanamicina a 37°C en un agitador orbital durante la noche. A continuación se usó este inóculo para inocular 1 L de LB que contenía 50 µg/ml de kanamicina. La OD600 de este cultivo se dejó alcanzar 0,5-0,7 (fase mid-log) antes de inducir la expresión de la proteína con IPTG de isopropílico a 0,1 mM 65 durante 2 horas a 37°C con agitación de 200 rpm. Las células fueron cosechadas (7,500g) y se resuspendieron en un tampón de unión desnaturalizante (Urea 8M, 20 mM de fosfato de sodio pH 8,0 y 500 mM NaCl) y se sonicaron

en hielo durante ráfagas de 3 x 15 s en intervalos de 30 s usando un disruptor de células Branson Sonifer 250 (Branson Ultronics Corporation, Danbury, CT) con la micropunta sobre la configuración 3, después se centrifugó a

39.000 g durante 30 min a 4°C. Las proteínas recombinantes se purificaron a partir del sobrenadante mediante la carga en una columna pre-equilibrada Ni-NTA agarosa y después el lavado con tampón de lavado desnaturalizante (urea 8M, 20 mM fosfato de sodio pH 6,0 y 500 mM NaCl) para eluir las proteínas no unidas. A continuación, la columna se lavó usando 10 volúmenes de tampón de unión B y la proteína recombinante se eluyó con tampón desnaturalizante de elución (urea 8 M, 20 mM fosfato de sodio pH 6,0, 500 mM NaCl y 0,5 M de imidazol). La proteína purificada se dializó contra urea 2M-PBS y se almacenó a -80°C.

[0115] Muestras de proteínas recombinantes se analizaron mediante SDS-PAGE y sus masas moleculares determinadas usando ProtParam en línea (http://au.expasy.org/tools/protparam.html). La concentración de proteína de todas las muestras se determinó por el ensayo de proteínas Bio-Rad utilizando BSA como estándar.

[0116] La inmunización y el modelo de periodontitis de ratón. Los experimentos con periodontitis de ratón se realizaron como se ha descrito anteriormente (3) y fueron aprobados por el Comité de Ética para la Experimentación Animal de la Universidad de Melbourne. Ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad (12 ratones por grupo) alojados en microaisladores se inmunizaron por vía subcutánea (sc 100 µL), ya sea con 50 µg de una de las proteínas recombinantes o complejo rgpA-Kgp, 2x109 células matadas por formalina de cepa W50 de P.gingivaleso PBS; cada antígeno se emulsionó en adyuvante incompleto de Freund (IFA). Después de 30 días los ratones fueron reforzados con antígeno (inyección s.c., emulsionado en IFA) y luego sangrado del plexo retrobulbar 12 días más tarde. Cuatro días después de la segunda inmunización, a los ratones se les dio la kanamicina (Sigma-Aldrich, Nueva Gales del Sur, Australia) a 1 mg/ml en agua desionizada ad libitum durante 7 días. Tres días después del tratamiento antibiótico (2 días después de la hemorragia), los ratones se inocularon por vía oral cuatro veces a una distancia de 2 días, con 1 x 1010 W50 P.gingivalesviable (25 µL) en tampón de PG (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM de CaCl2 y 5 mM de cisteína-HCl, pH 8,0) que contiene 2% (peso/vol) de carboximetilcelulosa (CMC; Sigma-Aldrich, Nueva Gales del Sur, Australia), y un control de grupo fue simulado infectado con tampón de PG que contiene 2% (peso/vol) de CMC solo. Los inóculos se prepararon de la cámara anaeróbica y luego se aplicaron inmediatamente al margen gingival de los dientes molares maxilares. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron otras cuatro dosis (2 días de diferencia) de 1 x 1010 células de W50 P.gingivalesviable (25 µL) en tampón de PG que contiene 2% (peso/vol) de CMC. El número de bacterias viables en cada inóculo se verificó por enumeración en agar de sangre. Los ratones fueron alimentados con una dieta en polvo suave (Barastock, Australia) y se alojaron en jaulas equipadas con un fondo de malla de alambre elevado a impedir el acceso a la ropa de cama. Cuatro semanas después de la última dosis, los ratones fueron sangrados del plexo retrobulbar y matados, y los maxilares se retiraron y se cortaron por la mitad con una mitad (derecha) utilizada para la medición de la pérdida de hueso alveolar y la otra mitad (izquierda) utilizada para PCR de tiempo real.

[0117] Los maxilares de mitad derecha se hirvieron (1 min) en agua desionizada, se descarnaron mecánicamente, y se sumergieron en 2% de hidróxido de potasio (peso/vol) (16 h, 25°C). A continuación, los maxilares medios se lavaron (dos veces con agua desionizada) y se sumergieron en 3% (peso/volumen) de peróxido de hidrógeno (6 h, 25°C). Después de los maxilares medios se lavaron (dos veces con agua desionizada), se tiñeron con 0,1% (peso/volumen) de azul de metileno acuoso, y una imagen digital de la cara vestibular de cada mitad maxilar fue capturada con una cámara digital Olympus DP12 montada en un microscopio de disección, usando el software OLYSIA BioReport versión 3.2 (Olympus Australia Pty Ltd, Nueva Gales del Sur, Australia) para evaluar la pérdida ósea horizontal. La pérdida de hueso horizontal es la pérdida que ocurre en un plano horizontal, perpendicular a la cresta ósea alveolar (ABC) que se traduce en una reducción de la altura de la cresta. Cada maxilar medio fue alineado de manera que se superponen las cúspides bucal y lingual molares de cada imagen diente, y la imagen fue capturada con una escala micrométrica en el marco, de manera que las mediciones podrían ser estandarizadas para cada imagen. El área de la unión cemento-esmalte para la ABC para cada diente molar se midió utilizando software de imágenes OLYSIA BioReport versión 3.2. Mediciones de pérdida de hueso se determinaron dos veces por un solo examinador utilizando un protocolo aleatorizado y ciego.

[0118] La determinación de anticuerpo de subclase mediante un ELISA. Para determinar las respuestas de anticuerpos de subclase de los sueros de ratón, se realizaron ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) por triplicado utilizando una solución de 5-µg/ml de W50 P.gingivalesmatada por formalina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,15 M NaCl), pH 7,0, que contenía 0,1% (vol/vol) de Tween 20 (PBST) para recubrir los pocillos de placas de microtitulación de polivinilo de fondo plano (Dynatech Laboratories, McLean, VA). Después de la eliminación de la solución de revestimiento, PBST que contiene 2% (peso/vol) de polvo de leche descremado se añadió a los pocillos para bloquear el plástico sin recubrir durante 1 h a temperatura ambiente. Después los pocillos se lavaron cuatro veces con PBST, diluciones en serie de sueros de ratón en PBST que contiene 0,5% (peso/vol) de leche descremada se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 16 h a temperatura ambiente (SK-PBST). Después se lavaron los pocillos seis veces con PBST, una dilución 1/2.000 de IgG de cabra para IgM de ratón, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) se añadió en SK-PBST y se dejó unirse durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces en PBST, y una dilución 1/5.000 de rábano picante peroxidasa conjugado de inmunoglobulina de conejo anti-cabra (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST se añadió a cada pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente . Después se lavaron los pocillos seis veces con PBST, el anticuerpo unido se detectó

mediante la adición de 100 µL de ácido sulfónico de sustrato ABTS [0,9 mM de 2,2'-azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6) en 80 mM de ácido cítrico que contiene 0,005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4,0] a cada pocillo. La densidad óptica a 415 nm se midió usando un lector de microplacas (lector de microplacas Bio-Rad, modelo 450). [0119] Electroforesis en gel de SDS-PAGE y transferencia Western. Las proteínas recombinantes (10 µg) se analizaron utilizando el sistema de electroforesis XCell SureLock Mini-Cell. Las proteínas recombinantes se mezclaron en 20 µL de tampón de muestra reductora (10% [peso/vol] SDS, 0,05% [peso/vol] azul de bromofenol, 25% [vol/vol] glicerol, y 0,05% [vol/vol] 2-mercaptoetanol). El pH se ajustó a pH 8,0 con 1,5 M Tris-HCl, y después la solución se calentó durante 5 min a 100°C. Las proteínas recombinantes (10 µg/carril) se cargaron en Novex 12% (peso/vol) de Tris-glicina de mini geles prefabricados, y la electroforesis se llevó a cabo usando una corriente de 30 a 50 mA y una diferencia de potencial de 125 V usando una sistema de electroforesis Novex (Novex, San Diego, CA). Las proteínas se visualizaron usando 0,25% w/v azul de Coomassie R250.

[0120] Análisis de epítopos de la secuencia de péptido de sitio activo de proteinasa Kgp (KAS-2). Los sitios de unión de anticuerpos para el péptido KAS2 de sitio activo de proteinasa Lys-específica (433-468 SEQ ID No: 28) se determinó por la síntesis de ocho péptidos de residuos de superposición N-terminalmente biotinilados (compensados por uno, la superposición por siete residuos) en un sistema de síntesis de péptido multipin (Chiron Technologies, Melbourne, Australia) utilizando protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida estándar para la química de Fmoc. Los péptidos biotinilados (5 µg/ml) en PBS 0,1 M, pH 7,4 se unieron a placas recubiertas de estreptavidina, durante la noche a 4°C (Nunc, NSW Australia). Después los pocillos se lavaron cuatro veces con el mapeo de epítopos PBST de los péptidos unidos a la placa se llevaron a cabo mediante ELISA según las instrucciones Chiron Technologies utilizando sueros de ratón a una dilución de 1: 1000 en 1% p/v no grasa de la leche desnatada en polvo en 0,1 M PBS, pH 7,4, que contiene 0,1% v/v de Tween 20 (SK-PBST). Después se lavaron los pocillos seis veces con PBST, una dilución 1/2.000 de IgG de cabra se añadió en SK-PBST y se dejó que se unieran durante 2 h a temperatura ambiente IgG de ratón (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia). Las placas se lavaron seis veces en PBST, y se añadió una dilución 1/5.000 de inmunoglobulina de conejo anti-cabra conjugada por peroxidasa de rábano (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST a cada pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente . Después se lavaron los pocillos seis veces con PBST, el anticuerpo unido se detectó mediante la adición de 100 µL de sustrato ABTS [0,9 mm 2,2’-azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6) ácido sulfónico en 80 mM de ácido cítrico que contiene 0,005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4,0] a cada pocillo. La densidad óptica a 415 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas Bio-Rad, modelo 450).

[0121] Análisis estadístico. Los datos de pérdida de hueso se analizaron estadísticamente usando un análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) y la prueba T3 de Dunnett (SPSS para Windows, versión 12). Los títulos de anticuerpos de subclase IgA, IgM, IgG y se analizaron estadísticamente utilizando de la prueba t de Student utilizando el software SPSS (SPSS para Windows, versión 12).

Ejemplo 2

[0122] Caracterización y purificación de las proteínas recombinantes (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1). Con el fin de caracterizar la capacidad de los fragmentos del dominio A1 Kgp adhesina y quimera Kgp proteinasa y fragmentos de los dominios adhesina A1 Kgp para proteger contra P.gingivalesinfección, expresamos y purificamos las proteínas recombinantes:-KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1. Las proteínas recombinantes (KsA1 y KLA1) y proteínas de quimera recombinantes (KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1) se purificaron a partir de cuerpos de inclusión, usando la cromatografía de afinidad de quelato de níquel y las proteínas purificadas se analizaron por SDS-PAGE (Fig. 1). Cada una de las proteínas recombinantes purificadas consistía en una banda principal de proteína con pesos moleculares de 40, 36, 31 y 32 kDa correspondientes a KAS2-KLA1, KLA1, KsA1 y KAS1-KsA1, y estos pesos corresponden a las masas moleculares calculadas de las proteínas recombinantes His-tag utilizando ProtParam. Para caracterizar la inmunogenicidad de las proteínas recombinantes KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1 se usaron para inmunizar ratones y los sueros se utilizaron para sondear placas recubiertas de péptido KAS2 y placas revestidas con células W50 P.gingivalesmatadas con formalina (Fig 2). Se encontraron proteínas de quimera recombinantes KAS1-KsA1 y antisueros KAS2-KLA1 reconocían péptido KAS2 (Fig 2A) a un nivel similar a antisueros específicos a KAS2 (conjugado de toxoide KAS2-difteria), así como células W50 P.gingivalesmatadas por formalina (Fig 2B). Sin embargo, el antisuero contra la proteína recombinante KLA1 sólo reconoció células W50 P.gingivalesmatadas (Fig 2B).

Ejemplo 3

[0123] Efecto de la inmunización con las proteínas recombinantes (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1) sobre pérdida de hueso alveolar inducida por P.gingivalesen el modelo de periodontitis de ratón. Las proteínas recombinantes KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1, cepa W50 P.gingivalesmatada por formalina y el complejo rgpA-Kgp se utilizaron para determinar y comparar la protección inducida contra pérdida de hueso alveolar inducida por P.gingivalesusando un modelo de ratón modificado de la pérdida de hueso periodontal sobre la base de lo reportado por Baker et al (4). Se inmunizaron ratones (días 0 y 30), ya sea con proteínas recombinantes KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 o KAS2-KLA1, complejo rgpA-Kgp o células de cepa W50 P.gingivalesmatadas por formalina (FK-W50) o adyuvante PBS solo y oralmente se desafiaron con W50 P.gingivalesviables. La inmunización con todos los antígenos recombinantes, células complejas rgpA-Kgp y FK-W50 protegieron ratones BALB/c contra pérdida de

hueso alveolar inducida por P.gingivalesya que estos animales mostraron significativamente menos pérdida de hueso (p <0,001) en comparación con el grupo inmunizado por PBS (Figura 3). Sin embargo, ratones inmunizados por KAS2-KLA1 tenían significativamente menos pérdida de hueso que los ratones inmunizados con KLA1 (p <0,01); KsA1 (p <0,001), complejo rgpA-Kgp (p <0,001), las células FK-W50 (p <0,001) y no ratones expuestos (p <0,001). No hubo diferencia significativa en la pérdida de hueso entre los ratones inmunizados KAS2-KLA1 y KAS1-KsA1. Además, ratones inmunizados por KAS1-KsA1 mostraron significativamente menos pérdida de hueso que los ratones no expuestos (p <0,01) y ratones inmunizados con complejos rgpA-Kgp (p <0,05), pero no fueron significativamente diferentes de ratones inmunizados por KsA1, KLA1, y FK-W50. No hubo diferencia significativa en la pérdida de hueso entre ratones inmunizados por KsA1, KLA1, complejo rgpA-Kgp y FK-W50.

Ejemplo 4

[0124] Respuestas de subclase de anticuerpo inducidas por la inmunización con las proteínas recombinantes (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 y KAS2-KLA1) en los modelos de periodontitis de ratón. Antes y después del desafío de inoculación oral con ratones de células P.gingivalesviables, los ratones fueron sangrados y los sueros se recogieron por centrifugación. Fig. 4 muestra la reactividad de subclase de anticuerpo a células W50 P.gingivalesmatadas por formalina para cada inmunógeno (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 o KAS2-KLA1 o células de cepa W50 P.gingivalesmatadas por formalina (FK-W50)) en el modelo de ratón periodontitis. Todos los inmunógenos protectores indujeron un alto título de anticuerpos IgG a FK-W50. Además, la subclase de anticuerpos predominante cada inmunógeno protector inducido fue IgG1 con anticuerpos sólo débilmente inmunorreactivos IgG2a, IgG2b e IgG3 FK-W50-específicos (Fig 4). La subclase de anticuerpo predominante inducida por cada inmunógeno tanto antes (Fig 4A) como después de la inoculación oral (Fig 4B) era IgG1.

Ejemplo 5

[0125] El mapeo de epítopos de KAS2 (433-468). Ocho péptidos de residuos biotinilados superpuestos (compensación por uno, superposición por siete) para KAS2 (433-468) se sintetizaron y se usaron para recubrir placas recubiertas con estreptavidina. Los epítopos de unión a anticuerpo se identificaron a continuación, utilizando antisueros de ratones inmunizados con conjugado toxoide de KAS1-KsA1, KAS2-KLA1 y KAS2-difteria (Fig 5). Un incremento de dos veces en la densidad óptica (415 nm) por encima del fondo se consideró como una respuesta de anticuerpos positiva (umbral de OD). Los antisueros reconocieron las siguientes secuencias peptídicas derivadas de SEQ ID No.28 viz. KAS1 -KsA1 reconocieron péptidos 435-442, 436-443, 445-452, 446-453 y 447-454 (umbral OD = 0,07, Fig 5A), mientras que KAS2 -KLA1 reconocieron péptidos 435-442, 447-454 y 448-455 (umbral ID = 0,07, Fig 5A). Esto sugiere el reconocimiento de una serie de epítopos mínimos viz. péptido 436-442 (VSFANYT y su variante VGFANYT), péptido 447-452 (ETAWAD y su variante ETSWAD), y el péptido 448-453 (TAWADP y su variante TSWADP). Los péptidos que incluyen el epítopo de péptido 436 a 442 incluyen GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA y VGFANYTA. Los péptidos que incluyen el péptido 447-452 y/o 448-453 epítopos incluyen SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL y TSWADPL, más particularmente GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TA-WADPLL y TSWADPLL.

Ejemplo 6

Síntesis de péptidos KAS y RAS para la conjugación a una proteína.

[0126] Los péptidos se sintetizaron manualmente o utilizaron un sintetizador de péptidos de microondas CEM. Se utilizaron protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida estándar para la química Fmoc. Los péptidos se ensamblan como la forma carboxiamida usando resina AM-sure derivada de enlazador Rink (AAPPTEC, KY, EE.UU.). El acoplamiento se logra con activación HBTU/HOBt utilizando 4 equiv de Fmoc-aminoácido y 6 equivalentes de DIPEA. El grupo Fmoc se eliminó mediante 20% de piperidina en 1 M HOBt/DMF.

[0127] Las resinas teniendo péptidos KAS o RAS se hincharon en DMF y el grupo Fmoc N-terminal eliminaron por 2% v/v DBU en DMF que contenía 2% v/v de piperidina. A continuación, el grupo amino N-terminal se derivatizó con el grupo de ácido S-Acetilmercaptoacético (SAMA) utilizando 5 equiv de SAMA-OPfp y 5 equiv de HOBt. La reacción se controló mediante el ensayo de ácido sulfónico de trinitrobenceno (TNBSA). Cuando se devolvió una prueba TNBSA negativa la resina se lavó (5 x DMF, 3 x DCM y 3 x éter dietílico). A continuación se secó la resina bajo vacío. La escisión de los péptidos del soporte de resina se realizó mediante TFA: fenol: TIPS: EDT: agua (92: 2: 2: 2: 2) cóctel de escisión durante 2,5 horas o 4 horas dependiendo del contenido de arginina del péptido. Después de la escisión, la resina se eliminó por filtración y el filtrado se concentró a aproximadamente 1 ml bajo una corriente de nitrógeno. Después de que los productos de péptidos se precipitaron en éter frío, se centrifugaron y se lavaron tres veces. Los precipitados peptídicos se disolvieron en 5 a 10 ml de agua que contiene 0,1% v/v de TFA y el residuo insoluble se eliminó por centrifugación. Los péptidos se purificaron mediante RP-HPLC.

[0128] Un número de diferentes restos químicos pueden ser utilizados para derivatizar péptidos para la conjugación a proteínas, estos introducirían grupos reactivos tales como; haluros (bromo, cloro y yodo), maleimido, succinimidilo, hidrazinilo, oxima, tiol, que luego se puede utilizar para derivatizar el péptido a una proteína tal como KgpA1 a través de sus residuos de cisteína nativos o se ha derivatizado con el grupo reactivo complementario que permite que la

ligación química proceda para formar un conjugado de péptido-proteína.

[0129] Conjugación de Sama-péptidos a KA1. A una solución, que contiene 10 mg/ml de KA1 recombinante u otro dominio de adhesina del complejo rgpA-Kgp en solución salina tamponada con fosfato (fosfato de sodio 0,1 M, 0,9% de NaCl, pH 7,4) se añadió 0,1 ml de una solución de 1% p/v de éster benzoil-N-hidroxisuccinimida m-maleimido (MBS) en DMF. Después de 30 min MBS sin reaccionar se eliminó y KA1 modificados por MBS se recogieron por filtración en gel utilizando una columna PD10 (Pharmacia, NSW, Australia) equilibrada en tampón de conjugación (0,1 M de fosfato sódico, 5 mM de EDTA; pH 6,0). Péptido SAMA purificado (1,3 m moles) se disolvió en 200 µL 6 M de guanidina HCl que contiene 0,5 M Tris; 2 mM de EDTA, pH 6,0 y se diluyó con 800 µl de agua MilliQ y se desprotegió in situ mediante la adición de 25 µL de 2M NH2OH (40 equiv) disuelto en agua MilliQ. Los MBS-KA1 recogidos se hicieron reaccionar inmediatamente con SAMA-péptido desprotegido y se agitaron durante una hora a temperatura ambiente. El conjugado de péptido-KA1 se separó del péptido sin reaccionar por filtración en gel utilizando una columna PD10 equilibrada con PBS pH 7,4 y se liofilizó. La reacción se controló mediante la prueba de Ellman.

Ejemplo 7

[0130] Preparación de anticuerpos. El antisuero policlonal a las proteínas recombinantes se crían en ratones mediante inmunización con las proteínas por vía subcutánea. Los ratones se inmunizaron en el día 0 con 25 µg de proteína en adyuvante incompleto de Freund y el día 30 con 25 µg de proteína en adyuvante incompleto de Freund. Las inmunizaciones se llevaron a cabo utilizando procedimientos estándar. Se obtienen antisueros policlonales que tienen un título alto contra las proteínas. Si los anticuerpos monoclonales deseados específicamente dirigidos contra proteínas recombinantes se obtienen usando procedimientos estándar.

EJEMPLO 8

[0131] Inmunización para la generación de anticuerpos. Ratones BALB/c o CD1 (ratones suizos criados) de 6-8 semanas de edad (10 ratones por grupo) se inmunizaron subcutáneamente (100 µL s.c.), eran 50 µg de la KAS2-LA1 quimera y el antígeno emulsionado en adyuvante de Freund incompleto (IFA). Después de 30 días los ratones fueron reforzados con antígeno (inyección s.c., emulsionado en IFA) y 12 días más tarde los ratones fueron sacrificados y se sometieron a sangrado cardíaco para recoger sueros.

[0132] Determinación de anticuerpo de subclase mediante un ELISA. Para determinar las respuestas de anticuerpos de subclase de los sueros de ratón, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) se realizaron por triplicado usando una solución de 5 µg/ml de KAS2-LA1 quimera o W50 P.gingivalesmatada por formalina o el complejo rgpA-Kgp en solución salina tamponada por fosfato (PBS) (0,01 M Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,15 M NaCl), pH 7,0, que contenía 0,1% (vol/vol) de Tween 20 (PBST) para recubrir pocillos de placas de microtitulación de polivinilo de fondo plano (Dynatech Laboratories, McLean, VA). Después de la eliminación de la solución de revestimiento, PBST que contiene 2% (peso/vol) de leche descremada se añadió la leche en polvo a los pocillos para bloquear el plástico sin recubrir durante 1 h a temperatura ambiente. Después los pocillos se lavaron cuatro veces con PBST, diluciones en serie de sueros de ratón en PBST que contiene 0,5% (peso/vol) de leche descremada se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 16 h a temperatura ambiente (SK-PBST). Después se lavaron los pocillos seis veces con PBST, una dilución 1/2.000 de IgG de cabra para IgM de ratón, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) se añadió en SK-PBST y se dejó unir durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron seis veces en PBST, y se añadió una dilución 1/5.000 de inmunoglobulina de conejo anti-cabra conjugada con peroxidasa de rábano (Sigma, Nueva Gales del Sur, Australia) en SK-PBST a cada pocillo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Después se lavaron los pocillos seis veces con PBST, el anticuerpo unido se detectó mediante la adición de 100 µL de sustrato de ABTS [0,9 mM de 2,2'azino-bis(3-etilbenz-tiazolina-6) ácido sulfónico en 80 mM de ácido cítrico que contiene 0,005% (vol/vol) de peróxido de hidrógeno, pH 4,0] a cada pocillo. La densidad óptica a 415 nm se midió utilizando un lector de microplacas (lector de microplacas Bio-Rad, modelo 450).

[0133] Respuestas de subclase de anticuerpo inducidas por la inmunización con la proteína recombinante KAS2-KLA1 en ratones exogámicos (CD1, suizo). Los ratones CD1 (suizo) se inmunizaron con la KAS2-LA1 quimera, se sangraron y los sueros se recogieron por centrifugación. Fig. 6 muestra la reactividad de subclase de anticuerpo a KAS2-LA1 quimera, células W50 de P.gingivalesmatadas con formalina y el complejo rgpA-Kgp. La KAS2-LA1 quimera indujo un fuerte anticuerpo IgG con una respuesta de anticuerpos de IgG1 predominante que reconoce la KAS2-LA1 quimera y transversal se reaccionó fuertemente con células W50 P.gingivalesFK y el complejo rgpA-Kgp (Fig. 6). Además, la KAS2-LA1 quimera indujo solamente anticuerpos de antígeno específico débiles inmunorreactivos IgG2a, IgG2b e IgG3 (figura 6).

Ejemplo 9

Desarrollo de un modelo estructural Kgp e identificación de secuencias accesibles de superficie de sitio activo.

[0134] Nuestro trabajo ha demostrado que péptidos del sitio activo de proteinasa Kgp son altamente inmunogénicos e inducir altos niveles de protección contra pérdida de hueso inducida por P. gingivalis. En un intento de identificar adicionalmente de péptidos de sitio activo de proteinasa como candidatos a vacuna en un modelo de dominio catalítico de Kgp fue desarrollado usando la suite de programas Orchestrar dentro de Sybyl7.3 (Fig 7). El modelo se basa en PDB estructura 1 CRV de la proteasa RgpB de P. gingivalis, las proteínas tienen una identidad en pares 23,58% y la puntuación Z es 25,09 (un modelo de alta confianza). El servidor de la interacción de proteína Meta-PPISP predice dos superficies de interacción proteína-proteína para Kgp: la superficie de unión del sustrato (como en RgpB), y una segunda superficie única de Kgp. Las principales diferencias entre los modelos RgpB y Kgp están en los bucles que enmarcan la segunda superficie de interacción y un hueco de 19 residuos (Val526 a Phe545) que no podía ser modelado en Kgp que cae dentro de la segunda superficie de interacción. La Figura 7 muestra el modelo Kgp con las cintas más gruesas mostrando secuencias accesibles de superficie alrededor del sitio activo de la proteinasa de Kgp, se encontraron que las secuencias accesibles por superficie eran Asp388-Gln394, Leu421-Ala423, Ala443-Glu447 con Ala451, Asn510-Trp513, y Ile570 -Gly577 con Tyr580. A partir del modelo (Fig 6), es evidente que, junto con KAS2 (A) otras tres secuencias KAS4 (Asp388-Val395) (B), KAS5 (Asn510-Asp516) (C) y KAS6 (Ile570-Tyr580) (D) son prominentes y de longitud suficiente para ser dianas de vacunas. Así, una proteína quimérica recombinante puede ser producida que tiene cada uno de estos péptidos en la secuencia y se unió al Nterminal de KLA1 para producir multiKAS-KLA1, que se puede utilizar para inducir una respuesta inmune y, por tanto, para proteger contra enfermedades o condiciones relacionadas con P. gingivalis.

Ejemplo 10

Proceso para el modelado de proteinasa Arg-X para identificar regiones inmunogénicas que flanquean el sitio catalítico.

[0135] La estructura tridimensional de proteinasa Arg-X se determinó de acuerdo con los métodos de Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, Medrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. La estructura cristalina de gingipain R: una proteinasa de cisteína bacteriana Arg-específica con un pliegue similar a caspasa. EMBO J. 1999 Oct 15; 18 (20): 5453-62

Ejemplo 11

[0136] El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes que contiene anticuerpos.

Ingrediente: % en peso

Dihidrato de fosfato dicálcico: 50,0

Glicerol: 20,0

Carboximetilcelulosa sódica: 1,0

Sulfato de laurilo sódico: 1,5

Sarconisato de lauroílo sódico: 0,5

Sabor: 1,0

Sacarina sódica: 0,1

Gluconato de clorhexidina: 0,01

Dextranasa: 0,01

Anticuerpos específicos que contienen suero de cabra: 0,2

Agua: equilibrio

Ejemplo 12

[0137] El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes.

Ingrediente: % en peso

Dihidrato de fosfato dicálcico: 50,0

Sorbitol: 10,0

Glicerol: 10,0

Carboximetilcelulosa sódica: 1,0

Sulfato de laurilo sódico: 1,5

Sarconisato de lauroílo sódico: 0,5

Sabor: 1,0

Sacarina sódica: 0,1

Monofluorofosfato sódico: 0,3

Gluconato de clorhexidina: 0,01

Dextranasa: 0,01

Anticuerpos específicos que contienen suero bovino: 0,2

Agua: equilibrio

Ejemplo 13 [0138] El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes.

5

Ingrediente: % en peso

Dihidrato de fosfato dicálcico: 50,0

Sorbitol: 10,0

10: Glicerol Carboximetilcelulosa sódica 10,0 1,0

Deitanolamida de lauroílo: 1,0

Monolaurato de sucrosa: 2,0

Sabor: 1,0

15: Sacarina sódica Monofluorofosfato sódico 0,1 0,3

Gluconato de clorhexidina: 0,01

Dextranasa: 0,01

Anticuerpos específicos que contienen leche bovina lg: 0,2

20: Agua equilibrio

Ejemplo 14

[0139] El siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes. 25 Ingrediente

% en peso Sorbitol 22,0 Musco de Irlanda 1,0 Hidróxido sódico (50%) 1,0 30 Gantrez 19,0 Agua (desionizada) 2,69 Monofluorofosfato sódico 0,76 Sacarina sódica 0,3 Pirofosfato 2,0 35 Alumina hidratada 48,0 Aceite de sabor 0,95 Anticuerpos monoclonales de ratón 0,3 sulfato de laurilo sódico 2,00

Ejemplo 15

[0140] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de pasta de dientes líquida.

45 Ingrediente

% en peso Poliacrilato sódico 50,0 Sorbitol 10,0 Glicerol 20,0 Sabor 1,0 50 Sacarina sódica 0,1 Monofluorofosfato sódico 0,3 Gluconato de clorhexidina 0,01 Etanol 3,0 Anticuerpos específicos que contienen lg equino 0,2 55 Ácido linólico 0,05 Agua equilibrio

Ejemplo 16

[0141] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de enjuague bucal. Ingrediente

% en peso

10 15: Etanol Sabor Sacarina sódica Monofluorofosfato sódico Gluconato de clorhexidina Deitanolamida de lauroílo Anticuerpos específicos que contienen lg de conejo Agua 20,0 1,0 0,1 0,3 0,01 0,3 0,2 equilibrio

Ejemplo 17

20: [0142] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de enjuague bucal.

Ingrediente: % en peso

Gantrez S-97 Glicerina 25 Aceite de sabor Monofluorofosfato sódico Gluconato de clorhexidina Deitanolamida de lauroílo Anticuerpos monoclonales de ratón 30 Agua

Ejemplo 18

35 [0143] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de pastilla.

Ingrediente

Azucar Jarabe de maíz

40 Aceite de sabor NaF Anticuerpos monoclonales de ratón Estearato Mg Agua 45

Ejemplo 19

2,5 10,0 0,4 0,05 0,01 0,2 0,3 equilibrio

% en peso

75-80 1-20 1-2 0,01-0,05 0,3 1-5 equilibrio

[0144] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de crema de masaje gingival. Ingrediente

% en peso

Petrolato blanco Glicol de propileno Alcohol de estearilo Glicol de polietileno 4000

55 Glicol de polietileno 400 Monoestearato de sucrosa Gluconato de clorhexidina Anticuerpos específicos de ratón Agua

60 8,0 4,0 8,0 25,0 37,0 0,5 0,1 0,3 equilibrio

Ejemplo 20

5 [0145] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de goma de mascar.

Ingrediente

% en peso Goma de base 30,0 Carbonato de calcio 2,0 Sorbitol cristalino 53,0 Glicerina 0,5 Aceite de sabor 0,1 Anticuerpos específicos de ratón 0,3 Agua equilibrio 15

Ejemplo 21

[0146] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación farmacéutica

Ingrediente

% en peso Anticuerpos monoclonales específicos humanizados 10 Salina tamponada de fosfato estéril 90

Ejemplo 22

[0147] Lo siguiente es un ejemplo de una formulación de gel periodontal.

Ingrediente

% en peso Pluronic F127 20,0 Alcohol de estearilo 8,0 Anticuerpos específicos 3,0 Dióxido de silicon coloidal (Aerosil 200) 1,0

35 Gluconato de clorhexidina 0,1 Agua equilibrio

Referencias

[0148]

1. McKee, A. S., A. S. McDermid, A. Baskerville, A. B. Dowsett, D. C. Ellwood, and P. D. Marsh. 1986. Effect of hemin on the physiology and virulence of BacteroidesgingivalesW50. Infect. Immun. 52:349-355.

45 2. Slots, J. 1982. Importance of black-pigmented Bacteroides in human periodontal disease. Host parasite interactions in periodontal diseases. American Society for Microbiology.

3. O’Brien-Simpson, N. M., R. Pathirana, R. A. Paolini, Y.-Y. Chen, P. D. Veith, T. V., R. N. Pike, N. Alley, and E.

C. Reynolds. 2005. An immune response directed to proteinase and adhesin functional epitopes protects against Porphyromonas gingivalis-induced bone loss. Journal of Immunology 175:3980-3989.

4. Baker, P. J., R. T. Evans, and D. C. Roopenian. 1994. Oral infection with Porphyromonasgingivalesand induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Arch Oral Biol 39:1035-1040.

55 LISTADO DE SECUENCIAS

[0149]

<110> Oral Health Australia Pty Ltd

<120> PREVENCIÓN, TRATAMIENTO Y DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN P.GINGIVALES

<130> 81595649TPG 65

<150> AU2008904476

<151> 2008-08-29

5: <150> AU2008905483 <151> 2008-10-23

<150> US61/151132

10: <151> 2009-02-09

<150> AU2009903052

15: <151> 2009-06-30 <160> 85

<170> PatentIn versión 3.5

20: <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivales

25: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (6) .. (6) <223> X puede ser G o S

30: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (18) .. (18) <223> X pueden ser o bien S o A

35: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (23) .. (23) <223> x puede ser s o L

40: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (24) .. (24) <223> X puede ser L o V

45: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (26) .. (26) <223> X puede ser A o T

50: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (27) .. (27) <223> X puede ser T o S

55: <220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (29) .. (29) <223> X puede ser V o L

60: <220>

65: <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (36) .. (36) <223> X puede ser D o N

<400> 1

15: <210> <211> 37 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivales 2

<220> <221> MISC_CARACTERISTICA <222> (8) .. (8) <223> X puede ser V o A

25: <400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

45 <400> 3

<210> 4

<211> 7

<212> PRT <213>gingivalesPorphyromonas

<400> 4

65 <210> 5

<211> 8

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 6

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 7

35 <210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 8

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 9

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 10

<210> 11

<211> 6

<212> PRT 10 <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 11

20 <210> 12

<211> 6

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

25 <400> 12

<210> 13

<211> 7

<212> PRT 35 <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 13

<210> 14 45 <211> 7

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 14 50

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis 60

<400> 15

<210> 16

<211> 7 5 <212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 16

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis 20

<400> 17

<210> 18 30 <211> 7

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 18 35

40

45: <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 19

50

55 <210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

60 <400> 20

<210> 21

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 21

<210> 22 15 <211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 22

25: <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 23

35

45: <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <400> 24

<210> 25

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 25

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 26

<210> 27

<211> 23

<212> PRT 15 <213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (6) .. (6)

<223> X puede ser G o S

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (18) .. (18) 25 <223>X puedeser S oA

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (23) .. (23)

<223> X puede ser S o L

<400> 27

<210> 28

<211> 36 45 <212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (5) .. (5)

<223> X puede ser G o S

<220>

<221>: MISC_CARACTERISTICA 55 <222> (17) .. (17)

<223> X puede ser S o A

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (22) .. (22)

<223> X puede ser S o L

<220>

<221>: MISC_CARACTERISTICA 65 <222> (23) .. (23)

<223> X puede ser L o V

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222>: (25) .. (25) 5 <223> X puede ser A o T

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222>: (26) .. (26) 10 <223>Xpuedeser ToS

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222>: (28) .. (28) 15 <223>X puedeser V oL

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222>: (35) .. (35) 20 <223>X puedeser DoN

<400> 28

<210> 29 35 <211> 20

<212> PRT

<213> Porphyromonasgingivales

<220>: 40 <221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (2) .. (2)

<223> X puede ser G o S

<220>: 45 <221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (14) .. (14)

<223> X puede ser S o A

<220>: 50 <221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (19) .. (19)

<223> X puede ser S o L

<220>: 55 <221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (20) .. (20)

<223> X puede ser L o V

<400> 29 60

<210> 30

<211> 22

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 30

<210> 31

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (8) .. (8)

<223> X puede ser V o A

<400> 31

<210> 32

<211> 36

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (7) .. (7)

<223> X puede ser V o A

<400> 32

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (4) .. (4)

<223> X puede ser V o A

<400> 33

15 <210> 34

<211> 21

<212> PRT

<213> Porphyromonasgingivales

20 <400> 34

30 <210> 35

<211> 362

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

35 <400> 35

20 25: <210> 36 <211> 231 <212> PRT <213>gingivales Porphyromonas <400> 36

30

35

40

45

50

55

60 <210> 37

<211> 306

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

60 <400> 37

35 <210> 38

<211> 362

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

40 <400> 38

<210> 39

<211> 141

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 39

<210> 40

<211> 119

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 40

10 <210> 41

<211> 133

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

15 <400> 41

<210> 42

<211> 120

<212> PRT 45 <213>gingivales Porphyromonas

<400> 42

<210> 43

<211> 185

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 43

<210> 44

<211> 119

<212> PRT

<213>gingivales Porphyromonas 5

<400> 44

<210> 45 40 <211> 131

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 45 45

<210> 46

<211> 275

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 46

<210> 47

<211> 49

<212>: ADN 35 <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 47 gaccatggct catcaccatc accatcacaa taccggagtc agctttgca 49

<210> 48

<211> 36

<212>: ADN 45 <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 48 gactcgagtt gctttc atttgtcctt attagtgagt 36

<210> 49

<211> 31

<212>: ADN 55 <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 49 gaccatggct tggggagaca atacgggtta c 31

<210> 50

<211> 27

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 50

gactcgagac ctccgttagg caaatcc 27

5: <210> 51 <211> 41 <212> ADN <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 51 ccgtattgtc tccccatttg tccttattag tgagtgcttt c: 41

15: <210> 52 <211> 37 <212> ADN <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 52 cactaataag gacaaatggg gagacaatac gggttac: 37

25: <210> 53 <211> 51 <212> ADN <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 53 catggatctg agaccgcatg ggctgatcca cttttcttgt tggatgccga t: 51

<210> 54 <211> 62 <212> ADN <213> Porphyromonas gingivalis

35: <400> 54

45: <210> 55 <211> 25 <212> ADN <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 55 gattcggaaa gtgtt ctcgaggaat: 25

55: <210> 56 <211> 53 <212> ADN <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 56 ccatggctga ttatagctgg aattcccagg tagtcagctt tgcaaactat aca: 53

65: <210> 57 <211> 52 <212> DNA <213> Porphyromonas gingivalis

<400> 57 ctttgcaaac tatacagcgc atggatctga gaccgcatgg gctgatccac tt 52

<210> 58

<211> 52

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 58 atgggctgat ccacttctga attcttattg gggcgagatc ggcaatatta cc 52

<210> 59

<211> 52

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 59 gatcggcaat attacccata ttggtgctca ttacgcttgg ggagacaata cg 52

<210> 60

<211> 52

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 60 ctcgagacct ccgttaggca aatccaatgc cggtgttatc agatagttgt ca 52

<210> 61

<211> 1706

<212> PRT <213>gingivalesPorphyromonas

<400> 61

<210> 62

<211> 1732

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 62

<210> 63

<211> 2164

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 63

<210> 64

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (2) .. (2)

<223> X puede ser S o Y

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (3) .. (3)

<223> X puede ser cualquiera de los Y o S

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (6) .. (6)

<223> X puede ser P o S

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (7) .. (7)

<223> X puede ser K o Q

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (8) .. (8)

<223> X puede ser I o V

<400> 64

<210> 65

<211> 7

<212> PRT

<213> Porphyromonasgingivales

<400> 65

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> Porphyromonasgingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (4) .. (4)

<223> X puede ser V o I

<400> 66 <210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 67

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (1) .. (1)

<223> X puede ser N o D

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (3) .. (3)

<223> X puede ser S o Y

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (6) .. (6)

<223> X puede ser S o P

<400> 68

<210> 69

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 69 <210> 70

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 70

<210> 71

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 71

<210> 72

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 72

<210> 73

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 73

<210> 74

<211> 23

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 74

<210> 75

<211> 24

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 75

<210> 76

<211> 27

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 76

<210> 77

<211> 27

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 77

<210> 78

<211> 28

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 78

<210> 79

<211> 16

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<220>

<221> MISC_CARACTERISTICA

<222> (6) .. (7) 35 <223> X puede ser NP o NPNP o NPNPNP o NPNPNPNP o NPNPNPNPNP o NPNPNPNPNPNP

<400> 79

<210> 80

<211> 325

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivales

<400> 80

35: <210> 81 <211> 260 <212> PRT <213>gingivales Porphyromonas <400> 81

45

55

<210> 82

<211> 258

<212> PRT <213>gingivales Porphyromonas

<400> 82

<210> 83

<211> 15

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 83

<210> 84

<211> 15

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 84

<210> 85

<211> 17

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 85

Claims

Reivindicaciones

1. Una proteína quimérica o de fusión capaz de inducir una respuesta inmune a P. gingivalis, comprendiendo la proteína un primer péptido unido directamente o a través de un conector a un segundo polipéptido, en el que:

(A)

dicho primer péptido comprende una región de una enzima similar a tripsina P.gingivalesseleccionada del grupo que consiste en:

(i)

una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1;

(ii)

una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2;

(iii) la secuencia mostrada en una de SEQ ID NOs: 27 a 30; y

(iv) la secuencia mostrada en una de SEQ ID NOs: 31 a 34;

(B)

dicho segundo polipéptido comprende un dominio de adhesina de P. gingivalis, seleccionado del grupo que consiste en:

(i)

una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35; y

(ii)

una secuencia que es la misma que la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 36 o 37.
2. La proteína quimérica o de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde:

(a) dicho primer péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 27-30 y dicho segundo polipéptido comprende una secuencia que es la misma que una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 36-37.
3.

La proteína quimérica o de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el residuo C-terminal de dicho primer péptido está unido covalentemente directamente o a través de un enlazador que es o bien (i) hasta 15 aminoácidos de longitud, o (ii) menos de 5 aminoácidos de longitud, al residuo N-terminal de dicho segundo polipéptido.
4.

La proteína quimérica o de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el residuo N-terminal de dicho primer péptido está unido covalentemente directamente o a través de un enlazador que es o bien (i) hasta 15 aminoácidos de longitud, o (ii) menos de 5 aminoácidos de longitud, al residuo C-terminal de dicho segundo polipéptido.
5.

La proteína quimérica o de fusión de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho primer péptido comprende una secuencia que es la misma que o al menos 90% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 28 y dicho segundo polipéptido comprende una secuencia que es la misma que o al menos 90% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 37.
6.

La proteína quimérica o de fusión de acuerdo con la reivindicación 2 en la que dicho primer péptido comprende una secuencia que es la misma que o al menos 90% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 27 y dicho segundo polipéptido comprende una secuencia que es la misma que o al menos 90% idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 36.
7.

Una composición que comprende una proteína quimérica o de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
8.

La composición de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende además un adyuvante.
9.

Una proteína quimérica o de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, o una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para su uso en la prevención o reducción de la incidencia de gravedad de una condición o enfermedad P.gingivalesrelacionada en un sujeto.
10.

Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica una proteína quimérica o de fusión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6.
11.

La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicha secuencia está enlazada de modo operable a al menos un elemento regulatorio.
12.

Un método para la diagnosis o monitorización de una condición o enfermedad relacionada con P.gingivalesen un sujeto, que comprende el uso de una proteína quimérica o de fusión de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-6 para detectar anticuerpos anti-P.gingivalesen una muestra biológica obtenida de dicho sujeto.
13.

Una proteína quimérica o de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para uso en un método de detección de anticuerpos anti-P.gingivalesen una muestra biológica obtenida de un sujeto

Fig.6