CN108291913B - 确定体内相互作用模式的方法 - Google Patents

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Abstract

本文报道了用于确定与具有至少两个特异性结合抗原的结合位点的人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用的方法，其包括以下步骤：1)确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，和2)在足以将抗体切割成Fab和Fc区的条件和时间下，温育包含抗体和衍生自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸‑牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物，并确定抗体的Fabs对多聚体的结合亲和力，由此如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则抗体对多聚体抗原的结合亲和力是亲和力驱动的，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则抗体对多聚体抗原的结合亲和力是亲合力驱动的。

Description

确定体内相互作用模式的方法
本发明属于免疫测定领域。尤其是本文报道了一种用于选择结合测定的方法，该测定适当地反映了治疗性结合剂(药物)对其各靶标的相互作用模式(即亲和力或亲合力)。这与选择反映治疗性结合剂(药物)结合强度的结合测定相关。
发明背景
生物制药产品的质量除了其作用之外具有决定性的重要性。因此，除了对作用模式进行详细研究之外，确定基于蛋白质的药物的身份、纯度和活性以便将其安全地用作治疗剂是绝对必要的。
单克隆抗体(mAb)可以借助各种分离和测试技术成功分析。
木瓜蛋白酶，作为一种半胱氨酸蛋白酶，在精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)和酪氨酸(Y)之后相对非特异性地切割肽键。如果温育时间足够长，木瓜蛋白酶消化导致完全水解。然而，通过有限的蛋白水解，抗体可以在其铰链区中相对选择性地被切割(Lottspeich，F和Engels，J.W.，“Bioanalytik Spektrum AkademischerVerlag”Munich第2版(2006)201-214)。切割发生在将两条重链连接在一起的二硫键的N端侧上。在该过程中保留二硫键，从而在消化后获得三个片段(2个Fab片段，1个Fc片段)。两个N-末端片段被称为抗原结合片段(Fab、抗原结合片段)，C-末端片段被称为结晶片段(Fc、结晶片段)。每个Fab片段由完整轻链和重链的氨基末端那半组成。Fc片段由仍然通过二硫桥连接在一起的重链的两个羧基末端部分组成。
近年来，已经鉴定出不同的IgG特异性蛋白酶。
在WO 2015/40125中报道了链球菌红疹毒素B(SpeB)。它被描述为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的半胱氨酸蛋白酶，显示出将IgG在铰链区中切割成两个稳定的单体Fab片段和一个Fc片段。进一步报道SpeB在根据Kabat编号系统的位置238和239(根据EU编号系统的位置225和226)之间切割IgG的铰链区。
来自人类病原体酿脓链球菌的半胱氨酸内切蛋白酶IdeS(免疫球蛋白降解酶S)(也称为Mac-1或sib-38)是特异性切割免疫球蛋白G型(IgG)抗体重链的半胱氨酸蛋白酶。IgG是迄今为止唯一已知的IdeS底物(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。IdeS由339个氨基酸组成，包括包含29个氨基酸的信号肽(von Pawel-Rammingen，U.等人，EMBO J.21(2002)1607-1615)，其中RGD基序由氨基酸214至216形成。IdeS在包含在识别序列LLGGP中的根据Kabat编号系统的位置249和250(根据EU编号系统的位置236和237)(Gly-Gly)之间的铰链区切割人IgG(G类免疫球蛋白)。人类IgG2在识别基序PVAGP中的氨基酸丙氨酸和甘氨酸之间被切割。IgG2a和IgG3型的鼠抗体也被切割(Vincents，B.等人，Biochem.43(2004)15540-15549)。
牙龈红棕色单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是进行性牙周病的主要致病因子(参见例如Kadowaki，T.等人，J.Biol.Chem.269(1994)21371-21378)。由此分离出不同的酶，其中包括牙龈菌蛋白酶、胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。
Kikuchi，Y.等人报道了通过使用表面等离振子共振测定抗体片段的浓度和结合亲和力(J.Biosci.Bioeng.100，(2005)311-317)。
在WO 95/11298中提供了基本上纯的Lys-牙龈菌蛋白酶复合物制剂及制备方法，其中Lys-牙龈菌蛋白酶的特征在于通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳估计具有105kDa的表观分子量，其中样品在没有煮沸的情况下制备，所述Lys-牙龈菌蛋白酶具有在赖氨酸残基后切割的酰胺分解和/或蛋白水解活性以及不具有在精氨酸残基后切割的酰胺分解和/或蛋白水解活性，其中酰胺分解和蛋白水解活性被TLCK，半胱氨酸蛋白酶组特异性抑制剂(包括碘乙酰胺和碘乙酸)抑制，其中所述Lys-牙龈菌蛋白酶的酰胺分解和/或蛋白水解活性对亮抑酶肽、抗痛素、反式-环氧丁二酰-L-亮氨酰氨基-(4-胍基)丁烷、丝氨酸蛋白酶组特异性抑制剂(包括二异丙基氟磷酸和苯基甲基磺酰氟)，以及特异于Lys-牙龈菌蛋白酶蛋白质复合体的抗体及及其催化组分的抑制不敏感。
在WO2015/086549中报道了使用具有较小kD值(解离常数)的二价双特异性抗体与其抗原相互作用以将二价双特异性抗体固定到固体表面上来确定二价双特异性抗体的生物学活性。
Inagaki，S.等人报道了关于牙周炎患者对牙龈红棕色单胞菌的牙龈菌蛋白酶的抗体应答(J.Periodont.74(2003)1432-1439)。
发明内容
本文报道了用于选择用于多特异性结合剂(例如双特异性抗体)的(功能性)结合免疫测定的方法。与标准抗体相比，双特异性分子的功能评估需要考虑其他方面，即测定形式应该反映单个靶标的体内相互作用并考虑药物的结合位点。这方面指导选择用于确定药物的功能性和用于决策制定的免疫测定，例如，能够确定正确的结合值，或最大限度地鉴定最适合的药物。
本文报道的一个方面是用于确定与具有至少两个特异性结合抗原的结合位点的人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用的方法，包括以下步骤：
1)确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)将包含抗体和源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物在足以将抗体切割成Fab和Fc-区的条件下温育足够的时间，并确定抗体Fab对于多聚体抗原的结合亲和力，
和
如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力为亲和力驱动的，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的。
本文报道的一个方面是确定人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用的方法，包括以下步骤：
1)确定抗体对于多聚体抗原的结合亲和力，
2)在还原剂存在下，在30℃至42℃的温度下，将包含抗体、抗原和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶或其酶活性片段的混合物在7.5至8.5的pH下温育10min至240min时间以将抗体切割成Fab和Fc区，由此抗体的浓度高于抗原的浓度，并确定抗体的Fab对于多聚体抗原的结合亲和力，
和
如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力为亲和力驱动的，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的。
本文报道的一个方面是选择用于确定人IgG1亚类的抗体与多聚体抗原的结合相互作用的测定形式的方法，包括以下步骤：
1)使用表面等离振子共振方法确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在还原剂存在下，在30℃至42℃的温度下，将包含抗体、抗原和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶或其酶活性片段的混合物在7.5至8.5的pH下温育10min至240min时间以将抗体切割成Fab和Fc区，由此抗体的浓度高于抗原的浓度，并在表面等离振子共振方法中通过直接应用前一步骤中获得的温育的反应混合物，利用表面等离振子共振确定抗体的Fab对其抗原的结合亲和力，
由此抗体对多聚体抗原的结合亲和力为i)如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则是亲和力驱动的，或ii)如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的，
和
选择
i)在与可溶性多聚体抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定
ii)在与可溶性多聚体抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行溶液或表面测定，
iii)在与表面结合的抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，或
iv)在与表面结合抗原的亲合力驱动的相互作用的情况下，进行表面测定
用于确定人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用。
在一个实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或表面等离振子共振在溶液中确定结合亲和力。
在一个实施方案中，使用利用荧光激活细胞分选(FACS)或细胞效应的细胞测定来确定结合亲和力。
在一个实施方案中，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差100％或更少(较小的值设定为100％)，则在步骤1)和2)中确定的抗体对多聚体抗原的结合亲和力相当，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过100％(较小的值设定为100％)，则其不同。
在一个实施方案中，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差2倍或更小(较小的值用作计算的基础；设定为100％)，则在步骤1)和2)中确定的抗体对多聚体抗原的结合亲和力相当，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过2倍(较小的值设定为100％)，则其不同。
在一个实施方案中，如果在两个步骤中确定的结合亲和力的比率在1.5和0.5之间(步骤1的值是分母，步骤2)的值是分子)，则在步骤1)和2)中确定的抗体对多聚体抗原的结合亲和力相当，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力的比率小于0.5，则其不同。
在一个实施方案中，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差75％或更少(较小的值设定为100％)，则在步骤1)和2)中确定的抗体对多聚体抗原的结合亲和力相当，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过75％(较小的值设定为100％)，则其不同。
在一个实施方案中，用10或更高的抗体：多聚体抗原比率来确定(在体内样条件下)结合亲和力。
在一个实施方案中，用小于1的多聚体抗原与结合位点的摩尔比来确定结合亲和力。
在一个实施方案中，源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽是牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶。在一个实施方案中，源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽包含SEQ ID NO：02或SEQ ID NO：03或SEQ ID NO：04的氨基酸序列或者是其功能变体。在一个实施方案中，牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶具有SEQ ID NO：02或SEQ ID NO：03或SEQ ID NO：04的氨基酸序列或者是其功能变体。在一个实施方案中，源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽具有包含SEQ ID NO：01的至少230至739位残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中，温育是在还原剂存在下，pH为(从pH)7.5至(pH)8.5，在(从)30℃至42℃的温度下，持续时间为(从)10min至240min以将抗体切割成Fab和Fc区。
在一个实施方案中，还原剂选自2-巯基乙醇、半胱氨酸和二硫苏糖醇组成的组。在一个实施方案中，还原剂是半胱氨酸。在一个实施方案中，还原剂是浓度为0.5mM至10mM的半胱氨酸。
在一个实施方案中，pH值是约pH8。
在一个实施方案中，温度为(从)35℃至38℃。
在一个实施方案中，温育约60min的时间。
在一个实施方案中，抗体在Fc区中包含两条重链多肽中的突变P329G、L234A和L235A。
在所有方面的一个实施方案中，温育的混合物用于确定结合亲和力而无中间纯化。
在所有方面的一个实施方案中，结合亲和力的确定是通过表面等离振子共振。
本发明的详细描述
本发明属于(功能性)免疫测定领域。尤其是本文报道了用于选择适当反映治疗药物的结合强度的(功能)结合测定的方法。治疗相关的相互作用通常处于靶标浓度低于(或至多等于)治疗药物浓度的条件下。在该(浓度)条件下用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化允许确定治疗药物对给定靶标的治疗相关的相互作用(亲和力或亲合力)。这意味着存在相应的靶标。这种情况(使用单价结合剂)仅对于多聚体(例如二聚体)可溶性靶标或细胞表面靶标是必需的。
对于相应测定，亲和力驱动的相互作用模式需要溶液测定，而亲合力驱动的相互作用需要表面测定。应用错误的测定形式会导致错误的测定结果。
功能测定用于分析治疗分子。当功能测定应该指示药物与靶标的体内结合强度时，需要确保这种体内相互作用模式(亲和力或亲合力)在功能测定中在体外反映。当药物对于给定靶标是二价(多价)时，这是尤其相关的。一种评估相互作用模式的方法是通过蛋白水解消化产生单价药物，并比较在代表体内情况的环境中消化之前和之后的结合强度。然而，这通常需要被消化的单价药物的纯化，因为蛋白酶，仍然是二价(多价)的未完全消化的药物，以及仅部分消化的药物可能损害测定结果。
总之，所用的蛋白酶高度特异性地和定量地切割药物。因此，可以在消化之前和之后评估药物的结合强度而无需纯化。与未消化的药物相比，消化后结合强度的降低指示了亲合结合模式。在消化之前和之后没有区别的情况下，结合模式是亲和的。在功能测定中保持测定的结合模式(亲和或亲合)对于获得指示体内结合强度的测定结果是至关重要的。而且，保持测定之间测定的结合模式(亲和或亲合)对于获得相当的测定结果是必需的。
定义：
相互作用模式可以或是亲和力或亲合力驱动的。对相互作用模式的一种衡量是结合强度。
术语靶标和抗原在本文中可互换使用。
术语治疗性分子、药物、抗体和双特异性分子在本文中可互换使用。
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号系统来编号，在本文中被称为“根据Kabat编号”。具体而言，Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号系统(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)用于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3，在这种情况下其在本文中通过参考“根据Kabat EU索引编号”被进一步澄清)。
必须指出的是，除非上下文另外明确指出，否则如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数形式。因此，例如，对“一个细胞”的引用包括多个这样的细胞及其本领域技术人员已知的等同物等等。同样，术语“一”(或“一个”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。还应该指出，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”表示此后数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示此后数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示此后数值的+/-5％的范围。
术语“牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶”表示根据Kabat编号系统在位置238和239之间(根据EU编号系统的位置225和226)特异性切割人IgG1和IgG3亚类重链的多肽，即铰链区氨基酸序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVF(SEQ ID NO：05)在第二个氨基酸残基之后切割，产生片段DK(SEQ ID NO：06)和THTCPPCPAPELLGGPSVF(SEQ ID NO：07)。在一个实施方案中，所述多肽即牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶包含SEQ ID NO：02或SEQID NO：03或SEQ ID NO：04的氨基酸序列或其功能变体。在一个实施方案中，所述多肽即牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶具有包含SEQ ID NO：01的至少230至739位残基的氨基酸序列。“牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶”具有EC编号3.4.22.47，并且还表示为牙龈菌蛋白酶K、KGP、赖氨酸-牙龈菌蛋白酶、PrtP蛋白酶、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶、赖氨酸特异性牙龈菌蛋白酶、赖氨酸特异性牙龈菌蛋白酶K或赖氨酸特异性牙龈菌蛋白酶蛋白酶。牙龈红棕色单胞菌的示例性赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的全长氨基酸序列在SEQID NO：01中表示。该多肽是对赖氨酰键具有严格特异性的内肽酶。通过加入约30μM的2-巯基乙醇，约50mM半胱氨酸，约30mM二硫苏糖醇，约2mM EDTA，约2mM EGTA或谷胱甘肽来激活多肽的酶活性。它在从pH6.5到pH9.5的pH范围内是有活性的，pH从约7.5到约pH8.5(优选约pH8.0)适用于免疫球蛋白的水解。在示例性的IgG降解方法中，使用以下条件：IgG(终浓度15μM)，KGP(终浓度10nM活性蛋白酶)，Tris缓冲液(0.1mol/L，pH8.0)，EDTA(终浓度1mM)，L-半胱氨酸(终浓度2mM)，37℃。人IgG被切割一次，但如果糖结构被去除，则可能发生第二次切割。如果存在离液剂和/或去污剂，酶切割可能受到不利影响。因此，在一个实施方案中，该方法在来自该方法中使用的所有溶液中不存在离液剂和/或去污剂的情况下进行。
术语“全长抗体”表示包含两条所谓的轻免疫球蛋白链多肽(轻链)和两条所谓的重免疫球蛋白链多肽(重链)的抗体。全长抗体的每个重链和轻链免疫球蛋白链多肽含有包含能够与抗原相互作用的结合区的可变结构域(可变区)(通常为多肽链的氨基末端部分)。全长抗体的每个重链和轻链免疫球蛋白链多肽包含恒定区(通常为羧基末端部分)。重链恒定区介导抗体i)与带有Fcγ受体(FcγR)的细胞如吞噬细胞，或ii)与带有也称为Brambell受体的新生儿Fc受体(FcRn)的细胞的结合。它也介导了与一些因子的结合，包括经典补体系统的因子，如组分(C1q)。抗体轻链或重链的可变结构域继而包含不同的区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能天然存在的突变外，包含在该群的单个抗体是相同的。单克隆具有高度特异性，针对单个抗原位点。此外，与包含针对不同抗原位点(决定簇或表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一抗原位点。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以被合成而不被其他抗体污染。修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法生产抗体。
抗体的“Fc区”不直接参与抗体抗原的结合，但表现出各种效应子功能。根据重链恒定区的氨基酸序列，将抗体(免疫球蛋白)分为以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别中的一些进一步分为亚类(同种型)，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的IgG，或IgA1和IgA2中的IgA。根据抗体所属的免疫球蛋白类别，免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α(IgA)、δ(IgD)、(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。根据本发明的抗体优选属于IgG类。“抗体的Fc区”是本领域技术人员公知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶切割进行定义。
功能测定：
本发明属于免疫测定领域。尤其是本文报道了一种用于选择多特异性结合剂，例如如双特异性抗体的体内样测定的方法。
多特异性结合剂是结合多种不同相互作用配偶体的分子，由此每个靶标/相互作用配偶体可以单价或多价结合。例如，双特异性结合剂特异性结合两个不同的靶标/相互作用配偶体，由此每个靶标/相互作用配偶体可以单价或二价结合。例如，抗体如IgG类的全长抗体是二价的。因此，当确定亲和力时，它应该是避免了二价结合剂的亲合力效应的“真实的”亲和力。为了确定结合二价或多价靶标的抗体的亲和力和结合动力学，因此有必要将二价抗体变成单价结合实体如片段抗原结合(Fab)单位。目前确定二价抗体亲和力的方法是两步法：
1：切割待分析的抗体以生产单价结合实体，和
2：纯化1的反应混合物。
或者，可以重新克隆并表达Fab片段，对于上述方法，需要更多的时间和劳动。
为了确定多特异性结合剂与其每个靶标/相互作用配偶体的相互作用强度，必须选择和执行用于确定对每个靶标/相互作用配偶体的特异性和亲和力的单独测定，以完全表征所述多特异性结合剂的相互作用。
下面概述了双特异性抗体的概念。这仅仅作为例证而完成，而不应被解释为限制在所附权利要求中阐述的本发明的范围。
双特异性抗体是包含第一抗原的至少一个结合位点和第二抗原的至少一个结合位点的结合剂。
双特异性抗体可以包含第一抗原的一个结合位点和第二抗原的一个结合位点。在这种情况下，双特异性抗体对于其每种抗原是单价的并且总体上是二价的。因此，多特异性结合剂的最简单形式是二价双特异性抗体。这种形式也被表示为1+1形式。
双特异性抗体还可以包含第一抗原的两个结合位点和第二抗原的一个结合位点。这种双特异性抗体是三价双特异性抗体。这种形式也被表示为2+1形式。
双特异性抗体还可以包含第一抗原的两个结合位点和第二抗原的两个结合位点。这种双特异性抗体是四价双特异性抗体。这种形式也被表示为2+2形式。
此外，双特异性抗体可以是全长抗体。术语“全长抗体”表示包含两条所谓的抗体轻链多肽(简称：轻链)和两条所谓的抗体重链多肽(简称：重链)的免疫球蛋白。全长抗体的每条抗体重链和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(通常为多肽链的氨基末端部分)。全长抗体的每条抗体重链和轻链多肽包含恒定区(通常为羧基末端部分)。重链恒定区介导抗体i)与带有Fcγ受体(FcγR)的细胞如吞噬细胞，或ii)与带有也称为Brambell受体的新生儿Fc受体(FcRn)的细胞的结合。它也介导了对一些因子的结合，所述因子包括经典补体系统的因子，如组分(C1q)。抗体轻链或重链的可变结构域又包含不同的区段，即四个构架区(FR)和三个高变区(CDR)，并且通过可变区中的其高变区与抗原相互作用。一对抗体重链可变结构域和同源抗体轻链可变结构域表示为结合位点。
术语“溶液测定”表示这样的测定，其中治疗药物，例如抗体固定在固相上，并将靶标以可溶形式(即作为可溶性靶标)施用。溶液测定也可以是细胞内测定，其中靶标存在于细胞的细胞质中。
术语“表面测定”表示其中靶标在固相上并且治疗药物，例如抗体以可溶形式应用。固相可以是通常用于免疫测定中的任何固相或表达靶标的细胞的表面。
图1示出了当前发明下的决策树。
如果双特异性抗体对于各自抗原(靶标/相互作用配偶体)是单价的，则可以使用溶液测定或基于固体表面的测定。
如果双特异性抗体对其抗原(靶标/相互作用配偶体)是二价的，则它取决于抗原的种类(靶标/相互作用配偶体)，即可溶性或表面结合，所述测定形式应选择：
在单体可溶性抗原(靶标/相互作用配偶体)的情况下，仅可以使用溶液测定；
在与可溶性多聚体抗原(靶标/相互作用配偶体)的亲和力驱动的相互作用的情况下，仅可以使用溶液测定；
在与可溶性多聚体抗原(靶标/相互作用配偶体)的亲合力驱动的相互作用的情况下，可以使用溶液或基于固体表面的测定；
在与表面结合的抗原(靶标/相互作用配偶体)的亲和力驱动的相互作用的情况下，仅可以使用溶液测定；
在与表面结合的抗原(靶标/相互作用配偶体)的亲和力驱动的相互作用的情况下，仅可以使用基于固体表面的测定；
因此，为了做出这一决定，双特异性抗体与抗原(靶标/相互作用配偶体)的相互作用(双特异性抗体对所述抗原为二价的)必须归类为亲和力驱动或亲合力驱动的。
术语“亲和力驱动的相互作用”表示结合剂与其靶标/相互作用配偶体之间的相互作用，其强度不依赖于所讨论的靶标/相互作用配偶体的结合剂中相互作用位点的数量。因此，亲和力描述了抗体与其抗原之间单一相互作用的强度。IgG类的二价抗体具有两个抗原结合位点，亲合力通常应用于抗体相互作用，其中多个抗原结合位点同时与靶抗原相互作用，通常以多聚体结构。
术语“亲合力驱动的相互作用”表示结合剂与其靶标/相互作用配偶体之间的相互作用，其强度取决于所讨论的目标/相互作用配偶体的结合剂中相互作用位点的数量。因此，抗体的亲合力是指多个亲和力的累积强度。亲合力通常是关于多个抗原结合位点(通常以多聚体结构)参与的相互作用而获得。为了确定抗体的亲和力，有必要将二价抗体转化为单价结合实体如抗原结合片段(Fab)。
可以通过分析双特异性抗体与所讨论的抗原(靶标/相互作用配偶体)的相互作用强度对抗体中对于所讨论的抗原(靶标/相互作用配偶体)的结合位点的数目的依赖性而将双特异性抗体的亲和力驱动的相互作用与亲合力驱动的相互作用区分开。
在相互作用强度不依赖于结合位点的数量的情况下，相互作用是亲和驱动的。但是如果相互作用强度确实取决于结合位点的数量，那么相互作用就是亲合力驱动的。
因此，必须对相互作用强度进行两次测定：一次是双特异性抗体，一次是仅针对所讨论的抗原(靶标/相互作用配偶体)为单价的双特异性抗体或其片段。
以下描述了不同的抗体片段：
-F(ab’)2片段：
F(ab’)2片段具有约110kDa的分子量并且包含经由铰链区二硫键连接的IgG类全长抗体的两个抗原结合位点；它没有大部分但不是全部的Fc区域
-Fab'片段：
Fab'片段具有约55kDa的分子量；它可以通过还原F(ab’)2片段的铰链区二硫键而形成；Fab'片段包含游离巯基；因为它来自F(ab’)2，它可能含有一小部分Fc.-区
-片段抗原结合-Fab：
该Fab具有约50kDa的分子量；它是可以从IgG和IgM类的抗体获得的单价结合片段；它包含通过分子内二硫键连接的重链的VH和CH1结构域和完整的轻链
-Fv片段：
Fv片段具有约25kDa的分子量；它是含有完整抗原结合位点(VH结构域和VL结构域)的最小抗体片段；Fv片段的VH和VL结构域通过非共价相互作用保持在一起
-“rIgG”片段：
“rIgG”片段表示通过仅减少全长抗体的铰链区二硫键(例如使用2-MEA)获得的半抗体；它具有约75kDa的分子量
-可结晶的片段-Fc片段：
Fc片段具有约50kDa的分子量；它包含全长抗体的重链的CH2和CH3结构域和部分铰链区；两条链通过一个或多个二硫键(在铰链区)保持在一起；Fc片段不能结合抗原，但其负责全长抗体的效应子功能。
特别优选和常用的是Fab。
单价片段可以例如通过重新克隆和表达各自的Fab片段而获得。这是时间和劳动密集型的方法。
或者，可能切割待分析的抗体以生产单价结合实体。这可以酶促进行。
通常，通过用分别在铰链区上方或下方切割的非特异性蛋白酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶部分蛋白水解消化IgG产生Fab片段。片段含有连接重链的二硫键，但切割是在轻链和重链之间的二硫键位点之下(Porter，1959；Nisonoff等人，1960；Akita和Nakai，1993，Andrew和Titus，2003；Mage，1987；Zhao等人，2009；Andrew，SM和JA Titus.2003)。
用胃蛋白酶消化的IgG产生F(ab’)2片段，其随后轻度减少以产生Fab'片段。最可能的是铰链区域更容易受到蛋白酶的攻击，因为它是暴露的以及柔性的。随后，从消化混合物中纯化片段。
然而，缺乏重现性、未切割的IgG和过度消化常常是个问题。
用木瓜蛋白酶消化，例如难以获得均匀的Fab(Parham，1983；1986；Mage，1987)。固定化的木瓜蛋白酶产品(例如木瓜蛋白酶琼脂糖树脂；参见例如Tischer，W.和V.Kasche，1999；Luo，Q.等人，2002)允许更好地控制消化反应以及从粗蛋白酶消化中有效去除Fab和Fc片段；然而纯化仍然是必需的。
获得单体抗原结合片段的另一种方法包括通过用酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)消化产生F(ab’)2片段并用2-巯基乙胺(2-MEA)温和还原以产生Fab'片段(vonPawel-Rammingen，U.等人，2002+2003；Ishikawa，E.和S.Yoshitake，1980；DeSilva，B.S.等人，1995)。
IgG类抗体的两个抗原结合结构域也可以通过将IgG还原成两个半-IgG来获得(rIgG；参见例如Billah，M.M.等人，2010)。它是选择性地仅还原铰链区二硫键的产物，这些键是最易接近且最容易还原的，特别是使用温和还原剂如2-MEA。
最后，还可以通过轻链和重链Fd片段(VH-CH1)的重组表达来获得Fab(Zhao等人，2009)。然而，如果需要几种不同的Fab用于例如比较，则这是耗时且费力的。
在PCT/EP2015/057164中报道了在40min消化hIgG1中使用内蛋白酶Lys-C进行有限消化以通过质谱分析链组装。使用该程序，Lys-C只在铰链区上方切割一次，产生Fab和Fc片段。
在IgG类抗体的上铰链区选择性切割的蛋白酶是来自酿脓链球菌的链球菌红疹毒素B(SpeB)(von Pawel-Rammingen，U.等人，2002)。这种蛋白酶需要还原剂如DTT或TCEP，其活性范围为1-5mM(Persson，H.等人，2013；www.genovis.com/fabulous)，产生消化的抗体的链间硫醇的同时还原。
下表示出了IgG特异性蛋白酶及其切割位点(也参见Brezski，R.J.和Jordan，R.E.，mAbs 2(2010)212-220)。
Figure BDA0001673101580000161
Figure BDA0001673101580000171
自30多年以来，已研究牙龈红棕色单胞菌蛋白酶。它们已经被鉴定为需要存在用于活性的还原剂的半胱氨酸-蛋白酶。它们之一是半胱氨酸蛋白酶牙龈菌蛋白酶K(EC3.4.22.47)。
Scott等人早在1993年(Scott，C.F.等人，J.Biol.Chem.268(1993)7935-7942)就纯化了牙龈红棕色单胞菌(KGP)的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶。
Scott等人鉴定了半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽和2-巯基乙醇作为用于激活KGP的合适还原剂。
KGP在P1位置切割具有Lys的肽，在P2处的残基似乎不太重要。但是，如果P2被Lys或Arg占据，则水解似乎被阻断。KGP能够水解蛋白底物如BSA、酪蛋白、血红蛋白、酸溶性人胎盘I型胶原、人IgG和IgA(Curtis，MA等人，Crit.Rev.Oral Biol.Med.12(2001)192-216)。
Okamoto，K.等人(J.Biochem.120(1996)398-406)报道了牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的氨基酸序列，包括各个结构域的鉴定。Slakeski，N.等人报道并保藏了kgp基因，保藏号为U75366和AAB60809.1(Oral Microbiol.Immunol.14(1999)92-97)。已鉴定了几个C末端截短但有活性的形式。已经发现，对于C-末端截短的蛋白KGP(Δ1292-1732)、KGP(Δ1157-1732)、KGP(Δ738-1732)、KGP(Δ681-1732)和KGP(Δ602-1732)，酶活性仅对于最后两个突变体是几乎不可测量的(参见例如Sztukowska，M.等人，Mol.Microbiol.54(2004)1393-1408)。
KGP对合成底物具有窄的特异性，限于分别含有精氨酸和赖氨酸残基的肽键，但它们仍然可以以有限的降解方式降解免疫球蛋白G和A(Yamamoto，K.等人，在：Proteases：newPerspectives(1999)，V.Turk(编)，
Figure BDA0001673101580000172
Verlag Basel(CH)，175-184；Yamamoto，K.等人，在：N Katunuma，H Kido，H Fritz，J Travis(编)：Medical Aspects of Proteasesand Protease Inhibitors，IOS Press，Amsterdam，139-149；Kadowaki，T.等人，J.Biol.Chem.269(1994)21371-21378；Abe，N.等人，J.Biochem，123(1998)305-312)。
Fujimura等人(Microbiol.Lett.163(1998)173-179)在1998年报道了包膜相关的精氨酸-牙龈菌蛋白酶(RGP)和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶(KGP)的比较性质。酶通常通过还原试剂如巯基乙醇、二硫苏糖醇和半胱氨酸来激活。RGP-B被甘氨酰甘氨酸显著激活，并且KGP被EDTA和EGTA显著激活。RGP和KGP对发色合成底物的水解活性分别限于在P-1位置具有精氨酸和赖氨酸的化合物。当用三种酶分别处理IgG时，证明在每种反应产物中产生了34kDa和15kDa的两个新片段(还原条件下的SDS)。发现用于KGP活性的最适pH为7.5。硫醇试剂激活了RGPs和KGP，而二硫苏糖醇(20-30mM)是KGP的最佳激活剂，其次是巯基乙醇(20-30mM)和半胱氨酸(大于1.5mM但小于10mM)。KGP只切割X-Y-Lys-pNA。
Vincents，B.等人报道了牙龈红棕色单胞菌的牙龈菌蛋白酶K可以水解人IgG的亚类1和3，由此IgG1的重链在铰链区内的单个位点处被切割，产生Fab和Fc片段，并且IgG3也在重链内被切割，但是在CH2区域周围的几个位点处切割(FASEB J.，25(2011)3741-3750)。IgG2的切割不由KGP介导(Guentsch，A.等人，J.Periodont.Res.48(2013)458-465)。
de Diego，I.等人报道了KGP活性位点的高分辨率晶体结构，这表明催化可能需要催化三联体Cys477-His444-Asp388，而不是通常在半胱氨酸肽酶中发现的半胱氨酸-组氨酸二联体(J.Biol.Chem.289(2014)32291-32302)。
本文报告的方法
本文报道了用于选择多特异性结合剂的(功能)免疫测定的快速且容易的方法，其具有用于多聚体靶标/相互作用配偶体的一个或多个结合位点。
该方法基于全长多特异性结合剂与其对靶标/相互作用配偶体单价的片段之间的结合强度的比较。
所需的单价片段可以是例如Fab。Fab通过酶消化从IgG1亚类的全长抗体获得。已经发现，牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶可用于由包含人IgG1亚类抗体的铰链区的全长抗体产生Fab。利用这种酶，可以实现高度特异性且定量的蛋白酶消化，产生完整的Fab和Fc片段的均质库，没有任何通常与其他蛋白水解酶相关的过度消化。此外，反应混合物可以直接地，即不经任何中间纯化而应用于表面等离振子共振芯片。
更详细地说，这通过溶液消化和通过SPR对Fab片段的直接动力学亲和力测定来完成，无需任何预先纯化或清洁步骤。通过ESI-QTOF-MS验证了人IgG1的牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的完全消化。
该消化方法可以用于使用表面等离振子共振方法确定特异性结合二聚体或多聚体抗原的例如，亚类IgG1或者包含衍生自人亚类IgG1的Fc区的人或人源化抗体的动力学速率常数。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：1)将抗体与牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶温育以完全切割它，产生Fab和Fc-片段的均质库，和2)通过表面等离振子共振(SPR)确定在消化混合物中的Fab的结合亲和力。消化混合物上的直接SPR允许在没有任何预先纯化的情况下对Fab片段的精确动力学表征。
已经发现通过用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化无需后续纯化获得的IgG1亚类的抗体的Fabs的SPR确定的亲和力常数对应于通过重组表达或通过用木瓜蛋白酶消化随后在SPR测量之前进行纯化获得的Fab的亲和力常数。
本文报道的一个方面是确定人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用的方法，其中所述抗体具有至少两个特异性结合抗原的结合位点，所述方法包括以下步骤：
1)确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在足以将抗体切割成Fab和Fc区的条件和时间下温育包含抗体、抗原和衍生自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物，由此抗体浓度高于抗原浓度，并且确定抗体的Fab对多聚体抗原的结合亲和力，
和
如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力为亲和力驱动的，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的。
本文报道的一个方面是选择用于确定人IgG1亚类的抗体与多聚体抗原的结合相互作用的测定形式的方法，由此所述抗体具有至少两个特异性结合抗原的结合位点，所述方法包括以下步骤：
1)确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在足以将抗体切割成Fab和Fc区的条件和时间下温育包含抗体、抗原和衍生自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物，由此抗体浓度高于抗原浓度，并且确定抗体的Fab对多聚体抗原的结合亲和力，
由此抗体对多聚体抗原的结合亲和力i)如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则是亲和力驱动的，或ii)如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的，
和
选择
i)在与可溶性多聚体抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，
ii)在与可溶性多聚体抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行溶液或表面测定，
iii)在与表面结合的抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，或
iv)在与表面结合抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行表面测定
用于确定人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用。
在一个实施方案中，使用ELISA确定结合亲和力。
在一个实施方案中，使用表面等离振子共振方法来确定结合亲和力。
在一个实施方案中，在步骤1)和步骤2)中使用相同的测定。
在一个实施方案中，使用FACS或细胞效应来确定结合亲和力。
术语“特异性结合(抗原)”表示在体外测定中抗体与其抗原的结合，在一个实施方案中，在结合测定中，其中抗体与表面结合并且抗原与抗体的结合通过表面等离振子共振(SPR)测量。特异性结合意指10-8M或更低的结合亲和力(KD)。示例性的SPR方法是BIAcore测定(GE Healthcare Biosensor AB，Uppsala，瑞典)。结合的亲和力由术语ka(与来自抗体/抗原复合物的抗体结合的速率常数)，kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。同时，通过10-7mol/L或更差例如，10-5mol/L的KD确保不与抗原结合的性质。在一个实施方案中，分别在与抗原特异性结合和不特异性结合抗原之间至少100倍的抗体KD-间隙。
在一个实施方案中，步骤2)的温育的反应混合物直接应用于表面等离振子共振方法中。
在一个实施方案中，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差100％或更少(较小值设定为100％)，则在步骤1)和2)中确定的针对多聚体抗原的结合亲和力相当，如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过100％(较小值设定为100％)，则其不同。
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：
1)使用表面等离振子共振方法确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在还原剂存在下，在30℃至42℃的温度下，将包含抗体、抗原和来自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物在7.5至8.5的pH下温育10min至240min时间以将抗体切割成Fab和Fc区，由此抗体的浓度高于抗原的浓度，并在表面等离振子共振方法中通过直接应用前一步骤中获得的温育的反应混合物，利用表面等离振子共振测定抗体的Fab对其抗原的结合亲和力。
在一个实施方案中，用于选择用于确定人IgG1亚类的抗体与多聚体抗原的结合相互作用的测定形式，由此抗体具有至少两个特异性结合抗原的结合位点的方法包括以下步骤：
1)使用表面等离振子共振方法确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在还原剂存在下，在30℃至42℃的温度下，将包含抗体、抗原和来自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽的混合物在7.5至8.5的pH下温育10min至240min时间以将抗体切割成Fab和Fc区，由此抗体的浓度高于抗原的浓度，并在表面等离振子共振方法中通过直接应用前一步骤中获得的温育的反应混合物，利用表面等离振子共振方法测定抗体的Fab对其抗原的结合亲和力，
由此抗体对多聚体抗原的结合亲和力为i)如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则是亲和力驱动的，或ii)如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的，
和
选择
i)在单体可溶性抗原的情况下，进行溶液测定，
ii)在与可溶性多聚体抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，
iii)在与可溶性多聚体抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行溶液或表面测定，
iv)在与表面结合的抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，或者
v)在与表面结合的抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行表面测定
用于确定人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用。
在一个实施方案中，温育处于体内条件下。在一个实施方案中，温育用10或更大的抗体：多聚体抗原比率。在一个实施方案中，在温育中，抗体浓度至少是抗原浓度的10倍。
在一个实施方案中，源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽是牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶。在一个实施方案中，源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽包含SEQ ID NO：02或SEQ ID NO：03或SEQ ID NO：04的氨基酸序列或其功能变体。在一个实施方案中，源自牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的多肽具有包含SEQ ID NO：01的至少230至739位残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中，还原剂选自2巯基乙醇、半胱氨酸和二硫苏糖醇组成的组。在一个实施方案中，还原剂是半胱氨酸。在一个实施方案中，还原剂是浓度为0.5mM至10mM的半胱氨酸。在一个实施方案中，还原剂是浓度为约2mM的半胱氨酸。
在一个实施方案中，pH值是约pH8。
在一个实施方案中，温度为35℃至38℃。在一个实施方案中，温度约为37℃。
在一个实施方案中，温育持续30min至120min的时间。在一个实施方案中，温育约60min的时间。
在一个实施方案中，抗体在Fc区中包含两种重链多肽中的突变P329G、L234A和L235A。
在一个实施方案中，抗原是多聚体抗原。在一个实施方案中，抗原是同型多聚体抗原。在一个实施方案中，抗原选自由血管内皮生长因子A(VEGF-A)、癌胚抗原(CEA)、血管生成素-2(ANG2)和成纤维细胞激活蛋白(FAP)组成的组。
本文报道的方法允许快速测定二价抗体对其多聚体抗原的结合亲和力，而不需要重组产生抗体的单一结合位点形式。利用本文报道的方法，可以确定二价抗体对其抗原的结合亲和力，而不需要对已用于产生二价抗体的Fab的反应混合物的中间纯化。
以下用抗体贝伐单抗举例说明了本文报道的方法。贝伐单抗是人IgG1亚类的人源化抗VEGF抗体。治疗性抗体贝伐单抗结合二聚体抗原，即VEGF-A。
通过UHR ESI-QTOF质谱分析贝伐单抗Fab和消化物的质量。在木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab和纯化的重组Fab的解卷积质谱为两种材料的高质量提供了证据，因为仅可检测到Fab片段的质量。
更详细地说，通过使用大小排阻层析对反应混合物进行脱盐后，通过电喷雾电离质谱确认牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶完全消化贝伐单抗。MS谱中不能鉴定片段化或副产物。
为了比较，贝伐单抗已用酶木瓜蛋白酶消化。从MS谱图可以看出，由于抗体的非特异性片段化和功能丧失，木瓜蛋白酶不适用于功能评估。
图2(用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化1小时)，图3(用木瓜蛋白酶消化1.5小时)和图4(用木瓜蛋白酶消化2小时)示出了各自的MS谱。可以看出，使用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶时，除铰链区单一切割外没有发生抗体片段化。
更详细地说，通过UHR ESI-QTOF质谱分析重组贝伐单抗Fab和木瓜蛋白酶和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化物的质量。在木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab和纯化的重组Fab的解卷积质谱显示两种物质的高质量，因为仅完整Fab 48208Da(理论平均质量：48208Da)和47726Da(理论平均质量：47726)的质量可以被检测到。用木瓜蛋白酶消化的贝伐单抗的质谱的评估显示不仅存在48207Da Fab(理论平均质量：48208Da)和Fc-片段(由于Fc N-聚糖的异质性而存在多个质量)。此外，在木瓜蛋白酶消化物中检测到对应于质量x：23422Da和23453Da，y：34587Da和z：47607Da的未分配片段。相反，用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的贝伐单抗的解卷积质谱表明仅存在47969Da Fab(理论平均质量：47970Da)和Fc片段(由于Fc N-聚糖而存在多个质量)。用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化是完全的，没有任何未经消化的或单次切割的IgG(没有一个Fab的IgG)是通过质谱可检测的。在牙龈红棕色单胞菌消化物的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的粗制消化混合物中，也不能检测到片段的任何非特异性消化、过度消化或进一步降解。
如本文报道的方法用不同的贝伐单抗来源的样品进行：
1)全长二价抗体
2)重组生产的Fab
3)用本文报道的方法产生的Fab(没有中间纯化)(在牙龈红棕色单胞菌的功能性赖氨酸-牙龈菌蛋白酶存在下直接在温育后和在24小时额外温育后测定)
4)用木瓜蛋白酶生产的Fab(没有终止反应且没有中间纯化)
5)用木瓜蛋白酶生产的Fab(具有反应终止，没有中间纯化)
6)用木瓜蛋白酶生产的Fab(具有中间纯化)
为了比较贝伐单抗的不同产生的Fab的亲和力，测定了用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化而无需Fab纯化的贝伐单抗的结合亲和力和重组瞬时表达的贝伐单抗Fab，用木瓜蛋白酶消化后纯化的Fab的结合亲和力。
为了确定亲和力，将鼠抗His标签抗体固定化，并在传感器芯片表面上捕获与His标签缀合的二聚体VEGF-A。之后，注射结合VEGF-A的分析物并飞过表面。将衍生的传感图拟合1：1Langmuir结合模型，并用于确定缔合速率常数ka，解离速率常数kd和结合常数KD。通常，Fab片段的速率和结合常数都非常相似(参见下表)。发现牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化混合物中Fab的结合常数为1.1nM，并且确定用木瓜蛋白酶消化后的重组Fab和纯化Fab的结合常数分别为0.8和1.0nM。全长二价抗体的KD被确定为0.18nM，表明与二聚体VEGF-A的亲合结合。但是当将木瓜蛋白酶消化混合物应用于固定的芯片表面时，没有观察到与捕获的二聚体VEGF-A的结合。结果是，不能确定木瓜蛋白酶消化混合物的结合常数。已经发现应用含木瓜蛋白酶的样品后VEGF-A表面被破坏，因为它不能再使用了。
结果在下表中呈现。
Figure BDA0001673101580000251
Figure BDA0001673101580000261
可以看出，贝伐单抗与其抗原的结合是亲合力驱动的，因为所确定的结合亲和力在全长二价抗体和单价Fab之间不可比(差异大于100％)。
可以看出，由于牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶对人IgG1是特异的，因此它不会破坏固定的芯片表面。与此相反，将未纯化的木瓜蛋白酶消化反应混合物应用于固定的芯片表面后没有观察到结合。应用含有木瓜蛋白酶的样品后VEGF表面不能再使用，因为木瓜蛋白酶的存在已经损害所述表面。
相应的SPR图如图5-1至5-4所示。
用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的贝伐单抗的储存和通过SPR的重复亲和力测定允许消化物在4℃下分别稳定至少24和48小时，即不发生进一步的消化或片段化。
除了使用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶来确定结合二聚体或多聚体抗原的人IgG1s的亲和力外，蛋白酶也可以用于结合单体抗原的IgG1难以固定在SPR金属表面上的情况。
此外，牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶将非常有利于Fab片段的结构分析和以原子分辨率分析人IgG1-抗原结合的结构-功能关系，例如通过X射线晶体学。与IgG相比，Fab片段更易于结晶。
通过在基于细胞的测定中比较完整的二价单克隆抗体和所述牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的抗体结合可溶性寡聚靶标，分析了靶标结合中第二药物结合位点参与体内相互作用模式。由于VEGF-A是可溶性二聚体，因此在基于VEGF-A特异性细胞的报告基因测定中评价了牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的影响。在该测定中，测量VEGF-A与VEGF受体2的结合和信号转导。测试并比较二价抗VEGF-A抗体，用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的抗体，通过木瓜蛋白酶消化获得的所述抗体的纯化Fab片段和VEGF-A-单价CrossMab。对于所有化合物的剂量反应曲线相当，对完整抗体，牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的抗体，纯化的Fab(在木瓜蛋白酶消化后)以及CrossMab的EC50值分别为1.2、10.3、10.4和12.1nM。二价抗体的EC50比Fab片段和单价CrossMab低约9-10倍。因此，二价抗VEGF-A抗体的两个结合位点增加了与可溶性二聚体VEGF-A的结合强度(亲合力)。具有一个针对VEGF-A的结合位点的CrossMab具有与Fab片段相似的EC50(12.1对10.3-10.4nM)。单独使用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶显示出没有VEGF-A抑制(参见图6)。
通过在基于细胞的测定中比较结合细胞表面相关靶标的完整和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的单克隆抗体，分析靶标结合中第二药物结合位点参与体内相互作用模式。许多治疗靶标如癌胚抗原(CEA)定位于细胞表面。为了评价涉及与细胞表面相关的靶标特异性结合的抗体——抗-CEA二价单克隆抗体的牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化物，所述抗体用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化，并在流式细胞术测定中分析通过所述二价抗体的木瓜蛋白酶消化获得的纯化的Fab片段，通过Alexa Fluor 647标记的抗人κ轻链检测抗体来测量与表达CEA的胃腺癌细胞的结合。通过UHR-ESI-QTOF-MS确认牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的抗体和纯化的Fab的完整性。用二价抗体和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的抗体以及纯化的Fab获得的S形剂量-反应曲线表明抗体的两个结合位点都参与细胞表面靶标的结合，具有高结合强度(亲合力)。用与非相关靶标结合的抗体对阴性对照没有检测到结合，用单独的牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶也未检测到结合。
重组方法：
可以使用重组方法和组合物产生抗体，例如如US 4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码如本文所述的抗体的分离的核酸。此类核酸可编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在另一个实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如已经转化有)：(1)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了如本文报道的生产抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗体的条件下培养如上述提供的包含编码抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体。
对于抗体的重组生产，分离编码例如如上所述的抗体的核酸并将其插入到一个或多个载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规方法(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序此类核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中生产抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如US5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523。(参见Charlton，KA，在：Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，BKC(编)，Humana Press，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254)，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达后，抗体可以从细菌细胞浆液中以可溶性级分分离并且可以进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已被“人源化”，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于糖基化抗体表达的合适宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多可与昆虫细胞结合使用的杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中生产抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适合悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人类胚胎肾系(例如，在Graham，F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，例如在Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，例如在Mather，JP等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述；MRC5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，例如Y0、NS0和Sp2/0。对于适合抗体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述参见例如Yazaki，P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,Vol.248,Lo,B.K.C.(编),Humana Press,Totowa,NJ(2004),pp.255-268。
一般的色谱方法是本领域技术人员已知的，例如Chromatography，第5版，Fundamentals and Techniques,Heftmann,E.(编)；Elsevier Science PublishingCompany,New York,(1992)；Advanced Chromatographic and Electromigration Methodsin Biosciences,Deyl,Z.(编),Elsevier Science BV,Amsterdam,The Netherlands,(1998)；Chromatography Today,Poole,D.F.,and Poole,S.K.,Elsevier SciencePublishing Company,New York,(1991)；Scopes,Protein Purification:Principles andPractice(1982)；Sambrook,J.等人，(编),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；或CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等人，(编),John Wiley&Sons,Inc.,NewYork。
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提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求中阐述。应该理解，可以在不背离本发明精神的情况下对所述方法进行修改。
附图说明
图1决策树。
图2在37℃用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化1小时的贝伐单抗的UHR ESI-QTOF质谱。仅检测到Fab和Fc片段。
图3在37℃用木瓜蛋白酶消化1.5h的贝伐单抗的UHR ESI-QTOF质谱。除Fab和Fc片段外，还检测到几种Fab和抗体片段。
图4在37℃用木瓜蛋白酶消化2h的贝伐单抗的UHR ESI-QTOF质谱。检测到几个抗体片段。Fab和Fc片段不能被鉴定。
图5-1贝伐单抗的表面等离振子共振传感图。
图5-2重组贝伐单抗Fab的表面等离振子共振传感图。
图5-3用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的贝伐单抗的表面等离振子共振传感图。
图5-4贝伐单抗、用木瓜蛋白酶消化而没有终止消化的贝伐单抗以及用木瓜蛋白酶消化并具有终止消化的贝伐单抗的表面等离振子共振传感图。
图6分析靶标结合的第二结合位点参与体内相互作用模式的结果。
图7分析靶标结合的第二结合位点参与体内相互作用模式的结果。
实施例
贝伐单抗从Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，Germany)获得。木瓜蛋白酶以浓度为10mg/mL的悬浮液从Sigma-Aldrich/Roche Diagnostics GmbH获得。以商品名GingisKHAN从Genovis(Lund，Sweden)获得牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶。将GingisKHAN在200μL双蒸水(ddH2O)中重构，产生2000U/200μL，并且在每次消化之前在50μLddH2O(最终浓度：20mM半胱氨酸)中新鲜制备10x还原剂。
实施例1
瞬时Fab表达和纯化
将抗体轻链和重链Fd-片段按基因合成进行订购，并使用标准克隆程序通过独特的限制性位点将其克隆到用于每个链的分开的表达载体中，使得能够在悬浮生长的HEK细胞中分泌表达。根据细胞供应商的说明书，使用抗体载体的Maxiprep(Qiagen，目录号12163)制剂，Opti-MEM培养基(Invitrogen，目录号31985)293fectin(Invitrogen，目录号31985070)，和在无血清FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen，目录号12338018)中为1-2×10E+06活细胞/mL的初始细胞密度进行向至HEK293-F细胞(Invitrogen，目录号510029)的转染。在摇瓶中培养7天后，通过以14,000×g离心30min收获含有细胞培养物上清液的抗体并通过0.22μm无菌过滤器(Thermo Scientific，目录号566-0020)过滤。将抗体直接从上清液中纯化，或将上清液保存于-80℃直至纯化。通过SEC和BioAnalyzer分析纯化的Fab的质量。
实施例2
贝伐单抗用木瓜蛋白酶的酶切
没有纯化：
将抗体在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH6.0中稀释至终浓度为1mg/mL，加入2μL250mM L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich，Schnelldorf，德国)和10.9μL稀释的木瓜蛋白酶(7.34U/mL，在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH6.0中)，并在37℃温育1小时。
有纯化：
在37℃下，在5mM半胱氨酸存在下将抗体与木瓜蛋白酶(0.8U/mg mAb；Sigma-Aldrich/Roche)温育170分钟。为了从未切割的抗体、Fc片段和木瓜蛋白酶分离Fab，根据制造商方案将混合物应用于CaptureSelect IgG-CH1和MabSelectSuRe亲和色谱(GEHealthcare)。最后，使用140mM NaCl，20mM组氨酸(pH 6.0)作为运行缓冲液进行使用Superdex 75 10/300GL柱(GE Healthcare)的大小排阻层析。使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定Fab的蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)时，通过SDS-PAGE并用考马斯亮蓝染色来分析纯度。
实施例3
用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶酶切贝伐单抗
将GingisKHAN在200μL ddH2O中重构得到2000U/200μL，并且在每次消化之前在50μL ddH2O中(最终浓度：20mM半胱氨酸)新鲜制备10x还原剂。将100μg抗体在100mM Tris，pH8.0中稀释至1mg/mL的终浓度，随后用10μL GingisKHAN和11μL新鲜制备的10x还原剂在37℃下消化1小时。
实施例4
UHR-ESI-QTOF质谱
样品通过HPLC在Sephadex G25柱(Kronlab，5x250mm，TAC05/250G0-SR)上使用具有2％甲酸(v/v)的40％乙腈脱盐。总质量通过配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上的ESI-QTOF MS测定。用碘化钠进行校准(Waters ToF G2-Sample Kit 2Part：700008892-1)。对于重组和纯化的Fab，数据采集在900-2600m/z(ISCID：0.0eV)进行，对于hIgG1或消化的hIgG1s，数据采集在900-4000m/z(ISCID：0.0eV)进行。使用内部开发的Roche软件工具对原始质谱进行评估并转化为单个相对摩尔质量。为了可视化结果，使用相同的内部开发的软件来生成解卷积质谱。
实施例5
表面等离振子共振
使用BIAcore T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振来研究结合亲和力和动力学。使用PBS-T(10mM Na2HPO4，140mM NaCl，0.05％Tween 20，pH7.4)作为运行和稀释缓冲液在25℃下进行所有实验。使用标准胺偶联化学将抗His标签(GE Healthcare，#28995056)或抗人Fab抗体(GE Healthcare，#28958325)固定在Series S CM5Sensor Chip(GE Healthcare，#29104988)上。组氨酸标记的人VEGF或全长IgG/Fab被捕获在表面上导致10至50RU之间的应答。将分析物以2.2nM到1800nM的浓度以30μL/min的流速注入表面上(结合相)180s。通过运行缓冲液清洗来监测解离相长达3600sec。通过以流速为5μL/min注射10mM甘氨酸pH 1.5持续60sec来再生表面。通过减去从模拟表面获得的应答和通过减去空白注射(双重参照)来校正体折射率差异。使用BIAevaluation软件将衍生曲线拟合为1：1Langmuir结合模型。
实施例6
VEGF-A特异性报告基因测定
报告基因细胞系GloResponseTM NFAT-RE-luc2P/KDR HEK293表达KDR(KDR＝VEGF受体2)和在萤火虫萤光素酶前面的NFAT应答元件购自Promega Corporation，Madison，USA。在VEGF-A与KDR结合后，通过钙依赖磷酸酶的信号转导导致NFAT的激活，易位至细胞核，与NFAT应答元件结合并随后表达萤光素酶基因。用抗-VEGF抗体温育VEGF121(10.8nM40μL/孔)，所述抗体用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶，双特异性抗-VEGF-A/第二，非相关抗原CrossMab和阴性牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶对照(在DMEM中稀释，1％FBS，40μL/孔)在室温下温育约30min。在40μL补充有1％FBS的DMEM中加入5x104GloResponseTM HEK293细胞(Promega Coop.，在FreeStyleTM 293表达培养基，100μg/mL潮霉素B，250μg/mL遗传霉素(Thermo Fischer Scientific，Sigma-Aldrich，Calbiochem)中培养)作为悬浮液并在37℃，5％CO2下温育5小时。在加入发光底物(PromegaCoop.，ONE-GloTM EX，60μL/孔)之前，将平板在室温下平衡约15min。内容物在定轨摇床上以600rpm混合约1-3min。用发光读数仪测定发光强度。
实施例7
CEACAM5细胞表面结合测定
在RPMI1640，20％胎牛血清(FBS)，1×GIBCO GlutaMax(Thermo FischerScientific，Dreieich，德国)中培养的1×105胃腺癌细胞用PBS，5％FBS洗涤两次，重悬于PBS，5％FBS中并用抗CEA抗体，通过木瓜蛋白酶消化所述抗CEA抗体而获得的纯化的Fab片段，用牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶消化的所述抗体和阴性对照(结合至不相关靶标-仅牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶的抗体)在4℃下温育1小时。根据制造商(Molecular Probes，Thermo Fischer Scientific)的说明书使用Alexa Fluor647Protein Labeling Kit标记的小鼠抗人κ轻链抗体(150μg/mL)检测结合的抗体/Fab片段。将混合物在4℃黑暗中温育30min并使用BD FACSCanto II和FACSDiva Software(BDBiosciences，Heidelberg，Germany)通过流式细胞术分析。用同种型对照(AlexaFluor647-标记的小鼠IgG2a，BD Biosciences)验证特异性。使用正向和侧向分散基于大小和粒度进行活细胞的门控，并通过测量荧光信号检测结合的抗体/Fab片段。
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Claims (23)

1.一种确定人IgG1亚类的抗体与多聚体抗原的结合相互作用的方法，包括以下步骤：
1)确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在还原剂存在下，在30℃至42℃的温度下，将包含抗体、抗原和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶或其酶活性片段的混合物在7.5至8.5的pH下温育10min至240min时间以将抗体切割成Fab和Fc区，其中抗体的浓度高于抗原的浓度，并确定抗体的Fab对于多聚体抗原的结合亲和力，
和
如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力是亲和力驱动的，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则抗体对多聚体抗原的结合亲和力是亲合力驱动的，其中
如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差2倍或更小，其中较小的值用作计算的基础且设定为100％，则在两个步骤中确定的结合亲和力相当，以及如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过2倍，其中较小的值设定为100％，则在两个步骤中确定的结合亲和力不同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用ELISA或表面等离振子共振方法在溶液中确定所述结合亲和力。
3.根据权利要求1所述的方法，其中利用FACS或细胞效应使用细胞测定来确定所述结合亲和力。
4.一种选择用于确定人IgG1亚类的抗体与多聚体抗原的结合相互作用的测定形式的方法，包括以下步骤：
1)使用表面等离振子共振方法确定抗体对多聚体抗原的结合亲和力，
2)在还原剂存在下，在30℃至42℃的温度下，将包含抗体、抗原和牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶或其酶活性片段的混合物在7.5至8.5的pH下温育10min至240min时间以将抗体切割成Fab和Fc区，其中抗体的浓度高于抗原的浓度，并在表面等离振子共振方法中通过直接应用前一步骤中获得的温育的反应混合物，利用表面等离振子共振测定抗体的Fab对其抗原的结合亲和力，
由此抗体对多聚体抗原的结合亲和力i)如果在两个步骤中确定的结合亲和力相当，则是亲和力驱动的，或ii)如果在两个步骤中确定的结合亲和力不同，则是亲合力驱动的，其中如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差2倍或更小，其中较小的值用作计算的基础且设定为100％，则在两个步骤中确定的结合亲和力相当，以及如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过2倍，其中较小的值设定为100％，则在两个步骤中确定的结合亲和力不同；
和
选择
i)在与可溶性多聚体抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，
ii)在与可溶性多聚体抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行溶液或表面测定，
iii)在与表面结合的抗原发生亲和力驱动的相互作用的情况下，进行溶液测定，或
iv)在与表面结合抗原发生亲合力驱动的相互作用的情况下，进行表面测定
用于确定人IgG1亚类抗体与多聚体抗原的结合相互作用。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中如果在步骤1)和2)中确定的结合亲和力相差2倍或更少，其中较小的值用作计算的基础，则在两个步骤中确定的抗体对多聚体抗原的结合亲和力相当，并且如果在两个步骤中确定的结合亲和力相差超过2倍，其中较小的值设定为100％，则结合亲和力不同。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力是用10或更高的抗体:多聚体抗原比率确定的。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶包含SEQ ID NO：02或SEQ ID NO：03或SEQ ID NO：04的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶具有至少包含SEQ ID NO：01的第230至739位残基的氨基酸序列。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述牙龈红棕色单胞菌的赖氨酸-牙龈菌蛋白酶具有至少包含SEQ ID NO：01的第230至739位残基的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述还原剂选自由2-巯基乙醇、半胱氨酸和二硫苏糖醇组成的组。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述还原剂选自由2-巯基乙醇、半胱氨酸和二硫苏糖醇组成的组。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述还原剂是半胱氨酸。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述还原剂是浓度为0.5mM至10mM的半胱氨酸。
14.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述还原剂是浓度为0.5mM至10mM的半胱氨酸。
15.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述pH值为约pH8。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述pH值为约pH8。
17.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述温度为35℃至38℃。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述温度为35℃至38℃。
19.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述温育持续约60min的时间。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述温育持续约60min的时间。
21.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述温育的混合物用于在不进行中间纯化的情况下确定结合亲和力。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述温育的混合物用于在不进行中间纯化的情况下确定结合亲和力。
23.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述结合亲和力的确定是通过表面等离振子共振。
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